Czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od pH reportera fluorescencyjnego mt-Keima

Summary

Mitofagia, selektywna degradacja mitochondriów, jest związana z homeostazą mitochondriów i jest rozregulowana w różnych chorobach ludzkich. Jednak wygodne metody eksperymentalne do pomiaru aktywności mitofagii są bardzo ograniczone. Tutaj zapewniamy czuły test do pomiaru aktywności mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej.

Abstract

Mitofagia to proces selektywnego usuwania uszkodzonych lub niepotrzebnych mitochondriów za pomocą autofagii. Stwierdzono ścisłe powiązania między wadliwą mitofagią a różnymi chorobami ludzkimi, w tym chorobami neurodegeneracyjnymi, rakiem i chorobami metabolicznymi. Ponadto ostatnie badania wykazały, że mitofagia bierze udział w prawidłowych procesach komórkowych, takich jak różnicowanie i rozwój. Jednak dokładna rola i mechanizmy molekularne leżące u podstaw mitofagii wymagają dalszych badań. Dlatego tak ważne jest opracowanie solidnej i wygodnej metody pomiaru zmian w aktywności mitofagii. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół ilościowej oceny aktywności mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu białka fluorescencyjnego Keima ukierunkowanego na mitochondria (mt-Keima). Ten test cytometrii przepływowej może analizować aktywność mitofagii szybciej i bardziej czułie niż konwencjonalne metody oparte na mikroskopii lub immunoblottingu. Protokół ten można zastosować do analizy aktywności mitofagii w różnych typach komórek.

Introduction

Mitochondria to organelle, które są niezbędne do proliferacji komórek i fizjologii. Mitochondria są odpowiedzialne za wytwarzanie ponad 80% podaży ATP poprzez fosforylację oksydacyjną, a także dostarczają różnych produktów pośrednich metabolicznych do biosyntezy i metabolizmu^1,2. Oprócz swojej roli w dostarczaniu energii i metabolizmie, mitochondria odgrywają kluczową rolę w wielu innych ważnych procesach, w tym w wytwarzaniu reaktywnych form tlenu (ROS), regulacji śmierci komórki i wewnątrzkomórkowej dynamice Ca²⁺³. Zmiany w funkcjonowaniu mitochondriów są związane z chorobami ludzkimi, w tym rakiem, cukrzycą i różnymi chorobami neurodegeneracyjnymi^4,5. Uważa się również, że zwiększona dysfunkcja mitochondriów i mutacje mitochondrialnego DNA przyczyniają się do prawidłowych procesów starzenia^6,7,8. Dlatego kontrola jakości jest kluczową kwestią w mitochondriach. Mitochondria to wysoce dynamiczne organelle, które mogą stale zmieniać swój kształt między wydłużonymi sieciami a krótką, rozdrobnioną formą. Dynamika mitochondriów odgrywa ważną rolę w utrzymaniu funkcji mitochondriów, a także w ich degradacji przez mitofagię⁹.

Mitofagia to mechanizm, który polega na selektywnej degradacji całych mitochondriów za pomocą maszynerii autofagii. Mitofagia jest głównym mechanizmem leżącym u podstaw obrotu mitochondrialnego i usuwania uszkodzonych lub dysfunkcyjnych mitochondriów. W tym procesie mitochondria są najpierw otoczone błoną, co powoduje powstawanie autofagosomów, które następnie łączą się z lizosomami w celu degradacji hydrolitycznej⁹. Wcześniejsze badania genetyczne na Drosophila sugerowały, że dwa geny związane z chorobą Parkinsona, indukowana przez PTEN domniemana kinaza 1 (PINK1) (PARK6) i Parkina (PARK2), funkcjonują w tym samym szlaku^10,11. Badania podsekwencyjne wykazały, że szlak PINK1-Parkin jest odpowiedzialny za eliminację uszkodzonych mitochondriów, a defekty tego szlaku skutkują dysfunkcyjną mitofagią i mogą przyczyniać się do chorób u ludzi^12,13. Defekty w procesach mitofagii zostały ostatnio wykryte w różnych chorobach ludzkich, w tym raku, chorobach serca, chorobach wątroby i chorobach neurodegeneracyjnych ¹⁴. Ponadto ostatnie badania wykazały również, że mitofagia ma kluczowe znaczenie dla wielu procesów fizjologicznych, takich jak różnicowanie, rozwój i odpowiedź immunologiczna^{15,16,17,18,19}, co sugeruje, że mitofagia może odgrywać bardziej aktywną rolę w kontrolowaniu funkcji komórek.

Pomimo niedawnego potwierdzenia, że mitofagia odgrywa ważną rolę zarówno w kontroli jakości mitochondriów, jak i w chorobach ludzkich, mechanizmy molekularne leżące u podstaw mitofagii pozostają słabo poznane. Chociaż mechanizmy związane z mitofagią były systematycznie badane u drożdży, badania mające na celu zbadanie mechanizmów związanych z mitofagią w komórkach ssaków koncentrowały się głównie na szlaku PINK1-Parkin. Wcześniejsze badania wykazały, że szlak PINK1-Parkin jest przede wszystkim odpowiedzialny za selektywne usuwanie uszkodzonych mitochondriów poprzez mitofagię^12,20,21. Jednak ostatnie badania wykazały, że w niektórych modelach mitofagia może być aktywowana nawet przy braku funkcjonalnego PINK1^22,23,24. Wyniki te sugerują, że oprócz szlaku PINK1-Parkin istnieje dodatkowy niezidentyfikowany szlak, który może aktywować mitofagię.

Brak wygodnej metody oceny aktywności mitofagii jest główną przeszkodą w badaniu ścieżek regulujących mitofagię i jej rolę w zdarzeniach patofizjologicznych. Mikroskopia elektronowa jest potężnym narzędziem do bezpośredniej wizualizacji mitochondriów pochłoniętych autofagosomami. Jednak mikroskopia elektronowa ma ograniczenia w ilościowym określaniu aktywności mitofagii. Chociaż strategie wykorzystujące sondy fluorescencyjne sprzężone z białkiem lekkim 1 (LC3) związane z mikrotubulami, takie jak GFP-LC3, są obecnie najczęściej stosowanymi podejściami²⁵, przejściowy charakter sygnału opartego na LC3 i wysoki odsetek sygnałów fałszywie dodatnich ograniczają jego czułość na wykrywanie mitofagii w komórkach²⁶. Połączenie western blotting w celu pomiaru poziomu białka mitochondrialnego, kwantyfikacji mitochondrialnego DNA i analizy mikroskopii fluorescencyjnej w celu kolokalizacji mitochondriów z autofagosomami lub lizosomami byłoby dobrym podejściem do oceny mitofagii. Ograniczenia w zakresie kwantyfikacji i brak wygody istniejących metodologii wymagają jednak nowych podejść. Wprowadzenie nowego białka fluorescencyjnego zależnego od pH, mitochondrialnego celu Keima (mt-Keima), znacznie poprawiło zdolność wykrywania mitofagii²⁷. Poprzez fuzję sekwencji ukierunkowanej na mitochondria podjednostki VIII OKSYDAZY CYTOCHROMU C (COX VIII) z Keimą, mt-Keima jest kierowana do macierzy mitochondrialnej. Duże przesunięcie piku wzbudzenia Keimy z 440 nm do 586 nm (odpowiadające odpowiednio pH 7 i pH 4) można wykorzystać do oceny mitofagii z dobrą czułością zarówno w eksperymentach in vitro, jak i in vivo^28,29. Co ważniejsze, oporność mt-Keima na degradację lizosomalną powoduje integrację sygnału mt-Keima w lizosomach, co pozwala na łatwy ilościowy pomiar aktywności mitofagii. Zmiana fluorescencji, która występuje w mt-Keima, może być analizowana za pomocą mikroskopii konfokalnej lub cytometrii przepływowej^28,29. Jednak do tej pory nie przedstawiono szczegółowo metody pomiaru aktywności mitofagii opartej na cytometrii przepływowej za pomocą mt-Keima.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół dla techniki opartej na cytometrii przepływowej do pomiaru aktywności mitofagii w komórkach za pomocą mt-Keima. Chociaż wykazaliśmy tutaj, że analiza cytometrii przepływowej z powodzeniem wykryła mitofagię wywołaną przez CCCP w komórkach HeLa eksprymujących Parkinę, technikę tę można zastosować do wielu różnych typów komórek.

Protocol

1. Generacja komórek HeLa wykazujących ekspresję mito-Keima (mt-Keima)

1. Przygotowanie lentiwirusa mt-Keima
   1. Pokryj naczynie hodowlane o średnicy 100 mm, dodając 2 ml 0,001% soli fizjologicznej buforowanej poli-L-lizyną/fosforanem (PBS) i odstaw na 5 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Usunąć roztwór poli-L-lizyny za pomocą szklanej pipety podłączonej do próżni i umyć naczynie hodowlane, dodając 2 ml 1x PBS.
   3. Płytka 1,5 x 10⁶ HEK293T komórek na powlekanym szalku hodowlanym z 10 ml DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny, a następnie hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych CO_{2 przez} jeden dzień.
   4. Transfekcja 2 μg plazmidu lentiwirusowego mt-Keima mt-Keima class=²⁹ DNA wraz z pakietem DNA (psPAX 2 μg i pVSVG 0,25 μg) przy użyciu odczynnika do transfekcji przez 8 godzin zgodnie z instrukcjami producenta.
   5. Usuń pożywkę do transfekcji i dodaj 8 ml świeżej pożywki.
   6. Zebrać pożywkę zawierającą cząstki wirusa 48 godzin później. Usunąć resztki komórkowe z zebranych pożywek przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 minut i przefiltrować je za pomocą filtra strzykawkowego 0,45 μm.
      nuta: W przypadku długotrwałego stosowania należy wykonać porcje cząstek lentiwirusa i przechowywać próbki w temperaturze -80 °C. Należy unikać poddawania próbek wirusa cyklom zamrażania i rozmrażania w celu skutecznego zakażenia wirusowego.
2. Zakażenie komórek HeLa-Parkin lentiwirusem mt-Keima
   1. Płytka 5 x 10⁴ komórki HeLa wykazujące ekspresję parkiny (HeLa-Parkin) w 60-milimetrowym naczyniu hodowlanym z 4 ml DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny w temperaturze 37 °C na jeden dzień przed pobraniem lentiwirusa mt-Keima.
      nuta: Ze względu na brak endogennej ekspresji Parkiny w komórkach HeLa³⁰, użyte tutaj komórki HeLa-Parkin wyraźniej pokazują mitofagię indukowaną przez CCCP. Procedura ta może być również stosowana do innych pierwotnych lub unieśmiertelnionych linii komórkowych.
   2. Następnego dnia usuń pożywkę wzrostową i dodaj 1 ml pożywki lentiwirusowej mt-Keima. Dodać dodatkowe 2 ml pożywki wzrostowej zawierającej 3 μl roztworu podstawowego polibrenu (8 mg/ml w wodzie destylowanej). Inkubować przez jeden dzień w inkubatorze do hodowli tkankowych CO_{2 .}
   3. Następnego dnia usuń mieszaninę lentiwirusową mt-Keima i dwukrotnie umyj komórki 1x PBS. Dodaj 4 ml pożywki wzrostowej i traktuj komórki 2 μg/ml puromycyny przez dwa dni.
   4. Po dwóch dniach selekcji puromycyny usuń pożywkę wzrostową i umyj komórki dwukrotnie 1x PBS. Dodać pożywkę wzrostową i hodować komórki w inkubatorze CO₂ do momentu użycia.
      nuta: Metodę tę można zastosować do generowania komórek, które stabilnie eksprymują mt-Keima, w tym innych linii komórkowych i komórek pierwotnych.

2. Wywoływanie mitofagii za pomocą leczenia CCCP i przygotowanie próbek FACS

1. Płytka 5 x 10⁴ komórki HeLa-Parkin wykazujące ekspresję mt-Keima w 60-milimetrowym naczyniu hodowlanym z 4 ml DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny i hodować je przez jeden dzień w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych_CO2
.
2. Następnego dnia usunąć pożywkę wzrostową i dodać 4 ml świeżego DMEM zawierającego 10 μM m-chlorofenylohydrazonu cyjanku karbonylu (CCCP). Inkubować komórki HeLa-Parkin-mt-Keima w inkubatorze tkanek CO₂ przez 6 godzin.
3. Usuń pożywkę wzrostową 6 godzin później i umyj komórki 2 ml 1x PBS. Odłącz komórki, traktując je roztworem trypsyny/EDTA i dezaktywuj trypsynę, dodając pożywkę wzrostową zawierającą 10% FBS. Przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
4. Odwirować komórki przy 500 x g przez 5 minut.
5. Ostrożnie usunąć pożywkę wzrostową przez aspirację i ponownie zawiesić komórki za pomocą 1 ml zimnego 1x PBS.
6. Przenieś komórki do odpowiedniej probówki FACS i umieść ją na lodzie.
   nuta: Przygotować niezakażone komórki HeLa jako kontrolę negatywną.
   nuta: Komórki są żywotne na lodzie przez kilka godzin, a sygnały fluorescencyjne mt-Keima również pozostają stabilne.

3. Analiza FACS mitofagii

Uwaga: W tym badaniu, komórki były analizowane za pomocą cytometru przepływowego wyposażonego w laser o długości fali 405 nm i 561 nm. Komórki wzbudzono fioletowym laserem (405 nm) z emisją wykrytą przy 610 ± 10 nm za pomocą detektora BV605 oraz żółto-zielonym laserem (561 nm) z emisją wykrytą przy 610 ± 10 nm przez detektor PE-CF594 jednocześnie (Rysunek 1).

1. Bramkowanie żywych komórek
   1. Włącz cytometr przepływowy i komputer, a następnie zaloguj się do oprogramowania do analizy.
   2. Wygeneruj nowy eksperyment lub zduplikuj istniejący eksperyment. Aby wzbudzić komórki za pomocą lasera fioletowego (405 nm) i żółto-zielonego (561 nm) i wykryć emisję w detektorze 610 ± 10 nm, wybierz BV605 i PE-CF594 oprócz rozpraszania do przodu (FSC) i rozpraszania bocznego (SSC) w oknie parametrów zgodnie z wymaganiami fluorofory.
      nuta: Wszystkie fluorofory należy dodawać w trybie liniowym.
   3. Krótko zawirować każdą próbkę komórkową, aby rozproszyć agregaty komórkowe.
   4. Umieścić probówkę zawierającą próbkę kontrolną komórki HeLa-Parkin, która nie jest zakażona lentiwirusem mt-Keima, w porcie wstrzyknięcia próbki i nacisnąć przycisk "uruchom" na cytometrze.
   5. Na wykresie kropkowym FSC w porównaniu z SSC dostosuj napięcie FSC i SSC, aby umieścić komórki w środku wykresu kropkowego.
   6. Narysuj bramkę P1 za pomocą ikony wielokąta wokół żywych komórek i wyeliminuj martwe komórki i szczątki komórek (Rysunek 2A).
2. Dostosuj napięcia dla fioletowego i zielonego lasera
   1. Umieścić probówkę zawierającą komórki HeLa-Parkin zakażone lentiwirusem mt-Keima na porcie wstrzyknięcia próbki i nacisnąć przycisk "uruchom" na cytometrze.
   2. Na wykresie kropkowym BV605 (405 nm) w porównaniu z SSC dostosuj napięcie BV605 tak, aby komórki HeLa-Parkin wyrażające mt-Keima były wyraźnie odróżniane od komórek kontrolnych, które nie wykazują ekspresji mt-Keima (Rysunek 2B).
   3. Na wykresie kropkowym PE-CF594 (561 nm) w porównaniu z SSC dostosuj napięcie PE-CF594 tak, aby komórki HeLa-Parkin wyrażające mt-Keima były wyraźnie odróżniane od komórek kontrolnych (Rysunek 2B).
3. Oceń procent komórek w mitofagii
   1. Uzyskaj wykres punktowy BV605 w porównaniu z PE-CF594 przy użyciu skali liniowej. Narysuj bramkę za pomocą ikony wielokąta wokół komórek wyrażających mt-Keima i wyeliminuj komórki, które nie wyrażają mt-Keima (Rysunek 3A). Populacja komórek mt-Keima fluorescencyjnie dodatnia jest określana jako bramka "mt-Keima".
   2. Utwórz kolejny wykres punktowy BV605 w porównaniu z PE-CF594 pokazujący tylko komórki bramkowane "mt-Keima". Na tym wykresie kropkowym narysuj bramę wokół nieleczonych komórek mt-Keima-dodatnich. Podstawowa aktywność mitofagii kontrolnych komórek HeLa jest niska, a stosunek emisji w PE-CF594 / BV605 jest mniejszy niż 1. Stąd brama ta nazywana jest bramą "niską".
   3. Narysuj kolejną bramę zawierającą powyższy obszar "niskiej" bramy. Ta bramka jest określana jako bramka "wysoka", ponieważ zawiera komórki o wysokiej aktywności mitofagii, czyli komórki o wysokim współczynniku emisji w PE-CF594 / BV605 (Rysunek 3B).
   4. Aby obliczyć procent komórek w bramce "wysokiej", wybierz menu "Pokaż hierarchię populacji". Wartość "Procent rodzica" (%Parent) reprezentuje procent komórek w "wysokiej" bramce w populacji mt-Keima-dodatniej.
   5. Ustaw co najmniej 10 000 zdarzeń do nagrania w bramce zatrzymującej "mt-Keima" i uruchom każdą próbkę.

Results

Przykład analizy cytometrii przepływowej mitofagii indukowanej przez CCCP w komórkach HeLa-Parkin jest pokazany w Rysunek 4. Korzystając z opisanej powyżej metody analizy cytometrii przepływowej, możemy wykryć dramatyczny wzrost komórek mitofagowych w bramie "wysokiej". Odsetek komórek w "wysokiej" bramce wzrósł ponad 10-krotnie w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi (Figura 4A). Ten wzrost aktywności mitofagii został całkowicie...

Discussion

Tutaj przedstawiamy szybką i czułą metodę wykorzystania cytometrii przepływowej do pomiaru aktywności mitofagii komórkowej w komórkach wyrażających mt-Keima. Komórki poddawane wysokiemu poziomowi mitofagii wykazują zwiększony stosunek wzbudzenia PE-CF594 (561 nm)/BV605 (405 nm). Tak więc aktywność mitofagii można wyrazić jako odsetek komórek wykazujących wysoki stosunek 561/405. Obliczyliśmy procent komórek w regionie "wysokiej" bramki na wykresie kropkowym PE-CF594 (561 nm) w porównaniu z BV605 (405 nm), a wyniki wykaza...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ODCZYNNIKI
poly-L-lizyna	Sigma-Aldrich	P2636
FBS	GIBCO	16000-044
penicylina/streptomycyna	wellgene	LS202-02
PBS	Hyclon	SH30013.02
HEK293T		ATCC CRL-3216
DMEM	GIBCO	12800-082
OPTI-MEM	GIBCO	31985-070
Termos turbofektowy	naukowy	R0531
0,45 μ m filtr strzykawkowy	sartorius	16555
HeLa	ATCC	CCL-2
polybrene	Sigma-Aldrich	H9268	8 mg/ml
puromycyna	Sigma-Aldrich	P8833	2 mg/ml
Cyjanek karbonylu m-chlorofenylohydrazyna (CCCP)	Sigma-Aldrich	C2759	10 mM
trypsyna-EDTA	wellgene	LS015-01
EQUIPMENTS
BD LSRFortessa	BD Bioscience	LSRFortessa
FACSDIVA	BD Bioscience	FACSDIVA (v8.0.1)