Artykuł metodologiczny

Manipulowanie żywymi komórkami w celu zbudowania stabilnego zespołu komórkowego 3D bez sztucznego rusztowania

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57815

⸱

26 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Faculty of Life and Medical Sciences, Doshisha University, 2The Institute of Genetics and Animal Breeding, Polish Academy of Sciences

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Pokazujemy nowatorską metodę konstruowania jednokomórkowego trójwymiarowego (3D) montażu bez sztucznego rusztowania.

Streszczenie

Medycyna regeneracyjna i inżynieria tkankowa oferują wiele zalet w leczeniu trudnych do opanowania chorób, a kilka badań wykazało znaczenie trójwymiarowych (3D) zespołów komórkowych w tych dziedzinach. Sztuczne rusztowania były często używane do budowy zespołów komórkowych 3D. Jednak rusztowania używane do budowy zespołów komórkowych są czasami toksyczne i mogą zmieniać właściwości komórek. W związku z tym korzystne byłoby ustanowienie nietoksycznej metody ułatwiającej kontakt komórka-komórka. W tym artykule przedstawiono nowatorską metodę konstruowania stabilnych zespołów komórkowych za pomocą pęsety optycznej z dekstranem. Jedną z zalet tej metody jest to, że w ciągu kilku minut nawiązuje stabilny kontakt między komórkami. Ta nowa metoda pozwala na konstruowanie trójwymiarowych zespołów komórkowych w naturalnym hydrofilowym polimerze i oczekuje się, że będzie przydatna do konstruowania jednokomórkowych zespołów 3D nowej generacji w dziedzinie medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej.

Wprowadzenie

Podczas gdy ludzkie tkanki składają się z kilku zespołów komórek i mogą pomóc w utrzymaniu homeostazy organizmu, pojedyncze komórki same w sobie również odgrywają ważną rolę poprzez interakcję między komórkami. Dlatego ważne jest, aby wyjaśnić, w jaki sposób pojedyncze komórki mogą być stymulowane przez sygnały zewnętrzne i w jaki sposób przekazują takie sygnały innym przylegającym komórkom. W tym celu ustalono kilka metod budowy jednokomórkowych zespołów 3-wymiarowych (3D) opartych na jednej komórce1,2,3,4,5,6,7,8. Jednak materiały używane do budowy zespołów komórkowych można jeszcze ulepszyć. Na przykład syntetyczne żele i polimery, w tym glikol polietylenowy (PEG), mają pewne chemiczne właściwości fizykochemiczne i mogą wpływać na komórki docelowe (np. toksyczność).

Niedawno opisaliśmy nowy system, który może generować jednokomórkowy zestaw komórek 3D za pomocą dekstranu (DEX) poprzez ustanowienie stabilnego kontaktu komórka-komórka9. Uznaliśmy, że technologia ta może być przydatna w kilku dziedzinach badań, w tym w medycynie regeneracyjnej, a nawet biologii nowotworów. W tym raporcie opisujemy, w jaki sposób manipulujemy pojedynczymi komórkami i konstruujemy trójwymiarowe (3D) zespoły komórkowe w obecności różnych hydrofilowych biomakrocząsteczek, w tym DEX, bez sztucznego rusztowania.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

  1. Utrzymuj mysie komórki nabłonka gruczołu sutkowego NAMRU (komórki NMuMG) z 5 ml D-MEM zawierającym 10% (v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v) penicyliny-streptomycyny (P / S) w kolbie o długości25 cm 3. Usuń zmodyfikowaną pożywkę Eagle's (D-MEM) firmy Dulbecco, zawierającą 10% FBS i 1% P/S.
  2. Dodać 3-5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (-) o temperaturze 37 °C do kolby. Należy pamiętać, że pH PBS wynosi 7,1-7,3.
  3. Usunąć cały PBS z kolby za pomocą aspiratora.
  4. Dodać 1,5 ml trypsyny o temperaturze 37 °C (0,25% m/v) do kolby.
  5. Inkubować kolbę przez około 1-2 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 .
  6. Dodać 3,5 ml D-MEM zawierającego 10% FBS i 1% P/S do kolby. Odpipetować do mieszania.
  7. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirowywać przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że promień obrotu i prędkość obrotowa wirówki wynoszą odpowiednio 16,6 cm i 1500 obr./min. W tym stanie względna siła odśrodkowa wynosi 417 x g.
  8. Dodać 5 ml świeżego D-MEM (10% FBS i 1% P/S) do kolby po zassaniu pożywki (w razie potrzeby kriokonserwować komórki roztworem do krioprezerwacji, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta).

2. Przygotowanie dekstranu (DEX)

  1. Przygotować 80 mg/ml roztworu DEX, mieszając 10 ml D-MEM (10% FBS, 1% P/S) i 0,8 g DEX. Należy pamiętać, że roztwór DEX można przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego (0,22 μm) po odpowiednim czasie hodowli komórek.
  2. Przygotować zawiesinę komórkową zawierającą 40 mg/ml pożywki DEX przez zmieszanie 200 μl roztworu DEX i 200 μl zawiesiny komórek przygotowanej w 2.1. Należy zauważyć, że gęstość liczbowa komórek w roztworze wynosi około 2,3×105 komórek/ml.

3. Przygotowanie do pracy z laserem i mikroskopią

  1. Włącz laser (fala ciągła, długość fali 1,064 nm) (Rysunek 1a). Należy pamiętać, że użycie wiązki laserowej o długości fali w zakresie od czerwieni do bliskiej podczerwieni jest najbardziej skuteczne; Ten obszar długości fali nazywany jest oknem diagnostyczno-terapeutycznym10, ponieważ jest minimalnie absorbowany przez komórki.
  2. Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania.
  3. Kliknij dwukrotnie ikony (1) kamery, (2) diody elektroluminescencyjnej (LED), (3) regulacji ostrości i (4) ruchomego stage. Na wyświetlaczach odpowiadających (1)-(4) pojawi się (Rysunek 1b).

4. Manipulacja komórkami za pomocą laserowego systemu pułapkowania

  1. Umieścić 20 μl próbki przygotowanej w kroku 2.2 na dolnej szklance pokrywowej (grubość 0,17 mm, rozmiar = 30 mm × 40 mm) i przykryć ją górnym szkłem nakrywkowym (grubość 0,17 mm, wielkość = 18 mm × 18 mm), z separacją zapewnioną przez dwie przekładki (grubość 0,17 mm, wielkość = 10 mm × 24 mm), jak pokazano w Rysunek 2. Należy pamiętać, że te okulary nie wymagają specjalnej powłoki.
  2. Umieścić celę próbki przygotowaną w kroku 4.1 na dolnej soczewce obiektywu (zanurzenie w wodzie ok. 10 μl, powiększenie = 60X, odległość robocza = 0,28 mm, apertura numeryczna = 1,2)).
  3. Zamocuj górną soczewkę obiektywu (zanurzenie w wodzie o wielkości ok. 10 μl, powiększenie = 60X, odległość robocza = 2 mm, apertura numeryczna = 1,0) w górnej części celi próbki.
  4. Włącz światło LED, klikając ikonę 2 (Rysunek 1b).
  5. Dostosuj odległość między próbką a dolną soczewką obiektywu, klikając ikony na panelu 3 (Rysunek 1b), aż znajdzie się w ostrości.
  6. Naświetlić wiązki laserowe w pozycji 1 i pozycji 2 (Rysunek 1B) próbki, klikając ikony I, II i III (Rysunek 1b).
  7. Ustaw intensywność każdej wiązki laserowej na 1 500 mW, wprowadzając tę wartość w ikonie IV (Rysunek 1b).
  8. Przesuń etap próbki, klikając ikonę 4 wskazującą kierunki (Rysunek 1b), aż komórka zostanie uwięziona w pozycji 1 (Rysunek 1b).
  9. Przeciągnij kursor wskazujący pozycję 2 (Rysunek 1b), aż inna komórka zostanie uwięziona w pozycji 2.

5. Budowa trójwymiarowej (3D) struktury komórkowej

  1. Manipuluj pojedynczą komórką tak, aby stykała się z inną komórką. Utrzymuj ten stan przez 300 s; Oznacza to, że każda komórka jest naświetlana laserem przez 300 s.
  2. Zapisz oś X-Y pokazaną w Rysunek 1b.
  3. Skonstruuj dowolny zespół komórek 2D, łapiąc i transportując inną komórkę do komórek.
  4. Zbuduj zespół komórkowy 3D, przesuwając stół montażowy w górę i w dół.
  5. Upewnij się, że zespół pozostaje stabilny po wyłączeniu lasera.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia mikroskop oraz oprogramowanie wykorzystane w niniejszym badaniu. Rysunek 2 jest schematyczną prezentacją procedury nanoszenia roztworu próbki zawierającego komórki. Rysunek 3 demonstruje tworzenie struktury piramidalnej przy użyciu dwowiązkowych pęset optycznych. W przypadku powodzenia eksperymentu, te agregaty komórkowe pozostają stabilne nawet po wyłączeniu lasera.

System ultradźwiękowy (a) i oprogramowanie analityczne (b) do śledzenia pozycji w badaniu obrazowania medycznego.
Rycina 1: (a) System sterowania dla systemu pułapkowania laserowego (NanoTracker2 (11)). System jest aktywowany poprzez włączenie przełącznika lasera zgodnie z krokami ①-③. (b) Oprogramowanie do sterowania systemem pułapkowania laserowego. Kamera, oświetlenie LED, regulacja ostrości oraz ruchoma platforma są aktywowane poprzez kliknięcie odpowiednio ikon ①, ②, ③ i ④. Obraz mikroskopowy jest wyświetlany w panelu 1. Sterowanie włączaniem/wyłączaniem oświetlenia LED znajduje się w panelu 2. Ostrość jest regulowana w panelu 3. Wiązki laserowe są emitowane w pozycjach 1 i 2 poprzez kliknięcie ikon od I do IV. Szczegóły dotyczące tego systemu pułapkowania laserowego podano w Ref. (12). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces przygotowania preparatu do mikroskopii; schemat przedstawia montaż i konfigurację obrazowania do analizy.
Rycina 2: Reprezentatywny schemat rozmieszczenia szkiełka przedmiotowego. 20 µL próbki (zawiesina komórek zawierająca dekstran) jest nanoszona na szkiełko i wykorzystywana do manipulacji laserowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Struktura komórkowa; schemat porównania modeli molekularnych; mikroskopia; analiza biologii komórki.
Rysunek 3: a) Zespoły komórek nabłonkowych (NMuMG) o zamierzonym kształcie w medium z DEX (40 mg/mL): jako przykład klastra 3D przedstawiono piramidę. b) Przedstawiono również schematyczny rysunek piramidowego zespołu komórkowego 3D. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Niniejsze badanie pokazuje konkretne zastosowanie naszych ostatnich raportów 9,11 na temat wykorzystania rozpuszczalnych polimerów do budowy jednokomórkowych zespołów 3D. Takie zespoły są stabilnie formowane w roztworze masowym, gdy liczba komórek wynosi do 10 i mogą być utrzymywane przez pojedynczą wiązkę laserową. Zespoły wytrącają się na powierzchni szkła, gdy jest więcej niż 10 komórek. Chociaż eksperymenty są wciąż w początkowej fazie, spodziewamy się, że nowatorska metodologia może być potężnym narzędziem do budowy jednokomórkowych zespołów 3D nowej generacji, które są niezbędne do postępu w dziedzinie biologii komórki i medycyny regeneracyjnej.

W roztworze niezawierającym polimeru komórki odpychają się nawzajem z powodu odpychania elektrostatycznego wynikającego z ładunku powierzchniowego, siły odpychania hydratacji, efektu odpychania glikokaliksu i falowania błony. Nasze poprzednie badanie wykazało, że pary komórek mogą być stabilne przez długi czas, gdy komórki są traktowane PEG. Co ważniejsze, udany transport pary komórek do regionu bez PEG, po tym, jak komórki były utrzymywane w kontakcie przez 5 minut w PEG, sugeruje, że kontakt komórkowy jest utrzymywany w stabilny sposób. Jest to dobrze wyjaśnione w kategoriach efektu wyczerpania11 i zasadniczo ten sam mechanizm dotyczy zestawów komórkowych generowanych za pomocą DEX9. Nasze obecne wyniki sugerują, że inne rodzaje naturalnych makrocząsteczek mogą być również wykorzystane do budowy stabilnych zestawów komórkowych 3D.

Dla szybkiego transportu komórek ważne jest stężenie polimeru. Ogólnie rzecz biorąc, lepkość roztworu drastycznie wzrasta, gdy polimer rozpuszcza się powyżej stężenia nakładającego się. W tym stanie trudno jest manipulować komórkami za pomocą pęsety optycznej. W związku z tym doświadczenie należy przeprowadzić poniżej stężenia nakładającego się. Dla roztworu DEX stężenie nakładające się wynosi ok. 50 mg/ml (lepkość kinetyczna wynosi 5,5 mm2/s). Jak pokazano w Ref. 9, zaobserwowano stabilny zespół komórkowy, gdy stężenie DEX wynosiło od 10 mg / ml do 40 mg / mL. Wynik ten sugeruje, że efekt zubożenia jest wystarczająco duży, aby utrzymać stabilny kontakt komórka-komórka, nawet gdy stężenie DEX jest niższe niż stężenie nakładające się. Wykazano, że dodatek DEX nie wpływa na żywotność komórek do 40 mg/ml 9.

Opracowanie metody budowy zespołów komórkowych 3D jest ważne w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, ponieważ naśladowanie mikrośrodowiska komórkowego in vivo poprzez strukturyzację pojedynczych komórek może ułatwić tworzenie tkanek pochodzących z komórek macierzystych. Do tej pory używaliśmy obecnego protokołu do konstruowania zestawów komórkowych przy użyciu komórek Neuro2A9 oprócz komórek NMuMG. Mamy nadzieję, że uda nam się ustalić eksperymentalną metodologię konstruowania trójwymiarowych zespołów komórkowych większej liczby komórek o różnej morfologii. System pęset optycznych opracowany przez Ichikawę i wsp.13 miałoby zastosowanie do tego celu, ponieważ orientacja komórek może być kontrolowana. Dalsze badania w tym kierunku powinny być obiecujące.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Shu Hashimoto, Aoi Yoshida i Taeko Ohta z Uniwersytetu Doshisha za ich hojną pomoc przy przygotowaniu eksperymentu. Prace te były wspierane przez KAKENHI (15H02121, 15K05400, 25103012, 50587441) oraz przez Program Wspierany przez MEXT dla Fundacji Badań Strategicznych na Uniwersytetach Prywatnych. Badania te były również wspierane przez polski grant Konsorcjum Naukowego KNOW (Leading National Research Centre) "Zdrowe Zwierzę – Bezpieczna Żywność", decyzja Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego nr 05-1/KNOW2/2015.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Mikroskop IX71OlympusIX71
Dextran(200 000; klasa biologii molekularnej)WakoCAS.NO  9004-54-0
System pułapkowania laserowego (NanoTracker 2)JPK InstrumentsS/N T-05-0200
Górna soczewka obiektywuOlympusLUMPLFLN60XW
Dolna soczewka obiektywowaOlympusUPLSAPO60XW
Szkło pokrywy górnejMATUNAMIC022401
Szkło osłonowe pośrednie (dystans)MATUNAMI-wykonanena zamówienie (rozmiar = 10mm&razy; 10 mm, grubość = 0,17 mm)
Dolna pokrywa szklanaMATUNAMIC030401
KameraŹródło obrazowaniaDFK 31AF03
OprogramowanieJPK InstrumentsNanoTracker2 Oprogramowanie
PFM Komórki NMuMG RIKEN BRCRCB2868
PBSWako166-23555
Bankier komórkowyNippon Zenyaku KogyoZR621
D-MEMWako Pure Chem. Ind., Japonia044-29765
FBSCell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japonia172012-500ML
TrypsinThermo Fisher Scientific25200056
Penicylina-StreptomycynaWako Pure Chem. Ind., Japonia161-23181

Bibliografia

  1. Aloysious, N., Nair, P. D. Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study. Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).
  2. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  3. Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Scientific Reports. 5, 8577(2015).
  4. Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel. ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).
  5. Liu, Z. Q., et al. Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation. Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).
  6. McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells. World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).
  7. Sadovska, L., et al. A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).
  8. Srinivasan, P. P., et al. Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).
  9. Yoshida, A., et al. Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold. Polymers. 9, 319(2017).
  10. Anderson, R. R., Parrish, J. A. Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation. Science. 220, 524-527 (1983).
  11. Hashimoto, S., et al. Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer. Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).
  12. Rauch, P., Jähnke, T. Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments. Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).
  13. Ichikawa, M., et al. Tilt control in optical tweezers. Journal of Biomedical Optics. 13, 010503(2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Pincety optyczneroztwór dekstranuzawiesina komórkowatrójwymiarowy montaż komórkowykontakt międzykomórkowypolimer hydrofilowymanipulacja laserowaukład mikroskopowypułapkowanie komórekmontaż bezrusztowiowy
Manipulowanie żywymi komórkami w celu zbudowania stabilnego zespołu komórkowego 3D bez sztucznego rusztowania
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.