Manipulowanie żywymi komórkami w celu zbudowania stabilnego zespołu komórkowego 3D bez sztucznego rusztowania

Podsumowanie

Pokazujemy nowatorską metodę konstruowania jednokomórkowego trójwymiarowego (3D) montażu bez sztucznego rusztowania.

Streszczenie

Medycyna regeneracyjna i inżynieria tkankowa oferują wiele zalet w leczeniu trudnych do opanowania chorób, a kilka badań wykazało znaczenie trójwymiarowych (3D) zespołów komórkowych w tych dziedzinach. Sztuczne rusztowania były często używane do budowy zespołów komórkowych 3D. Jednak rusztowania używane do budowy zespołów komórkowych są czasami toksyczne i mogą zmieniać właściwości komórek. W związku z tym korzystne byłoby ustanowienie nietoksycznej metody ułatwiającej kontakt komórka-komórka. W tym artykule przedstawiono nowatorską metodę konstruowania stabilnych zespołów komórkowych za pomocą pęsety optycznej z dekstranem. Jedną z zalet tej metody jest to, że w ciągu kilku minut nawiązuje stabilny kontakt między komórkami. Ta nowa metoda pozwala na konstruowanie trójwymiarowych zespołów komórkowych w naturalnym hydrofilowym polimerze i oczekuje się, że będzie przydatna do konstruowania jednokomórkowych zespołów 3D nowej generacji w dziedzinie medycyny regeneracyjnej i inżynierii tkankowej.

Wprowadzenie

Podczas gdy ludzkie tkanki składają się z kilku zespołów komórek i mogą pomóc w utrzymaniu homeostazy organizmu, pojedyncze komórki same w sobie również odgrywają ważną rolę poprzez interakcję między komórkami. Dlatego ważne jest, aby wyjaśnić, w jaki sposób pojedyncze komórki mogą być stymulowane przez sygnały zewnętrzne i w jaki sposób przekazują takie sygnały innym przylegającym komórkom. W tym celu ustalono kilka metod budowy jednokomórkowych zespołów 3-wymiarowych (3D) opartych na jednej komórce^1,2,3,4,5^,6,7^,8. Jednak materiały używane do budowy zespołów komórkowych można jeszcze ulepszyć. Na przykład syntetyczne żele i polimery, w tym glikol polietylenowy (PEG), mają pewne chemiczne właściwości fizykochemiczne i mogą wpływać na komórki docelowe (np. toksyczność).

Niedawno opisaliśmy nowy system, który może generować jednokomórkowy zestaw komórek 3D za pomocą dekstranu (DEX) poprzez ustanowienie stabilnego kontaktu komórka-komórka⁹. Uznaliśmy, że technologia ta może być przydatna w kilku dziedzinach badań, w tym w medycynie regeneracyjnej, a nawet biologii nowotworów. W tym raporcie opisujemy, w jaki sposób manipulujemy pojedynczymi komórkami i konstruujemy trójwymiarowe (3D) zespoły komórkowe w obecności różnych hydrofilowych biomakrocząsteczek, w tym DEX, bez sztucznego rusztowania.

Protokół

1. Przygotowanie komórek

1. Utrzymuj mysie komórki nabłonka gruczołu sutkowego NAMRU (komórki NMuMG) z 5 ml D-MEM zawierającym 10% (v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% (v) penicyliny-streptomycyny (P / S) w kolbie o długości^{25 cm 3}. Usuń zmodyfikowaną pożywkę Eagle's (D-MEM) firmy Dulbecco, zawierającą 10% FBS i 1% P/S.
2. Dodać 3-5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (-) o temperaturze 37 °C do kolby. Należy pamiętać, że pH PBS wynosi 7,1-7,3.
3. Usunąć cały PBS z kolby za pomocą aspiratora.
4. Dodać 1,5 ml trypsyny o temperaturze 37 °C (0,25% m/v) do kolby.
5. Inkubować kolbę przez około 1-2 minuty w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO₂ .
6. Dodać 3,5 ml D-MEM zawierającego 10% FBS i 1% P/S do kolby. Odpipetować do mieszania.
7. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirowywać przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Należy pamiętać, że promień obrotu i prędkość obrotowa wirówki wynoszą odpowiednio 16,6 cm i 1500 obr./min. W tym stanie względna siła odśrodkowa wynosi 417 x g.
8. Dodać 5 ml świeżego D-MEM (10% FBS i 1% P/S) do kolby po zassaniu pożywki (w razie potrzeby kriokonserwować komórki roztworem do krioprezerwacji, postępując zgodnie ze wskazówkami producenta).

2. Przygotowanie dekstranu (DEX)

1. Przygotować 80 mg/ml roztworu DEX, mieszając 10 ml D-MEM (10% FBS, 1% P/S) i 0,8 g DEX. Należy pamiętać, że roztwór DEX można przefiltrować za pomocą filtra strzykawkowego (0,22 μm) po odpowiednim czasie hodowli komórek.
2. Przygotować zawiesinę komórkową zawierającą 40 mg/ml pożywki DEX przez zmieszanie 200 μl roztworu DEX i 200 μl zawiesiny komórek przygotowanej w 2.1. Należy zauważyć, że gęstość liczbowa komórek w roztworze wynosi około 2,3×10⁵ komórek/ml.

3. Przygotowanie do pracy z laserem i mikroskopią

1. Włącz laser (fala ciągła, długość fali 1,064 nm) (Rysunek 1a). Należy pamiętać, że użycie wiązki laserowej o długości fali w zakresie od czerwieni do bliskiej podczerwieni jest najbardziej skuteczne; Ten obszar długości fali nazywany jest oknem diagnostyczno-terapeutycznym10, ponieważ jest minimalnie absorbowany przez komórki.
2. Kliknij dwukrotnie ikonę oprogramowania.
3. Kliknij dwukrotnie ikony (1) kamery, (2) diody elektroluminescencyjnej (LED), (3) regulacji ostrości i (4) ruchomego stage. Na wyświetlaczach odpowiadających (1)-(4) pojawi się (Rysunek 1b).

4. Manipulacja komórkami za pomocą laserowego systemu pułapkowania

1. Umieścić 20 μl próbki przygotowanej w kroku 2.2 na dolnej szklance pokrywowej (grubość 0,17 mm, rozmiar = 30 mm × 40 mm) i przykryć ją górnym szkłem nakrywkowym (grubość 0,17 mm, wielkość = 18 mm × 18 mm), z separacją zapewnioną przez dwie przekładki (grubość 0,17 mm, wielkość = 10 mm × 24 mm), jak pokazano w Rysunek 2. Należy pamiętać, że te okulary nie wymagają specjalnej powłoki.
2. Umieścić celę próbki przygotowaną w kroku 4.1 na dolnej soczewce obiektywu (zanurzenie w wodzie ok. 10 μl, powiększenie = 60X, odległość robocza = 0,28 mm, apertura numeryczna = 1,2)).
3. Zamocuj górną soczewkę obiektywu (zanurzenie w wodzie o wielkości ok. 10 μl, powiększenie = 60X, odległość robocza = 2 mm, apertura numeryczna = 1,0) w górnej części celi próbki.
4. Włącz światło LED, klikając ikonę 2 (Rysunek 1b).
5. Dostosuj odległość między próbką a dolną soczewką obiektywu, klikając ikony na panelu 3 (Rysunek 1b), aż znajdzie się w ostrości.
6. Naświetlić wiązki laserowe w pozycji 1 i pozycji 2 (Rysunek 1B) próbki, klikając ikony I, II i III (Rysunek 1b).
7. Ustaw intensywność każdej wiązki laserowej na 1 500 mW, wprowadzając tę wartość w ikonie IV (Rysunek 1b).
8. Przesuń etap próbki, klikając ikonę 4 wskazującą kierunki (Rysunek 1b), aż komórka zostanie uwięziona w pozycji 1 (Rysunek 1b).
9. Przeciągnij kursor wskazujący pozycję 2 (Rysunek 1b), aż inna komórka zostanie uwięziona w pozycji 2.

5. Budowa trójwymiarowej (3D) struktury komórkowej

1. Manipuluj pojedynczą komórką tak, aby stykała się z inną komórką. Utrzymuj ten stan przez 300 s; Oznacza to, że każda komórka jest naświetlana laserem przez 300 s.
2. Zapisz oś X-Y pokazaną w Rysunek 1b.
3. Skonstruuj dowolny zespół komórek 2D, łapiąc i transportując inną komórkę do komórek.
4. Zbuduj zespół komórkowy 3D, przesuwając stół montażowy w górę i w dół.
5. Upewnij się, że zespół pozostaje stabilny po wyłączeniu lasera.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia mikroskop i oprogramowanie użyte w tym badaniu. Rysunek 2 jest schematycznym przedstawieniem procedury umieszczania roztworu próbki zawierającego komórki. Rysunek 3 pokazuje tworzenie struktury piramidy za pomocą pęsety optycznej o podwójnej wiązce. Jeśli eksperyment się powiedzie, te zespoły komórkowe pozostają stabilne nawet po wyłączeniu lasera.

Rysunek 1: (a) System sterowania systemem pułapek laserowych (NanoTracker2 (11)). System jest aktywowany przez włączenie przełącznika laserowego w krokach (1)-(3). b) Oprogramowanie do sterowania systemem pułapkowania laserowego. Kamera, światło LED, regulacja ostrości i ruchomy stage są aktywowane przez kliknięcie ikon odpowiednio (1), (2), (3) i (4). Obraz mikroskopowy zostanie wyświetlony w panelu 1. Element sterujący włączaniem/wyłączaniem diody LED znajduje się w panelu 2. Ostrość jest kontrolowana w panelu 3. Wiązki laserowe są naświetlane w pozycjach 1 i 2 poprzez kliknięcie ikon od I do IV. Szczegółowe informacje na temat tego systemu pułapkowania laserowego znajdują się w ref. (12). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Reprezentatywny schemat rozmieszczenia szkła przesuwnego. 20 μl próbki (zawiesina komórek zawierająca dekstran) umieszcza się na szkiełku podstawowym i wykorzystuje do manipulacji laserowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: a) Zespoły komórek nabłonkowych (NMuMG) o zamierzonym kształcie w pożywce z DEX (40 mg/mL): piramida jest pokazana jako przykład klastra 3D. b) Pokazany jest również schematyczny rysunek zespołu komórkowego 3D w kształcie piramidy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Niniejsze badanie pokazuje konkretne zastosowanie naszych ostatnich raportów ^9,11 na temat wykorzystania rozpuszczalnych polimerów do budowy jednokomórkowych zespołów 3D. Takie zespoły są stabilnie formowane w roztworze masowym, gdy liczba komórek wynosi do 10 i mogą być utrzymywane przez pojedynczą wiązkę laserową. Zespoły wytrącają się na powierzchni szkła, gdy jest więcej niż 10 komórek. Chociaż eksperymenty są wciąż w początkowej fazie, spodziewamy się, że nowatorska metodologia może być potężnym narzędziem do budowy jednokomórkowych zespołów 3D nowej generacji, które są niezbędne do postępu w dziedzinie biologii komórki i medycyny regeneracyjnej.

W roztworze niezawierającym polimeru komórki odpychają się nawzajem z powodu odpychania elektrostatycznego wynikającego z ładunku powierzchniowego, siły odpychania hydratacji, efektu odpychania glikokaliksu i falowania błony. Nasze poprzednie badanie wykazało, że pary komórek mogą być stabilne przez długi czas, gdy komórki są traktowane PEG. Co ważniejsze, udany transport pary komórek do regionu bez PEG, po tym, jak komórki były utrzymywane w kontakcie przez 5 minut w PEG, sugeruje, że kontakt komórkowy jest utrzymywany w stabilny sposób. Jest to dobrze wyjaśnione w kategoriach efektu wyczerpania¹¹ i zasadniczo ten sam mechanizm dotyczy zestawów komórkowych generowanych za pomocą DEX⁹. Nasze obecne wyniki sugerują, że inne rodzaje naturalnych makrocząsteczek mogą być również wykorzystane do budowy stabilnych zestawów komórkowych 3D.

Dla szybkiego transportu komórek ważne jest stężenie polimeru. Ogólnie rzecz biorąc, lepkość roztworu drastycznie wzrasta, gdy polimer rozpuszcza się powyżej stężenia nakładającego się. W tym stanie trudno jest manipulować komórkami za pomocą pęsety optycznej. W związku z tym doświadczenie należy przeprowadzić poniżej stężenia nakładającego się. Dla roztworu DEX stężenie nakładające się wynosi ok. 50 mg/ml (lepkość kinetyczna wynosi 5,5 mm²/s). Jak pokazano w Ref. 9, zaobserwowano stabilny zespół komórkowy, gdy stężenie DEX wynosiło od 10 mg / ml do 40 mg / mL. Wynik ten sugeruje, że efekt zubożenia jest wystarczająco duży, aby utrzymać stabilny kontakt komórka-komórka, nawet gdy stężenie DEX jest niższe niż stężenie nakładające się. Wykazano, że dodatek DEX nie wpływa na żywotność komórek do 40 mg/ml ⁹.

Opracowanie metody budowy zespołów komórkowych 3D jest ważne w dziedzinie medycyny regeneracyjnej, ponieważ naśladowanie mikrośrodowiska komórkowego in vivo poprzez strukturyzację pojedynczych komórek może ułatwić tworzenie tkanek pochodzących z komórek macierzystych. Do tej pory używaliśmy obecnego protokołu do konstruowania zestawów komórkowych przy użyciu komórek Neuro2A⁹ oprócz komórek NMuMG. Mamy nadzieję, że uda nam się ustalić eksperymentalną metodologię konstruowania trójwymiarowych zespołów komórkowych większej liczby komórek o różnej morfologii. System pęset optycznych opracowany przez Ichikawę i wsp.¹³ miałoby zastosowanie do tego celu, ponieważ orientacja komórek może być kontrolowana. Dalsze badania w tym kierunku powinny być obiecujące.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Mikroskop IX71	Olympus	IX71
Dextran(200 000; klasa biologii molekularnej)	Wako	CAS.NO  9004-54-0
System pułapkowania laserowego (NanoTracker 2)	JPK Instruments	S/N T-05-0200
Górna soczewka obiektywu	Olympus	LUMPLFLN60XW
Dolna soczewka obiektywowa	Olympus	UPLSAPO60XW
Szkło pokrywy górnej	MATUNAMI	C022401
Szkło osłonowe pośrednie (dystans)	MATUNAMI-wykonane		na zamówienie (rozmiar = 10mm&razy; 10 mm, grubość = 0,17 mm)
Dolna pokrywa szklana	MATUNAMI	C030401
Kamera	Źródło obrazowania	DFK 31AF03
Oprogramowanie	JPK Instruments	NanoTracker2 Oprogramowanie
PFM Komórki NMuMG	RIKEN BRC	RCB2868
PBS	Wako	166-23555
Bankier komórkowy	Nippon Zenyaku Kogyo	ZR621
D-MEM	Wako Pure Chem. Ind., Japonia	044-29765
FBS	Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japonia	172012-500ML
Trypsin	Thermo Fisher Scientific	25200056
Penicylina-Streptomycyna	Wako Pure Chem. Ind., Japonia	161-23181