Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie FITC-dekstranu jako reportera regulowanej egzocytozy

12.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57936

⸱

20 czerwca 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Developmental Biology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 2Department of Pathology, Sackler Faculty of Medicine, Tel Aviv University, 3Laboratory of Membrane Trafficking Mechanisms, Department of Developmental Biology and Neurosciences, Graduate School of Life Sciences, Tohoku University, 4Departments of Pathology and of Microbiology and Immunology and Sean N. Parker Center for Allergy and Asthma Research, School of Medicine, Stanford University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę obrazowania żywych komórek regulowanej egzocytozy. Metoda ta wykorzystuje dekstran FITC, który gromadzi się w organellach związanych z lizosomami, jako reporter. Ta prosta metoda pozwala również na rozróżnienie różnych trybów regulowanej egzocytozy w komórkach, które są trudne do manipulowania genetycznie.

Streszczenie

Regulowana egzocytoza to proces, w którym ładunek, który jest przechowywany w granulkach wydzielniczych (SG), jest uwalniany w odpowiedzi na wyzwalacz wydzielniczy. Regulowana egzocytoza ma fundamentalne znaczenie dla komunikacji międzykomórkowej i jest kluczowym mechanizmem wydzielania neuroprzekaźników, hormonów, mediatorów stanu zapalnego i innych związków przez różne komórki. Znane są co najmniej trzy odrębne mechanizmy regulowanej egzocytozy: pełna egzocytoza, w której pojedynczy SG w pełni łączy się z błoną plazmatyczną, egzocytoza typu kiss-and-run, w której pojedynczy SG przejściowo łączy się z błoną plazmatyczną, oraz egzocytoza złożona, w której kilka SG łączy się ze sobą, przed lub po fuzji SG z błoną plazmatyczną. Rodzaj regulowanej egzocytozy podejmowanej przez komórkę jest często podyktowany rodzajem wyzwalacza wydzielniczego. Jednak w wielu komórkach pojedynczy wyzwalacz wydzielniczy może aktywować jednocześnie wiele trybów regulowanej egzocytozy. Pomimo ich obfitości i znaczenia w różnych typach i gatunkach komórek, mechanizmy determinujące różne sposoby wydzielania są w dużej mierze nierozwiązane. Jednym z głównych wyzwań w badaniu różnych trybów regulowanej egzocytozy jest trudność w ich rozróżnieniu, a także w ich oddzielnym badaniu. W tym miejscu opisujemy zastosowanie izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC)-dekstranu jako reportera egzocytozy i obrazowania żywych komórek w celu rozróżnienia różnych szlaków regulowanej egzocytozy, koncentrując się na egzocytozie złożonej, w oparciu o odporność i czas trwania zdarzeń egzocytarnych.

Wprowadzenie

Regulowana egzocytoza jest podstawowym mechanizmem, dzięki któremu łatwo wytwarzany ładunek jest uwalniany z komórki wydzielniczej w odpowiedzi na określony wyzwalacz. Ładunek jest wstępnie formowany i sekwestrowany w pęcherzykach wydzielniczych, w których jest przechowywany do momentu, gdy wyzwalacz przekaże sygnał do uwolnienia zawartości SG. Różne rodzaje sygnałów mogą powodować różne tryby regulowanej egzocytozy lub różne tryby regulowanej egzocytozy mogą występować jednocześnie. Znane są trzy główne tryby regulowanej egzocytozy: pełna egzocytoza, która polega na pełnym zespoleniu pojedynczej granulki wydzielniczej z błoną plazmatyczną; egzocytoza typu kiss-and-run, która polega na przejściowym połączeniu granulki wydzielniczej z błoną plazmatyczną, a następnie jej recyklingowi; oraz egzocytoza złożona, która charakteryzuje się homotypowym połączeniem kilku SG przed (tj. egzocytozą wieloziarnistą) lub sekwencyjną (tj. egzocytozą sekwencyjną) do fuzji z błoną plazmatyczną1. Egzocytoza złożona jest uważana za najbardziej rozległy sposób uwalniania ładunku2, ponieważ pozwala na szybkie wydzielanie ładunku, w tym z SG, które znajdują się dystalnie od błony komórkowej. Egzocytoza złożona została udokumentowana zarówno w komórkach zewnątrzwydzielniczych, jak i endokrynnych3,4,5,6,7,8,9, a także w komórkach odpornościowych. W komórkach odpornościowych, takich jak eozynofile10,11,12 i neutrophils13, egzocytoza złożona umożliwia szybkie i silne uwalnianie mediatorów, które są wymagane do zabijania inwazyjnych patogenów, takich jak bakterie lub pasożyty. Komórki tuczne (MC) wykorzystują egzocytozę złożoną w celu skutecznego uwalniania wstępnie zmagazynowanych mediatorów stanu zapalnego podczas wrodzonej odpowiedzi immunologicznej, anafilaksji i innych reakcji alergicznych14,15,16,17. Ponieważ różne tryby egzocytozy mogą występować jednocześnie18,19, wyzwaniem stało się rozróżnienie ich w czasie rzeczywistym lub zidentyfikowanie ich odpowiednich mechanizmów fuzji, a tym samym wyjaśnienie ich podstawowych mechanizmów.

Tutaj prezentujemy metodę, opartą na obrazowaniu żywych komórek załadowanego FITC-dekstranu, która pozwala na śledzenie zdarzeń egzocytarnych w czasie rzeczywistym i rozróżnianie ich różnych trybów. W szczególności nasza metoda pozwala na wyłączne monitorowanie egzocytozy złożonej.

FITC-dekstran jest koniugatem wrażliwego na pH fluoroforu FITC z glukanem polisacharydowym dekstranem. Wykazano, że znakowane fluorescencyjnie dektrans dostają się do komórki przez mikropinocytozę20,21 i makropinocytoza22,23. W miarę dojrzewania przedziałów endocytarnych do lizosomów wykazano, że FITC-dekstran gromadzi się w lizosomie bez widocznej degradacji. Ponieważ jednak FITC jest wysoce wrażliwym na pH fluoroforem24, a światło lizosomu jest kwaśne, fluorescencja FITC-dekstranu słabnie po osiągnięciu lizosomu24. W związku z tym ustalenie, że dekstrans jest ładunkiem docelowym lizosomów, w połączeniu z czułością pH FITC, stworzyło podstawy do zastosowania FITC-dekstranu w badaniach egzocytozy lizosomów25,26,27,28,29.

W kilku typach komórek, w tym MCs, neutrofile, eozynofile, cytotoksyczne limfocyty T, melanosomy i inne, SG wykazują cechy lizosomalne i są klasyfikowane jako organelle związane z lizosomami (LRO) lub lizosomy wydzielnicze30,31. Ponieważ LRO mają kwaśne pH światła, FITC-dekstran może być używany do wizualizacji ich egzocytozy, w wyniku wyższego pH związanego z eksterioryzacją LRO. Rzeczywiście, FITC-dekstran został użyty do monitorowania egzocytozy w MCs18,32,33. W tej metodzie FITC-dekstran jest dodawany do hodowli komórkowej, pobierany przez komórki przez pinocytozę i sortowany do SG. Podobnie jak w lizosomach, fluorescencja FITC jest wygaszana w SG, gdy znajdują się one w komórce. Jednak po fuzji SG z błoną plazmatyczną, a w konsekwencji wystawieniu na działanie środowiska zewnętrznego, dekstran FITC odzyskuje swoją fluorescencję wraz ze wzrostem pH SG, co umożliwia proste śledzenie zdarzeń egzocytarnych za pomocą mikroskopii żywych komórek. Tutaj dostosowaliśmy tę metodę, aby umożliwić unikalne śledzenie egzocytozy złożonej.

Wcześniej używano dwóch innych metod do śledzenia egzocytozy złożonej. Mikroskopia elektronowa była pierwszą metodą charakteryzowania struktur egzocytarnych, która sugerowała występowanie różnych trybów egzocytozy. W szczególności obserwacje "tuneli wydzielniczych" w komórkach groniastych trzustki34 i MCs35,36,37 dały początek hipotezie egzocytozy złożonej. Jednakże, chociaż wysoka rozdzielczość mikroskopii elektronowej ma moc ujawniania stopionych pęcherzyków, nie może śledzić dynamiki ich fuzji, a zatem nie może określić, czy odpowiadają one fuzji SG podczas egzocytozy złożonej, czy fuzji ponownie wychwyconych granulek po ich endocytozie. Przeszkodę tę można pokonać innymi metodami, które mogą mierzyć egzocytozę w żywych komórkach, takimi jak pomiary pojemności błony plazmatycznej za pomocą zacisków krosowych11,13,38,39 lub amperometry40 nośnika. Jednak mocowanie punktowe wymaga specjalnej konfiguracji i może nie być odpowiednie dla wszystkich typów ogniw. Pomiary amperometryczne są w stanie śledzić egzocytozę tylko wtedy, gdy ładunek jest uwalniany w bardzo bliskiej odległości od elektrody. Dlatego korzystanie z obrazowania żywych komórek ma przewagę nad tymi metodami, ponieważ nie tylko pozwala na śledzenie egzocytozy w czasie rzeczywistym, ale także umożliwia szybkie i proste pozyskiwanie danych z całej komórki.

Śledzenie FITC-dekstranu za pomocą mikroskopii żywych komórek oferuje również pewne zalety innym metodom opartym na obrazowaniu żywych komórek. Na przykład szeroko stosowaną metodą jest mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM) komórek załadowanych fluorescencyjną sondą SG lub wyrażających fluorescencyjny ładunek SG lub białko błonowe znakowane białkiem fluorescencyjnym26,41,42,43. Siła tej metody polega na jej zdolności do monitorowania wyłącznie zdarzeń zachodzących w pobliżu błony komórkowej (zwanych dalej śladem węglowym), a więc zdarzeń egzocytarnych. Jest to jednak również wada tej metody, ponieważ można obrazować tylko frakcję komórkową, która przylega do szkła nakrywkowego i znajduje się blisko soczewki mikroskopu44. To, czy takie ślady rzeczywiście reprezentują całą powierzchnię błony komórkowej, jest nadal dyskusyjne45,46,47. W związku z tym użycie barwnika wrażliwego na pH, takiego jak dekstran FITC, oraz standardowego mikroskopu fluorescencyjnego lub mikroskopu konfokalnego z otwartym otworkiem umożliwia obrazowanie całej komórki, uchwycając w ten sposób całkowite zdarzenia egzocytarne, które zachodzą w tej komórce.

Dodatkowe reportery wrażliwe na pH, które są używane do badania regulowanej egzocytozy za pomocą obrazowania całych komórek lub TIRFM, obejmują ładunek SG lub białko błonowe SG połączone z floryną, wrażliwym na pH wariantem GFP. Przykłady obejmują NPY-flouryna-, β-heksoseaminidaza-flouryna i synapto-phluorin48,49,50,51,52. Podczas gdy ekspresja tych sond może bardziej odzwierciedlać endogenny skład SG, pociąga za sobą transfekcję komórek, a zatem może być mniej odpowiednia dla komórek, które są trudne do transfekcji. Dlatego podczas badania komórek, które są trudne do transfekcji lub w warunkach eksperymentalnych, które wymagają wielu manipulacji genomowych, korzystne jest zastosowanie związku, który można po prostu uzupełnić do pożywki do hodowli komórkowej, takiego jak dekstran FITC. FITC-dekstran ma również przewagę nad pomarańczą akrydynową (AO), innym barwnikiem wrażliwym na pH, który został użyty do śledzenia egzocytozy za pomocą mikroskopii żywych komórek53,54,55,56,57,58. Wykazano, że AO indukuje fotolizę pęcherzyków, która powoduje fałszywe błyski, które nie odpowiadają rzeczywistym procesom wydzielania27. W przeciwieństwie do tego, FITC-dekstran odzwierciedla lepsze zdarzenia wydzielania, prawdopodobnie ze względu na niską produkcję reaktywnego tlenu indukowaną przez światło27.

Warto zauważyć, że alternatywnym podejściem do badania egzocytozy jest śledzenie napływu barwnika z zewnętrznego podłoża do SG poprzez pory fuzyjne, które otwierają się podczas tego procesu. W takim przypadku barwnik jest dodawany do podłoża zewnętrznego wraz ze spustem wydzielniczym. Następnie, gdy por fuzyjny się otworzy, barwnik dyfunduje do klasy SG59,60. Niewątpliwą zaletą tej metody jest to, że oferuje ona również możliwość oszacowania wielkości porów fuzji, przy użyciu barwników o zmiennej wielkości. Na przykład dektrans o różnej masie cząsteczkowej (MW), sprzężony z różnymi fluoroforami, może być stosowany jako barwniki zewnątrzkomórkowe, przy czym maksymalny rozmiar dekstranu, który może przeniknąć do SG, odpowiadałby rozmiarowi porów fuzyjnych59,61,62,63,64. Ponadto takie podejście nie wymaga stosowania sondy wrażliwej na pH. Jednak istotną wadą jest to, że stosunek sygnału do szumu jest bardzo niski, ponieważ podczas akwizycji obrazów w mediach obecna jest duża ilość barwnika, co skutkuje wysokim tłem.

Ogólnie rzecz biorąc, użycie FITC-dekstranu jako markera egzocytozy przezwycięża kilka wad wcześniej opisanych metod, takich jak stosunek sygnału do szumu, toksyczność, dynamiczne śledzenie i złożoność.

Tutaj opisujemy użycie FITC-dekstranu do monitorowania egzocytozy złożonej w linii komórek tucznych RBL-2H3 (tutaj określanej jako RBL, pierwotnie ustalonej przez Ecclestona i wsp.65 i dalej klonowane przez Barsumian et al.66), w odpowiedzi na aktywację immunoglobuliny E (IgE)/antygenu (Ag).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowania

  1. Przygotowanie pożywek hodowlanych RBL
    1. Wymieszaj 500 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 56 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5,5 ml roztworu penicyliny, streptomycyny i nystatyny, 5,5 ml roztworu L-glutaminy 200 mM. Powoduje to DMEM o niskim poziomie glukozy uzupełnionym 10% FBS, 100 μg / ml streptomycyny, 100 jednostek / ml penicyliny, 12 jednostek / ml nystatyny i 2 mM L-glutaminy.
    2. Przefiltrować media za pomocą filtra próżniowego o wielkości porów 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Utrzymanie komórek RBL.
    1. Wyhoduj komórki RBL do maksymalnej konfluencji 90% w 10 cm naczyniu. Jeśli hodowla komórkowa jest zdrowa, komórki powinny mieć kształt wrzeciona z okazjonalnymi wypukłościami.
    2. W celu rozszczepienia komórek należy odłączyć komórki od naczynia poprzez zasysanie pożywki i zastąpienie 2 ml roztworu B. Inkubować przez 5-10 minut w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C.
    3. Po odłączeniu komórek zneutralizuj trypsynę, dodając 2 ml pożywki hodowlanej za pomocą pipety i podziel komórki w stosunku 1:2 - 1:10.
  3. Przygotowanie bufora 20x Tyrode
    1. Przygotuj podstawowy 20-krotny roztwór 54 mM KCl, 20 mM MgCl2, 2,74 M NaCl i 8 mM NaH2PO4 w wodzie podwójnie destylowanej (DDW). Dobrze wymieszać i przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Hodowla komórek RBL do mikroskopii żywych komórek

  1. Przygotowanie roztworu FITC-dekstranu.
    1. Zmieszać 1 mg sproszkowanego dekstranu FITC (150 K) na 1 ml pożywki hodowlanej (patrz krok 1.1.1). Aby uzyskać pełnokomorową szklankę nakryciową, przygotuj 3 ml.
    2. Używając jednostki filtrującej strzykawkę z octanu celulozy o wielkości porów 0,22 μm, przefiltruj rozpuszczony dekstran FITC.
    3. Dodać mysie IgE do stężenia 1 μg/ml.
  2. Wysiewanie komórek RBL do obrazowania
    1. Dzień przed obrazowaniem odessać pożywkę z szalki hodowlanej i zastąpić 2 ml roztworu B. Inkubować przez 5 - 10 minut w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Po odłączeniu komórek zneutralizuj trypsynę, dodając 2 ml pożywki hodowlanej.
    2. Policz komórki RBL za pomocą hemocytometru i odpowiednio dostosuj objętość za pomocą pożywki hodowlanej, aby uzyskać stężenie komórek 7,5 x 105 / ml.
    3. Dodać 10 μl zawiesiny komórkowej do komorowego szkła nakrywkowego wstępnie wypełnionego świeżą pożywką hodowlaną uzupełnioną FITC-dekstranem (w wyniku czego w komorze zostanie wysiew7,5 x 10 3 komórek).
    4. Hodować komórki RBL przez noc w wilgotnej atmosferze 5% CO2 w temperaturze 37 °C. Komórki powinny pozostać na poziomie sub-konfluencji, aby upewnić się, że komórki są oddzielone i że łatwo jest zidentyfikować każdą komórkę indywidualnie pod mikroskopem.
  3. Transfekcja komórek RBL - opcjonalnie.
    1. Aby zobrazować zdarzenia egzocytarne w połączeniu z innymi fluorescencyjnie znakowanymi białkami, zobacz protokół transfekcji dla komórek RBL w Azouz i wsp.67

3. Mikroskopia egzocytozy na żywych komórkach

  1. Przygotowanie roztworów:
    1. Przygotować końcowy roztwór buforowy Tyrode'a, rozcieńczając roztwór podstawowy w DDW w rozcieńczeniu 1:20 i uzupełnić 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/ml BSA i 5,6 mM glukozy.
    2. Świeżo przygotuj 20-krotny odczynnik sekretagogiczny w buforze Tyrode'a [1 μg/ml dinitropfenylu sprzężony z albuminą surowicy ludzkiej (DNP-HAS (Ag)) w naszym przypadku, dla stężenia 50 ng/ml 1x].
    3. Przygotować roztwór chlorku amonu o stężeniu 400 mM, rozpuszczając proszek w buforze Tyrode'a.
  2. Przygotowanie komórek.
    1. Umyj nakrycie z komorą 3 razy, odsysając pożywkę z komory i ponownie napełniając ją 300 μl buforu Tyrode, podgrzanego do temperatury 37 °C. Na koniec uzupełnij komorę 300 μl buforu Tyrode, podgrzanego do 37 °C.
    2. Umieść szklaną pokrywę z komorą w komorze inkubatora mikroskopu. Upewnij się, że komora jest stabilna.
  3. Ustawianie mikroskopu
    1. Aby wybrać obszar zainteresowania do śledzenia, włącz fluorescencyjne źródło światła (tradycyjnie lampę rtęciową) i wybierz odpowiedni filtr fluorescencyjny (wybierz filtr dla zielonych fluoroforów do oglądania FITC-dstranu). Gdy obszar zainteresowania jest ostry i znajduje się w środku pola widzenia, wyłącz źródło światła, aby uniknąć fotowybielania i toksyczności.
      UWAGA: Część dekstranu FITC-wbudowanego w komórki może zachować fluorescencję. Dzieje się tak, ponieważ dekstran FITC może być również sortowany do przedziałów nielizosomalnych, takich jak endosomy.
    2. Włącz odpowiednie oświetlenie do wzbudzenia FITC. Jeśli używasz mikroskopu laserowego, włącz laser o długości fali 488 nm. Emisja powinna być zgromadzona w okolicach 500 - 550 nm (szczyt emisji FITC przy 510 - 520 nm).
    3. Podczas korzystania z mikroskopu konfokalnego otwórz otwór do maksimum. Pozwoli to na użycie mniejszej mocy lasera, aby uniknąć bielenia i toksyczności oraz zapewni wychwycenie zdarzeń egzocytozy ze wszystkich płaszczyzn komórki.
    4. Skalibruj odstęp czasu między akwizycjami obrazu.
      1. Różne komórki mogą różnić się kinetyką regulowanej egzocytozy68. W przypadku specyficznego obrazowania egzocytozy złożonej zalecamy odstęp czasu wynoszący co najmniej 5 sekund. Jednak z reguły, aby umożliwić szybkie obrazowanie, upewnij się, że czas akwizycji pojedynczej klatki jest krótki.
      2. W przypadku korzystania z laserowego skaningowego mikroskopu konfokalnego należy ustawić kierunek skanowania na dwukierunkowy, nie dopuszczać do uśredniania i ustawić rozdzielczość na 512 x 512 (zalecane; dwa ostatnie przepisy pomogą również zminimalizować bielenie i toksyczność).
  4. Obrazowanie egzocytozy.
    1. Obrazuj komórki przez żądany czas trwania, w zależności od typu komórki lub sekretagogii. W komórkach RBL wyzwalanych IgE/Ag większość zdarzeń egzocytarnych występuje w ciągu 15 - 20 minut od aktywacji.
    2. W celu aktywacji komórek dodaj do komory 16 μl z 20x roztworu wydzielającego.
  5. Potwierdzenie obecności FITC-dekstranu w komórkach.
    1. Aby potwierdzić obecność i lokalizację FITC-dekstranu w SGs, delikatnie dodaj 16 μl roztworu chlorku amonu (należy uważać, aby nie przesunąć komory, aby nie stracić ostrości) do komory (uzyska to końcowe stężenie 20 mM). Spowoduje to alkalizację SG i wygaszenie fluorescencji FITC, co nastąpi w ciągu kilku sekund.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1a przedstawia schematycznie, w jaki sposób dekstran-FITC może służyć jako wskaźnik regulowanej egzocytozy i odzwierciedlać różne tryby zdarzeń egzocytotycznych. Najpierw komórki inkubuje się z dekstranem-FITC, który jest internalizowany drogą pinocytozy i kierowany do ziarnistości wydzielniczych (SG). Ponieważ SG komórek tułowiowych (MCs) są dużymi gęstymi ziarnistościami (LROs), ich niskie pH wygasza fluorescencję FITC, co przedstawiono tutaj jako c...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Tutaj opisujemy, w jaki sposób śledzenie fluorescencji dekstranu FITC załadowanego do SG może być wykorzystane do specyficznego wychwytywania złożonych zdarzeń egzocytozy. Udało się to osiągnąć poprzez ustawienie mikroskopu tak, aby uzyskiwał obraz co 15 sekund, zapewniając w ten sposób, że w czasie rejestrowane będą tylko długotrwałe zdarzenia, a tym samym wykluczając krótkie zdarzenia, które odpowiadałyby pełnej egzocytozie lub egzocytozie typu kiss-and-run. Aby ustalić metodę, wykazaliśmy, że knockdown izoform Rab5, k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych

Podziękowania

Dziękujemy Dr. U. Ashery za hojny dar cDNA. Dziękujemy doktorom G. Mass, L. Mittlemanowi, M. Shaharbani i Y. Zilbersteinowi z Centrum Obrazowania Komórkowego i Molekularnego Sacklera za ich nieocenioną pomoc w mikroskopii. Praca ta była wspierana przez Amerykańsko-Izraelską Dwunarodową Fundację Naukową (grant 2013263 dla R. Sagi-Eisenberga, I. Hammela i S.J. Galli) oraz grant 933/15 z Izraelskiej Fundacji Naukowej. założony przez Izraelską Akademię Nauk (dla R. Sagi-Eisenberga) i NIH przyznaje U19 AI 104209 i R01 AR067145 (dla S.J. Galli).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DMEM o niskim poziomie glukozyIndukcje biologiczne01-050-1A
Surowica bydlęca płoduGibco12657
Roztwór pióra-paciorkowca-nystatynyIndukcje biologiczne03-032-1B
L-glutamina 200 mM roztwór Indukcje biologiczne03-020-1A
FITC dekstran 150KSigma-Aldrich46946-500MG-F
Trypsyna / EDTA roztwór BIndukcje biologiczne03-052-1ACiepłe w 37 stopniach; C kąpiel wodna przed użyciem
Filtr górnego próżni 0,22 &mikro; m Wielkość porów Sigma-AldrichCLS430769-1EA
Jednostka filtrująca strzykawkę z octanu celulozy, 0,22 i mikro; m wielkość porówSartorius16534K
Komorowe szkło nakrywkowe Thermo scientific155411
Naczynia hodowlane traktowane kulturami tkankowymiCorning Sigma-AldrichCLS430167
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA4503
Anty-DNP monoklonalna IgESigma-AldrichD8406
DNP-HSA (Ag)Sigma-AldrichA6661 Unikaj bezpośredniej ekspozycji na światło
Bufor Hepes 1M, pH 7,4Indukcje biologiczne03-025-1B
CaCl2MERK102382
GlukozaLaboratoria BDH284515V
Chlorek amonuMERK1145
RURY Sól dipotasowaSigma-Aldrich108321-27-3
Hydratoctanu wapniaSigma-Aldrich114460-21-8
Tetrahydrat octanu magnezuSigma-AldrichM5661
Glutaminian potasu (jednohydrat soli potasowej kwasu L-glutaminowego)Sigma-AldrichG1501
NaH2PO4MERK6346
NaClMERK106404
MgCl2MERK105833
KClMERK104936
Elektroporator BTXECM830
, ZeissZeissLSM 5 Pascal, Axiovert 200Mużywany na rysunku 3. Wyposażony w elektroniczny inkubator strumienia powietrza z regulacją temperatury
Mikroskop konfokalny, ZeissZeissLSM 800, Axio Observer.Z1 /7używany na rysunku 2. Wyposażony w detektor GaAsP, elektroniczny inkubator strumienia powietrza z kontrolowaną temperaturą
Mikroskop konfokalny, LeicaLeica SP5Używany na rysunku 1. Wyposażone w detektor Leica HyD i inkubator najwyższego stopnia (okolab)
RBL-2H3komórki RBL-2H3 zostały sklonowane w laboratorium Reubena P. Siraganian. Patrz odnośnik 67
Mikroskop konfokalny Komórki ,

Bibliografia

  1. Wu, L. -G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. Exocytosis and endocytosis: Modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76, 301-331 (2014).
  2. Pickett, J. A., Edwardson, J. M. Compound exocytosis: Mechanisms and functional significance. Traffic. 7 (2), 109-116 (2006).
  3. Behrendorff, N., Dolai, S., Hong, W., Gaisano, H. Y., Thorn, P. Vesicle-associated membrane protein 8 (VAMP8) is a SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor) selectively required for sequential granule-to-granule fusion. J Biol Chem. 286 (34), 29627-29634 (2011).
  4. Kwan, E. P., Gaisano, H. Y. Glucagon-like peptide 1 regulates sequential and compound exocytosis in pancreatic islet beta-cells. Diabetes. 54 (9), 2734-2743 (2005).
  5. Hoppa, M. B., et al. Multivesicular exocytosis in rat pancreatic beta cells. Diabetologia. 55 (4), 1001-1012 (2012).
  6. Zhu, D., et al. Syntaxin-3 regulates newcomer insulin granule exocytosis and compound fusion in pancreatic beta cells. Diabetologia. 56 (2), 359-369 (2013).
  7. Vardjan, N., Jorgačevski, J., Stenovec, M., Kreft, M., Zorec, R. Compound exocytosis in pituitary cells. Ann N Y Acad Sci. 1152 (1), 63-75 (2009).
  8. Cochilla, A. J., Angleson, J. K., Betz, W. J. Differential regulation of granule-to-granule and granule-to-plasma membrane fusion during secretion from rat pituitary lactotrophs. J Cell Biol. 150 (4), 839-848 (2000).
  9. Mair, N., Haller, T., Dietl, P. Exocytosis in alveolar type II cells revealed by cell capacitance and fluorescence measurements. Am J Physiol. 276, 376-382 (1999).
  10. Carmo, L. A. S., et al. CD63 is tightly associated with intracellular, secretory events chaperoning piecemeal degranulation and compound exocytosis in human eosinophils. J Leukoc Biol. 100 (2), 391-401 (2016).
  11. Hafez, I., Stolpe, A., Lindau, M. Compound exocytosis and cumulative fusion in eosinophils. J Biol Chem. 278 (45), 44921-44928 (2003).
  12. Scepek, S., Lindau, M. Focal exocytosis by eosinophils - compound exocytosis and cumulative fusion. EMBO J. 12 (5), 1811-1817 (1993).
  13. Lollike, K., Lindau, M., Calafat, J., Borregaard, N. Compound exocytosis of granules in human neutrophils. J Leukoc Biol. 71 (6), 973-980 (2002).
  14. Mukai, K., Tsai, M., Starkl, P., Marichal, T., Galli, S. J. IgE and mast cells in host defense against parasites and venoms. Semin Immunopathol. 38 (5), 581-603 (2016).
  15. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nat Med. 18 (5), 693-704 (2012).
  16. Lundequist, A., Pejler, G. Biological implications of preformed mast cell mediators. Cell Mol Life Sci. 68 (6), 965-975 (2011).
  17. Blank, U. The mechanisms of exocytosis in mast cells. Adv Exp Med Biol. , 107-122 (2011).
  18. Cohen, R., Corwith, K., Holowka, D., Baird, B. Spatiotemporal resolution of mast cell granule exocytosis reveals correlation with Ca2+ wave initiation. J Cell Sci. 125 (12), 2986-2994 (2012).
  19. Harata, N. C., Aravanis, A. M., Tsien, R. W. Kiss-and-run and full-collapse fusion as modes of exo-endocytosis in neurosecretion. J Neurochem. 97 (6), 1546-1570 (2006).
  20. Cao, H., Chen, J., Awoniyi, M., Henley, J. R., McNiven, M. A. Dynamin 2 mediates fluid-phase micropinocytosis in epithelial cells. J Cell Sci. 120 (23), 4167-4177 (2007).
  21. Frost, B., Jacks, R. L., Diamond, M. I. Propagation of tau misfolding from the outside to the inside of a cell. J Biol Chem. 284 (19), 12845-12852 (2009).
  22. Saeed, M. F., Kolokoltsov, A. A., Albrecht, T., Davey, R. A. Cellular entry of ebola virus involves uptake by a macropinocytosis-Like mechanism and subsequent trafficking through early and late endosomes. PLoS Pathog. 6 (9), e1001110(2010).
  23. Wang, J. T. H., Kerr, M. C., Karunaratne, S., Jeanes, A., Yap, A. S., Teasdale, R. D. The SNX-PX-BAR family in macropinocytosis: The regulation of macropinosome formation by SNX-PX-BAR proteins. PLoS One. 5 (10), e13763(2010).
  24. Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
  25. Thorn, P., Jang, Y. Visualization of exocytosis in pancreatic acinar cells by fluorescence microscopy. Pancreapedia Exocrine Pancreas Knowl Base. , (2011).
  26. Jaiswal, J. K., Andrews, N. W., Simon, S. M. Membrane proximal lysosomes are the major vesicles responsible for calcium-dependent exocytosis in nonsecretory cells. J Cell Biol. 159 (4), 625-635 (2002).
  27. Jaiswal, J. K., Fix, M., Takano, T., Nedergaard, M., Simon, S. M. Resolving vesicle fusion from lysis to monitor calcium-triggered lysosomal exocytosis in astrocytes. Proc Natl Acad Sci. 104 (35), 14151-14156 (2007).
  28. Lima, W. C., Leuba, F., Soldati, T., Cosson, P. Mucolipin controls lysosome exocytosis in Dictyostelium. J Cell Sci. 125 (9), 2315-2322 (2012).
  29. Ravdin, J. I., Murphy, C. F., Schlesinger, P. H. The cellular regulation of vesicle exocytosis by Entamoeba histolytica. J Protozool. 35 (1), 159-163 (1988).
  30. Blott, E. J., Griffiths, G. M. Secretory lysosomes. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (2), 122-131 (2002).
  31. Raposo, G., Fevrier, B., Stoorvogel, W., Marks, M. S. Lysosome-related organelles: A view from immunity and pigmentation. CELL Struct Funct. 27 (6), 443-456 (2002).
  32. Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
  33. Klein, O., et al. Rab5 is critical for SNAP23 regulated granule-granule fusion during compound exocytosis. Sci Rep. 7 (1), 15315(2017).
  34. Ichikawa, A. Fine structural changes in response to hormonal stimulation of the perfused canine pancreas. J Cell Biol. 24 (3), 369-385 (1965).
  35. Bloom, G. D., Haegermark, Ö A study on morphological changes and histamine release induced by compound 4880 in rat peritoneal mast cells. Exp Cell Res. 40 (3), 637-654 (1965).
  36. Bloom, G. D., Chakravarty, N. Time course of anaphylactic histamine release and morphological changes in rat peritoneal mast cells. Acta Physiol Scand. 78 (3), 410-419 (1970).
  37. Horsfield, G. I. The effect of compound 48/80 on the rat mast cell. J Pathol Bacteriol. 90 (2), 599-605 (1965).
  38. Alvarez de Toledo, G., Fernandez, J. M. Compound versus multigranular exocytosis in peritoneal mast cells. J Gen Physiol. 95 (3), 397-409 (1990).
  39. Fernandez, J. M., Neher, E., Gomperts, B. D. Capacitance measurements reveal stepwise fusion events in degranulating mast cells. Nature. 312 (5993), 453-455 (1984).
  40. Oberhauser, A. F., Robinson, M., Fernandez, J. M. Simultaneous capacitance and amperometric measurements of exocytosis: A comparison. Biophys J. 71 (2), 1131-1139 (1996).
  41. Nagamatsu, S., Ohara-Imaizumi, M. Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with TIRF microscopy. Methods Mol Biol. 440, Humana Press. (2008).
  42. Akopova, I., et al. Imaging exocytosis of ATP-containing vesicles with TIRF microscopy in lung epithelial A549 cells. Purinergic Signal. 8 (1), 59-70 (2012).
  43. Joselevitch, C., Zenisek, D. Imaging exocytosis in retinal bipolar cells with TIRF microscopy. J Vis Exp. (28), e1305(2009).
  44. Axelrod, D. Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence. J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).
  45. Plattner, H., Artalejo, A. R., Neher, E. Ultrastructural organization of bovine chromaffin cell cortex-analysis by cryofixation and morphometry of aspects pertinent to exocytosis. J Cell Biol. 139 (7), 1709-1717 (1997).
  46. Eitzen, G. Actin remodeling to facilitate membrane fusion. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 175-181 (2003).
  47. Becherer, U., Pasche, M., Nofal, S., Hof, D., Matti, U., Rettig, J. Quantifying exocytosis by combination of membrane capacitance measurements and total internal reflection fluorescence microscopy in chromaffin cells. PLoS One. 2 (6), e505(2007).
  48. Wilson, J. D., Shelby, S. A., Holowka, D., Baird, B. Rab11 regulates the mast cell exocytic response. Traffic. 17 (9), 1027-1041 (2016).
  49. Makhmutova, M., Liang, T., Gaisano, H., Caicedo, A., Almaça, J. Confocal imaging of neuropeptide Y-pHluorin: A technique to visualize insulin granule exocytosis in intact murine and human islets. J Vis Exp. (127), e56089(2017).
  50. Almaça, J., Liang, T., Gaisano, H. Y., Nam, H. G., Berggren, P. -O., Caicedo, A. Spatial and temporal coordination of insulin granule exocytosis in intact human pancreatic islets. Diabetologia. 58, 2810-2818 (2015).
  51. Dominguez, N., van Weering, J. R. T., Borges, R., Toonen, R. F. G., Verhage, M. Dense-core vesicle biogenesis and exocytosis in neurons lacking chromogranins A and B. J Neurochem. 144 (3), 241-254 (2017).
  52. Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2007).
  53. Steyer, J. A., Horstmann, H., Almers, W. Transport, docking and exocytosis of single secretory granules in live chromaffin cells. Nature. 388 (6641), 474-478 (1997).
  54. Zoccarato, F., Cavallini, L., Alexandre, A. The pH-sensitive dye acridine orange as a tool to monitor exocytosis/endocytosis in synaptosomes. J Neurochem. 72 (2), 625-633 (1999).
  55. Tsuboi, T., Rutter, G. A. Multiple forms of kiss-and-run exocytosis revealed by evanescent wave microscopy. Curr Biol. 13 (7), 563-567 (2003).
  56. Tsuboi, T., Zhao, C., Terakawa, S., Rutter, G. A. Simultaneous evanescent wave imaging of insulin vesicle membrane and cargo during a single exocytotic event. Curr Biol. 10 (20), 1307-1310 (2000).
  57. Tsuboi, T., Kikuta, T., Sakurai, T., Terakawa, S. Water secretion associated with exocytosis in endocrine cells revealed by micro forcemetry and evanescent wave microscopy. Biophys J. 83 (1), 172-183 (2002).
  58. Avery, J., et al. A cell-free system for regulated exocytosis in PC12 cells. J Cell Biol. 148 (2), 317-324 (2000).
  59. Larina, O., et al. Dynamic regulation of the large exocytotic fusion pore in pancreatic acinar cells. Mol Biol Cell. 18 (9), 3502-3511 (2007).
  60. Nemoto, T., et al. Sequential-replenishment mechanism of exocytosis in pancreatic acini. Nat Cell Biol. 3 (3), 253-258 (2001).
  61. Jaiswal, J. K., Chakrabarti, S., Andrews, N. W., Simon, S. M. Synaptotagmin VII restricts fusion pore expansion during lysosomal exocytosis. PLoS Biol. 2 (8), e233(2004).
  62. Lasič, E., Stenovec, M., Kreft, M., Robinson, P. J., Zorec, R. Dynamin regulates the fusion pore of endo- and exocytotic vesicles as revealed by membrane capacitance measurements. Biochim Biophys Acta - Gen Subj. 1861 (9), 2293-2303 (2017).
  63. Bonnafous, P., Stegmann, T. Membrane perturbation and fusion pore formation in influenza hemagglutinin-mediated membrane fusion. A new model for fusion. J Biol Chem. 275 (9), 6160-6166 (2000).
  64. Balseiro-Gomez, S., Flores, J. A., Acosta, J., Ramirez-Ponce, M. P., Ales, E. Transient fusion ensures granule replenishment to maintain repeated release after IgE-mediated mast cell degranulation. J Cell Sci. 129 (21), 3989-4000 (2016).
  65. Eccleston, E., Leonard, B. J., Lowe, J. S., Welford, H. J. Basophilic leukaemia in the albino rat and a demonstration of the basopoietin. Nat New Biol. 244 (133), 73-76 (1973).
  66. Barsumian, E. L., Isersky, C., Petrino, M. G., Siraganian, R. P. IgE-induced histamine release from rat basophilic leukemia cell lines: isolation of releasing and nonreleasing clones. Eur J Immunol. 11 (4), 317-323 (1981).
  67. Azouz, N. P., Fukuda, M., Rothenberg, M. E., Sagi-Eisenberg, R. Investigating mast cell secretory granules; from biosynthesis to exocytosis. J Vis Exp. (95), e52505(2015).
  68. Martin, T. F. J. Tuning exocytosis for speed: fast and slow modes. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1641 (2-3), 157-165 (2003).
  69. Azouz, N. P., et al. Rab5 is a novel regulator of mast cell secretory granules: impact on size, cargo, and exocytosis. J Immunol. 192 (9), 4043-4053 (2014).
  70. Azouz, N. P., Matsui, T., Fukuda, M., Sagi-Eisenberg, R. Decoding the regulation of mast cell exocytosis by networks of Rab GTPases. J Immunol. 189 (5), 2169-2180 (2012).
  71. Beraldo, W. T., Silva, W. D., Fernandes, A. D. L. Ihibitory effects of carbohydrates on histamine release and mast cell disruption by dextran. Br J Pharmacol Chemother. 19 (3), 405-413 (1962).
  72. Oda, T., Kodama, N., Arizona, K. K. Ketotifen, a mast cell stabilizer, protects dextran sulfate sodium (DSS)-induced colitis in rats. Gastroenterology. 108 (4), a887(1995).
  73. Sagi-Eisenberg, R., Geller-Bernstein, C., Ben-Neriah, Z., Pecht, I. Direct measurements of the dextran-dependent calcium uptake by rat peritoneal mast cells. FEBS Lett. 161 (1), 37-40 (1983).
  74. Hanahoe, T. H. Mechanism of histamine release from rat isolated peritoneal mast cells by dextran: the role of immunoglobulin E. Agents Actions. 14 (3-4), 468-474 (1984).
  75. Harris, J. M., West, G. B. Rats resistant to the dextran anaphylactoid reaction. Br J Pharmacol Chemother. 20, 550-562 (1963).
  76. Baxter, J. H., Adamik, R. Temperature dependence of histamine release from rat mast cells by dextran. Proc Soc Exp Biol Med. 146 (1), 71-74 (1974).
  77. Chakravarty, N., Goth, A., Sen, P. Potentiation of dextran-induced histamine release from rat mast cells by phosphatidyl serine. Acta Physiol Scand. 88 (4), 469-480 (1973).
  78. Baxter, J. H. Role of Ca++ in mast cell activation, desensitization, and histamine release by dextran. J Immunol. 111 (5), 1470-1473 (1973).
  79. Chen, H. -Y., et al. Nanoimaging granule dynamics and subcellular structures in activated mast cells using soft X-ray tomography. Sci Rep. 6 (1), 34879(2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie FITC-dekstranuegzocytoza złożonaobrazowanie żywych komórekziarnistości wydzielniczemikroskopia fluorescencyjnawyzwalacz wydzielaniaegzocytoza komórek tucznychchlorek amonukomórki RBL
Obrazowanie FITC-dekstranu jako reportera regulowanej egzocytozy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.