Artykuł metodologiczny

In Situ Mikroskopia do określania w czasie rzeczywistym morfologii pojedynczych komórek w bioprocesach

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57823

⸱

5 grudnia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Chair of Bioprocess Engineering, Department of Biotechnology, Technische Universität Berlin, 2SOPAT GmbH

W tym artykule

Podsumowanie

Urządzenie do mikroskopii fotooptycznej in situ zostało opracowane do monitorowania wielkości pojedynczych komórek bezpośrednio w zawiesinie komórki. Pomiar w czasie rzeczywistym odbywa się poprzez sprzężenie sondy fotooptycznej z możliwością sterylizacji z automatyczną analizą obrazu. Zmiany morfologiczne pojawiają się w zależności od stanu wzrostu i warunków uprawy.

Streszczenie

Monitorowanie in situ w bioprocesach mikrobiologicznych ogranicza się głównie do właściwości chemicznych i fizycznych podłoża (np. wartości pH i stężenia tlenu rozpuszczonego). Niemniej jednak morfologia komórek może być odpowiednim wskaźnikiem optymalnych warunków, ponieważ zmienia się w zależności od stanu wzrostu, akumulacji produktu i stresu komórkowego. Co więcej, rozkład wielkości pojedynczych komórek dostarcza nie tylko informacji o warunkach uprawy, ale także o niejednorodności populacji. Aby uzyskać takie informacje, opracowano urządzenie do mikroskopii fotooptycznej in situ1, aby umożliwić monitorowanie rozkładu wielkości pojedynczej komórki bezpośrednio w zawiesinie komórek w bioreaktorach. Zautomatyzowana analiza obrazu jest sprzężona z mikroskopią opartą na modelu sieci neuronowej, który jest trenowany na obrazach z adnotacjami użytkownika. Kilka parametrów, które uzyskuje się na podstawie ujęć mikroskopu, jest skorelowanych z istotnymi cechami komórek w procesie, takimi jak ich aktywność metaboliczna. Do tej pory prezentowana seria sond mikroskopowych in situ była stosowana do pomiaru wielkości osadów w zawiesinach grzybów strzępkowych. Wykorzystano go do rozróżnienia wielkości pojedynczej komórki w hodowli mikroalg i powiązania jej z akumulacją lipidów. Kształt cząstek komórkowych był związany z pączkowaniem w kulturach drożdży. Analizę mikroskopową można ogólnie podzielić na trzy etapy: (i) akwizycja obrazu, (ii) identyfikacja cząstek oraz (iii) analiza danych. Wszystkie kroki muszą być dostosowane do organizmu, dlatego w celu uzyskania wiarygodnych wyników wymagane są określone informacje z adnotacjami. Możliwość monitorowania zmian w morfologii komórek bezpośrednio na linii lub w trybie on-line (w obejściu) umożliwia monitorowanie i kontrolowanie wartości w czasie rzeczywistym, zarówno w rozwoju procesu, jak i w skali produkcji. Jeśli dane off-line korelują z danymi w czasie rzeczywistym, obecne żmudne pomiary off-line z nieznanymi wpływami na rozmiar komórki stają się zbędne.

Wprowadzenie

Cechy morfologiczne komórek są często związane ze stanem fizjologicznym, związek między formą a funkcją istnieje dla wielu zastosowań. Na morfologię pojedynczej komórki ma wpływ stan wzrostu, wiek komórki, osmotyczne i inne potencjalne stresy komórkowe lub akumulacja produktu. Zmiany morfologiczne komórek są często miarą żywotności wzrostu kultury. Wewnątrzkomórkowa synteza produktów, akumulacja lipidów w algach i tworzenie ciał inkluzyjnych u bakterii są również związane z wielkością komórki. Kolejnym czynnikiem, który warto zbadać, może być aglomeracja komórek, jak podsumowano niedawno2.

Niejednorodność populacji może być określana ilościowo na podstawie cech morfologicznych poszczególnych komórek. Badania wykazały, że heterogeniczność w obrębie kultury może być znacząca, np. w warunkach produkcji na dużą skalę3 na ogólną wydajność subpopulacji może mieć wpływ niska wydajność subpopulacji4.

Zazwyczaj, ocena cech morfologicznych komórek jest wykonywana przez ręczne pobieranie próbek lub za pomocą komory przepływowej by-pass sprzężonej z urządzeniem fotooptycznym. Prowadzi to do kilku ograniczeń: ograniczona ilość pozyskanych danych z trudem zapewnia statystycznie wiarygodne pomiary; opóźnienie czasowe między pobraniem próbek a dostępnością wyników może być zbyt duże w porównaniu z dynamiką procesu; A co najważniejsze, procedura pobierania próbek (lokalizacja portu pobierania próbek, wstępna obróbka próbki przed pomiarem, niekorzystne warunki w probówce do pobierania próbek lub obejściu) może wywołać błąd tendencyjny, ponieważ sama procedura pobierania próbek może już wpływać na morfologię komórki. Wreszcie, zawsze istnieje wysokie ryzyko zanieczyszczenia podczas pobierania próbek lub w roztworach obejściowych, jeśli nie można ich sterylizować na miejscu.

Zastosowanie mikroskopii in situ (ISM) może obejść kilka z tych problemów. Jeśli komórki zostaną wykryte automatycznie, można przeprowadzić poprawną identyfikację ich cech morfologicznych5. Do tej pory głównymi ograniczeniami tej metody były (i) czas oceny obrazów, który był zbyt długi dla zastosowań in situ, oraz (ii) słaba rozdzielczość obrazów, zwłaszcza przy dużej gęstości komórek. Chociaż pierwsze rozwiązania ISM obejmowały mechaniczne pobieranie próbek, rozcieńczanie sondy lub były ograniczone do systemu obejściowego6,7, dalsze podejścia pozwalają na bezpośrednie przechwytywanie zawiesiny komórek8.

Ostatnie osiągnięcia w ISM pozwalają na monitorowanie komórek w trybie line lub on-line na podstawie pojedynczej komórki, co zapewnia rozkład parametrów morfologicznych w czasie rzeczywistym bezpośrednio w zawiesinach komórkowych przy znacznie wysokich stężeniach komórek. Dzięki analizom off-line kluczowych parametrów komórek można zidentyfikować korelacje z informacjami dostarczanymi przez sprzężoną automatyczną detekcję komórek i ISM. Następnie uzyskuje się nowe konstrukcje miękkich czujników, w których niemierzalny parametr jest szacowany na podstawie morfologii pojedynczej komórki.

W tym raporcie, ISM jest przeprowadzany poprzez sprzężenie sondy fotooptycznej z automatyczną analizą obrazu. Technologia ISM składa się z jednoprętowej sondy sensorycznej, która umożliwia rejestrowanie obrazów w znanym zakresie ostrości w regulowanej szczelinie pomiarowej za pomocą kamery CCD o wysokiej rozdzielczości [MM-Ho = CCD GT2750 (2750x2200) i MM 2.1 = CMOS G507c (2464x2056)]. Oświetlenie lampą błyskową odbywa się przez transmisję. W związku z tym światło pochodzi z przeciwnej strony kamery9 i jego intensywność można regulować. Komórki przechodzą w sposób ciągły przez tę szczelinę wraz ze strumieniem cieczy. W związku z tym uzyskuje się reprezentatywną populację próby. Sonda może być zamontowana bezpośrednio do bioreaktora tak, aby sięgała do zawiesiny ogniwa, lub może być używana w sterylizowalnym by-passie. Obudowa czujnika jest podłączona do systemu przed sterylizacją, części optyczne są następnie montowane w obudowie.

Do tej pory badano odpowiednie mikroorganizmy przemysłowe, np. grzyby strzępkowe (średnica do ponad 200 μm), heterotroficzne mikroalgi Crypthecodinium cohnii (średnia średnica komórki 20 μm) oraz drożdże Saccharomyces cerevisiae (średnia średnica komórki 5 μm), były badane za pomocą tego lub podobnych urządzeń, które są pokrótce opisane.

Grzyby strzępkowe mają tendencję do tworzenia granulek w określonych warunkach uprawy. Są one o wielkości do kilkuset μm. Strzępki komórek grzyba rozwijają różną długość w zależności od naprężenia hydrodynamicznego w fazie płynnej. Ma to wpływ na aktywność metaboliczną i wzrostową, pobieranie substratu i uwalnianie produktu. Zastosowano ISM w celu określenia rozkładu wielkości granulek i szerokości stref o mniejszej gęstości biomasy na krawędziach granulek (dane własne niepublikowane).

Wielkość C. cohnii zmienia się między 15 a 26 μm, gdy komórki gromadzą wielonienasycony kwas tłuszczowy kwas dokozaheksaenowy (DHA) pod wpływem ograniczenia azotu. Ten biotechnologiczny proces produkcji DHA składa się z dwóch części: fazy wzrostu, w której komórki dzielą się i stają się mniejsze, oraz fazy produkcji, w której komórki gromadzą produkt, a tym samym stają się większe. W związku z tym wielkość komórki wykorzystano do określenia stanu procesu, w którym korzystny był wzrost lub produkcja DHA. Ostatecznie stwierdzono korelację między wielkością komórki a zawartością DHA. W tym przypadku technologia ISM pozwala monitorować wewnątrzkomórkową akumulację DHA w czasie rzeczywistym bez konieczności pobierania próbek, rozbijania komórek i wspólnej analizy metodą chromatografii gazowej10.

Pączkujące drożdże zwykle mają wielkość od 3 do 8 μm. Odsetek komórek, które są w stanie dojrzewania w danym momencie, zgodnie z opisem wskaźnika pączkowania (BI), dostarcza informacji o żywotności wzrostu11,12, a nawet udowodniono związek z wydzielaniem rekombinowanego białka13. Za pomocą ISM wyróżniono pączkujące i niepączkujące komórki drożdży (komórki z pączkiem i bez)14. Warunki stresowe mogą również prowadzić do szerszego zróżnicowania wielkości komórek w populacji drożdży, jak ostatnio wykazano w uprawach na małą skalę, w których naśladowano warunki upraw na dużą skalę z ograniczoną ilością składników odżywczych i były naśladowane3.

Dlatego ISM ma potencjał do monitorowania wzrostu, żywotności i tworzenia produktu na poziomie pojedynczej komórki podczas wszystkich etapów bioprocesu w celu identyfikacji optymalnych warunków uprawy lub w celu kontroli procesu. Opisane tutaj metody koncentrują się na zastosowaniach mikrobiologicznych z pojedynczymi komórkami, ale mają również zastosowanie do większych cząstek, takich jak komórki ludzkie i zwierzęce, aglomeraty komórkowe i granulki organizmów nitkowatych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Następujące kroki są niezbędne do dostosowania parametrów do odpowiedniego mikroorganizmu i warunków hodowli. Dostosowanie ustawień sondy trwa około 20 min dla doświadczonego użytkownika. Szczegółowy opis narzędzi i kroków znajduje się w odpowiednim podręczniku obsługi sondy firmy SOPAT GmbH. Generalnie w poniższym protokole wymagane są następujące narzędzia: (i) Probe Controller do regulacji sondy i akwizycji obrazów; (ii) Fiji (ImageJ) do adnotacji na pozyskanych obrazach; (iii) SOPAT support do trenowania sztucznej sieci neuronowej (ANN) i tworzenia schematu pracy; (iv) Batcher do przetwarzania partii danych z wykorzystaniem wcześniej pozyskanych obrazów i schematu pracy; (v) Result Analyzer do wizualizacji i oceny wyników na obrazach przetworzonych w partiach; oraz (vi) Monitor do zautomatyzowanego pomiaru w czasie rzeczywistym i wizualizacji wyników.

1. Ustawianie parametrów sprzętowych

  1. Przygotować kulturę o najwyższym stężeniu komórek, jakie może zostać osiągnięte podczas eksperymentu, lub odwirować i resuspendować osad w celu uzyskania takiego stężenia. W tym przypadku dla hodowli S. cerevisiae wybrano stężenie suchej biomasy wynoszące 65 g L-1.
  2. Przygotować różne rozcieńczenia, od najwyższego do najniższego stężenia, tak aby w pełni pokryć oczekiwany zakres. Zaleca się zastosowanie minimum 4 różnych stężeń.
  3. Określić zakres wielkości komórek mikroorganizmu za pomocą konwencjonalnej mikroskopii. Zdefiniować oczekiwaną maksymalną średnicę (dmax) poszczególnych komórek. W przypadku S. cerevisiae wartość ta została ustalona na 8 µm.
  4. Wybrać dwie przerwy pomiarowe wynoszące odpowiednio 5x i 10x oczekiwanej dmax komórek.
  5. Wybrać maksymalną intensywność stroboskopu. Dla obu przerw dobrać intensywności stroboskopu przy najwyższym stężeniu komórek w taki sposób, aby komórki były nadal widoczne na obrazach o najniższej intensywności światła (najciemniejszych obrazach).
  6. Wybrać minimalną intensywność stroboskopu, a następnie dobrać intensywności stroboskopu dla obu przerw tak, aby komórki były nadal widoczne na obrazach o najwyższej intensywności światła (najjaśniejszych obrazach). Użyć najniższego stężenia komórek, które prawdopodobnie wystąpi w okresie pomiarowym.
  7. Wybrać jedną pozycję ogniskowania, która daje najostrzejsze obrazy dla każdej przerwy pomiarowej, dla obu intensywności stroboskopu oraz dla zakresu stężeń podlegających badaniu (szczegóły dotyczące ogniskowania patrz w kroku 2). Odpowiednio ustawić ostrość na komórkach, aby dane obrazowe mogły zostać później zannotowane (patrz krok 4).
  8. Zmierzyć wcześniej przygotowaną serię rozcieńczeń stężenia komórek (patrz krok 2), stosując obie szerokości przerw oraz obie intensywności stroboskopu.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Narzędzie do kalibracji stężenia. Lewy interfejs użytkownika (GUI): ustawienie katalogów obrazów (minimum 3) o znanych stężeniach; środkowy GUI: wybór cech do obliczenia w katalogu obrazów; prawy GUI: wybór ważonego błędu średniokwadratowego (WRMSE) w celu zidentyfikowania wartości minimalnej. WRMSE oraz najlepsza korelacja między dowolną cechą obrazu a stężeniem komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

  1. Oceń eksperyment z serii rozcieńczeń.
    1. Użyj narzędzia Concentration Calibration (CoCa) Tool (patrz Rysunek 1), aby określić optymalną korelację między wyodrębnionymi cechami obrazu (jasnością lub ostrością) a wcześniej zmierzonymi stężeniami podanymi przez użytkownika, np. suchą biomasą lub liczbą komórek. Dalsze szczegóły znajdują się w instrukcji oprogramowania.
    2. Określ optymalną korelację między informacjami wyodrębnionymi z cech obrazu przy różnych stężeniach a pomiarami off line. Patrz legenda Rysunku 1.
    3. Wybierz najbardziej odpowiedni odstęp pomiarowy oraz intensywności stroboskopu, biorąc pod uwagę krzywą korelacji stężenia z cechami, które dają najmniejszy ważony błąd średnio kwadratowy (WRMSE).
      UWAGA: Odstęp pomiarowy jest stały podczas eksperymentu, natomiast intensywność stroboskopu może być dostosowana do stężenia komórek.

2. Pomiar Off Line

  1. Za pomocą wzornika grubości ustaw pożądaną przerwę pomiarową zgodnie z krokiem 1.
  2. Otwórz graficzny interfejs użytkownika Kontrola sondy w panelu sterowania SOPAT.
  3. Podłącz wybraną sondę do wzmacniacza w podsekcji oprogramowania Działania i naciśnij Połącz.
  4. Naciśnij Odtwórz przycisk rozpoczęcia strumieniowania (Podgląd na żywo).
  5. Oczyść szczelinę pomiarową, rozpylając w niej etanol, a następnie ostrożnie usuń kurz i zanieczyszczenia za pomocą papieru optycznego. Sprawdź, czy szkło czujnika jest wolne od cząsteczek za pomocą Podgląd na żywo w CamControl.
    UWAGA: Cząstki i kurz zakłócają pomiary oraz automatyczną identyfikację komórek.
  6. Włóż suchy papier optyczny do szczeliny pomiarowej. Otwórz zakładkę Kontrola sondy następnie należy dostosować intensywność stroboskopu, aby umożliwić wizualizację papieru. Obracaj śrubę mocującą do momentu, aż pojedyncze włókna papieru staną się wyraźnie widoczne.
  7. Napełnić probówkę pożywką hodowlaną. Zanurzyć mikroskop w pożywce hodowlanej tak, aby szczelina została całkowicie pokryta zawiesiną komórkową. Otworzyć zawór. Kontrola sondy następnie należy dostosować pożądaną intensywność stroboskopu zgodnie z sekcją 1. Należy ustawić ostrość na komórkach, precyzyjnie regulując śrubę blokującą ostrość. W trakcie eksperymentu nie wolno już zmieniać ustawień ostrości.
    UWAGA: Do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml dodaje się 5–6 ml pożywki hodowlanej, aby odpowiednio wypełnić przestrzeń pomiarową.
  8. Zdefiniuj liczbę klatek na punkt czasowy [-] w menu interfejsu użytkownika Wyzwalanie w interfejsie graficznym użytkownika Liczba klatek na wyzwalaczUstaw liczbę klatek na 200 klatek na wyzwalanie.
    UWAGA: Liczbę pól widzenia można zredukować do najniższej wartości niezbędnej do uzyskania statystycznie wiarygodnego wyniku. Zależy to od wielkości próby wymaganej do otrzymania reprezentatywnego rozkładu morfologicznej wielkości komórek (patrz również krok 5).
  9. Zdefiniuj częstotliwość odświeżania klatek [Hz] w menu Wyzwalanie w interfejsie graficznym użytkownika Częstotliwość klatekWybierz częstotliwość klatek, która zagwarantuje, że ruchome cząsteczki z poprzedniej klatki nie pojawią się w następnej.
    UWAGA: Można to zweryfikować za pomocą testowego wyzwalacza z 200 klatkami. Należy sprawdzić obrazy pod kątem obecności cząstek, które są rejestrowane wielokrotnie. W takim przypadku należy zmniejszyć częstotliwość klatek. Dla offline do pomiarów zaleca się częstotliwość 1 Hz.
  10. W menu należy ustawić katalog, w którym zapisywane będą pozyskane obrazy. Ogólne.
  11. Przeprowadź akwizycję obrazu poprzez aktywację Uruchom akwizycję wyzwalacza obrazu przycisk. Delikatnie poruszaj probówką z zawiesiną hodowlaną w górę i w dół, aby wywołać przepływ przez szczelinę pomiarową.
  12. Powtórz krok 2.5 po każdym pomiarze.
  13. Sprawdź pozyskane obrazy. Komórki muszą być wystarczająco ostre, aby umożliwić ich adnotację. Przejrzyj obrazy pod kątem obecności cząsteczek, które są rejestrowane wielokrotnie. W takim przypadku należy zmniejszyć częstotliwość próbkowania klatek.
  14. Zapisz ustawienia, wybierając następującą ścieżkę: C:\Program Files\SOPAT GmbH\monitoringPrograms\camcontrol, a następnie naciśnij Zapisz.

3. Identyfikacja cząsteczek

  1. Wykonaj adnotację cząstek do trenowania sztucznej sieci neuronowej (ANN) (zbiór treningowy).
    1. Wczytaj pozyskane obrazy do narzędzia adnotacyjnego „Fiji, ImageJ”, przeciągając i upuszczając plik do głównego okna „ImageJ” (patrz: interfejs narzędzia „Fiji” na Rysunku 2)
    2. Otwórz menedżera ROI, wybierając: Analyze | Tools | ROI Manager.
    3. Wybierz narzędzie zaznaczania. Zaleca się stosowanie narzędzia Wand (tracing) tool, freehand, oval lub elliptical.
    4. Narysuj okrąg wokół cząstki, która ma zostać poddana adnotacji, korzystając z wymienionych wcześniej narzędzi zaznaczania, a następnie doprecyzuj obszar za pomocą narzędzia pędzla (brush tool).
    5. Dodaj adnotację do ROI Manager, naciskając Add [t].
    6. Zaznacz wszystkie obiekty zainteresowania (komórki do identyfikacji) na około 15 obrazach.
      UWAGA: Aby objąć wszystkie niezbędne informacje, t.j. różne kształty, rozmiary, stężenia komórek, jasność itp., użyj pięciu obrazów z początku, pięciu z połowy i pięciu z końca eksperymentu.
    7. Zdecyduj, czy komórki muszą zostać podzielone na różne podklasy ze względu na ich kształt (np. różne fazy cyklu komórkowego), czy też wszystkie komórki należą do tej samej klasy.
    8. Odpowiednio zmień nazwę każdej zaznaczonej cząstki. Ustaw jedną nazwę lub skrót dla każdej klasy oraz licznik dla każdej cząstki z tej klasy (np. cell_1, cell_2 itp.). Wykonaj adnotację co najmniej 50 cząstek na klasę.
    9. Nie adnotuj obiektów, których nie należy wykrywać, ponieważ nie są one istotne dla procesu, takich jak pęcherzyki gazu lub inne cząstki, np. nierozpuszczone składniki pożywki.
      UWAGA: Obiekty te nie zostaną uwzględnione w procedurze trenowania ANN i będą traktowane jako tło.
    10. Nie adnotuj komórek, które znajdują się poza ogniskiem.
    11. Adnotuj obrazy tak spójnie, jak to możliwe. W przypadku wątpliwości można zastosować etykietę Ignore. Zdecydowanie zaleca się, aby nie nadużywać tej opcji, ponieważ ANN rozpozna jedynie struktury, które zostały oznakowane.

figure-protocol-2
Rycina 2: Interfejs użytkownika narzędzia Fiji. Z adnotowanych obrazów tworzony jest zestaw treningowy. Przedstawiono adnotację ręczną składającą się z dwóch klas, a lista adnotowanych cząstek jest wyświetlana w ROI Manager. Dla różnych klas można ustawić różne nazwy i kolory. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Zapisz adnotowane obiekty oraz obraz w formacie ZIP i prześlij plik do sieci treningowej, albo poprzez prześlij na platformę lub prześlij plik ZIP poprzez e-mail
    UWAGA: Zazwyczaj wymagana jest liczba iteracyjnych rund uczenia, aby uzyskać odpowiednie predykcje dla obiektów klasyfikowanych na obrazach. Każda runda uczenia prowadzi do wygenerowania przez program przepływu pracy (workflow).
  2. Użyj przepływu pracy (*.wf) z wytrenowanym algorytmem rozpoznawania obiektów, aby przeanalizować obrazy testowe za pomocą programu do przetwarzania partii danych. System dozujący które można uruchomić w panelu sterowania.
  3. Zweryfikuj detekcję obiektów na obrazach testowych poprzez kwantyfikację wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych.
    1. Ilościowo określ detekcję zdarzeń fałszywie dodatnich: cząsteczek błędnie zidentyfikowanych jako komórki, komórek błędnie sklasyfikowanych oraz komórek, których kontur nie został prawidłowo wyznaczony.
    2. Ilościowo określ liczbę zdarzeń fałszywie ujemnych (komórek, które nie zostały rozpoznane jako takie).
  4. Wizualizuj wyniki w narzędziu Analizator wyników poprzez uruchomienie programu w panelu sterowania.
    1. Zaimportuj żądane pliki z wynikami za pomocą Plik | Importuj plik lub Plik | Importuj foldery.
    2. Wizualizację wyników wykonano poprzez Wykres | Utwórz wykres w interfejsie graficznym (GUI) wykresów.
    3. Wybierz jedną z następujących opcji: Wykres rozkładu, Wykres czułości, Charakterystyka w czasie, Charakterystyka w punktach badania oraz Cecha kontra cecha
      UWAGA: Instrukcja dotycząca wykorzystania Analizator wyników jest dołączony do systemu i dostępny również w dziale wsparcia technicznego.
    4. Jeśli wyniki są akceptowalne, uruchom proces w Dozownik partii na wszystkich obrazach uzyskanych podczas eksperymentu. Jednocześnie można stworzyć program monitorujący, łącząc zapisane ustawienia z Sterownik sondy (*.pcfg) z przepływem pracy (*.wf), patrz również instrukcja.
      UWAGA: Przedstawiony schemat postępowania może być również wykorzystany do monitorowania przyszłych eksperymentów z użyciem tej pożywki.
    5. Jeśli wyniki nie są zadowalające, należy sprawdzić adnotacje w zbiorze treningowym i/lub przeprowadzić kolejną iterację procesu uczenia (patrz krok 4.2).

4. Kwantyfikacja wielkości próby

  1. Ustaw odchylenie standardowe (σ), które jest dopuszczalne wśród wykrytych cząstek.
    UWAGA: Odchylenie standardowe zmienia się równolegle do homogeniczności rozmiaru komórek. Maksymalne odchylenie standardowe wskazuje na próbkę o najwyższym stopniu heterogeniczności rozmiaru.
  2. Ustaw amplitudę przedziału ufności lub pożądaną dokładność w odniesieniu do oczekiwanej wariancji pomiarów (e).
  3. Ustaw dopuszczalny błąd (α) w przedziale od 5% (z1-α/2 = 1.96) do 10% (z1-α/2 = 1.64).
  4. Oblicz liczbę komórek do zidentyfikowania z każdej klasy na podstawie równania 1.
    figure-protocol-3 [Równanie 1]
    UWAGA: Na podstawie liczby komórek można określić liczbę obrazów, które należy pozyskać dla każdego punktu danych.
  5. Przeprowadź analizę czułości dla losowych punktów czasowych eksperymentu, aby sprawdzić, czy analiza n cząstek prowadzi do zmienności średnicy Fereta i Dv90 mniejszej niż 5%. Można to obliczyć automatycznie w programie Result Analyzer.

5. Pomiar On Line (by-pass) lub In Line

  1. W pierwszej kolejności należy przeprowadzić procedurę pomiaru off line (patrz krok 2) w celu skonfigurowania ustawień sprzętowych i programowych w zależności od organizmu i procesu (stężenia lub pożywki).
  2. Wgraj zapisane ustawienia z poprzedniej sekcji, wybierając przycisk Load, a następnie wskaż następującą ścieżkę: C:\Program Files\SOPAT GmbH\monitoringPrograms\camcontrol.
  3. Podłącz sondę do celi przepływowej lub do bioreaktora.
    UWAGA: Pomiary in situ można przeprowadzać przy użyciu kołnierza zaciskowego.
  4. Przeprowadź sterylizację.
    UWAGA: Jedynie elementy instrumentu mające kontakt z medium w obrębie sondy można sterylizować za pomocą pary wodnej. Długość części sondy mającej kontakt z medium może wynosić od 6 do 222 mm (Rysunek 3).

figure-protocol-4
Rycina 3: Schemat urządzeń ISM. Sonda MM-Ho (A) może być zainstalowana bezpośrednio w bioreaktorze, natomiast sonda MM 2.1 (B) może być stosowana jako bypass. Cyrkulacja pożywki hodowlanej została zaznaczona strzałkami na każdym obrazku. Współczynniki konwersji wynoszą 0.166 µm pix-1 dla MM-Ho oraz 0.087 µm pix-1 dla MM 2.1. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

  1. Zdefiniuj częstotliwość akwizycji obrazu w interfejsie graficznym użytkownika (GUI) Wyzwalanie w terenie Interwał wyzwalania [s].
    UWAGA: W zależności od dynamiki procesu można dostosować częstotliwość akwizycji obrazów. Na przykład, jeśli przewidywana jest 3-godzinna faza adaptacyjna (lag-phase), częstotliwość akwizycji może być niższa niż w przypadku monitorowania zmiany metabolizmu lub akumulacji produktu. Zazwyczaj wymaga to znacznie krótszego odstępu czasu między akwizycjami, rzędu minut. Przykładowo, sekwencja akwizycji obrazów co 5–10 min podczas hodowli drożdży w układzie okresowym (batch) dostarcza wystarczających informacji do uchwycenia dynamiki procesu.
  2. Zdefiniuj częstotliwość klatek zgodnie z wyjaśnieniem w kroku 2.10.
    UWAGA: W online i w linii pomiarów, częstotliwość klatek można zwiększyć, ponieważ mieszanie mechaniczne może zwiększyć szybkość przepływu przez szczelinę.
  3. Rozpocznij akwizycję obrazu, naciskając przycisk Rozpocznij strumieniowanie wybranej sondy.
  4. Zatrzymaj akwizycję po zakończeniu eksperymentu za pomocą przycisku Zatrzymaj strumieniowanie wybranej sondy.
    UWAGA: W przypadku 1Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia. uruchom, rozpocznij akwizycję tuż przed inokulacją hodowli i przejdź do kroku 4. W przypadku kolejnych pomiarów otwórz program Monitorowanie w panelu sterowania i wybierz utworzony przepływ pracy (patrz krok 4). Rozpocznij monitorowanie tuż przed inokulacją kultury, naciskając przycisk Odtwórz przycisk

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Pomyślnie przeprowadzono detekcję wielkości komórek w kulturach drożdży z wykorzystaniem ISM oraz zautomatyzowaną analizę obrazu w celu odróżnienia komórek pączkujących od niepączkujących. Zarówno natężenie stroboskopu, jak i wybór przerwy pomiarowej posiadają zakres tolerancji, w którym identyfikacja cząstek nie ulega zmianie. Na przykład komórki S. cerevisiae mierzono przy różnych natężeniach stroboskopu w zakresie zmienności 11% przy stężeniu biomasy suchej 4 g L-1....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Do pomiaru dynamiki morfologicznej grzybów, mikroalg i komórek drożdży wykorzystano ISM w postaci przedstawionej tutaj z tymi samymi lub bardzo podobnymi urządzeniami, co umożliwiło określenie aktywności wzrostu, a w przypadku glonów akumulacji produktu wewnątrzkomórkowego. Czujnik nie ma ruchomych części i może być bezpośrednio stosowany w każdym standardowym bioreaktorze zbiornikowym z mieszadłem, zarówno przez standardowy port, jak i w sterylizowalnym obejściu. Ponieważ drożdże są znacznie mniejsze niż glony, zmniejsz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni za wsparcie niemieckiego Federalnego Ministerstwa Gospodarki i Energii w ramach ZIM-Koop, projekt "Inspekcja Smart Process", nr grantu. ZF 4184201CR5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Czujnik MM 2.1 - MFCSOPAT GmbH, Niemcyn.a.Monokularowasonda mikroskopowa Inline Wersja 2.1 z komórką przepływową Mirco
Wersja oprogramowania v1R.003.0092SOPAT GmbH, Niemcyn.a.Grubościomierz
b.n.Możeto być dowolny dostawca, DIN 2275:2014-03
Etanol 70%n.n.Możeto być dowolny dostawca
Wersja instrukcji SOPAT 2.0.5SOPAT GmbH, Niemcy
Papier do soczewek optycznychVWR470150-460
Fidżi, ImageJopen source
50 ml stożkowe probówkiMoże to być dowolny dostawca
wirówkowe

Bibliografia

  1. Maaß, S., Rojahn, J., Hänsch, R., Kraume, M. Automated drop detection using image analysis for online particle size monitoring in multiphase systems. Computers & Chemical Engineering. 45, 27-37 (2012).
  2. Lemoine, A., Delvigne, F., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Tools for the determination of population heterogeneity caused by inhomogeneous cultivation conditions. Journal of biotechnology. 251, 84-93 (2017).
  3. Marbà-Ardébol, A. M., Bockisch, A., Neubauer, P., Junne, S. Sterol synthesis and cell size distribution under oscillatory growth conditions in Saccharomyces cerevisiae scale-down cultivations. Yeast. 35 (2), 213-223 (2017).
  4. Xiao, Y., Bowen, C. H., Liu, D., Zhang, F. Exploiting nongenetic cell-to-cell variation for enhanced biosynthesis. Nature chemical biology. 12 (5), 339-344 (2016).
  5. Beutel, S., Henkel, S. In situ sensor techniques in modern bioprocess monitoring. Applied microbiology and biotechnology. 91 (6), 1493(2011).
  6. Belini, V. L., Wiedemann, P., Suhr, H. In situ microscopy: A perspective for industrial bioethanol production monitoring. Journal of microbiological methods. 93 (3), 224-232 (2013).
  7. Havlik, I., et al. Monitoring of microalgal cultivations with on-line, flow-through microscopy. Algal Research. 2 (3), 253-257 (2013).
  8. Suhr, H., Herkommer, A. M. In situ microscopy using adjustment-free optics. Journal of biomedical optics. 20 (11), 116007(2015).
  9. Panckow, R. P., Reinecke, L., Cuellar, M. C., Maaß, S. Photo-Optical In-Situ Measurement of Drop Size Distributions: Applications in Research and Industry. Oil Gas Sci. Technol. - Rev. IFP Energies. 72 (3), 14(2017).
  10. Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Single-cell-based monitoring of fatty acid accumulation in Crypthecodinium cohnii with three-dimensional holographic and in situ microscopy. Process Biochemistry. 52, 223-232 (2017).
  11. Porro, D., Vai, M., Vanoni, M., Alberghina, L., Hatzis, C. Analysis and modeling of growing budding yeast populations at the single cell level. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 75 (2), 114-120 (2009).
  12. Brauer, M. J., et al. Coordination of growth rate, cell cycle, stress response, and metabolic activity in yeast. Molecular biology of the cell. 19 (1), 352-367 (2008).
  13. Puxbaum, V., Gasser, B., Mattanovich, D. The bud tip is the cellular hot spot of protein secretion in yeasts. Applied microbiology and biotechnology. 100 (18), 8159-8168 (2016).
  14. Marbà-Ardébol, A. M., Emmerich, J., Neubauer, P., Junne, S. Vol. P2. Prozessmesstechnik. 13. Dresdner Sensor-Symposium 201, Hotel Elbflorenz, Dresden, , 222-225 (2017).
  15. Marbà-Ardébol, A. -M., Emmerich, J., Muthig, M., Neubauer, P., Junne, S. Real-time monitoring of the budding index in Saccharomyces cerevisiae batch cultivations with in situ microscopy. Microbial cell factories. 17 (1), 73(2018).
  16. Marquard, D., Schneider-Barthold, C., Düsterloh, S., Scheper, T., Lindner, P. Online monitoring of cell concentration in high cell density Escherichia coli cultivations using in situ Microscopy. Journal of biotechnology. 259, 83-85 (2017).
  17. Marquard, D., et al. In situ microscopy for online monitoring of cell concentration in Pichia pastoris cultivations. Journal of biotechnology. 234, 90-98 (2016).
  18. Camisard, V., Brienne, J., Baussart, H., Hammann, J., Suhr, H. Inline characterization of cell concentration and cell volume in agitated bioreactors using in situ microscopy: application to volume variation induced by osmotic stress. Biotechnology and bioengineering. 78 (1), 73-80 (2002).
  19. Böhm, A., Ücker, A., Jäger, T., Ronneberger, O., Falk, T. ISOODL: Instance segmentation of overlapping biological objects using deep learning. 2018 IEEE 15th International Symposium on Biomedical Imaging, , 1225-1229 (2018).
  20. Davey, H. M. Life, Death, and In-Between: Meanings and Methods in Microbiology. Applied and environmental microbiology. 77 (16), 5571-5576 (2011).
  21. Lodolo, E. J., Kock, J. L., Axcell, B. C., Brooks, M. The yeast Saccharomyces cerevisiae-the main character in beer brewing. FEMS yeast research. 8 (7), 1018-1036 (2008).
  22. Albertin, W., et al. Population size drives industrial Saccharomyces cerevisiae. alcoholic fermentation and is under genetic control. Applied and environmental microbiology. 77 (8), 2772-2784 (2011).
  23. Gomes, J., Chopda, V. R., Rathore, A. S. Integrating systems analysis and control for implementing process analytical technology in bioprocess development. Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 90 (4), 583-589 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Monitorowanie bioproces wzautomatyzowana analiza obrazumodel sieci neuronowejidentyfikacja cz stekanaliza danychrozk ad wielko ci kom rekocena morfologicznapomiar w czasie rzeczywistym

Powiązane artykuły