Tutaj opisujemy nową metodę, która umożliwia długotrwałą beztlenową hodowlę ustalonych linii komórkowych. Maksymalny czas przeżycia, który został przetestowany, wynosi 17 dni. Metoda ta nadaje się do badania czynników cytotoksycznych i badania fizjologii komórek replikujących się beztlenowo.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Beztlenowy wzrost i utrzymanie linii komórkowych ssaków
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Większość powierzchni błony śluzowej wraz z punktami środkowymi w guzach i niszach komórek macierzystych to geograficzne obszary ciała, które są niedotlenione. Wcześniejsze badania wykazały, że inkubacja w warunkach normoksyjnych (5% CO2 w powietrzu) lub hipoksyjnych (niski poziom tlenu), po których następuje inkubacja beztlenowa (brak wolnego tlenu) powoduje ograniczoną żywotność (2-3 dni). Opracowano nowatorską metodologię, która umożliwia beztlenową hodowlę komórek (przez co najmniej 17 dni; maksymalny czas testowany). Najważniejszym aspektem tej metodologii jest zapewnienie, że do systemu nie zostanie wprowadzony tlen. Uzyskuje się to przez odgazowanie pożywek oraz przez przepłukanie probówek, szalek, kolb i pipet beztlenową mieszaniną gazów (H2, CO2, N2), a następnie umożliwienie materiałom zrównoważenia się ze środowiskiem beztlenowym (beztlenowym) przed użyciem. Podczas pozyskiwania mikrofotografii należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że uzyskane mikrofotografie nie zawierają artefaktów. W przypadku braku tlenu morfologia komórek jest znacznie zmieniona. Dla wszystkich komórek hodowanych beztlenowo odnotowuje się dwa odrębne morfotypy. Zdolność do wzrostu i utrzymania komórek ssaków przy braku tlenu może być zastosowana do analizy fizjologii komórek, interakcji wielodrobnoustrojowych i charakterystyki szlaków biosyntezy w celu opracowania nowych leków przeciwnowotworowych.
Wprowadzenie
Komórki z guzów litych, nisz komórek macierzystych i tych wyściełających powierzchnię błony śluzowej istnieją w środowiskach, w których występuje obniżony poziom tlenu, w tym anoksja1,2,3,4. W normalnych stanach fizjologicznych natlenienie waha się od hipoksji do anoksji (całkowitego braku tlenu)5,6. Uświadomienie sobie, że tlen atmosferyczny niekorzystnie wpływa na replikację komórek ssaków i że wzrost komórek in vitro można zoptymalizować w warunkach zubożonego tlenu, zost....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotuj pożywkę do beztlenowej hodowli różnych linii komórkowych ssaków
- Przygotuj kompletną pożywkę PS-74656 do hodowli komórek beztlenowych25.
- Przygotować sterylny roztwór podstawowy azotynów (5 M; 100x), rozpuszczając 17,25 g azotynów w 50 ml destylowanej wody dejonizowanej, a następnie przefiltrować w celu sterylizacji.
- Dodać 0,5 ml roztworu podstawowego azotynów na 50 ml DMEM o niskiej zawartości glukozy (1 g/l glukozy) z 110 mg/l L-glutaminy, 584 mg/l pirogronianu sodu i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS; inaktywowanej termicznie).
UWAGA: Stosowanie stężeń FBS większych niż....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Siła niniejszego protokołu tkwi w zapewnieniu długowieczności i wzrostu wielu linii komórkowych oraz w uznaniu faktu, że zachodzą głębokie zmiany i rozbieżności w morfologii komórek25. Najbardziej krytycznym elementem niniejszego badania jest przenoszenie i utrzymywanie komórek w warunkach ścisłej anaerobiozy. Wymaga to zastosowania komory beztlenowej zorganizowanej w sposób maksymalizujący efektywność protokołu (Rycina 1) oraz zapewni.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Metoda ta obejmuje komórki ssaków po raz pierwszy, które były hodowane przez dłuższy czas przy braku tlenu. Na podstawie obecnych obserwacji, zdolność do wzrostu beztlenowego poprzez szlak niefermentacyjny wydaje się być uniwersalna wśród linii komórek ssaków28, w których wzrost beztlenowy spowodował dywergencję fenotypu. Zaobserwowano to dla wszystkich badanych linii komórkowych. Wraz z uprawą beztlenową coraz większe proporcje komórek stawały się zaokrąglone, rozwijały populację podobną.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy dziękują Biuru Badań i Programów Sponsorowanych Uniwersytetu Środkowo-Zachodniego za wsparcie.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komora beztlenowa Whitney A35 | Don Whitley Scientific | Microbiology International | Możliwość zdjęcia przedniej części komory ułatwia umieszczanie narzędzi w środku bez obaw o przedostanie się przez portale. |
| Inkubator CO2 | Fisher Scientific | 3531 | |
| Kaptur do hodowli tkanek | Labconco | DO55735 | |
| Drummond | 4-000-100 | ||
| Santa | Cruz | sc-358867 | |
| 50 cc sterylne stożkowe probówki wirówkowe | DOT | 451-PG | |
| słoik | próżniowyNalgene 111410862889 | BTA-Mall 5311-0250 | |
| DMEM wysoka zawartość glukozy (4,5 g/L) | CellGro | 10-017-CM | |
| DMEM niska glukoza (1 g/L) | CellGro | 10-014-CV | |
| FBS | VWR | 1500-500 | |
| HBSS | VWR | 20-021-CV | |
| trypsyna | VWR | 25-052-CI | |
| gentamycyna | Gibco | 15750-060 | |
| sterylne pipety | CellTreat | 229210B, 229205B | |
| Kolba do hodowli tkankowych (T75 lub T150) | Santa Cruz | sc-200263, sc-200264 | |
| 24-dołkowe naczynia poddane hodowli tkankowej | DOT | 667124 | |
| glad torebki na kanapki z zamkiem błyskawicznym | Mikroskop | Costco | |
| (10, 20 40x obiektywy z montażem kamery) | Nikon Eclipse | TS100 | |
| trypan niebieski | Hemocytometr Invitrogen | T10282 | |
| Invitrogen | C10283 | ||
| Countess Automatyczny licznik | komórek Technologie życia | AMQAF1000 | |
| Pipety do mikromiareczkowania Rainin Końcówki do mikromiareczkowania | Rainin Classic | PR-100 | |
| Santa Cruz Biotechnologia | sc-213233 & sc-201717 | ||
| probówki (probówki 50cc) | Lab Depot | HS29050A | |
| azotyn sodu | Sigma | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigald/237213?lang=en®ion=US | |
| przezroczyste pudełka z pokrywkami | Rosti Mepal | dla pokojówek | |
| Skrobak do komórek w domu | |||
| CellTreat | 229310 | ||
| PBS | we własnym zakresie | ||
| Fisher Scientific | 64-17-5 | 70% etanolem | |
| sterylne | worki Santa Cruz | sc-200273 | |
| uchwytem (biurko) | Rękawice | HS10320 | |
| Elektroda | |||
| eDAQ | EPO354 | ||
| pH-metr | Jenway | 3510 | |
| papier / pHydrion | Sigma Aldich | Z111813 |
Bibliografia
- Cummins, J., Tangney, M. Bacteria and tumours: causative agents or opportunistic inhabitants? Infectious Agents and Cancer. 8 (1), 11(2013).
- Liao, J., et al. Enhanced efficie....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
