Artykuł metodologiczny

Prosta chirurgiczna indukcja przewodzeniowego ubytku słuchu z weryfikacją za pomocą wizualizacji otoskopu i behawioralnej reakcji na oklaski u szczurów

DOI:

10.3791/57993

⸱

26 października 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Instituto de Neurobiología, Universidad Nacional Autónoma de México, México, 2State Key Laboratory of Marine Pollution (SKLMP), City University of Hong Kong, Hong Kong, 3Department of Biomedical Sciences, College of Veterinary Medicine and Life Sciences, City University of Hong Kong, Hong Kong, 4Department of Physics, City University of Hong Kong, Hong Kong, 5Department of Clinical Oncology, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong, 6Department of Materials Science and Engineering, City University of Hong Kong, Hong Kong

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do ustalenia powtarzalnej indukcji przewodzeniowego ubytku słuchu poprzez chirurgiczne nakłucie błony bębenkowej i weryfikację za pomocą wizualizacji otoskopu oraz oceny behawioralnej za pomocą zaskoczenia klaskania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przewodzeniowy ubytek słuchu (CHL) jest powszechnym ubytkiem słuchu u ludzi. Celem protokołu jest opisanie prostej procedury chirurgicznej indukcji CHL u gryzoni. Protokół demonstruje CHL przez nakłucie błony bębenkowej. Weryfikacja operacji CHL polegała na badaniu otoskopowym i ocenie behawioralnej na podstawie reakcji na zaskoczenie, zarówno powtarzalne, jak i wiarygodne, i są prostymi metodami wykazującymi, że wystąpił ubytek słuchu. Prosta procedura CHL jest korzystna ze względu na jej powtarzalność i elastyczność w różnych dziedzinach badań nad ubytkiem słuchu. Ograniczenia związane z wywołaniem CHL za pomocą podejścia chirurgicznego są związane z krzywą uczenia się wykonywania zabiegu chirurgicznego i pewnością badania audiologicznego. Wywołanie upośledzenia słuchu przez CHL pozwala łatwo badać objawy neuronalne i behawioralne skutki ubytku słuchu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częstość występowania ubytku słuchu u dzieci i dorosłych wynosi około 19,5%1 i 15,2%2. Jednak około 39,3% wszystkich noworodków z nieprawidłowym badaniem przesiewowym słuchu nie otrzymuje leczenia naprawczego, jak podaje Centers for Disease Control3. Ubytek słuchu jest szeroko badanym schorzeniem, a gryzoń jest solidnym modelem do badania prawidłowego słuchu i zaburzeń związanych ze słuchem4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15. Zaburzenia słuchu, takie jak przewodzeniowy ubytek słuchu (CHL), prowadzą do wzrostu krótkotrwałej depresji synaptycznej w korze słuchowej4, co skutkuje płytszymi nachyleniami psychometrycznymi związanymi z progami wykrywania modulacji częstotliwości5. Przewodzeniowe modele ubytku słuchu polegające na chirurgicznym usunięciu/przemieszczeniu młoteczka, nakłuciu błony bębenkowej (TM) lub zatyczce do uszu są łatwe do zastosowania i umożliwiają szybką indukcję modelu ubytku słuchu5,14,15,16,17,18. Celem niniejszego protokołu i metody jest zademonstrowanie prostego i powtarzalnego modelu CHL u gryzoni.

Obecny protokół jest tani (≈$$300 ze wszystkimi narzędziami) i łatwo go dostosować do różnych poszukiwań badawczych. Szczur został poddany szczegółowym ocenom anatomii ucha środkowego19,20,21,22,23, surgical approaches24, modele w zapaleniu ucha środkowego25,26,27 i regeneracja po przebiciu TM16,17,18,28,29,30, co czyni go idealnym modelem do badania ubytku słuchu. Tutaj opisano prostą procedurę indukcji CHL z weryfikacją za pomocą otoskopu i oceną behawioralną z reakcją na klaskanie w przerażenie u szczurów, która następnie może być wykorzystana do zbadania dodatkowych następstw ubytku słuchu. Zabieg CHL jest wywoływany przez chirurgiczne nakłucie stawu skroniowo-żuchwowego. Weryfikacja procedury CHL odbywa się za pomocą wizualizacji otoskopowej w celu określenia braku TM. Ocena behawioralna jest przeprowadzana przez klaskanie w dłonie przy wysokim poziomie ciśnienia akustycznego (dB) (SPL). Metoda ta była już wcześniej stosowana u różnych gryzoni. Jest łatwa do odtworzenia, powoduje silne różnice psychometryczne i zmiany w neuronalnych reakcjach fizjologicznych4,5,16,17,18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecne badanie i procedury zostały zatwierdzone przez komisje etyczne ds. badań na zwierzętach Uniwersytetu Miejskiego w Hongkongu, Uniwersytetu w Hongkongu oraz Departamentu Zdrowia Specjalnego Regionu Administracyjnego Hongkongu.

1. Zwierzęta

  1. Stosować szczury Sprague-Dawley (SD) w wieku dwóch miesięcy (N = 90, 200-250 g).
    UWAGA: Gryzonie zostały dostarczone przez akredytowaną Jednostkę Zwierząt Laboratoryjnych Uniwersytetu w Hongkongu.
  2. Utrzymuj szczury w stałej temperaturze 25 °C i wilgotności 60-70% w Zakładzie Badań nad Zwierzętami Laboratoryjnymi.
  3. Kurnik trzyma się kurnika w 12/12-godzinnych cyklach światła/ciemności z dostępem do pożywienia i wody pitnej, ad libitum.
  4. Aklimatyzować gryzonie w środowisku inwentarskim przez co najmniej jeden dzień przed zabiegiem CHL.
  5. Podnieś gryzonia za kark i znieczul go koktajlem ketaminy i ksylazyny (odpowiednio 80-100 mg/kg: 5-10 mg/kg) poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowe (połącz 1,0 ml ketaminy z 0,5 ml ksylazyny jako końcowe stężenie).
    UWAGA: Użyj 1 ml strzykawki z igłą 23-25G. Wstrzyknąć około 0,2 ml na 100 g masy ciała szczura przez 30 minut znieczulenia.
  6. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby sprawdzić odczuwanie bólu i potwierdzić prawidłowe znieczulenie. Reakcja na głębokie uszczypnięcie palca u nogi (poprzez wycofanie kończyny tylnej) wskazuje na niewystarczające znieczulenie.

2. Konfiguracja chirurgiczna

  1. Wysterylizuj cały sprzęt w autoklawie lub sterylizatorze z gorącymi szklanymi kulkami przed rozpoczęciem operacji. Oczyść obszar operacyjny 70% etanolem.
  2. Przed rozpoczęciem zabiegu należy użyć rękawiczek lateksowych i fartucha laboratoryjnego.
  3. Umieść sterylną serwetę chirurgiczną na czystej ławce (Rysunek 1A).
  4. Wysterylizuj mikronożyczki i otoskop przed zabiegiem, aby zminimalizować infekcję ucha (Ryc. 1B).
  5. Umieść mikronożyczki i otoskop w sterylnym miejscu.
  6. Umieść gryzonia w polu operacyjnym i w jednej linii z chirurgiem.
  7. Kontynuuj chirurgiczną indukcję CHL.

3. Chirurgiczna indukcja przewodzeniowego ubytku słuchu

  1. Ułóż ogon i głowę gryzonia w pozycji leżącej, głowa najbliżej chirurga.
  2. Wizualizuj lewe i prawe ucho gryzonia pod otoskopem, aby zapewnić zdrową błonę bębenkową (Rysunek 2a). Oceń zarówno prawe, jak i lewe ucho każdego gryzonia, aby zweryfikować stan zdrowia przed indukcją CHL.
  3. Chwyć helisę ucha i rozszerz zewnętrzny przewód słuchowy (tj. przewód słuchowy, zewnętrzny przewód słuchowy, w tym przypadku przewód słuchowy), aby wnętrze zostało zasłonięte i poczerniałe przez głębokość. W tym przypadku kanał słuchowy jest prostopadły do powierzchni TM.
    UWAGA: Upewnij się, że puszka słuchowa jest teraz bezpośrednio równoległa, a TM tworzy kąt prosty z osią wkładania mikronożyczek. Zostanie to zwizualizowane jako tuba bez światła. Czasami przewód słuchowy musi być przechylony pod niewielkim kątem, około 15° do płaskiej powierzchni czaszki. Dzięki temu ręka chirurga jest prostopadła do powierzchni stawu skroniowo-oddechowego.
  4. Wprowadź mikronożyczki w środek przewodu słuchowego, zwracając uwagę, aby nie ślizgać się ani nie nacinać tkanki przewodu słuchowego i postępuj nieznacznie, około ≈5 mm od środka ciemności, delikatnie popychając do przodu przez środek TM.
    UWAGA: Przebicie TM może być potwierdzone trzaskiem, gdy końcówki mikronożyczek przebijają TM. Trzaskający dźwięk można usłyszeć na filmie po około ≈ 2 minutach i 52 sekundach. To nie jest dźwięk nożycowy; jest to dźwięk przebicia TM. Zgodnie z pomiarem po analizie, "pop" jest o około ≈ 20 dB SPL większy niż dźwięk tła zarejestrowany przez mikrofon wysokiej częstotliwości. Nie ma potrzeby weryfikowania dźwięku "trzasku" w takim zakresie, wystarczy wizualizacja otoskopu. Badacz może być zmuszony do przećwiczenia upewnienia się, że podczas każdej procedury CHL słychać "trzask".
  5. Natychmiast otwórz sprężynowe mikronożyczki i obróć je trzy razy po przebiciu TM, aby zapewnić przemieszczenie głowy młoteczka z dala od TM (tylko wtedy, gdy pożądane jest przemieszczenie młoteczka).
  6. Wyjmij mikronożyczki i umieść gryzonia pod otoskopem w celu wizualizacji.
    UWAGA: Należy pamiętać, że po zabiegu chirurgicznym nie powinno dojść do znacznego krwawienia. Poddaj gryzonia eutanazji i nie przystępuj do oceny behawioralnej, jeśli wystąpi krwawienie.
  7. Wywołaj obustronną CHL, postępując jak powyżej w przeciwległym uchu.

4. Wizualizacja otoskopu

  1. Potwierdź udaną operację CHL za pomocą otoskopu przy użyciu wziernika o małej średnicy, aby uwidocznić środkowe ucho gryzonia.
  2. Oceń każdego gryzonia przed i po zabiegu chirurgicznym CHL pod otoskopem. Upewnij się, że TM jest normalna (Rysunek 2a) i uszkodzona TM po indukcji CHL (Rysunek 2b).
  3. Opieka pooperacyjna nad gryzoniem
    1. Umieść gryzonia w domowej klatce pod ciepłą lampą.
    2. Obserwuj gryzonia po indukcji CHL, aż gryzoń się poprawi.
    3. Wstrzyknij gryzoniu surowicę glukozy (dekstroza/sól fizjologiczna), aby odzyskać przytomność i umieścić gryzonia w klatce domowej w celu wyzdrowienia.
      UWAGA: Użyj igły 23G ze strzykawką 10 ml, aby wstrzyknąć 5 ml soli fizjologicznej po operacji CHL.
    4. Wstrzyknąć gryzoniu domięśniowo przeciwbakteryjną enrofloksacynę 0,05 mg/kg dwa razy w ciągu 24-godzinnego okresu rekonwalescencji.
    5. Regularnie obserwuj gryzonia pod kątem bólu, zachowania lub objawów po operacji.

5. Ocena behawioralna (walidacja indukcji CHL) - reakcja na zaskoczenie klaskaniem

  1. Potwierdź CHL (po potwierdzeniu otoskopem) 24 godziny po operacji z oceną behawioralną składającą się z testu klaśnięcia-przerażenia.
  2. Umieść szczura indukowanego CHL obok normalnego szczura w dwóch oddzielnych sąsiednich klatkach.
  3. Umieść gryzonie w cichym pomieszczeniu.
  4. Stań w odległości około 0,5 m od gryzoni i zacznij klaskać w równych odstępach czasu kilka razy (wybrano 5 klaśnięć w odstępach ponad 1 sekundy).
    UWAGA: Zaskoczenie klaskaniem wywołane klaskaniem w dłonie mierzyło ≈ 40 dB SPL większe niż dźwięk tła nagrany przez mikrofon wysokiej częstotliwości.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prosty zabieg CHL został przeprowadzony na 90 szczurach i z tej grupy 2 miały znaczne krwawienie, a 2 nie miały ubytku słuchu następnego dnia, co oceniono na podstawie behawioralnego zaskoczenia. Te cztery szczury zostały wyrzucone. Szczury należy wyrzucić zgodnie z powodami w dyskusji z powodu powikłań. Wywołanie przebicia TM i/lub przemieszczenia/usunięcia młoteczka (Rysunek 2B) wywołuje CHL, co skutkuje objawami behawioralnymi (np. CHL - brak reakcji na głośne przer...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy prostą chirurgiczną indukcję CHL z weryfikacją za pomocą wizualizacji otoskopu i behawioralnej reakcji na zaskoczenie klaskaniem u szczurów. Tutaj demonstrujemy metodę na szczurach, a wcześniej metoda ta była stosowana do myszoskoczków i myszy. Metodę można łatwo zastosować do innych gryzoni. Indukcja CHL pozwala na badanie subtelnej formy ubytku słuchu, która objawia się zmianami w korze słuchowej i psychofizycznymi objawami behawioralnymi 4,5,16,17,18.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak finansowych lub niefinansowych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez Hong Kong Research Grants Council, Early Career Scheme, Project #21201217 do C. L., dla projektu Brain mapping guided electrophysiology with applications in hearing and noise pollution research. Dziękujemy Posgrado en Ciencias Biomédicas, Instituto de Neurobiología Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) México za stypendium dla absolwentów 578458 FAM Manno.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rękawice lateksowe, poliwinylowe lub nitryloweAMMEXUżywaj rękawic niepudrowanych 8-milowe
Nożyczki Micro sprężynowe (patrz rys. 1b)RWD Life ScienceS11035-08o długości całkowitej 8,0 cm, z krawędzią tnącą 3,5 mm lub podobnymi mikrokleszkami. Wystarczą standardowe pęsety z mechanizmem sprężynowym
Otoscope mini 3000HEINE D-008.70.120MWystarczy standardowy otoskop LED
Laboratoriaszczurów lub myszyKażdy mały gryzoń 
Mała klatka dla gryzoniTecniplast1284LPotrzebujesz dwóch klatek, aby oddzielić gryzonia CHL od gryzonia słyszącego. Jeśli gryzonie są ze sobą w bezpośrednim kontakcie, będą się nawzajem przestraszyć. Wymiary klatki 365 x 207 x 140 mm, powierzchnia podłogi: 530 cm2/82.15 in2
JAX dla

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shargorodsky, J., Curhan, S. G., Curhan, G. C., Eavey, R. Change in prevalence of hearing loss in US adolescents. The Journal of the American Medical Association. 304 (7), 772-778 (2010).
  2. Lucas, J. W., Schiller, J. S., Benson, V. Summary health statistics for U.S. adults: National health interview survey, 2001. National Center for Health Statistics. Vital and health statistics. 10 (218), 1-134 (2004).
  3. Gaffney, M., Green, D. R., Gaffney, C. Newborn hearing screening and follow-up: Aare children receiving recommended services? Public Health Reports. 125 (2), 199-207 (2010).
  4. Xu, H., Kotak, V. C., Sanes, D. H. Conductive hearing loss disrupts synaptic and spike adaptation in developing auditory cortex. The Journal of Neuroscience. 27 (35), 9417-9426 (2007).
  5. Buran, B. N., et al. A sensitive period for the impact of hearing loss on auditory perception. The Journal of Neuroscience. 34 (6), 2276-2284 (2014).
  6. Finck, A., Sofouglu, M. Auditory sensitivity of the Mongolian gerbil. The Journal of Auditory Research. 6, 313-319 (1966).
  7. Finck, A. Auditory sensitivity of the Mongolian Gerbil (Merionesunguiculatus). The Journal of the Acoustical Society of America. 41 (60), 1579(1967).
  8. Finck, A., Schneck, C. D., Hartman, A. F. Jr Development of auditory function in the Mongolian gerbil. The Journal of the Acoustical Society of America. 46 (1A), 107(1969).
  9. Ryan, A. Hearing sensitivity of the Mongolian gerbil, Meriones Unguiculatis. The Journal of the Acoustical Society of America. 59, 1222-1226 (1976).
  10. Dallos, P., Harris, D., Ozdamar, O., Ryan, A. Behavioral, compound action potential, and single unit thresholds: relationship in normal and abnormal ears. The Journal of the Acoustical Society of America. 64 (1), 151-157 (1978).
  11. Kelly, J. B., Potash, M. Directional responses to sounds in young gerbils (Meriones unguiculatus. Journal of Comparative Psychology. 100 (1), 37-45 (1986).
  12. Heffner, H. E., Koay, G., Heffner, R. S. Behavioral assessment of hearing in mice--conditioned suppression. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 8, Unit 8.21D (2006).
  13. Heffner, R. S., Koay, G., Heffner, H. E. Audiograms of five species of rodents: implications for the evolution of hearing and the perception of pitch. Hearing Research. 157 (1-2), 138-152 (2001).
  14. Lupo, E. J., Koka, K., Thornton, J. L., Tollin, D. J. The effects of experimentally induced conductive hearing loss on spectral and temporal aspects of sound transmission through the ear. Hearing Research. 272 (1-2), 30-41 (2011).
  15. Liberman, M. C., Liberman, L. D., Maison, S. F. Chronic conductive hearing loss leads to cochlear degeneration. PLoS One. 10 (11), e0142341(2015).
  16. Tucci, D. L., Cant, N. B., Durham, D. Conductive hearing loss results in a decrease in central auditory system activity in the young gerbil. Laryngoscope. 109, 1359-1371 (1999).
  17. Tucci, D. L., Cant, N. B., Durham, D. Effects of conductive hearing loss on gerbil central auditory system activity in silence. Hearing Research. 155, 124-132 (2001).
  18. Cook, R. D., Hung, T. Y., Miller, R. L., Smith, D. W., Tucci, D. L. Effects of conductive hearing loss on auditory nerve activity in gerbil. Hearing Research. 164, 127-137 (2002).
  19. Albuquerque, A. A., Rossato, M., Oliveira, J. A., Hyppolito, M. A. Understanding the anatomy of ears from guinea pigs and rats and its use in basic otologic research. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 75, 43-49 (2009).
  20. Li, P., Gao, K., Ding, D., Salvi, R. Characteristic anatomical structures of rat temporal bone. Journal of Otology. 10, 118-124 (2015).
  21. Judkins, R. F., Li, H. Surgical anatomy of the rat middle ear. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 117, 438-447 (1997).
  22. Hellström, S., Salén, B., Stenfors, L. E. Anatomy of the rat middle ear. A study under the dissection microscope. Acta Anatomica (Basel). 112, 346-352 (1982).
  23. Albiin, N., Hellström, S., Salén, B., Stenfors, L. E., Wirell, S. The vascular supply of the rat tympanic membrane. The Anatomical Record. 212, 17-22 (1985).
  24. Li, P., Ding, D., Gao, K., Salvi, R. Standardized surgical approaches to ear surgery in rats. Journal of Otology. 10, 72-77 (2015).
  25. Johansson, U., Hellström, S., Anniko, M. Round window membrane in serous and purulent otitis media. Structural study in the rat. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 102, 227-235 (1993).
  26. Magnuson, K., Hellström, S. Early structural changes in the rat tympanic membrane during pneumococcal otitis media. European Archives of Oto-Rhino-Laryngology. 251, 393-398 (1994).
  27. Hellström, S., Salén, B., Stenfors, L. E. The site of initial production and transport of effusion materials in otitis media serosa. A study on rat middle ear cavity. Acta Oto-Laryngologica. 93, 435-440 (1982).
  28. Shen, Y., et al. Scaffolds for tympanic membrane regeneration in rats. Tissue Engineering Part A. 19, 657-668 (2013).
  29. Wang, A. Y., et al. Rat model of chronic tympanic membrane perforation: Ventilation tube with mitomycin C and dexamethasone. International Journal of PediatricOtorhinolaryngology. 80, 61-68 (2016).
  30. Stenfeldt, K., Johansson, C., Hellström, S. The collagen structure of the tympanic membrane: collagen types I, II, and III in the healthy tympanic membrane, during healing of a perforation, and during infection. Archives of Otolaryngology--Head & Neck Surgery. 132, 293-298 (2006).
  31. Zhao, H., et al. Temporary conductive hearing loss in early life impairs spatial memory of rats in adulthood. Brain and Behavior. 8, e01004(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Punkcja b ony b benkowejmodel szczuraprocedura chirurgicznaprzemieszczenie m oteczkaznieczulenie w zastrzyku domi niowymopieka pooperacyjnaweryfikacja utraty s uchu

Powiązane artykuły