Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Analiza N-glikanów z odmian Raphanus sativus przy użyciu PNGazy H+

6.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57979

⸱

25 czerwca 2018

 ,  ,  ,  , 
1Glycomics and Glycan Bioengineering Research Center (GGBRC), College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, 2College of Life Science, Nanjing Agricultural University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy prostą i szybką metodę przygotowania i analizy N-glikanów z różnych odmian rzodkiewki (Raphanus sativus).

Streszczenie

W ostatnich latach dużym zainteresowaniem poświęcono ugrupowania węglowodanowe roślin, ponieważ są one potencjalnym źródłem reakcji krzyżowych, wywołujących alergie odpowiedzi immunologicznych. Ponadto struktury węglowodanowe odgrywają również kluczową rolę w metabolizmie roślin. W tym miejscu przedstawiamy prostą i szybką metodę przygotowania i analizy N-glikanów z różnych odmian rzodkiewki (Raphanus sativus) przy użyciu N-glikanazy specyficznej dla uwalniania struktur węglowodanowych pochodzenia roślinnego. Aby to osiągnąć, surowe osady kwasu trichlorooctowego homogenatów rzodkiewki potraktowano PNGazą H+ i znakowano za pomocą 2-aminobenzamidu jako znacznika fluorescencyjnego. Znakowane próbki N-glikanów zostały następnie przeanalizowane za pomocą ultrasprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) i spektrometrii mas z desorpcją laserową wspomaganą matrycą i jonizacją czasu przelotu (MALDI-TOF) w celu szczegółowej oceny strukturalnej i ilościowego określenia względnej obfitości struktur N-glikanów pochodzących z rzodkiewki. Protokół ten może być również wykorzystany do analizy N-glikanów z różnych innych gatunków roślin i może być przydatny do dalszych badań nad funkcją i wpływem N-glikanów na zdrowie człowieka.

Wprowadzenie

N-glikany w roślinach przyciągnęły coraz większą uwagę w ostatnich latach, ponieważ poprzednie badania wykazały, że N-glikany są potencjalnym źródłem immunologicznych reakcji krzyżowych, które mogą wywoływać reakcje alergiczne1,2. Wykazano wcześniej, że N-glikany na glikoproteinach roślinnych mogą wpływać na aktywność katalityczną3,4, termostabilność i fałdowanie5,6 lub subkomórkowa lokalizacja i wydzielanie7. Aby skorelować struktury glikanów z ich odpowiednimi funkcjami, N-glikany muszą najpierw zostać uwolnione z glikoprotein chemicznie lub enzymatycznie. Klasyczną metodą chemiczną uwalniania zarówno N-, jak i O-glikanów jest eliminacja β, w której alkalicznej próbce towarzyszy redukcja borowodorkiem w celu uzyskania aldytolu8. Jednak procedura ta wyklucza znakowanie fluoroforem i powoduje znaczny rozpad jednostek monosacharydowych od redukującego końca struktury glikanu. Deglikozylacja chemiczna oparta na traktowaniu wodorotlenkiem/węglanem amonu jest również powszechnie stosowaną metodą alternatywną9. Żadna z tych chemicznych metod uwalniania nie powoduje degradacji nienaruszonych białek, co umożliwia analizę spektrometryczną mas nieznakowanych pul glikanów bez ingerencji fragmentów peptydów w tym samym zakresie mas. Jednak jedną z wad tych metod jest zwiększona szybkość degradacji α1,3-fukozylowanych N-glikanów, powszechnej struktury węglowodanowej występującej w roślinach10. Alternatywnie, szeroko stosowane są również enzymatyczne metody uwalniania z wykorzystaniem peptydowo-N-glikanaz (PNGazy, EC 3.5.1.52). Rekombinowana PNGaza F (z Flavobacterium meningosepticum) jest najczęstszym wyborem i pozwala na uwalnianie wszystkich typów N-glikanów, z wyjątkiem struktur zawierających rdzeń α1,3 fukozy11,12. Dlatego PNGaza A (wyizolowana z nasion migdałów) jest zwykle używana do analizy N-glikanów roślinnych13. Jednak enzym ten deglikozyluje tylko glikopeptydy pochodzące z proteolitu i nie jest w stanie deglikozylować natywnych glikoprotein14. W związku z tym przed dalszą analizą wymagane jest wieloetapowe badanie próbki, co powoduje rozległe straty glikanów, zwłaszcza tych o niskiej obfitości15. Ogólnym celem tej metody jest przedstawienie zoptymalizowanego przepływu pracy w zakresie uwalniania N-glikanów i znakowania fluorescencyjnego w prosty i niezawodny sposób. Podstawowym założeniem jest to, że PNGaza H+, która została niedawno odkryta w Terriglobus roseus i może być rekombinacyjnie wyrażana w E. coli, może hydrolizować N-glikany bezpośrednio z rusztowania białkowego w kwaśnych warunkach16. Kluczową zaletą stosowania PNGazy H+ w porównaniu z alternatywnymi metodami jest to, że reakcje znakowania fluorescencyjnego można przeprowadzać w tej samej probówce reakcyjnej bez zmiany reakcyjnych17,18. Proste warunki przygotowania i wysoki odzysk oligosacharydów o niskiej obfitości sprawiają, że metoda ta jest cennym narzędziem w analizie N-glikanów. Protokół ten jest odpowiedni do analizy N-glikanów z różnych gatunków roślin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Pobieranie próbek

  1. Kup różne odmiany świeżej rzodkiewki (Raphanus sativus L.).

2. Izolacja białka z rzodkiewki

  1. Homogenizuj około 100 g świeżej rzodkiewki za pomocą blendera kuchennego przez 10 minut.
  2. Przenieść zawiesinę do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i odwirować przy 14 000 × g w temperaturze 4 °C przez 20 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału.
  3. Ostrożnie przenieść supernatant do nowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml i dodać równą objętość 2 M roztworu kwasu trichlorooctowego (TCA).
    UWAGA: Dodanie TCA spowoduje wytrącenie rozpuszczalnych (gliko)białek.
  4. Odwirować w temperaturze 14 000 × g w temperaturze 4 °C przez 30 minut i usunąć supernatant z granulowanych (gliko) białek.
  5. Przemyć osad 20 ml wody dejonizowanej i odwirować w temperaturze 14 000 × g w temperaturze 4 °C przez 5 minut w celu usunięcia rozpuszczalnych oligosacharydów i polisacharydów.
  6. Powtórz krok 2.5. cztery razy.
  7. Ponownie zawiesić granulki w 1 ml wody dejonizowanej i przenieść do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.

3. Przygotowanie N-glikanów

  1. Zmieszać 50 μl roztworu białkowego z kroku 2.7. (równe 5 g świeżej rzodkiewki) z 0,2 mU rekombinowanej PNGazy H+ w 10 mM kwasu octowego.
  2. Mieszaninę reakcyjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 12 godzin. Po inkubacji odwirować przy 14 000 × g przez 5 minut, aby usunąć dodatkowe białko i enzym.
  3. Przenieść supernatant do świeżej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.

4. Oczyszczanie N-glikanów

  1. Przygotować kolumnę do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) w celu wzbogacenia N-glikanów i usunięcia soli i innych zanieczyszczeń z mieszaniny reakcyjnej, zwiększając selektywność fluorogenicznego środka znakującego 2-aminobenzamid (2-AB) do derywatyzacji N-glikanów.
    1. Dodaj 3 ml wody dejonizowanej, aby umyć kolumnę.
    2. Dodać 3 ml 80% roztworu acetonitrylu zawierającego kwas trifluorooctowy (TFA, 0,1% v/v) w celu uaktywnienia kolumny SPE.
    3. Dodaj 3 ml wody dejonizowanej, aby zrównoważyć kolumnę SPE.
  2. Przenieść próbkę z kroku 3.3 na kolumnę i odrzucić przepływ
    3. .
  3. Dodaj 1,5 ml wody dejonizowanej, aby umyć kolumnę i wyrzuć przepływ.
  4. Uwolnione N-glikany należy wypłukać z kolumny za pomocą 1,5 ml wodnego 20% roztworu acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA (v/v) do probówki wirówkowej o pojemności 2 ml.
  5. Usunąć rozpuszczalnik przez odparowanie odśrodkowe w temperaturze pokojowej. Odparowywać aż do całkowitego wyschnięcia próbki.

5. Derywatyzacja fluorescencyjna N-glikanów

  1. Przygotować 1 ml roztworu 2-AB, składającego się z 35 mM 2-AB i 0,1 M cyjanoborowodorku sodu w roztworze dimetylosulfotlenku dimetylu/kwasu octowego (7:3, v/v).
  2. Dodać 5 μl roztworu 2-AB do wysuszonych próbek (etap 4.5) pochodzących z sześciu różnych rzodkiewki. Wirować każdą próbkę, aż do całkowitego rozpuszczenia.
  3. Inkubować mieszaninę przez 2 godziny w temperaturze 65 °C.
  4. Pozostawić próbkę do ostygnięcia do temperatury pokojowej przez 5 minut, a następnie dodać 5 μl wody dejonizowanej i 40 μl acetonitrylu. Odwirować probówki o stężeniu 14 000 x g przez 3 minuty.
  5. Przenieść 48 μl z supernatantu do 300 μl fiolki HPLC o wysokim odzysku. Próbki derywatyzowanego N-glikanu należy przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do jednego miesiąca.

6. Profilowanie N-glikanów metodą HILIC-UPLC

  1. Analizuj próbki za pomocą standardowego systemu UPLC podłączonego do detektora fluorescencyjnego online ustawionego na długości fal wzbudzenia/emisji odpowiednio 330 nm/420 nm.
  2. Do analizy należy użyć kolumny glikanowej do chromatografii cieczowej z oddziaływaniem hydrofobowym (HILIC)-UPLC w temperaturze kolumny 60 °C.
  3. Przygotować rozpuszczalnik A, rozcieńczając 50 ml roztworu podstawowego (1 M roztwór mrówczanu amonu, pH 4,5) 950 ml wody przeznaczonej do chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LCMS). Przygotować roztwór podstawowy w następujący sposób:
    1. Dodać 43 ml kwasu mrówkowego do 700 ml H2O klasy LCMS.
    2. Dostosuj pH do 4,5 przez stopniowe dodawanie wodnego roztworu amoniaku (25% w/w).
    3. Przenieść rozpuszczalnik do cylindra miarowego i napełnić do 1000 ml preparatem H2O. Przechowywać w temperaturze 4-6 °C przez okres do 3 miesięcy.
  4. Użyj acetonitrylu klasy LCMS jako rozpuszczalnika B.
  5. Oddzielić N-glikany za pomocą następującej elucji gradientowej:
    1. Zacznij od dodania 95% rozpuszczalnika B do rozpuszczalnika A. Ustaw natężenie przepływu na 0,5 ml/min w zakresie od 0 do 44,5 min.
    2. Od 0 min do 6 min stopniowo zmniejszaj udział rozpuszczalnika B z gradientem liniowym do 78%.
    3. Od 6 min do 44,5 min stopniowo zmniejszaj udział rozpuszczalnika B z gradientem liniowym do 55,9%.
    4. Od 44,5 min do 46,5 min gwałtownie zmniejszyć udział rozpuszczalnika B z gradientem liniowym od 55,9% do 0% i utrzymać na poziomie 0% przez 2 min, a następnie rozpocząć płukanie kolumny. Zmniejsz natężenie przepływu do 0,25 ml/min z 44,5 do 55 min.
    5. Przemyć kolumnę dalej, zwiększając rozpuszczalnik B do 95% z 48,5 min do 50,5 min i utrzymywać na poziomie 95% przez 4,5 min.
    6. Ponownie wyrównać kolumnę do warunków początkowych 95% rozpuszczalnika B przy 0,5 ml/min od 50,5 do 57 min.
  6. Wstrzyknąć 45 μl próbki do systemu UPLC.
  7. Elucja N-glikanów za pomocą UPLC z czasem retencji od 15 do 40 minut.
  8. Zebrać każdą zaobserwowaną frakcję pikową UPLC za pomocą probówek wirówkowych o pojemności 2 ml i wysuszyć próbki przez odparowanie odśrodkowe.
  9. Wstrzyknąć około 1 pmol wzorca dekstranu znakowanego 2-AB (2-20 jednostek glukozy), aby skalibrować profilowanie roślinnego N-glikanu i przypisać ich czasy elucji do standaryzowanych jednostek glukozy.

7. Analiza MS MALDI-TOF

  1. Rozpuścić próbki z kroku 6.8 w 5 μl wody klasy LCMS. Zmieszać 1 μl roztworu próbki i 1 μl roztworu 6-aza-2-tiotyminy (ATT) (0,3% w/v w 70% v/v wodnym roztworze acetonitrylu) i odpipetować mieszaninę na nośnik próbki MALDI-TOF.
  2. Analizować próbki za pomocą spektrometru mas MALDI-TOF w trybie jonów dodatnich, naciskając przycisk Start.
  3. Analizuj widma masowe za pomocą dołączonego oprogramowania do analizy MALDI-TOF-MS.
  4. Zinterpretuj widma za pomocą oprogramowania do interpretacji glikanów o otwartym kodzie źródłowym19. Ustaw parametry wyszukiwania dla etykietowania 2-AB, [M+Na]+ i ustaw parametr dokładności na 2,0 Da.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia schematyczny przegląd opisanego protokołu, obejmujący izolację (gliko-)białek z rzodkiewki, przygotowanie N-glikanów, analizę UPLC oraz analizę MALDI-TOF-MS tych składników. Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne chromatogramy UPLC pochodnych N-glikanów analizowanych odmian rzodkiewki. Rysunek 3 przedstawia uzyskane wyniki struktur N-glikanów pochodnych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiony przez nas protokół pozwala na porównanie profili N-glikanów różnych odmian rzodkiewki. Istotną zaletą tej metody w porównaniu z istniejącymi protokołami jest to, że nie są wymagane żadne zmiany buforowe między enzymatycznym uwalnianiem N-glikanów a reakcją derywatyzacji z użyciem 2-AB. Najbardziej krytycznym etapem tej procedury jest oczyszczanie N-glikanów za pomocą kolumny SPE, ponieważ brak usunięcia soli lub innych zanieczyszczeń z mieszaniny reakcyjnej może negatywnie wpłynąć na wydaj...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (granty o numerach 31471703, A0201300537 i 31671854 dla J.V. i L.L., granty o numerze 31470435 dla G.Y.) oraz Plan 100 Zagranicznych Talentów (grant numer JSB2014012 dla J.V.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
< silny> chemiczny: < / silny>
kwas trichlorooctowy SCR, Szanghaj80132618
Kwas octowy lodowatyHuada, Kanton64-19-7
AcetonitrylOdczynnik ogólnyG80988C
Kwas trifluorooctowyEnergetycznyW810031
2-aminobenzamidHeowns, TianjinA41900
Cyjanoborowodorek soduJ& K Scientific Ltd314162
DimetylosulfotlenekHuada, Kanton67-68-5
Drabinka dekstranowa znakowana 2AB, 200 pmolAgilent TechnologiesAT-5190-6998
6-Aza-2-tiotymina Sigma275514
Narzędzia/Materiały:
Blender kuchennyNiedźwiedź, Wirówka GuangzhouLLJ-A10T1
Parownik odśrodkowy TechcompCT15RT
Hualida, kolumna TaicangLNG-T120
SPESupelcoSupelclean ENVI Carb SPE kolumna
Spektrometr masowy MALDI-TOFBrukerAutoflex
HPLC Analysis:< / strong>
fiolka HPLC o wysokim odzyskuAgilent Technologies # 5188-2788
System HPLCShimadzuNexera
do HPLCShimadzuRF-20Axs 
Piec kolumnowyHengxinCO-2000
HPLC KolumnaWodyAcquity UPLC BEH kolumna glikanowa2,1 i razy; 150 mm, 1,7 μ m wielkość cząstek
Woda klasy LCMSMerck Millipore#WX00011
Acetonitryl klasy LCMSMerck Millipore# 100029
Kwas mrówkowyAladynF112034
Roztwór amoniakuAladdinA112080
chemiczny Detektor fluorescencji

Bibliografia

  1. Altmann, F. The Role of Protein Glycosylation in Allergy. International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).
  2. Van Ree, R., et al. β (1, 2)-xylose and α (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens. Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).
  3. Biswas, H., Chattopadhyaya, R. Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation. Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).
  4. Lefebvre, B., et al. Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane. Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).
  5. Severino, V., et al. The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves. Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).
  6. Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function. Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).
  7. Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins. Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).
  8. Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates. Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).
  9. Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis. Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).
  10. Triguero, A., et al. Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants. Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).
  11. Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. Peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached α1 → 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue. European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).
  12. Fan, J. -Q., Lee, Y. C. Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).
  13. Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-β-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans. European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).
  14. Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity. Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).
  15. Wang, T., Voglmeir, J. PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis. Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).
  16. Wang, T., et al. Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A. Bioscience Reports. 34 (6), 00149(2014).
  17. Du, Y. M., et al. Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).
  18. Wang, T., Hu, X. -C., Cai, Z. -P., Voglmeir, J., Liu, L. Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).
  19. Ceroni, A., et al. GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans. Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Analiza N-glikanówodmiany rzodkiewnikarozdział UPLCspektrometria mas MALDI-TOFznakowanie 2-aminobenzamidemekstrakcja do fazy stałejwytrącanie kwasem trójchlorooctowympochodnązowanie fluorescencyjneglikowidzy roślin
Analiza N-glikanów z odmian Raphanus sativus przy użyciu PNGazy H+
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.