Mitofagia, selektywna degradacja mitochondriów, jest związana z homeostazą mitochondriów i jest rozregulowana w różnych chorobach ludzkich. Jednak wygodne metody eksperymentalne do pomiaru aktywności mitofagii są bardzo ograniczone. Tutaj zapewniamy czuły test do pomiaru aktywności mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Czuły pomiar mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu zależnego od pH reportera fluorescencyjnego mt-Keima
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mitofagia to proces selektywnego usuwania uszkodzonych lub niepotrzebnych mitochondriów za pomocą autofagii. Stwierdzono ścisłe powiązania między wadliwą mitofagią a różnymi chorobami ludzkimi, w tym chorobami neurodegeneracyjnymi, rakiem i chorobami metabolicznymi. Ponadto ostatnie badania wykazały, że mitofagia bierze udział w prawidłowych procesach komórkowych, takich jak różnicowanie i rozwój. Jednak dokładna rola i mechanizmy molekularne leżące u podstaw mitofagii wymagają dalszych badań. Dlatego tak ważne jest opracowanie solidnej i wygodnej metody pomiaru zmian w aktywności mitofagii. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół ilościowej oceny aktywności mitofagii za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu białka fluorescencyjnego Keima ukierunkowanego na mitochondria (mt-Keima). Ten test cytometrii przepływowej może analizować aktywność mitofagii szybciej i bardziej czułie niż konwencjonalne metody oparte na mikroskopii lub immunoblottingu. Protokół ten można zastosować do analizy aktywności mitofagii w różnych typach komórek.
Wprowadzenie
Mitochondria to organelle, które są niezbędne do proliferacji komórek i fizjologii. Mitochondria są odpowiedzialne za wytwarzanie ponad 80% podaży ATP poprzez fosforylację oksydacyjną, a także dostarczają różnych produktów pośrednich metabolicznych do biosyntezy i metabolizmu1,2. Oprócz swojej roli w dostarczaniu energii i metabolizmie, mitochondria odgrywają kluczową rolę w wielu innych ważnych procesach, w tym w wytwarzaniu reaktywnych form tlenu (ROS), regulacji śmierci komórki i wewnątrzkomórkowej dynamice Ca2+3. Zmiany w funkcjonowaniu mitochondriów są związane z choroba....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Generacja komórek HeLa wykazujących ekspresję mito-Keima (mt-Keima)
- Przygotowanie lentiwirusa mt-Keima
- Pokryj naczynie hodowlane o średnicy 100 mm, dodając 2 ml 0,001% soli fizjologicznej buforowanej poli-L-lizyną/fosforanem (PBS) i odstaw na 5 minut w temperaturze pokojowej.
- Usunąć roztwór poli-L-lizyny za pomocą szklanej pipety podłączonej do próżni i umyć naczynie hodowlane, dodając 2 ml 1x PBS.
- Płytka 1,5 x 106 HEK293T komórek na powlekanym szalku hodowlanym z 10 ml DMEM zawierającego 10% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny, a następnie hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze do ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przykład analizy cytometrycznej przepływowej mitofagii indukowanej CCCP w komórkach HeLa-Parkin przedstawiono na Rysunku 4. Stosując opisaną powyżej metodę analizy cytometrycznej, można wykryć gwałtowny wzrost liczby komórek mitofagicznych w bramce „high”. Odsetek komórek w bramce „high” wzrósł ponad 10-krotnie w porównaniu z nieleczonymi komórkami kontrolnymi (Rysunek 4A). Wzrost aktywności mitofagii został całkowicie zniesiony .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Tutaj przedstawiamy szybką i czułą metodę wykorzystania cytometrii przepływowej do pomiaru aktywności mitofagii komórkowej w komórkach wyrażających mt-Keima. Komórki poddawane wysokiemu poziomowi mitofagii wykazują zwiększony stosunek wzbudzenia PE-CF594 (561 nm)/BV605 (405 nm). Tak więc aktywność mitofagii można wyrazić jako odsetek komórek wykazujących wysoki stosunek 561/405. Obliczyliśmy procent komórek w regionie "wysokiej" bramki na wykresie kropkowym PE-CF594 (561 nm) w porównaniu z BV605 (405 nm), a wyniki wykaza.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca została wsparta grantem z National Research Foundation of Korea (2016R1D1A1B03931949) (dla J. U.) oraz grantem National Research Foundation of Korea (NRF) ufundowanym przez rząd Korei (MSIT) (No. 2016R1A2B2008887, No. 2016R1A5A2007009) (dla J.Y.)
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ODCZYNNIKI | |||
| poly-L-lizyna | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| FBS | GIBCO | 16000-044 | |
| penicylina/streptomycyna | wellgene | LS202-02 | |
| PBS | Hyclon | SH30013.02 | |
| HEK293T | ATCC CRL-3216 | ||
| DMEM | GIBCO | 12800-082 | |
| OPTI-MEM | GIBCO | 31985-070 | |
| Termos turbofektowy | naukowy | R0531 | |
| 0,45 μ m filtr strzykawkowy | sartorius | 16555 | |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | H9268 | 8 mg/ml |
| puromycyna | Sigma-Aldrich | P8833 | 2 mg/ml |
| Cyjanek karbonylu m-chlorofenylohydrazyna (CCCP) | Sigma-Aldrich | C2759 | 10 mM |
| trypsyna-EDTA | wellgene | LS015-01 | |
| EQUIPMENTS | |||
| BD LSRFortessa | BD Bioscience | LSRFortessa | |
| FACSDIVA | BD Bioscience | FACSDIVA (v8.0.1) |
Bibliografia
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: More than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), R551-R560 (2006).
- Zorov, D. B., Krasnikov, B. F., Kuzminova, A. E., Vysokikh, M., Zorova, L. D. Mitochondria revisited. Alternative functions of mitochondria. Bioscience Reports. Bioscience Reports. 17 (6), 507-520 (1997).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
