Analiza sekwencji genów immunoglobulin w przewlekłej białaczce limfocytowej: od materiału pacjenta do interpretacji sekwencji

Podsumowanie

Niniejszym przedstawiamy protokół, który szczegółowo opisuje aspekty techniczne i zasadnicze wymagania w celu zapewnienia solidnej analizy sekwencji genów IG u pacjentów z przewlekłą białaczką limfocytową (CLL), w oparciu o zgromadzone doświadczenie Europejskiej Inicjatywy Badawczej nad PBL (ERIC).

Streszczenie

Podczas dojrzewania limfocytów B, złożony proces rekombinacji genu immunoglobuliny (IG) V(D)J w połączeniu z hipermutacją somatyczną (SHM) powoduje powstanie unikalnej sekwencji DNA w każdej pojedynczej limfocytacji B. Ponieważ nowotwory złośliwe komórek B wynikają z klonalnej ekspansji pojedynczej komórki, geny IG reprezentują unikalną sygnaturę molekularną wspólną dla wszystkich komórek nowotworowych w obrębie pojedynczego pacjenta; w związku z tym rearanżacje genów IG mogą być wykorzystywane jako markery klonalne. Oprócz tego, że służy jako ważny identyfikator klonalny, sekwencja genu IG może działać jako "molekularna oś czasu", ponieważ jest związana z określonymi etapami rozwoju, a zatem odzwierciedla historię komórki B biorącej udział w transformacji nowotworowej. Ponadto w przypadku niektórych nowotworów złośliwych, w szczególności przewlekłej białaczki limfocytowej (PBL), sekwencja genu IG ma zdolności prognostyczne i potencjalnie predykcyjne. To powiedziawszy, ekstrapolacja znaczących wniosków z analizy sekwencji genów IG byłaby niemożliwa, gdyby nie były dostępne solidne metody i narzędzia pomagające w ich analizie. Niniejszy artykuł, opierając się na bogatym doświadczeniu Europejskiej Inicjatywy Badawczej nad PBL (ERIC), szczegółowo opisuje aspekty techniczne i zasadnicze wymagania niezbędne do zapewnienia wiarygodnej i odtwarzalnej analizy sekwencji genu IG w PBL, testu, który jest obecnie zalecany dla wszystkich pacjentów z PBL przed leczeniem. Dokładniej rzecz ujmując, opisano różne etapy analityczne, począwszy od identyfikacji klonotypowego przegrupowania genu IG i określenia sekwencji nukleotydów, a skończywszy na dokładnej interpretacji klinicznej danych sekwencji genu IG.

Wprowadzenie

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL), najczęstsza forma białaczki u dorosłych w krajach zachodnich, charakteryzuje się klonalną ekspansją dojrzałych nowotworowych komórek B¹. Z klinicznego punktu widzenia przebieg choroby jest niezwykle zmienny, a niektórzy pacjenci doświadczają agresywnej choroby, wymagającej leczenia bardzo wcześnie po rozpoznaniu i często nawrotowej lub opornej na leczenie. Jest to wyraźny kontrast ze znacznym odsetkiem pacjentów (~30%), u których występuje powolna choroba, nigdy nie wymagają leczenia i mają oczekiwaną długość życia podobną do zdrowych osób w tym samym wieku². Ta kliniczna heterogeniczność znajduje odzwierciedlenie w różnorodności nieprawidłowości molekularnych występujących u pacjentów z PBL, które ostatecznie napędzają patogenezę i progresję tej choroby³.

Ustalenie dokładnej diagnozy PBL jest zazwyczaj proste, jednak wspomniana wcześniej niejednorodność kliniczna może utrudniać skuteczne leczenie pacjentów z PBL i podkreśla potrzebę markerów prognostycznych i predykcyjnych, które mogłyby pomóc w podejmowaniu decyzji dotyczących leczenia². Liczne badania miały na celu udoskonalenie prognozowania PBL, czego kulminacją było zaproponowanie wielu nowych markerów klinicznych i biologicznych⁴. Status mutacji genu ciężkiej zmiennej immunoglobuliny klonotypowej (IGHV) jest jednym z najsolidniejszych markerów prognostycznych w PBL, głównie ze względu na fakt, że (i) pozostaje stabilny w czasie i wraz z postępem choroby oraz (ii) jest niezależny od innych parametrów klinicznych i biologicznych⁵. Niezależnie od tego, bardzo niewiele, jeśli w ogóle, markerów, w tym status mutacji IGHV, jest obecnie stosowanych w rutynie klinicznej w momencie diagnozy.

Początkowe doniesienia na temat klinicznej użyteczności sekwencjonowania genu IG w PBL pochodzą z 1999 roku, kiedy to 2 niezależne badania wykazały, że pacjenci bez lub z minimalnym obciążeniem hipermutacją somatyczną (SHM) (niezmutowana CLL, U-CLL) mają gorsze rokowanie niż pacjenci z wyższym obciążeniem SHM (zmutowany CLL, M-CLL)^6,7. Mówiąc dokładniej, grupa U-CLL składała się z przypadków będących nosicielami klonotypowych genów IGHV z niewielką ilością SHM lub bez SHM, a zatem wysokim procentem tożsamości z najbliższym genem IGHV linii zarodkowej (≥98%), podczas gdy M-CLL składała się z przypadków z wyższym ładunkiem mutacji (procent tożsamości z najbliższym genem IGHV linii zarodkowej <98%). Od czasu tych wczesnych badań stale wykazano, że przypadki U-PBL wykazują krótszy czas do pierwszego leczenia (TTFT) i całkowite przeżycie (OS) w porównaniu z M-CLL.

Patrząc z perspektywy czasu, te przełomowe badania podkreśliły kluczową rolę receptora komórek B (BcR) IG w patobiologii CLL, torując w ten sposób drogę do szeroko zakrojonych badań nad interakcjami CLL z mikrośrodowiskiem, które z kolei doprowadziły do bardziej wszechstronnego zrozumienia biologicznej heterogeniczności tej choroby^8,9. Nowsze badania dostarczyły dodatkowego wsparcia dla znaczenia analiz immunogenetycznych w CLL, ujawniając, że poszczególne przypadki mogą grupować się w podzbiorach ze względu na dzielenie (quasi) identycznych sekwencji genów BcR IG, zjawisko określane jako stereotypy BcR IG^10,11,12,13. Gromadzące się dowody potwierdzają pogląd, że pacjenci przypisani do tej samej stereotypowej podgrupy mają podobne właściwości kliniczno-biologiczne, które wyraźnie odróżniają ich od innych pacjentów z PBL w tej samej kategorii SHM, ale z różnymi sekwencjami genów IG; rzeczywiście doniesiono, że kategoryzacja pacjentów z PBL na podstawie stereotypii BcR IG dodatkowo udoskonala masową segregację pacjentów z PBL na grupy U-CLL lub M-CLL^{14,15,16,17,18,19,20}.

Z klinicznego punktu widzenia warto zauważyć, że status SHM klonotypowego genu IGHV wydaje się korelować ze specyficzną odpowiedzią na chemoimmunoterapię. W szczególności pacjenci z M-PBL leczeni kombinacją fludarabiny/cyklofosfamidu/rytuksymabu (FCR), złotego standardu leczenia dla sprawnych medycznie pacjentów z PBL bez defektów genu TP53, wykazywali znacznie dłuższe przeżycie wolne od progresji choroby (PFS) i OS w porównaniu z pacjentami z U-CLL, którzy otrzymali to samo leczenie^21,22,23. W związku z tym identyfikacja statusu SHM stała się ważna, w szczególności dla pomocy w leczeniu pacjentów z PBL, tj. markera predykcyjnego, a nie dla oceny przebiegu klinicznego choroby, tj. markera prognostycznego. W rzeczywistości, zgodnie z niedawną aktualizacją sponsorowanych przez NCI wytycznych z Międzynarodowych Warsztatów na temat CLL, status SHM przegrupowanych genów IGHV powinien być określony we wszystkich przypadkach PBL przed rozpoczęciem leczenia, zarówno w praktyce ogólnej, jak i badaniach klinicznych²⁴. Ponadto, ze względu na niedawne zatwierdzenie nowych środków terapeutycznych i rosnącą liczbę leków w badaniach, status SHM cząsteczki IG może odgrywać jeszcze większą rolę w postępowaniu terapeutycznym z pacjentami z PBL w najbliższej przyszłości⁵.

Ten raport szczegółowo opisuje wszystkie aspekty analizy sekwencji genów IG, zaczynając od wyboru odpowiedniego materiału, a kończąc na klinicznej interpretacji wyników sekwencjonowania. Dogłębna ocena tych etapów jest ważna w rutynowej diagnostyce w celu uzyskania wiarygodnych wyników i zapewnienia dokładnej stratyfikacji pacjentów w ramach badań klinicznych. Dostarczono protokoły, które pomagają w harmonizacji analizy sekwencji genów IG, zapewniając w ten sposób porównywalność wyników między różnymi laboratoriami.

Protokół

Protokół badawczy został zatwierdzony przez Komitet Etyki Instytutu Naukowego San Raffaele, Mediolan, Włochy.

1. Wybór materiału

1. Wybór materiału wyjściowego
   UWAGA: W większości przypadków PBL liczba komórek nowotworowych jest wysoka w momencie rozpoznania (>80-90%). W związku z tym sortowanie lub wzbogacanie komórek białaczkowych zwykle nie jest konieczne.
   1. W przypadku stosowania krwi obwodowej (PB), najczęstszego materiału z wyboru do analizy sekwencji genu IG, należy użyć objętości krwi między 10-20 ml.
   2. Alternatywnie, w przypadkach z niską liczbą komórek CLL, należy zastosować sortowanie komórek próbek PB lub materiału z innych tkanek, takich jak szpik kostny (BM) lub węzły chłonne (LN).
2. Czas pobierania próbek
   1. Czas pobierania próbek nie jest kluczowy, biorąc pod uwagę, że status IG SHM jest stabilny w godzinach nadliczbowych; to powiedziawszy, należy unikać pobierania próbek w określonych okresach, takich jak bezpośrednio po lub w trakcie terapii, ponieważ mała liczba komórek CLL może skomplikować analizę i prowadzić do niewiarygodnych wyników.
3. Odbiór i magazynowanie materiałów
   UWAGA: Zbieranie i przechowywanie materiału wyjściowego zależy w dużym stopniu od wyboru materiału.
   1. W przypadku próbek PB lub BM należy użyć probówek do pobierania EDTA lub CPT (cytrynian-tris-pirydozofosforan), aby zapobiec zahamowaniu procesu amplifikacji PCR; alternatywnie należy użyć probówek z heparyną.
   2. W przypadku próbek LN opcjami pobierania są zawiesiny komórek, biopsje ze świeżo zamrożonej tkanki lub, w rzadkich przypadkach, tkanki zatopione w parafinie (FFPE) utrwalone w formalinie.

2. Separacja gradientu gęstości

UWAGA: Jeśli PB lub BM jest materiałem wyjściowym do wyboru, co jest najczęstszym scenariuszem, zalecana jest izolacja komórek jednojądrzastych za pomocą separacji gradientu gęstości.

1. Dodać 200 μl EDTA (0,5 M EDTA/ pH 8,0) do 50 ml sterylnej probówki zbiorczej. Dodaj 20 ml PB i 15 ml RPMI. Wymieszać pipetując (wystarczy 2-3 razy).
2. Dodaj 15 ml pożywki o gradiencie gęstości do nowej probówki zbiorczej o pojemności 50 ml.
   UWAGA: W przypadku, gdy objętość PB jest mniejsza niż 20 ml, objętości RPMI (poprzedni krok) i gradient gęstości należy odpowiednio zmodyfikować.
3. Powoli nakładaj roztwór z kroku 2.1, aby nie zakłócał gradientu. Wirować przy 800 x g przez 20 minut przy wyłączonym hamulcu wirówki.
4. Zebrać jednojądrzasty pierścień komórkowy, który utworzył się między górną warstwą osocza/płytek krwi a warstwą pożywki gradientu gęstości, za pomocą sterylnej pipety Pasteura, a następnie przenieść do sterylnej probówki zbiorczej o pojemności 15 ml.
5. Dodaj RPMI do końcowej objętości 12 ml i wymieszaj. Wirować przy 750 x g przez 8 minut. Odrzucić supernatant.
6. Ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 10 ml RPMI i powtórzyć krok 2.5.
7. Rozpuść osad komórkowy w 1 ml PBS (DPBS, bez wapnia, bez magnezu). Przeprowadzić zliczanie komórek za pomocą płytki Neubauera, mieszając 20 μl próbki i 80 μl roztworu Türka w stosunku 1:10.
8. Jeżeli dalsze przetwarzanie próbki nie jest zaplanowane na ten sam dzień, należy odwirować próbkę o stężeniu 750 x g przez 8 minut. Odrzucić supernatant i przechowywać osad komórkowy w temperaturze -80^{o C}.

3. Ekstrakcja kwasów nukleinowych

1. Zdecyduj się na substrat do analizy statusu SHM genów IG. Genomowe DNA (gDNA) jest najpopularniejszym wyborem, ponieważ nie ma potrzeby wykonywania etapu odwrotnej transkrypcji; alternatywnie, zastosowanie RNA/komplementarnego DNA (cDNA) zapewnia, że przynajmniej na poziomie transkrypcji produktywna, funkcjonalna klonotypowa rearanżacja IG jest "preferowanym" celem.
2. Użyj jednego z wielu dostępnych na rynku zestawów odpowiednich do ekstrakcji gDNA lub całkowitego RNA i syntezy cDNA (patrz Tabela materiałów).
3. Oceń integralność DNA lub RNA za pomocą czułych systemów kwantyfikacji kwasów nukleinowych. W przypadku stosowania materiału FFPE do analizy, należy ocenić jakość i ilość wyekstrahowanego gDNA/cDNA za pomocą amplifikacji PCR znanego genu porządkowego, np. receptora kwasu retinowego alfa (RARa), beta-aktyny itp.

4. Amplifikacja i sekwencjonowanie rearanżacji genów IGHV-IGHD-IGHJ

1. Wybór startera IGH PCR
   1. Najlepiej wykonać multipleksową reakcję PCR ze starterami 5' specyficznymi dla podgrupy IGHV i starterami 3' specyficznymi dla genu IGHJ^25,26. Jeśli wyniki nie są optymalne, przygotuj oddzielne mieszaniny PCR, używając pojedynczych starterów specyficznych dla podgrupy IGHV.
   2. Użyć starterów 5', które wyżarzają się do regionu lidera znajdującego się bezpośrednio przed przegrupowaniem IG lub w regionie kodującym (np. Framework 1, FR1) genu IGHV.
      1. Stosować startery liderów, które pozwalają na amplifikację całej przegrupowanej sekwencji genu IGHV-IGHD-IGHJ, co z kolei umożliwi dokładne oszacowanie poziomów SHM. W związku z tym startery lidera IGHV są zalecane przez ERIC w ich zaktualizowanych wytycznych dotyczących analizy sekwencji genów IG²⁷.
      2. W przypadkach, gdy startery liderowe nie wzmacniają klonotypowego przegrupowania IG, należy użyć starterów IGHV FR1. Jednak startery szkieletowe nie amplifikują całej rearanżacji klonotypowego genu IG, co może prowadzić do niedokładnego określenia poziomu SHM. W przypadku tego scenariusza należy wyraźnie zaznaczyć w raporcie klinicznym, że użycie starterów IGHV FR1 może zawyżać rzeczywistą tożsamość procentową z najbliższym genem linii zarodkowej.
   3. Dla końca 3' użyj starterów konsensusu ukierunkowanych na geny IGHJ, multipleksowych zestawów starterów specyficznych dla genu IGHJ lub starterów specyficznych dla izotypu, w zależności od substratu. Sekwencje podkładów są przedstawione w Tabeli 1, podczas gdy Rysunek 1 przedstawia różne miejsca wyżarzania podkładu.
2. Amplifikacja PCR rearanżacji genu IGHV-IGHD-IGHJ
   1. Przygotuj mieszankę starterów, używając równomolowych ilości każdego startera (starterów) podgrupy, aby zapewnić bezstronne amplifikację.
      1. Na przykład, podczas stosowania starterów lidera, dwa różne startery są używane do wzmacniania przegrupowań należących do podgrupy IGHV1. Dlatego użyj ilości tych 2 starterów (IGHV1L i IGHV1bL) o połowę mniejszej niż IGHV4L, który jest jedynym starterem do rearanżacji podgrup IGHV4.
      2. Odwrotne podejście należy zastosować w przypadku starterów IGHJ1-2 i IGHJ4-5. Ponieważ startery te celują w dwie różne podgrupy genów IGHJ, ich ilość jest dwukrotnie większa w porównaniu ze starterami IGHJ3 i IGHJ6.
      3. Skorzystaj z tabeli 1, aby określić dokładne ilości podkładu podczas przygotowywania odpowiednich mieszanek podkładów.
   2. Wymieszać odczynniki PCR zgodnie z tabelą 2. Po połączeniu wszystkich odczynników PCR w probówce do PCR dodać 0,5 μl polimerazy Taq i 100 ng gDNA lub 2 μl cDNA (cDNA należy przygotować przy użyciu 1 μg RNA).
      UWAGA: Enzym Taq o aktywności korektorskiej nie jest niezbędny, ponieważ poziom błędu amplifikacji jest bardzo niski i dlatego nie wpływa na poziom SHM.
   3. Uruchom protokół thermal PCR wyszczególniony w Tabeli 3.
3. Ocena klonalności
   UWAGA: Kolejnym krytycznym krokiem jest ocena wzorca klonalności produktu PCR. Podczas oceny klonalności u pacjentów z PBL, najczęstszym objawem jest pojedynczy monoklonalny pik/pasmo.
   1. Do oceny klonalności należy używać metod o wysokiej czułości, takich jak analiza fragmentów lub heterodupleksów^28,29.
   2. Analiza fragmentów
      1. Wykonać multipleksowe PCR przy użyciu starterów PCR specyficznych dla lidera IGHV lub podgrupy FR1 znakowanych 5'; pozwoli to uzyskać produkty PCR, które można oddzielić za pomocą elektroforezy kapilarnej, umożliwiając w ten sposób ocenę klonalności produktów IGH PCR w oparciu o ich długość regionu 3 (CDR3) określającą komplementarność IGHV.
      2. Stosować startery, odczynniki i warunki termiczne identyczne z wymienionymi wcześniej (patrz tabele 1-3). Niestandardowe podkłady oznaczone 5' to fluorescencyjnie znakowane oligonukleotydy z wyborem barwników na końcu 5'. Przykładami barwników reporterowych są 6-FAM, HEX, NED lub TET. W związku z tym wymagane są 2 oddzielne reakcje w oparciu o użycie 3 różnych barwników na reakcję.
   3. Oceń rozmiar produktów PCR na sześcioprocentowym (6%) żelu poliakrylowym (ten procent daje optymalną rozdzielczość), używając 1x TBE jako bufora bieżącego. Praca pod napięciem 80 V przez 45 min.
      UWAGA: Zaleca się, aby produkty PCR mogły migrować po żelu przez wystarczająco długi czas, aby próbki monoklonalne mogły zostać oddzielone od tła poliklonalnego, a marker wielkości DNA mógł się odpowiednio oddzielić. Czynniki takie jak rozmiar i grubość żelu mogą wpływać na migrację, więc żadne pojedyncze ustawienie (napięcie i czas) nie może zagwarantować optymalnego wyniku To powiedziawszy, ustawienie napięcia na 80 V na 45 minut jest dobrym punktem wyjścia, ponieważ minimalizuje ryzyko zbyt szybkiej migracji próbki i "sciekania" z żelu.
   4. Sprawdź, czy produkty PCR zawierają około 500 par zasad w przypadku stosowania starterów liderowych IGHV i 350 par zasad w przypadku stosowania mieszanek starterów IGHV FR1.
      UWAGA: W rzadkich przypadkach stwierdzono, że przypadki PBL zawierają podwójne produkty monoklonalne, a w jeszcze rzadszych przypadkach przypadki mogą wykazywać wzór oligoklonalny. Czynnik interkalacyjny, taki jak bromek etydyny (EtBr) lub mniej niebezpieczne i bardziej wrażliwe dostępne na rynku barwienia DNA, można zastosować do wizualizacji DNA na żelach akrylowych za pomocą wzbudzenia UV lub światła niebieskiego.
4. Oczyszczanie produktu metodą PCR
   UWAGA: Produkty PCR są oczyszczane w celu usunięcia tła poliklonalnego pochodzącego z normalnych komórek B w próbce CLL, a także dimerów starterów, które mogą prowadzić do nieoptymalnego sekwencjonowania. Użyj dowolnej metody, która usuwa niewbudowane dNTP i startery do czyszczenia PCR, takiej jak zabieg enzymatyczny, np. Sap (fosfataza alkaliczna krewetek)/Exo (egzonukleaza I) lub oczyszczanie kolumnowe.
   1. Załaduj całkowitą objętość produktu PCR na 3% niskotopliwy żel agarozowy.
   2. Pozwól produktom PCR spływać po żelu, aż oddzielą się od tła.
   3. Wyciąć ostre, wydatne prążki PCR, oczyścić i wymyć. W przypadku wykrycia dwóch rearanżacji, oba prążki powinny zostać wycięte i zsekwencjonowane oddzielnie.
   4. Aby przeprowadzić oczyszczanie Sap/Exo, postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi konkretnych objętości, których należy użyć; jednak typowa reakcja może zawierać 1 μL Sap, 0,5 μL Exo i 2 μL 5x bufor inkubacyjny na 5-10 μL reakcji PCR. Wymieszać poprzez delikatne wirowanie każdej próbki i inkubować na bloku PCR w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Dezaktywować enzymy przez ogrzewanie do temperatury 85 °C przez 15 minut.
   5. Załaduj niewielką ilość produktów PCR na 3% żel agarozowy, aby ocenić czystość produktu.

5. Sekwencjonowanie Sangera

UWAGA: Istnieje kilka strategii sekwencjonowania, jednak niezależnie od dokładnego podejścia, bezpośrednie sekwencjonowanie obu pasm jest obowiązkowe, aby zapewnić wiarygodny wynik.

1. Ogólne protokoły sekwencjonowania
   1. Jeśli amplifikacja została przeprowadzona przy użyciu pojedynczych starterów, należy przystąpić do sekwencjonowania przy użyciu odpowiednich starterów IGHV i IGHJ lub starterów specyficznych dla stałego regionu. Podejście to można również przyjąć, jeśli użyto multipleksowanych starterów znakowanych fluorescencyjnie, a produkt PCR oceniono za pomocą analizy fragmentów (startery sekwencjonowania nie powinny być znakowane).
   2. Jeśli użyto starterów multipleksowanych, a klonalność oceniono na żelu, wówczas w pierwszym etapie sekwencjonowania należy użyć startera znajdującego się poniżej, np. startera IGHJ konsensusu o sekwencji 5'-GTGACCAGGGTNCCTTGGCCCCAG-3'. Alternatywnie można użyć startera CH, jeśli jako substrat użyto cDNA. Następnie użyj specyficznych dla podgrupy liderów IGHV lub starterów FR1 do drugiego etapu sekwencjonowania.
2. Przykładowy protokół sekwencjonowania
   UWAGA: Istnieje kilka protokołów sekwencjonowania, a przykładowy protokół jest szczegółowo opisany poniżej.
   1. Rozcieńczyć 33 ng produktu PCR w całkowitej objętości 11,5 μl, używając np. sterylnej wody. Denaturować produkt PCR przez ogrzewanie do temperatury 95 °C przez 5 minut. Natychmiast umieść na lodzie na 10 minut, aby zapobiec tworzeniu się struktur wtórnych.
   2. Dodać 8 μl mieszanki wzorcowej do każdej probówki wraz z 0,5 μl (odpowiadającym 5 pmol) startera.
   3. Jako kontrolę należy przygotować probówkę zawierającą 8 μl mieszanki wzorcowej, 0,5 μl matrycy kontrolnej pUC18, 2 μl (-)47 startera sekwencjonującego i 9,5 μl sterylnej wody. Ostateczna całkowita objętość w każdej probówce powinna wynosić 20 μl.
   4. Dla reakcji sekwencjonowania należy stosować warunki cykli termicznych, jak wyszczególniono w tabeli 4.
   5. Przygotować roztwór zatrzymujący, mieszając 2 μl octanu sodu 3M (pH 5,2), 2 μl EDTA 100 Mm (pH 8,0) i 1 μl glikogenu (stężenie 20 mg/ml), a następnie dodać 5 μl do każdej próbki. Przenieść produkt do nowej probówki do mikrowirówki.
   6. Dodaj 60 μl 100% etanolu (-20 °C) i delikatnie wymieszaj. Wirować z prędkością 14 000 obr./min przez 15 minut (4 °C). Odrzucić supernatant.
   7. Dodaj 100 μl 70% etanolu (-20 °C) i delikatnie wymieszaj. Wirować z prędkością 14 000 obr./min przez 10 minut (4 °C). Odrzucić supernatant. Powtórz raz.
   8. Suszyć granulki przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Dodać 40 μl roztworu dodecylosiarczanu sodu (SDS) do każdej próbki.
   9. Przenieść próbkę na płytkę sekwencjonującą, przykryć nasadkami paskowymi lub uszczelkami taśmowymi, załadować do maszyny i wykonać sekwencjonowanie Sangera. Płytka sekwencjonująca jest zwykle 96-dołkową płytką PCR z dnem w kształcie litery V, kompatybilną z sekwencerem. Tabliczki mogą być oznaczone kodami kreskowymi w zależności od tego, czy sekwencjonowanie ma być wykonane we własnym zakresie, w firmie komercyjnej czy w akademickim centrum/platformie sekwencjonowania.
3. Po sekwencjonowaniu "zszyj ze sobą" 2 odczyty wygenerowane z poszczególnych etapów sekwencjonowania, aby utworzyć kompletną rearanżację genu IGHV, tj. sekwencję konsensusu.

6. Analiza sekwencji

UWAGA: Poniższe sekcje skupiają się na wynikach uzyskanych z narzędzia IMGT/V-QUEST³⁰ podczas analizy przearanżowanych sekwencji IG oraz IMGT/JunctionAnalysis³¹, które są szczególnie istotne dla raportów klinicznych i badań naukowych. IMGT/V-QUEST to narzędzie do wyrównywania, które porównuje sekwencje IG przesłane przez użytkownika z katalogiem referencyjnym IMGT sets³⁰. Dane wyjściowe narzędzia zawierają kilka sekcji, w ramach których użytkownik może zdefiniować określone parametry.

1. Należy określić gatunek, np. Homo sapiens (człowiek) oraz typ receptora lub locus (np. IGH, IGK lub IGL).
2. Wklej sekwencje do analizy, w formacie FASTA i łącznie z nagłówkami, do obszaru tekstowego (w partiach do 50 sekwencji na przebieg). Alternatywnie dostępna jest opcja wprowadzenia ścieżki do pliku lokalnego zawierającego sekwencje FASA.
3. Wybierz jedną z następujących 3 opcji wyświetlania wyników:
   1. Widok szczegółowy: wybierz tę opcję, aby uzyskać wyniki dla każdej sekwencji z osobna.
   2. Widok syntezy: wybierz tę opcję, aby skompilować tabelę podsumowania uporządkowaną według nazwy genu i allelu IGHV lub według kolejności wprowadzania sekwencji. Ta opcja zapewnia również wyrównanie sekwencji, które w dowolnej przesłanej partii są przypisane do tego samego genu i allelu IGHV.
   3. Plik Excel: wybierz tę opcję, aby udostępnić wszystkie pliki wyjściowe jako arkusze kalkulacyjne połączone w jeden plik. Wszystkie opcje przeglądania mają duży wybór podstawowych i zaawansowanych parametrów do wyboru, jednak tylko czynniki najbardziej istotne dla analizy sekwencji IG CLL są omówione poniżej w sekcji "Reprezentatywne wyniki".

7. Narzędzie ARResT/AssignSubsets

1. Aby zbadać stereotypowość BcR IG w PBL (dodatkowe szczegóły podane poniżej w sekcji 'Reprezentatywne wyniki'), prześlij sekwencje IGHV-IGHD-IGHJ FASTA do narzędzia ARResT/AssignSubsets tool³². Narzędzie raportuje przypisanie do głównych podzbiorów stereotypowych CLL. Narzędzie do przypisywania podzbiorów wraz ze szczegółowymi instrukcjami jest dostępne na stronie ARResT/AssignSubset website^32, a także na stronie internetowej ERIC w zakładce usługi.

Wyniki

Przykłady podane poniżej ilustrują wyniki uzyskane z analizy sekwencjonowania genów IG zgodnie z krokami opisanymi powyżej. Chociaż ekstrakcja DNA i/lub RNA jest rutynową procedurą dla większości laboratoriów klinicznych/badawczych, pierwszym krytycznym krokiem jest sprawdzenie jakości/ilości gDNA i/lub RNA za pomocą spektrofotometru lub innej odpowiedniej technologii o wysokiej czułości. Kolejnym kluczowym krokiem jest amplifikacja PCR klonotypowego genu IGHV-IGHD-IGHJ. Jak wspomniano powyżej, tylko zastosowanie starterów liderowych IGHV umożliwia amplifikację pełnej długości przegrupowanej sekwencji genu IGHV, co pozwala na określenie rzeczywistego obciążenia SHM; w związku z tym, startery liderujące IGHV są zalecanym wyborem starterów (Rysunek 2). W rzadkich przypadkach, gdy startery liderowe IGHV nie mogą wzmocnić klonotypowego przegrupowania IG, można zastosować startery IGHV FR1. Jak wykazano w Rysunek 3, można zaobserwować kilka produktów/prążków PCR, zwłaszcza gdy materiałem wyjściowym jest gDNA; Pasma te należy wyciąć i zsekwencjonować oddzielnie. Jeśli zarówno startery IGHV leader, jak i IGHV FR1 nie dają wyników, analizę należy powtórzyć przy użyciu nowej próbki pacjenta (jeśli to możliwe). Ostatnim punktem kontrolnym przed sekwencjonowaniem jest określenie klonalności próbki za pomocą analizy fragmentów (Rysunek 4).

Uzyskane sekwencje powinny być analizowane za pomocą narzędzia IMGT/V-QUEST ³⁰. Parametry wybrane przez użytkownika obejmują gatunek, typ receptora lub locus, opcję wyszukiwania insercji i delecji itp. i są wymienione wraz z liczbą analizowanych sekwencji. Każda sekwencja FASTA jest wyświetlana, a V-DOMAIN analizowana przez IMGT/V-QUEST jest podświetlona na zielono. Dodatkowo, jeśli sekwencja wejściowa była w przeciwnej orientacji (antysens), program automatycznie dostarcza komplementarną sekwencję odwrotną i stwierdza to powyżej sekwencji FASA.

Tabela podsumowująca wyniki znajduje się bezpośrednio pod sekwencją FASTA, na górze strony wyników 'Szczegółowego widoku' i zawiera informacje ważne dla klinicznego raportowania analizy sekwencji genu IG w CLL. Każdy wiersz tej tabeli jest wyjaśniony poniżej.

Podsumowanie wyników. Pierwszy wiersz w tabeli wyników określa funkcjonalność sekwencji wejściowej: sekwencja przegrupowana IG może być zarówno produktywna, jak i nieproduktywna (Rysunek 5A i 5B). Rearanżacja genu IG jest nieproduktywna, jeśli kodony stop są obecne w regionie V-D-J (dla VH) lub w regionie V-J (dla VL) i/lub jeśli przegrupowanie jest poza ramką z powodu insercji/delecji. Trzecie wyjście jest dostarczane, gdy nie można określić funkcjonalności, tj. jeśli nie można zidentyfikować złącza IGHV-IGHD-IGHJ; w takim przypadku podsumowanie wyników będzie brzmiało następująco: "Nie znaleziono przegrupowania" lub "Nie znaleziono skrzyżowania". Ważne jest, aby pamiętać, że tylko produktywne, a tym samym funkcjonalne przegrupowania powinny być dalej analizowane. Jeżeli jedyna amplifikowana rearanżacja IG nie jest funkcjonalna (nieproduktywna lub "nie stwierdzono przegrupowania"), należy powtórzyć proces amplifikacji PCR. Jeśli wynik pozostaje negatywny, należy pobrać nową próbkę pacjenta.

V-GENE i allel. Wiersz "V-GENE i allel" wskazuje najbliższy gen i allel IGHV linii zarodkowej wraz z jego wynikiem dopasowania i procentową identycznością. Jeśli kilka genów i alleli daje ten sam wysoki wynik, wszystkie są wymienione. Procentowa identyczność między przesłaną sekwencją a najbliższym genem i allelem IGHV ma szczególne znaczenie, ponieważ określa status SHM. Wartość ta jest obliczana od pierwszego nukleotydu REGIONU V do końca 3' REGIONU V, z wyłączeniem CDR3. W przypadku stosowania starterów IGHV FR1 należy zawsze usuwać sekwencję odpowiadającą sekwencji startera, aby zapewnić jak najdokładniejszy wynik. Należy zauważyć, że niski procent tożsamości (<85%) może wynikać z wstawienia lub usunięcia (omówionego poniżej), a w takim przypadku w wierszu "Podsumowanie wyników" pojawi się komunikat "Ostrzeżenie", aby ostrzec użytkownika.

J-GENE i allel. Jak opisano dla genu V i allelu powyżej, wiersz "J-GENE i allel" wskazuje najbliższy gen i allel IGHJ linii zarodkowej wraz z jego wynikiem dopasowania i procentową tożsamością. Ponieważ jednak gen IGHJ jest dość krótki, a jego koniec 5' mógł zostać przycięty z powodu aktywności egzonukleazy, narzędzie poszukuje również alternatywnych opcji, w oparciu o największą liczbę kolejnych identycznych nukleotydów.

D-GENE i allel według IMGT/JunctionAnalysis. "D-GENE i allel według IMGT/JunctionAnalysis" wskazuje najbliższy gen i allel IGHD linii zarodkowej z ramką odczytu D-REGION zidentyfikowaną przez narzędzie w sekwencji użytkownika. IMGT/JunctionAnalysis³¹ zapewnia szczegółową i dokładną analizę skrzyżowania i został zintegrowany z interfejsem narzędzia IMGT/V-QUEST. Narzędzie to zarządza wszystkimi aspektami trudności związanymi z identyfikacją genu IGHD i alleli, tj. (i) krótką długością D-REGION; (ii) użycie 2 lub nawet 3 ramek odczytu; (iii) przycinanie egzonukleazy na obu końcach genu; oraz (iv) obecność mutacji.

Długości FR-IMGT, długości CDR-IMGT i ZŁĄCZE AA. Ten wiersz przedstawia długość IGHV FR i CDR pokazanych w nawiasach i oddzielonych kropkami i złączem aminokwasowym (AA). Sekwencja AA złącza ilustruje (i) przegrupowanie w ramce lub poza ramką (pozycje poza ramką są oznaczone znakiem "#"), (ii) obecność lub brak kodonów stop (kodon stop jest oznaczony gwiazdką "*") oraz (iii) obecność lub brak kotwic VH CDR3-IMGT: C (2nd-CYS 104) i W (J-TRP 118).

Hipermutacje somatyczne składają się głównie ze zmian pojedynczych nukleotydów, jednak można zaobserwować małe insercje i delecje w regionie V, choć z dużo mniejszą częstotliwością³³. W przypadku korzystania z domyślnych parametrów IMGT/V-QUEST wstawienia i usunięcia nie są automatycznie wykrywane; jednak silne przesłanki, że sekwencja może przenosić takie zmiany, tj. niski procent identyczności i/lub różne długości IGHV CDR1-IMGT i CDR2-IMGT między przesłaną sekwencją użytkownika a najbliższym genem i allelem linii zarodkowej, są wykrywane przez narzędzie, a pod tabelą podsumowującą wyniki pojawia się ostrzeżenie (Rysunek 5C).

IMGT udostępnia opcję o nazwie 'Szukaj wstawień i usunięć' w sekcji 'Zaawansowane parametry', znajdującej się poniżej sekcji 'Wyświetl wyniki'. W przypadkach, gdy pojawią się odpowiednie ostrzeżenia, zaleca się skorzystanie z tej funkcjonalności. W przypadku wykrycia wstawienia i usunięcia, w sekcji "Podsumowanie wyników" podaje się szczegółowe informacje na temat wyniku, w tym (i) miejsce, w którym następuje wstawienie lub usunięcie, tj. VH FR-IMGT lub CDR-IMGT; (ii) liczbę wstawionych/usuniętych nukleotydów; (iii) sekwencję (tylko w przypadku wstawiań); (iv) czy nastąpiło przesunięcie ramki; (v) kodon V-REGION, od którego rozpoczyna się insercja lub delecja; oraz (vi) dotkniętą pozycją nukleotydów w dostarczonej sekwencji (Rysunek 5D). W przypadku wstawień narzędzie usuwa wstawienie (wstawienia) z przesłanej sekwencji użytkownika, a następnie ponownie analizuje sekwencję przy użyciu standardowych parametrów IMGT/V-QUEST. Jeśli zostaną wykryte delecje, narzędzie dodaje przerwy, reprezentowane przez kropki, aby zastąpić usunięte nukleotydy przed powtórzeniem analizy.

Jak dla każdego testu diagnostycznego lub prognostycznego wykonywanego w laboratoriach klinicznych, najważniejsze są rygorystyczne standardy i wysoki poziom odtwarzalności. Wyniki IMGT/V-QUEST dostarczają wielu informacji niezbędnych do przedstawienia wyników analizy sekwencji genów IG w CLL, tj. (i) wykorzystanych genów i alleli IGHV, IGHD i IGHJ; (ii) funkcjonalność klonotypowego przegrupowania genu IGHV-IGHD-IGHJ, tj. czy przegrupowanie jest produktywne czy nieproduktywne; oraz (iii) procentową identyczność przegrupowanego genu i allelu IGHV w porównaniu z najbliższym genem i allelem IGHV linii zarodkowej. Aby uzyskać szczegółowe informacje na temat klinicznego raportowania genów IG w PBL, interpretacji problematycznych lub technicznie trudnych przypadków oraz zaleceń dotyczących dokładnego i solidnego określenia statusu SHM genu IGHV w CLL, czytelnik jest kierowany do ostatnio zaktualizowanych wytycznych i raportów ERIC^27,34.

Na koniec, dzięki naszej rosnącej wiedzy na temat stereotypii BcR IG w CLL, dodatkowym zalecanym wymogiem dla klinicznego raportowania rearanżacji genu IG w PBL jest przypisywanie przypadków do głównych podzbiorów stereotypowych. Obecnie zaleca się stwierdzenie w raporcie klinicznym, czy analizowaną produktywną rearanżację genu IGHV można przypisać do jednego z głównych stereotypowych podzbiorów, a mianowicie podzbiorów #1, #2, #4 lub #8^12,27. Przypisanie do głównych podzbiorów stereotypowych CLL powinno być wykonane za pomocą narzędzia ARResT/AssignSubsets (Rysunek 6)³².

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: ) ) powiedział: powiedział:

Podkłady 5' IGHV FR1	Sekwencja podkładowa		Ilość na 60 μL mieszanki gruntującej
IGHV1	CAGGTGCTGGTGCAGTCTGG		10
IGHV2	CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG		10
IGHV3	GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG		10
IGHV4	CAGGTGCTGCAGGAGTCGGG		10
Zobacz materiał IGHV5	GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC		10
Przekaźnik IGHV6	CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG		10
Podkłady liderowe IGHV 5'
IGHV1L	AAATCGATACCATGGACTGGACCTGGAGG		5
IGHV1bL (Przekaźnik IGHV1bL)	AAATCGATACCACCATGGACTGGACCTGGAG(C/A)		5
IGHV2aL	AAATCGATACCATGGACACACTTTGCT(A/C)AC		5
IGHV2bL (Biblioteka IGHV2bL)	AAATCGATACCACCATGGACATACTTTGTTCCAC		5
IGHV3aL	AAATCGATACCACCACCATGGAGTTTGGGCTGAGC		5
IGHV3bL (Przekaźnik IGHV3bL)	AAATCGATACCACCACCACCATGGA(A/G)(C/T)T(G/T)(G/T)G(G/A)CT(G/C/T)(A/C/T)GC		5
IGHV4L	AAATCGATACCATGAAACACCTGTGGTTCTT		10
IGHV5L (Przekaźnik IGHV5L	AAATCGATACCATGGGGTCAACCGCCATC		10
IGHV6L (Przekaźnik IGHV6L	AAATCGATACCACCATGTCTCTCTCCTTTC		10
Podkłady IGHJ 3'
IGHJ1-2	TGAGGAGACGGTGACCAGGGCC		20
IGHJ3	TGAAGAGACGGTGACCATTGTCCC		10
Zobacz materiał IGHJ4-5	TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC		20
Zobacz materiał IGHJ6	TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCC		10

Tabela 1. Sekwencje i ilości starterów do amplifikacji klonotypowego genu IGHV-IGHD-IGHJ metodą PCR.

pkt. pkt.

Odczynnik	Objętość (μL)
Bufor RB x 10	5
MgCl2 (50 mM)	3
dNTP (10 mΜ)	cyfra arabska
Mieszanka gruntująca IGHV lider/FR1 (10 μM)	3
Mieszanka gruntująca IGHJ (10 μM)	3
H2O	31,5
Całkowita objętość	47,5

Tabela 2. Odczynniki do amplifikacji klonotypowego genu IGHV-IGHD-IGHJ metodą PCR.

temperatura	czas trwania	Numer cyklu	opis
94 °C	5 minut	1	Aktywacja polimerazy
94 °C	1 minuta	39	denaturacja
59 °C	1 minuta		Wyżarzanie
72 °C	1,5 minuty		rozszerzenie
72 °C	10 minut	1	Końcowe przedłużenie
18 °C	∞	1	konserwacja

Tabela 3. Warunki cykli termicznych dla amplifikacji klonotypowego genu IGHV-IGHD-IGHJ metodą PCR.

temperatura	czas trwania	Numer cyklu	opis
94 °C	5 minut	1	Aktywacja polimerazy
96 °C	20 sekund	30	denaturacja
50 °C	20 sekund		Wyżarzanie
60 °C	4 minuty		rozszerzenie
4 °C	∞	1	konserwacja

Tabela 4. Warunki cykli termicznych dla reakcji sekwencjonowania genu IG.

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie rearanżacji genu IGHV-IGHD-IGHJ ze wskazaniem różnych miejsc wyżarzania starterów. 5' Startery IGHV wyżarzają się do sekwencji prowadzącej, która znajduje się przed sekwencją kodującą IGHV. Startery 5' IGHV (FR) wyżarzają się do początku regionu FR1, który znajduje się w obrębie przegrupowanego genu IGHV, podczas gdy startery 3' IGHJ wyżarzają się do końca przegrupowanego genu IGHJ. UTR: nieprzetłumaczony region. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Amplifikacja PCR rearanżacji genu IGHV-IGHD-IGHJ w 7 próbkach pacjentów przy użyciu starterów lidera 5' IGHV. Ósmy pas reprezentuje kontrolę dodatnią, podczas gdy kontrola ujemna dla PCR została załadowana do dziewiątego pasa. Oczekiwany produkt PCR ma wielkość około 500 par zasad przy użyciu starterów liderowych IGHV. Gwiazdka w ostatniej kolumnie żelu wskazuje drabinę DNA 100 pz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3. Amplifikacja PCR rearanżacji genu IGHV-IGHD-IGHJ w 13 próbkach pacjentów przy użyciu starterów IGHV FR1. Czternasty pas zawiera kontrolę dodatnią, podczas gdy kontrola ujemna została załadowana do piętnastego pasa. Jak wykazano na torze 2, dla którego materiał wyjściowy był DNA, obserwuje się kilka prążków PCR, które należy wyciąć i zsekwencjonować oddzielnie. Próbki na torach 5, 7 i 13 dały wyniki poliklonalne (potwierdzone rozmazem w żelu), a zatem etap PCR należy powtórzyć. Jeśli drugi PCR nie zdoła amplifikować przegrupowanego genu (genów) IG, analizę należy przeprowadzić na nowej próbce (jeśli to możliwe) lub przy użyciu innego zestawu starterów. Oczekiwany produkt PCR ma wielkość około 350 par zasad przy użyciu mieszanin starterów IGHV FR1. Gwiazdka w ostatniej kolumnie żelu wskazuje drabinę DNA 100 pz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4. Ocena klonalności za pomocą analizy genów. W analizie genów produkty monoklonalnej reakcji PCR powodują powstawanie dominującego piku produktów fluorescencyjnych o identycznej wielkości (górny panel), podczas gdy produkty poliklonalnej reakcji PCR powodują bardziej normalny rozkład rozmiarów produktów (dolny panel). Czerwone ślady to piki ze znakowanej fluorescencyjnie drabinki DNA, która jest ładowana w tym samym zastrzyku kapilarnym, co analizowana próbka. Fragmenty o standardowej wielkości są poddawane takiej samej sile elektroforetycznej jak próbka i dlatego są poddawane tym samym warunkom wtrysku. Równomierne rozmieszczenie fragmentów o standardowym rozmiarze potwierdza precyzyjne wywoływanie rozmiarów. Niebieskie ślady reprezentują monoklonalny (górny panel) lub poliklonalny (dolny panel) charakter próbek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5. Przykłady tabel podsumowujących wyniki dostarczane przez IMGT/V-QUEST. (A) Tabela podsumowująca wyniki dla produktywnej rearanżacji genu IGHV-IGHD-IGHJ (brak kodonów stop i złącze sekwencji w ramce). V-GENE i allel oraz J-GENE i allel zidentyfikowane w sekwencji użytkownika przez IMGT/V-QUEST w tym przypadku to IGHV4-34*01 i IGHJ6*02 (na podstawie najwyższej oceny wyniku dopasowania). Procent identyczności wynosi 99,65% z powodu pojedynczej mutacji somatycznej. Gen D i allel zidentyfikowany przez IMGT/JunctionAnalysis to IGHD3-3*01 w ramce odczytu 1. W nawiasach podano długości 4 regionów ramowych (FR) oraz 3 regionów określających komplementarność (CDR). Podano również sekwencję aminokwasów (AA) złącza IGHV-D-J. W tym przykładzie skrzyżowanie składało się z 22 AA. (B) Tabela podsumowująca wyniki dla sekwencji rearanżacji genu IGHV-IGHD-IGHJ, która jest nieproduktywna z powodu połączenia poza ramką. X dla długości CDR3-IMGT oznacza, że dla tej sekwencji nie można było określić długości. Znaki "#" obserwowane w sekwencji złącza AA wskazują na przesunięcie ramki. (C) Tabela podsumowująca wyniki ostrzegająca o niskiej tożsamości V-REGION (60,94%) i wskazująca, że należy użyć opcji "wstawienia i usunięcia" w sekcji "Parametry zaawansowane". (D) Tabela podsumowująca wyniki dla przypadku z niskim procentem identyczności linii zarodkowej zilustrowana w (C) po powtórzeniu analizy sekwencji przy użyciu opcji "Wyszukaj insercje i delecje". Prawidłowy procent tożsamości jest wyświetlany w nawiasach kwadratowych i jest obliczany z uwzględnieniem insercji jako pojedynczego zdarzenia mutacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6. Tabela raportów przypisania podzbiorów wygenerowana przez narzędzie ARResT/AssignSubsets. Sekwencje FASTA IG od 10 pacjentów z PBL (A1-A10) przesłano do narzędzia ARResT/AssignSubsets. Przypadek A4 został przypisany do stereotypowej podgrupy PBL #2 (pacjenci w tej grupie są znani ze złego rokowania niezależnie od obciążenia SHM) z dużą pewnością. Siedem pozostałych przypadków/sekwencji nie zostało przypisanych do głównego stereotypowego podzbioru i dlatego zostało sklasyfikowanych jako nieprzypisane. Dwie z przesłanych sekwencji (A7 i A8) nie mogły być użyte do przypisania podzbioru i zamiast tego zostały sklasyfikowane jako pominięte/w złej kondycji z powodu problemów z sekwencją, tj. z powodu złącza poza ramką lub obecności kodonów stop. Wyczerpujące wyjaśnienie nagłówków tabel i narzędzia jest dostępne na stronie internetowej ARResT/AssignSubsets ³². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Badanie genów IG w PBL było niezbędne nie tylko dla lepszego zrozumienia patobiologii choroby, ale także dla poprawy stratyfikacji ryzyka dla pacjentów. Dlatego tak ważne jest, aby wieloetapowa procedura analizy sekwencji genów IG i późniejsza interpretacja danych sekwencji była przeprowadzana w ustandaryzowany sposób. Dostępność odpowiedniego i wystarczającego materiału pacjenta oraz czas pobierania próbek nie powinny mieć wpływu na zdolność do przeprowadzenia analizy mutacji genu IG, ponieważ badanie można przeprowadzić na PB i na dowolnej próbce z dużą liczbą komórek nowotworowych PBL. Rozdzielanie komórek jednojądrzastych krwi przy użyciu metod rozdzielania gradientowego jest rutynowo wykonywane w laboratoriach diagnostycznych i jak zawsze, należy zachować ostrożność podczas dodawania roztworu krwi/RPMI do probówki zawierającej gradient; Zadanie to powinno być wykonywane powoli, delikatnie, aby uniknąć zakłócenia gradientu i zapobiec utracie komórek.

Po oddzieleniu komórek ekstrahuje się kwasy nukleinowe. Zarówno gDNA, jak i cDNA nadają się do analizy SHM klonotypowego przegrupowania IGH, jednak istnieją zalety i wady stosowania obu materiałów. Przebieg pracy w laboratorium przebiega szybciej przy użyciu gDNA, ponieważ przed amplifikacją PCR nie trzeba wykonywać odwrotnej transkrypcji. To powiedziawszy, użycie gDNA jako substratu do PCR może skutkować amplifikacją zarówno produktywnych, jak i nieproduktywnych rearanżacji, co z kolei może prowadzić do dodatkowej praktycznej pracy laboratoryjnej, tj. oczyszczania lub wycinania żelu z wielu produktów PCR i indywidualnego sekwencjonowania wszystkich przegrupowań. Porównując podejścia gDNA i cDNA, w przypadku tych ostatnich należy wykonać etap odwrotnej transkrypcji przed przystąpieniem do amplifikacji PCR. Jednak w tym przypadku, w większości przypadków, tylko produktywne przegrupowania IG zostaną wzmocnione, a następnie zsekwencjonowane. W ten sposób tylko jeden produkt PCR zostanie oczyszczony i zsekwencjonowany, a interpretacja wyników będzie prostsza.

Skuteczność amplifikacji w dużej mierze zależy od jakości gDNA/cDNA, którą należy ocenić za pomocą czułej metody kwantyfikacji, oraz od zastosowanych starterów. Zastosowane startery mają kluczowe znaczenie dla całej procedury analitycznej, ponieważ dokładne określenie poziomu SHM można osiągnąć tylko poprzez amplifikację całej sekwencji przegrupowanego genu IGHV. Całkowite przegrupowanie można ocenić tylko wtedy, gdy stosuje się 5' startery liderowe IGHV, co uzasadnia niedawne zalecenia ERIC dotyczące stosowania starterów liderowych²⁷. Stosowanie alternatywnych starterów, prowadzących do amplifikacji niekompletnych rearanżacji genów IGHV-IGHD-IGHJ, nie jest odpowiednie do analizy mutacji genu IGHV i dlatego zdecydowanie się je odradza. Jedyny wyjątek dotyczy przypadków, które wielokrotnie dają wynik ujemny, gdy stosowane są startery lidera IGHV, a analiza nowego materiału pacjenta nie jest możliwa lub również nie daje wyników. Jeśli użycie innej próbki i/lub materiału pacjenta (gDNA/cDNA) i różnych zestawów starterów nadal nie pozwala na wytworzenie produktu PCR, możliwymi przyczynami mogą być zbyt niskie obciążenie komórek nowotworowych lub to, że limfocytoza nie jest spowodowana klonem PBL (w takim przypadku immunofenotyp powinien zostać ponownie oceniony). Startery użyte do analizy powinny być zawsze podane w raporcie klinicznym.

Ponieważ PBL wynika z akumulacji monoklonalnych limfocytów B posiadających tę samą rearanżację genu IGHV-IGHD-IGHJ, w zdecydowanej większości przypadków ocena klonalności ujawni unikalny pik monoklonalny, tj . pojedynczy klon. W rzadkich przypadkach można zaobserwować podwójne przegrupowania, a nawet wzorce oligoklonalne³⁵. W takich przypadkach elektroforeza żelowa nie jest preferowaną techniką oceny klonalności i należy zastosować bardziej czułe metody, takie jak analiza fragmentów. Po potwierdzeniu klonalności ostatnim etapem przed sekwencjonowaniem jest oczyszczanie produktu PCR w celu zapewnienia uzyskania sekwencji o wysokiej jakości. Wreszcie, narzędzie IMGT/V-QUEST jest zasobem zalecanym do analizy sekwencji IG przez ERIC. Ponieważ bazy danych IMGT są stale aktualizowane, a wyniki są raportowane w sposób spójny i dobrze opisany, narzędzie to zapewnia ustandaryzowaną analizę i ułatwia analizę porównawczą między różnymi placówkami klinicznymi lub akademickimi.

Ponieważ analiza immunogenetyczna w PBL ma implikacje prognostyczne i w szczególności predykcyjne, solidna analiza rearanżacji genu IGHV-IGHD-IGHJ, w tym przypisanie do głównych podgrup stereotypowych PBL, jest już nie tylko pożądana, ale ma kluczowe znaczenie. Jest to szczególnie widoczne w erze nowatorskich terapii i potencjału, jaki analiza genów IG ma w podejmowaniu decyzji dotyczących leczenia 5,21,22,23,36,37,38, jak oficjalnie wskazano w niedawnej aktualizacji wytycznych sponsorowanych przez NCI z Międzynarodowych Warsztatów na temat CLL²⁴. To powiedziawszy, rygorystyczne standardy są uzasadnione, zwłaszcza, że określenie statusu SHM klonotypowego przegrupowanego genu IGHV u pacjentów z PBL nie jest sprawą trywialną i obejmuje wieloetapowy proces. Co ważne, niektóre etapy eksperymentalne, w szczególności wybór starterów, dają lepsze wyniki, gdy przestrzegane są określone opcje i/lub podejścia, inne aspekty techniczne, takie jak wybór materiału lub metoda oceny klonalności, są podatne na pewien stopień elastyczności, ze względu na fakt, że prowadzą do subtelnych różnic, jeśli takie istnieją, w odniesieniu do wyników końcowych.

W ciągu ostatniej dekady ERIC dążył do promowania standaryzacji i harmonizacji różnych metod związanych z diagnostyką i prognozowaniem PBL. Znajduje to odzwierciedlenie w opublikowanych zaleceniach i wytycznych dotyczących analizy immunogenetycznej^27,34, licznych zorganizowanych warsztatach i wydarzeniach edukacyjnych, ustanowieniu sieci IG, a także eksperckiego forum internetowego do dyskusji i udzielania wskazówek dotyczących interpretacji sekwencji genów IG w PBL. Ogólnym celem ERIC poprzez te działania jest promowanie optymalnego zarządzania klinicznego i opieki nad pacjentem. Pomimo intensywnych wysiłków, zadanie to jest dalekie od ukończenia, a w rzeczywistości stało się bardziej złożone ze względu na opracowanie nowatorskiego sekwencjonowania wysokoprzepustowego mającego na celu profilowanie immunologiczne. Niemniej jednak, mimo że wyzwania nadal istnieją, intensywne wysiłki na rzecz solidnej standaryzacji analizy genów IG w PBL są kontynuowane i są obecnie przedmiotem bieżących działań w ramach ERIC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BD Vacutainer Plastikowe probówki do pobierania krwi z K2EDTA: Korek do probówki	ThermoFisher scientific	02-689-4	przechowywanie materiału
BD Vacutainer CPT Probówka do przygotowania komórek jednojądrzastych - Heparyna sodowa	Becton Dickinson	362753	przechowywanie materiału
BD Vacutainer Heparyna Probówki do pobierania krwi FAQ	Daigger Scientific	366480	magazyn materiałów
UltraPure 0.5 M EDTA pH 8,0	Invitrogen	15575038	przetwarzanie komórek
Probówki wirówkowe 15 ml CS500	Corning	352096	przetwarzanie komórek
Probówki wirówkowe PP 50 ml CS500	Corning	352070	przetwarzanie komórek
RPMI Medium 1640 (1X) płyn	Invitrogen	21875-091	przetwarzanie komórek
Ficoll-Paque PLUS, 6 x 100 mL	STEMCELL Technologie	17-1440-02	Przetwarzanie komórek
Pipety serologiczne 5 ml	Sarstedt	861,253,001	przetwarzanie komórek
Pipety serologiczne 10 ml	Sarstedt	861,254,001	przetwarzanie komórek
Pipety serologiczne 25 ml	Sarstedt	861,685,001	przetwarzanie komórek
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco (D-PBS) (1X)	Invitrogen	14190250	przetwarzanie komórek
Płytka Neubauera	Marienfeld-Superior	640010	Przetwarzanie komórek
Rozwiązanie Tuerk	Sigma-Aldrich	93770	Przetwarzanie komórek
PureLink Genomic DNA Mini Kit	Invitrogen	K1820-01	Ekstrakcja DNA
QIAamp RNA Blood Mini Kit	Qiagen	52304	Ekstrakcja RNA
AllPrep DNA/RNA Mini Kit	Qiagen	80204	Ekstrakcja DNA/RNA
5X bufor pierwszej nici	Invitrogen	P/N Y02321	synteza cDNA
Startery losowe, 20 i mikro; g	Promega	C1181	Synteza cDNA
RNaseOUT& handel; Rekombinowany inhibitor rybonukleazy	Invitrogen	10777019	synteza cDNA
DTT	Invitrogen	P/N Y00147	synteza cDNA
SuperScript II odwrotna transkryptaza	Invitrogen	18064-014	synteza cDNA
10 mM dNTP Mix	Invitrogen	18427013	synteza cDNA,
PCR PCR Bufor	Invitrogen	O00065	PCR
MgCl2 (chlorek magnezu) (25 mM)	ThermoFisher scientific	AB0359	PCR
Taq DNA Polimeraza, rekombinowany	Invitrogen	10342-020
PCR Applied Biosystems 5′ Znakowane startery	ThermoFisher naukowa-PCR		/Ocena klonalności
Zestaw DNA Agilent o wysokiej czułości	Agilent Technologies	5067-4626	Kwantyfikacja produktu PCR
Bufor UltraPure TBE, 10X	ThermoFisher 15581044 naukowa		elektroforeza żelowa
UltraPure Ethidium Bromde, 10 mg/ml	15585011	ThermoFisher	elektroforeza
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher scientific	S33102	elektroforeza żelowa
10X BlueJuice Gel Loading Buffer	Invitrogen	16500100	żel elektroforeza
DNA Ladder 1000 bp/1 kb NIEBIESKI gotowy do użycia	Geneon	305-105	elektroforeza żelowa
UltraPure Agaroza	ThermoFisher scientific	16500500	żel elektroforeza
Agaroza niska temperatura żelowania	Sigma-Aldrich	A9414-250G	Elektroforeza żelowa
Żele Novex TBE, 10%, 10-dołkowa	ThermoFisher naukowa	EC6275BOX	elektroforeza żelowa
ExoSAP-IT PCR Odczynnik do czyszczenia produktu ThermoFisher	scientific	78201.1.mL	PCR
Zestaw do ekstrakcji żelu QIAquick (50)	Qiagen	28704	Czyszczenie produktu PCR
Zestaw szybkiego startu GenomeLab DTCS Beckman	Coulter	608120	Sekwencjonowanie Sangera
Roztwór octanu sodu (3 M), pH 5,2	ThermoFisher scientific	R1181	Sekwencjonowanie Sangera
Glikogen, klasa biologii molekularnej	ThermoFisher scientific	R0561	Sekwencjonowanie Sangera
Etanol absolutny	EMD Millipore	1024282500	Sekwencjonowanie Sangera
Probówka SafeSeal 1,5 ml	Sarstedt	72,706	ogólnego zastosowania
Kubek Multiply-Pro 0,2 ml, PP	Sarstedt	72,737,002	ogólnego zastosowania
Sprzęt do wirówek
Wyposażenie			PCR
Bioanalizator	Sprzęt Agilent Technologies