Cyfrowy PCR do ilościowego oznaczania krążących mikroRNA w ostrym zawale mięśnia sercowego i chorobach sercowo-naczyniowych

Podsumowanie

Krążące mikroRNA okazały się obiecujące jako biomarkery chorób sercowo-naczyniowych i ostrych zawałów mięśnia sercowego. W tym badaniu opisujemy protokół ekstrakcji miRNA, odwrotnej transkrypcji i cyfrowego PCR w celu bezwzględnej kwantyfikacji miRNA w surowicy pacjentów z chorobami sercowo-naczyniowymi.

Streszczenie

Krążące mikroRNA (miRNA) w surowicy okazały się obiecujące jako biomarkery chorób sercowo-naczyniowych i ostrego zawału mięśnia sercowego (AMI), uwalniane z komórek sercowo-naczyniowych do krążenia. Krążące miRNA są wysoce stabilne i można je określić ilościowo. Ilościowa ekspresja określonych miRNA może być powiązana z patologią, a niektóre miRNA wykazują wysoką specyficzność tkankową i chorobową. Znalezienie nowych biomarkerów chorób sercowo-naczyniowych ma znaczenie dla badań medycznych. Całkiem niedawno wynaleziono cyfrową reakcję łańcuchową polimerazy (dPCR). dPCR, w połączeniu z fluorescencyjnymi sondami hydrolizy, umożliwia specyficzną bezpośrednią bezwzględną kwantyfikację. dPCR wykazuje doskonałe właściwości techniczne, w tym niską zmienność, wysoką liniowość i wysoką czułość w porównaniu z ilościową reakcją łańcuchową polimerazy (qPCR). W związku z tym dPCR jest dokładniejszą i bardziej powtarzalną metodą bezpośredniego oznaczania ilościowego miRNA, szczególnie do stosowania w dużych, wieloośrodkowych badaniach klinicznych dotyczących układu sercowo-naczyniowego. W niniejszej publikacji opisujemy, jak skutecznie przeprowadzić digital PCR w celu oceny bezwzględnej liczby kopii w próbkach surowicy.

Wprowadzenie

1. MiRNA to małe, niekodujące jednoniciowe cząsteczki RNA (o długości około 22 nukleotydów), które biorą udział w regulacji potranskrypcyjnej poprzez zmianę translacji informacyjnego RNA i wpływają na ekspresję genów² i są uwalniane do krążenia zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych. Ilościowa ekspresja specyficznych miRNA może być powiązana z patologią, a niektóre miRNA wykazują wysoką specyficzność tkankową i chorobową¹. W chorobach sercowo-naczyniowych miRNA stały się atrakcyjnymi kandydatami jako nowe biomarkery, ponieważ są niezwykle stabilne w surowicy i można je łatwo określić ilościowo za pomocą metodologii PCR³. Potencjalna wartość miRNA jako biomarkerów zawału mięśnia sercowego została oceniona w małych badaniach, ale brakuje walidacji w dużych kohortach². Na przykład miR-499 ulega silnej ekspresji w mięśniu sercowym i wykazano, że jest znacznie zwiększony w AMI^4,5,6. Ponadto reguluje zaprogramowaną śmierć komórki (apoptozę) i różnicowanie kardiomiocytów, a tym samym bierze udział w kilku mechanizmach zgodnie z klasą AMI⁷. Poza kilkoma małymi badaniami wykazującymi wyższość i przyrostową wartość miRNA w diagnostyce AMI, wyższość lub równość z troponinami sercowymi o wysokiej czułości nie została jeszcze udowodniona w badaniach na dużą skalę^2,5,6,8. W związku z tym potrzebne są bardziej prospektywne badania w dużych kohortach, aby ocenić potencjalną wartość diagnostyczną miRNA. Dodatkowo, metody kwantyfikacji miRNA muszą być zoptymalizowane i ustandaryzowane przy użyciu porównywalnych protokołów⁹. Standaryzowane testy mogą zmniejszyć niespójne wyniki i mogą pomóc miRNA stać się potencjalnymi biomarkerami do rutynowego zastosowania klinicznego, ponieważ biomarkery muszą być określone ilościowo w powtarzalny sposób, aby zapewnić ich zastosowanie kliniczne.

Ostatnio wprowadzono dPCR jako analizę punktu końcowego. Dzieli próbkę na około 20 000 indywidualnych reakcji¹⁰. System dPCR wykorzystuje następnie matematyczną analizę statystyczną Poissona sygnałów fluorescencyjnych (reakcje pozytywne i negatywne), umożliwiając bezwzględną kwantyfikację bez krzywej standardowej¹⁰. Łącząc dPCR z fluorescencyjnymi sondami hydrolizy, możliwa jest wysoce specyficzna bezpośrednia bezwzględna kwantyfikacja miRNA. Wykazano, że cyfrowa reakcja łańcuchowa polimerazy wykazuje lepsze właściwości techniczne (w tym zmniejszoną zmienność, zwiększoną odtwarzalność z dnia na dzień, wysoki stopień liniowości i wysoką czułość) do ilościowego określania poziomów miRNA w krążeniu w porównaniu z ilościowym PCR^10,11. Te doskonałe właściwości techniczne mogą pomóc w złagodzeniu obecnych ograniczeń w stosowaniu krążących miRNA jako biomarkerów i mogą prowadzić do ustanowienia miRNA jako biomarkerów w dużych, wieloośrodkowych badaniach klinicznych układu sercowo-naczyniowego i ogólnie jako metody diagnostycznej. W poprzednim badaniu niedawno zastosowaliśmy dPCR do bezwzględnej kwantyfikacji krążących miRNA u pacjentów z AMI i byliśmy w stanie wykazać lepszy potencjał diagnostyczny w porównaniu z kwantyfikacją miRNA za pomocą qPCR¹².

W tej publikacji chcemy pokazać, że użycie dPCR jest dokładną i powtarzalną metodą bezpośredniego oznaczania ilościowego krążących miRNA układu sercowo-naczyniowego. Bezwzględna kwantyfikacja poziomów miRNA w surowicy za pomocą cyfrowego PCR wykazuje potencjał do zastosowania w dużych, wieloośrodkowych badaniach klinicznych dotyczących układu sercowo-naczyniowego. W niniejszej publikacji szczegółowo opisujemy, jak skutecznie przeprowadzić digital PCR oraz jak wykryć bezwzględną liczbę kopii miRNA w surowicy.

Protokół

1. Ekstrakcja miRNA z osocza/surowicy

Uwaga: Aby odpowiednio określić ilościowo miRNA, kluczowym krokiem jest prawidłowa izolacja mikroRNA z osocza/surowicy. Kluczową rzeczą, o której należy pamiętać, zwłaszcza że istnieją różne protokoły, jest przestrzeganie tego samego przepływu pracy podczas przetwarzania próbek. W tym protokole miRNA jest ekstrahowane z 50 μl surowicy. Nie używaj więcej niż 200 μl, ponieważ ogranicza to prawidłowy proces ekstrakcji.

1. Przygotować surowicę lub rozmrozić zamrożone próbki.
2. Dodać 250 μl (5 objętości) komercyjnego odczynnika do lizy do 50 μl surowicy. Wspomagaj lizę poprzez wirowanie. Umieść probówkę z lizatem na stole w temperaturze pokojowej na 5 minut.
3. Uzupełnij lizat 3,5 μl kontroli kolców (1,6 x 10⁷ kopii/μl) i wymieszaj je przez wirowanie.
4. Dodać 50 μl chloroformu (tj. taką samą ilość jak w wyjściowej próbce surowicy) w celu rozdzielenia faz. Energicznie potrząsaj probówką przez 15 sekund. Umieść probówkę na stole w temperaturze pokojowej na 2 - 3 minuty.
5. W celu separacji faz odwirować probówkę o sile 12 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 min.
   Uwaga: Próbki są teraz rozdzielane na górną fazę wodną zawierającą RNA, białą interfazę i dolną, różową fazę organiczną.
6. Przenieść górną fazę wodną (100 μl) zawierającą RNA do nowej probówki. Nie przenoś żadnego białego materiału interfazowego, ponieważ fałszuje to prawidłową liczbę RNA.
7. Dodać 150 μl (tj. 1,5 razy więcej niż objętość przeniesionej próbki) 100% etanolu. Wymieszaj materiały, pipetując je w górę i w dół. Nie odwiruj ich i szybko przejdź do następnego kroku.
8. Pobrać pipetą 250 μl próbki na dostępną w handlu kolumnę wirową w probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Zamknij pokrywę. Odwirować kolumnę przy >8 000 x g w temperaturze pokojowej przez 15 s. Odrzuć przepływ.
9. Dodać 700 μl komercyjnego buforu do mycia nr 1 do kolumny wirowej. Zamknij pokrywę i odwiruj kolumnę przy >8 000 x g w temperaturze pokojowej przez 15 s. Wyrzucić przepływowy bufor myjący.
10. Dodać 500 μl komercyjnego buforu myjącego nr 2 do kolumny wirowej. Zamknij pokrywę i odwiruj kolumnę przy >8 000 x g w temperaturze pokojowej przez 15 s. Wyrzucić przepływowy bufor myjący.
11. Odpipetować 500 μl 80% etanolu do kolumny wirowej. Zamknij pokrywkę, odwiruj kolumnę przy >8 000 x g w temperaturze pokojowej przez 2 minuty. Wyrzuć probówkę zbiorczą z przepływem.
12. Przenieść kolumnę wirującą do nowej probówki zbiorczej o pojemności 2 ml. Odwirować kolumnę z pełną prędkością z otwartą pokrywą, aby wysuszyć membranę. Wyrzuć probówkę zbiorczą z przepływem.
13. Przenieś kolumnę wirową do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml. Eluuj RNA, nakładając 30 μl wody wolnej od RNaz bezpośrednio na środek membrany. Zamknij pokrywę. Odwirować kolumnę z pełną prędkością przez 1 minutę.
14. Przechowywać RNA w temperaturze -70 °C.
    Uwaga: Przechowywanie oczyszczonego RNA w wodzie wolnej od RNaz w temperaturze od -70 °C do -20 °C zapewnia brak degradacji RNA przez 1 rok. Zgodnie z protokołem producenta, minimalna ilość wody wolnej od RNaz do rozcieńczenia RNA wynosi 10 μL. Użycie mniej niż 10 μL może niewystarczająco nawodnić błonę i zmniejszyć całkowitą wydajność RNA.

2. Odwrotna transkrypcja

Uwaga: Komplementarne DNA (cDNA) zostało zsyntetyzowane przy użyciu następującego protokołu 15 μL odwrotnej transkrypcji (RT) (całkowita objętość reakcji).

1. Rozmrozić zestaw RT na lodzie. Przechowuj enzymy w zamrażarce tak długo, jak to możliwe, aby zapobiec ich degradacji i odwiruj je przed użyciem. Rozmrozić startery RT na lodzie i odwirować je przed użyciem.
2. Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z opisem w tabeli 1.
3. Połączyć 10 μl mieszanki głównej i 5 μl wyekstrahowanego RNA na dołek w 96-dołkowej płytce.
4. Odwirować płytkę dołka przy 2 000 x g w temperaturze 4 °C przez 2 minuty.
5. Do odwrotnej transkrypcji należy użyć protokołu cyklu termicznego opisanego w Tabeli 2.
   Uwaga: Jak opisano poniżej, cDNA może być bezpośrednio przetwarzane w cyfrowym urządzeniu do PCR (patrz Tabela materiałów); alternatywnie może być przechowywany w temperaturze -20 °C.

3. Wytwarzanie kropelek i cyfrowy PCR

Uwaga: Digital PCR został przeprowadzony przy użyciu następującego protokołu 40 μL.

1. Rozmrozić komercyjną mieszaninę dPCR, przygotowane cDNA i startery PCR na lodzie. Odwiruj je na krótko przed użyciem.
2. Przygotować mieszankę wzorcową zgodnie z opisem w tabeli 3.
3. Dodać 1,33 μl/dołek produktu RT i krótko odwirować.
4. Pobrać pipetę po 20 μl próbki do każdego dołka kasety 8-dołkowej (średni rząd).
   Uwaga: Jeśli kaseta z 8 dołkami nie jest całkowicie wypełniona, wypełnij pozostałe studzienki kontrolami bez matrycy (NTC), które pomijają cDNA (tj. produkt RT wytwarzany z wodą zamiast wyekstrahowanego RNA) lub komercyjnym buforem dPCR. NTC służy jako kontrola zanieczyszczeń. W pozostałych studniach nie wolno używać wody, ponieważ pogorszy to jakość tworzenia się kropel.
5. Odpipetować 70 μl oleju z generacji kropelek do sond do szybów naftowych (dolny rząd) kasety 8-dołkowej.
6. Umieść uszczelkę na górze kasety 8-dołkowej i umieść kasetę w generatorze kropel. Zamknij generator kropel. Poczekaj, aż 3 kontrolki zaświecą się na zielono.
   Uwaga: Kropelki są teraz generowane.
7. Ostrożnie i powoli przenieść 40 μl próbki uformowanej kropelkami (górny rząd) do oddzielnych studzienek na płytce 96-dołkowej za pomocą pipetowania.
8. Po zakończeniu tworzenia kropel na próbkach należy uszczelnić płytkę PCR folią dPCR do przekłuwania w temperaturze 180 °C przez 4 sekundy.
9. Umieścić uszczelnioną folią płytkę PCR w cyklerze i poddać ją cyklicznie zgodnie z opisem w tabeli 4, z szybkością narastania 2,5 °C/s.

4. Odczyt i analiza kropelek

1. Przenieś płytkę z termocyklera na podstawę uchwytu na płytkę. Dokręć płytkę do PCR, umieszczając górną część uchwytu płytki na płytce PCR.
2. Uruchom komercyjne oprogramowanie dPCR.
3. Wprowadź nazwę próbki, nazwę eksperymentu i cel w konfiguracji. Wybierz bezwzględną kwantyfikację.
4. Rozpocznij odczyt kropli, klikając przycisk URUCHOM. Wybierz FAM/HEX lub FAM/VIC jako chemię detekcji podczas pracy z sondami hydrolizy.
   Uwaga: Komercyjne oprogramowanie dPCR automatycznie przeanalizuje dane.
5. Sprawdź liczbę kropel w tabeli wyników, aby upewnić się, że krople są prawidłowo generowane.
6. Zaznacz wszystkie dołki z tym samym ilościowo oznaczonym miRNA i kliknij ANALIZUJ. Użyj plamy 2D, aby oznaczyć dodatnie krople i ręcznie skorygować automatycznie analizowane dane (rysunek 1).

5. Prawidłowe obliczenia na próbce

1. Znormalizować próbkę, mnożąc próbkę przez współczynnik normalizacji (NF).
   NF = mediana [pomiary C. elegans miR-39]_{wszystkie próbki}/[C. elegans miR-39]_{podana próbka}
2. Obliczyć końcowe stężenie miRNA w surowicy, dostosowując do współczynników rozcieńczenia (DF).
   [miRNA]_final = [miRNA]_{wartość surowa} x DF_RT x DF_dPCR x DF_Ex
   gdzie:
   [miRNA]_{wartość surowa} = miRNA oznaczone ilościowo za pomocą komercyjnego oprogramowania dPCR;
   DF_RT = współczynnik rozcieńczenia matrycy w odwrotnej transkrypcji;
   DF_dPCR = współczynnik rozcieńczenia matrycy w dPCR;
   DF_Ex = współczynnik rozcieńczenia w ekstrakcji.

6. Seria rozcieńczeń syntetycznych oligonukleotydów

1. Rozmrozić liofilizowany syntetyczny oligonukleotyd na lodzie. Krótko odwirować.
2. Rozcieńczyć liofilizowany syntetyczny oligonukleotyd w wodzie wolnej od nukleaz do końcowego stężenia 10 pmol/μL. Krótko odwirować.
3. Rozcieńczyć go w wodzie wolnej od nukleaz, jak opisano w Tabeli 5. Odwirować krótko rozcieńczenie między każdym etapem rozcieńczania przy 8 000 x g przez 10 s.
4. Kontynuuj odwrotną transkrypcję zgodnie z opisem w kroku 2 i analizuj próbki za pomocą cyfrowego PCR zgodnie z opisem w kroku 3 i kroku 4.

Wyniki

Cyfrowy PCR w połączeniu z fluorescencyjnymi sondami hydrolizy umożliwia badaczom bezpośrednie ilościowe określenie bezwzględnych ilości określonych miRNA w kopiach/μL. Ponieważ próbka w dPCR jest podzielona na około 20 000 indywidualnych reakcji PCR, dPCR nie wymaga technicznych powtórzeń¹⁰. System dPCR wykorzystuje matematyczną analizę statystyczną Poissona sygnałów fluorescencyjnych (różniących się między reakcjami pozytywnymi i negatywnymi), umożliwiając bezwzg...

Dyskusja

Digital PCR to stosunkowo nowa metoda PCR w punkcie końcowym, która umożliwia bezpośrednią bezwzględną kwantyfikację kwasów nukleinowych w próbce. Metoda ta ma szczególne zalety, w tym zmniejszoną zmienność, zwiększoną powtarzalność w ciągu dnia i doskonałą czułość^11,12. Ponadto, ze względu na podział próbki na około 20 000 pojedynczych reakcji i analiz punktów końcowych, dPCR jest bardziej odporny na substancje zakłócające w PCR w porównaniu z ilościowym RT-PCR<...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ekstrakcja RNA
miRNeasy Serum/Plasma Kit (50)	Qiagen-Sample & Assay Technologies, Hilden, Deutschland	217184	Zestaw do ekstrakcji mikroRNA. Zestaw zawiera komercyjny bufor RWT (nazywany numerem jeden w manuskrypcie)  i RPE (nazywany numerem dwa w rękopisie).
miRNeasy Serum/Plasma Spike-in-Control; miRNA Syn-cel-miR-39; 10pmol	Qiagen-Próbka i Assay Technologies, Hilden, Deutschland	219610	Spike-in do normalizacji, sekwencja: 5'-UCACCGGGUGUAAUCAGCUUG-3'
odwrotna transkrypcja
Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA TaqMan (1000 reakcji)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4366597	Zestaw do odwrotnej transkrypcji mikroRNA
TaqMan Testy mikroRNA M	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Testy stosowane w odwrotnej transkrypcji
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	testu 001352
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Numer testu 000200
Płytka PCR, 96-dołkowa, segmentowa, półspódniczka	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	AB0900	96-dołkowa płytka do odwrotnej transkrypcji
Microseal ' B’ pieczęć Uszczelki	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	MSB1001	Folia zapewniająca prawidłowe przechowywanie
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler używany do odwrotnej transkrypcji
Droplet Digital PCR
100 nmol RNA oligo has-miR-499-5p	Zintegrowane technologie DNA	Niestandardowe	Sekwencja: 5'-phos-UUAAGACUUGCAGUGUGUGUUU-3'ddPCR
Supermix do sond (bez dUTP)	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863024	Supermix stosowany w testach
mikroRNA TaqMan	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Testy stosowane w cyfrowym PCR (sonda do hydrolizy fluorescencyjnej)
has-miR-499 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Numer testu 001352, komercyjne startery
cel-miR-39 (750 RT/750 PCR rxns)	Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, USA	4440887	Numer testu 000200, komercyjne startery
Wkłady i uszczelki DG8	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864007	Kartridż pobiera do 8 próbek do generowania kropel
Wkład DG8 Holder	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863051	Mieści wkłady do generowania kropel
Olej do generowania kropel	do sond Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863005	Olej stosowany w
96-dołkowych płytkach ddPCR	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	12001925	96-dołkowa płytka do
zgrzewania płytek ddPCR PCR, foliowa, przebijalna	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814040	Folia przebijalna, kompatybilna z czytnikiem kropel
ddPCR Czytnik kropel	Olej Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863004	Olej używany do odczytu kropel
QX100 lub QX200 Generator kropel	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863002	Generator kropel, generuje kropelki z emulsji próbka/olej
PX1 PCR Uszczelniacz	płytek Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1814000	Uszczelnia płytkę przed PCR
C1000 Touch Thermal Cycler	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1851196	Cycler używany do
czytnika kropel ddPCR QX100 lub QX200	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863003	Odczytuje kropelki PCR-dodatnie i PCR-ujemne za pomocą detektora
optycznegoKontrola buforowa ddPCR dla sond	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1863052	Ślepa kontrola  oraz do napełnienia pozostałych studzienek 8-dołkowej kasety kasetowej
Software
QuantaSof Software	Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA	1864011	Program do odczytu kropel
Prism Windows 5	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA		Program do analizy statystycznej