Tutaj prezentujemy metodę optycznego obrazowania potencjałów czynnościowych, szczególnie w indukowanych komorowo indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych. Metoda opiera się na sterowanej przez promotor ekspresji wrażliwego na napięcie białka fluorescencyjnego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Specyficzne dla podtypu zapisy optycznego potencjału czynnościowego w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach komorowych pochodzących z komórek macierzystych
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kardiomiocyty generowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-CMs) są nowym narzędziem w badaniach sercowo-naczyniowych. Zamiast być jednorodną populacją komórek, iPSC-CM generowane przez obecne protokoły różnicowania reprezentują mieszaninę komórek o fenotypach komorowych, przedsionkowych i węzłowych, co komplikuje analizy fenotypowe. W tym artykule przedstawiono metodę optycznego zapisu potencjałów czynnościowych pochodzących z podobnych do komór iPSC-CM. Osiąga się to poprzez transdukcję lentiwirusową z konstruktem, w którym genetycznie kodowany wskaźnik napięcia jest pod kontrolą specyficznego dla komory elementu promotorowego. Gdy iPSC-CM są transdukowane za pomocą tego konstruktu, czujnik napięcia ulega ekspresji wyłącznie w komórkach podobnych do komór, umożliwiając rejestrację potencjału błony optycznej specyficznej dla podtypu za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej.
Wprowadzenie
Kardiomiocyty (CMs) pochodzące z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSCs) stanowią wschodzące narzędzie do analizy molekularnych mechanizmów chorób serca, badania nowych terapii oraz przesiewowego wykrywania niepożądanych działań leków na serce1,2,3. Od samego początku istotnym obszarem tych badań były choroby arytmogenne, takie jak kanalopatie4. W konsekwencji metody badania fenotypów elektrycznych kardiomiocytów, takich jak arytmie lub zmiany w morfologii potencjału czynnościowego (AP), stanowią kluczowy element tej technologii.
Ważnym aspektem przy zastosowaniu iPSC-CM jest fakt, że obecne protokoły różnicowania kardiomiocytów nie prowadzą do uzyskania jednorodnej populacji komórek. Zamiast tego powstaje raczej mieszanina komórek przypominających CM węzła zatokowego, przedsionkowego i komorowego na różnych poziomach dojrzałości5,6,7,8. Ta heterogeniczność może być istotnym źródłem zmienności eksperymentalnej, zwłaszcza w przypadku badania takich parametrów jak czas trwania potencjału czynnościowego (APD), które naturalnie różnią się między podtypami CM (np. APD jest krótszy w CM przedsionkowych niż w komorowych). Konwencjonalnym podejściem do rozwiązania tego problemu jest badanie pojedynczych iPSC-CM metodą patch clamp i klasyfikacja każdej komórki jako przypominająca komórki węzła, przedsionkowe lub komorowe na podstawie morfologii potencjału czynnościowego9. Wszelkie późniejsze analizy można wówczas ograniczyć do komórek reprezentujących interesujący nas podtyp CM. Główną wadą tej strategii jest ograniczona przepustowość i brak skalowalności. Ponadto inwazyjny charakter elektrofizjologii metodą patch clamp nie pozwala na sekwencyjne obrazowanie tych samych komórek w dłuższych odstępach czasu.
W niniejszym materiale przedstawiamy szczegóły eksperymentalne metody10 opracowanej do obrazowania optycznego potencjałów czynnościowych (AP) w konkretnych podtypach iPSC-CM. Rozwiązuje to problem heterogeniczności podtypów i drastycznie zwiększa przepustowość w porównaniu z metodami konwencjonalnymi, co umożliwia szybkie fenotypowanie iPSC-CM posiadających warianty genetyczne lub poddanych działaniu czynników farmakologicznych.
Przegląd podejścia do obrazowania optycznego specyficznego dla podtypów
Do optycznego obrazowania zmian potencjału błonowego kardiomiocytów (CMs) wykorzystuje się genetycznie kodowany wskaźnik napięcia (GEVI), którego właściwości fluorescencyjne zmieniają się podczas depolaryzacji i repolaryzacji błony komórkowej. W niniejszej procedurze zastosowano białko fluorescencyjne czujne na napięcie VSFP-CR.11, która składa się z domeny transbłonowej czujnika napięcia połączonej z parą zielonego (Clover) i czerwonego (mRuby2) białka fluorescencyjnego (Rycina 1A). Ze względu na bliskie sąsiedztwo obu fluoroforów, wzbudzenie zielonego białka fluorescencyjnego powoduje przekazanie części energii wzbudzenia do czerwonego białka fluorescencyjnego poprzez Przeniesienie energii rezonansowej Förstera (FRET). W związku z tym wzbudzenie zielonego białka fluorescencyjnego skutkuje emisją zarówno z zielonego, jak i czerwonego białka fluorescencyjnego (Rycina 1A, górny panel). Podczas depolaryzacji komórki dochodzi do zmiany strukturalnej sensora napięciowego, która przekłada się na reorientację dwóch białek fluorescencyjnych, zwiększając wydajność FRET. W rezultacie jeszcze większa część energii wzbudzenia jest przekazywana z zielonego do czerwonego białka fluorescencyjnego (Rysunek 1A, dolny panel). W rezultacie w zdepolaryzowanej komórce emisja fluorescencji zielonej jest słabsza, a emisja fluorescencji czerwonej jest silniejsza niż w komórce o spoczynkowym potencjale błonowym (Rycina 1B).
Rysunek 1: Obrazowanie optyczne potencjału błonowego z wykorzystaniem VSFP-CR. (A) Przedstawiono schemat obrazujący działanie białka fluorescencyjnego czułego na napięcie VSFP-CR. W wyniku depolaryzacji błony komórkowej dochodzi do reorganizacji strukturalnej w transmembranej domenie czujnika napięcia, co przekłada się na reorientację zielonego (GFP) i czerwonego (RFP) białka fluorescencyjnego, zwiększając efektywność wewnątrzcząsteczkowego transferu energii rezonansowej Förstera (FRET). (B) Przedstawiono widma emisyjne VSFP po wzbudzeniu GFP w komórkach przy spoczynkowym potencjale błonowym (panel górny) oraz w komórkach depolaryzowanych (panel dolny). Zmiana widmowa podczas depolaryzacji została wyolbrzymiona dla zwiększenia przejrzystości. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Zmiany w wydajności FRET, odzwierciedlające fluktuacje potencjału błonowego, są obrazowane przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w rozdzielacz obrazu, który rozdziela emisje fluorescencji czerwonej i zielonej i rzutuje je na dwa sąsiadujące obszary matrycy kamery sCMOS (Rysunek 2). Dzięki takiemu ustawieniu można jednocześnie rejestrować emisję fluorescencji w dwóch różnych pasmach długości fali, co pozwala na obliczenie stosunku fluorescencji czerwonej do zielonej, odzwierciedlającego potencjał błonowy w każdym obrazie z serii czasowej.
Rysunek 2: Konfiguracja systemu obrazowania. Przedstawiono główne komponenty systemu obrazowania wykorzystanego do rejestracji zmian widmowych napięciowo-czułego białka fluorescencyjnego odzwierciedlających zmiany potencjału błonowego z wysoką rozdzielczością czasową. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Ekspresja VSFP-CR w kardiomiocytach (CM) jest osiągana poprzez transdukcję lentiwirusem. Aby skierować ekspresję do interesującego nas podtypu CM, lentiwirus zawiera element promotora (enhancer MLC2v), który specyficznie napędza transkrypcję w iPSC-CM o charakterystyce komórek komorowych10. Gdy iPSC-CM, reprezentujące mieszaninę komórek o charakterystyce przedsionkowej, węźlkowej i komorowej, zostaną poddane transdukcji tym lentiwirusem, VSFP-CR ulega ekspresji wyłącznie w komórkach o charakterystyce komorowej. Ponieważ obrazowanie potencjałów czynnościowych metodą optyczną zależy od tego fluorescencyjnego sensora, zarejestrowane potencjały czynnościowe reprezentują wyłącznie interesujący nas podtyp CM (Rysunek 3).
Rycina 3: Ekspresja VSFP sterowana promotorem w celu obrazowania potencjału błonowego specyficznego dla podtypów. (a) Ten schemat przedstawia sposób rejestrowania optycznych potencjałów czynnościowych specyficznych dla podtypów kardiomiocytów. (b) przedstawiono iPSC-CMy zainfekowane VSFP pod kontrolą specyficznego dla komór komór komorowych enhancera MLC2v. Ekspresja sensora napięciowego jest obserwowana wyłącznie w kardiomiocytach o fenotypie komór komorowych w kanale GFP (panel lewy). Przedstawiono również obraz w kontraście fazowym (panel środkowy) oraz obraz nałożony (panel prawy). Białe linie przerywane wyznaczają granice komórek. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Przygotowanie kardiomiocytów pochodzących z iPSC do obrazowania
UWAGA: Metody hodowli iPSC i różnicowania serca zostały wcześniej opublikowane12,13,14 i nie są tutaj szczegółowo omawiane. W zależności od zastosowanego protokołu różnicowania zaleca się oczyszczanie iPSC-CM poprzez ręczną mikrodysekcję, magnetyczną separację komórek lub selekcję mleczanu. W przypadku poniższego protokołu, mikrowypreparowane eksplantaty z obszarów bicia, wygenerowane przy użyciu protokołu różnicowania jednowarstwowego13, pobrano w 15 dniu różnicowania serca i hodowano do 30 dnia na płytkach pokrytych fibronektyną, jak opisano wcześniej10.
- Wyjąć płytki z hodowli komórkowych z inkubatora i ręcznie zebrać eksplantaty serca do probówek mikrowirówkowych za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Po sedymentacji odessać supernatant hodowli komórkowej i delikatnie przemyć eksplantaty 2x zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS).
- Dysocjować iPSC-CM przez dodanie kolagenazy typu II (430 U/ml w HBSS) i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
- Po sedymentacji pozostałych dużych grudek komórkowych zebrać supernatant zawierający zdysocjowane pojedyncze iPSC-CM i dodać go do świeżej pożywki podtrzymującej CM zawierającej wysokie stężenie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (DMEM-F12, 20% FBS, 2 mM L-glutamina, 1:100 MEM aminokwasy endogenne, 100 U/ml penicylina-streptomycyna i 0,1 mM β-merkaptoetanolu).
- Powtórz dysocjację, jeśli pozostaną duże grudki komórek. Zebrać pojedyncze iPSC-CM przez odwirowanie i ponownie zawiesić je w pożywce CM o niskim stężeniu FBS (2% FBS).
- Ponownie zasiewać pojedyncze iPSC-CM w gęstości umożliwiającej późniejsze obrazowanie pojedynczych komórek na mikronaczyniu do hodowli komórek ze szklanym dnem o średnicy 3,5 cm, która została pokryta fibronektyną (2 μg/cm2). Zoptymalizuj gęstość wysiewu przed przystąpieniem do eksperymentów o wysokiej przepustowości. Zwykle wystarczy 5–10 eksplantatów sercowych na 3,5 cm naczynie; Jednak zależy to w dużej mierze od wielkości i czystości eksplantatu.
- Hodowla pojedynczych iPSC-CM po ich dysocjacji w pożywce podtrzymującej CM zawierającej 2% FBS przez co najmniej 48 godzin, aby zapewnić wystarczający odzysk.
Uwaga: W kolejnych krokach iPSC-CM są transdukowane lentiwirusem kodującym GEVI VSFP-CR pod kontrolą wzmacniacza MLC2v 10 w celu uzyskania specyficznej dla komory ekspresji GEVI. Alternatywnie można użyć konstruktów lentiwirusowych pozwalających na ekspresję GEVI specyficznie w komórkach węzłowych lub przedsionkowych lub niespecyficznych konstruktów, zawierających wszechobecnie wyrażany promotor PGK10. Plazmidy lentiwirusowe są dostępne na życzenie.
UWAGA: Podczas pracy z cząstkami lentiwirusa należy upewnić się, że środowisko pracy ma odpowiedni poziom bezpieczeństwa biologicznego, przestrzegać instrukcji bezpieczeństwa dotyczących pracy z potencjalnie zakaźnymi czynnikami i podjąć niezbędne środki ostrożności. - Przygotuj pożywkę infekcyjną, mieszając supernatant z hodowli komórkowych zawierający lentivirus10, który został wytworzony w komórkach HEK293 zgodnie z wcześniejszym opisem 15, z pożywką podtrzymującą CM (patrz krok 1.3) w stosunku 1:1.
- Dodać bromek heksadimetryny w końcowym stężeniu 8 μg/ml, aby zwiększyć skuteczność infekcji.
UWAGA: Ze względu na wysoką skuteczność infekcji iPSC-CM, wcześniejsze zagęszczenie lentiwirusa poprzez ultrawirowanie zwykle nie jest konieczne. - Odessać pożywkę podtrzymującą CM z pojedynczych iPSC-CM i zastąpić ją pożywką infekcyjną przygotowaną w krokach 1.7 i 1.8. Hodowlę zakażonych pojedynczych iPSC-CM w pożywce infekcyjnej przez 12 godzin w temperaturze 37 °C. Następnie odessać pożywkę i ponownie zastąpić ją pożywką konserwacyjną CM.
UWAGA: Sygnał fluorescencyjny z GEVI pojawia się 48 godzin po infekcji. Zaleca się obrazowanie zapisów potencjału błonowego, najwcześniej 72 godziny po zakażeniu, aby zapewnić odpowiednią siłę sygnału. Pojedyncze zakażone iPSC-CM można hodować przez co najmniej 3 tygodnie i obrazować sekwencyjnie. Jeśli podczas sesji obrazowania dojdzie do rozległego fotowybielania, sygnał fluorescencji odzyskuje się z czasem. - Przed obrazowaniem należy wymienić pożywkę do hodowli komórkowej roztworem Tyrode'a uzupełnionym Ca2+ (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM glukozy, 1,8 mM CaCl2 i 10 mM HEPES; pH 7,35).
2. Zapisy potencjału membrany optycznej
- Umieścić komorę obrazowania zawierającą iPSC-CM na stoliku odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w rozdzielacz obrazu, odpowiednie zestawy filtrów i kamerę (np. kamerę sCMOS) zdolną do szybkiego obrazowania z wysoką czułością.
UWAGA: Na przykład w rozgałęźniku obrazu należy użyć filtra wzbudzenia pasmowo-przepustowego 480/40 nm w połączeniu z długoprzepustowym zwierciadłem dichroicznym 500 nm oraz długoprzepustowego zwierciadła dichroicznego 568 nm w połączeniu z filtrami emisji pasmowo-przepustowej 520/28 nm i 630/75 nm. W przypadku obrazowania jednokomórkowego obiektyw zanurzeniowy z olejkiem o dużym powiększeniu i dużej aperturze numerycznej zapewnia najlepszy stosunek sygnału do szumu. - Jeśli wymagana jest stymulacja elektryczna, zainstaluj elektrody stymulujące w komorze obrazowania i podłącz je do generatora bodźców.
UWAGA: Użyliśmy wkładki stymulatorskiej, która zawierała dwie platynowe elektrody i pasowała do 3,5 cm naczyń do hodowli komórek ze szklanym dnem. Zobrazowano ogniwa znajdujące się między elektrodami. Typowymi parametrami stymulacji są impulsy prostokątne o czasie trwania 5 ms, o amplitudzie 10 V/cm odległości między elektrodami. - Opcjonalnie można użyć podgrzewanego stolika mikroskopowego, aby zapewnić stabilną temperaturę iPSC-CM podczas obrazowania, a nawet ustawić komorę inkubacyjną mikroskopu, jeśli planowane jest obrazowanie długotrwałe.
- Ustaw ostrość komórek i umieść komórkę wyrażającą GEVI w środku pola widzenia.
UWAGA: Najwygodniej jest to zrobić za pomocą okularów mikroskopu wykorzystujących zestaw filtrów z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) lub czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP) do identyfikacji komórek wykazujących ekspresję GEVI. - Ustaw ścieżkę optyczną tak, aby emitowane światło było kierowane do rozdzielacza obrazu. Zmień kostkę filtra w mikroskopie na tę, która ma być połączona z filtrami w rozdzielaczu obrazu (patrz Tabela materiałów).
- W oprogramowaniu sterującym kamerą ustaw ustawienia akwizycji tak, aby możliwe było szybkie obrazowanie (np. 100 klatek na sekundę, z czasem naświetlania 10 ms na klatkę).
Uwaga: Zwykle wiąże się to z binowaniem pikseli aparatu (np. 8 x 8 pikseli układu aparatu jest łączonych w binacje, aby wygenerować jeden piksel w filmie poklatkowym). - Skonfiguruj rozdzielacz obrazu zgodnie z instrukcją producenta. Dwa obrazy reprezentujące dwa różne pasma długości fal emisji powinny przylegać do siebie, a każdy z nich powinien zajmować połowę obrazu.
UWAGA: Ten krok należy wykonać tylko 1 raz na początku każdej sesji obrazowania. - Sprawdź i, jeśli to konieczne, wyreguluj ostrość obrazu wytwarzanego przez aparat.
- Dostosuj jasność światła podświetlanego tak, aby uniknąć nasycenia pikseli; najłatwiej można to zrobić, używając palety kolorów, w której nasycone piksele są reprezentowane przez unikalny kolor.
UWAGA: Podczas wszystkich tych przygotowań przed obrazowaniem należy ograniczyć ekspozycję próbki na światło wzbudzające do niezbędnej ilości (tj. nie pozostawiać światła włączonego przez dłuższy czas), aby uniknąć fotowybielania GEVI. - Ustaw akwizycję szeregów czasowych (np. 5 000 obrazów przy 100 klatkach na sekundę przez czas trwania serii wynoszący 50 sekund). Przyciemnij światło w pomieszczeniu (w tym monitory komputerowe), aby światło rozproszone nie wpływało na pomiar. Jeśli przesłona światła wzbudzenia nie jest kontrolowana przez oprogramowanie do obrazowania, otwórz ją tuż przed rozpoczęciem akwizycji.
- Rozpocznij akwizycję serii obrazów. Jeśli wymagana jest stymulacja elektryczna, rozpocznij sekwencję stymulacji w odpowiednim punkcie czasowym, chyba że jest ona automatycznie inicjowana przez oprogramowanie do obrazowania. Jeżeli pożądane jest zastosowanie środka farmakologicznego, należy to zrobić ręcznie (np. poprzez odpipetowanie 100 μl środka w dziesięciokrotnym stężeniu końcowym do komory rejestrującej zawierającej 900 μl buforu i delikatne wymieszanie go z pipetą) lub przy użyciu systemu perfuzji o stałym przepływie.
- Po zakończeniu akwizycji zamknij migawkę światła wzbudzenia, jeśli to konieczne. Zapisz nagranie na dysku twardym.
- Pozostawiając ustawienia zapisu (tj. czas ekspozycji, liczbę klatek na sekundę i natężenie światła) bez zmian, wykonaj zapis fluorescencji tła (jak w kroku 2.11) na obszarze szkiełka nakrywkowego niezawierającym komórek lub na innym szkiełku nakrywkowym, na którym nie zasiano żadnych komórek.
UWAGA: Jeśli pomiary sekwencyjne są wykonywane bez zmiany ustawień akwizycji, dla wszystkich tych pomiarów konieczny jest tylko jeden zapis fluorescencji tła. - W razie potrzeby należy przeprowadzić dodatkowe eksperymenty (kroki 2.4–2.13) na różnych iPSC-CM znajdujących się na tym samym szkiełku nakrywkowym. Należy pamiętać, że w przypadku zastosowania leku wszystkie CM na szkiełku nakrywkowym zostaną naruszone.
3. Analiza
>UWAGA: W zależności od używanego oprogramowania do obrazowania (które zazwyczaj jest zastrzeżonym pakietem oprogramowania dostarczanym przez producenta kamery lub całego systemu obrazowania fluorescencyjnego), możliwe jest przeprowadzenie analizy uzyskanych obrazów częściowo lub nawet całkowicie w ramach tego pakietu oprogramowania. Jednak tutaj opisano przepływ pracy analizy obrazu, który można wykonać za pomocą oprogramowania open source (>tj. platformy do analizy obrazów ImageJ)16, który można wygodnie zainstalować za pomocą dystrybucji, takiej jak Fiji17, oraz pakiet R do obliczeń statystycznych18. Krótko mówiąc, obszary zainteresowania (ROI) reprezentujące komórki lub tło są rysowane w ImageJ, a średnia fluorescencja w tych ROI w czasie jest eksportowana do pliku, który następnie jest dalej analizowany w R lub, alternatywnie, za pomocą oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych.
- W oprogramowaniu do obrazowania zapisz lub wyeksportuj uzyskane szeregi czasowe obrazu (zarówno nagranie zawierające komórki, jak i odpowiadające mu nagranie w tle) do formatu (np. TIF), który może być odczytany przez ImageJ. Alternatywnie można użyć wtyczki BioFormats (https://imagej.net/Bio-Formats), która udostępnia procedury umożliwiające ImageJ odczytywanie zastrzeżonych formatów plików różnych marek producentów systemów obrazowania.
UWAGA: W poniższych krokach założono, że interwały obrazowania są takie same w całym nagraniu. Jeśli tak nie jest, może być konieczne wyeksportowanie informacji o taktowaniu z oprogramowania do obrazowania i uwzględnienie ich w dalszej analizie. - Otwórz stos TIF zawierający komórki w obrazie ImageJ.
- Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby narysować ROI nad fluorescencyjnym kardiomiocytem w czerwonym kanale. Upewnij się, że zwrot z inwestycji jest wystarczająco duży, aby komórka nie wysunęła się z obszaru zwrotu podczas zawierania umowy.
- Otwórz wtyczkę menedżera ROI ("Analizuj | Narzędzia | ROI Manager") i naciśnij przycisk "Dodaj [t]", aby dodać ten ROI jako ROI1.
- Przeciągnij ROI na tę samą komórkę w zielonym kanale i dodaj ten ROI jako ROI2.
- W oknie "Analizuj | Ustaw pomiary, odznacz wszystkie opcje z wyjątkiem "Średnia wartość szarości".
UWAGA: Należy to zrobić tylko 1 raz w sesji ImageJ. - W menedżerze ROI naciśnij przycisk "Więcej | Przycisk Multi Measure'. Wybierz opcje "Zmierz wszystkie plasterki" i "Jeden rząd na plasterek" i naciśnij "OK". Otworzy się okno zawierające arkusz kalkulacyjny z trzema wierszami (numer wycinka i średnia fluorescencja w dwóch ROI reprezentujących komórkę odpowiednio w kanale czerwonym i zielonym).
- Za pomocą opcji "Plik | Zapisz jako', aby zapisać arkusz kalkulacyjny w pliku z wartościami rozdzielanymi przecinkami (CSV).
- Zamknij okno ze stosem obrazów i oknem arkusza kalkulacyjnego bez zamykania okna menedżera ROI. Otwórz stos TIF zawierający pomiar tła.
- W menedżerze ROI naciśnij przycisk "Więcej | Przycisk Multi Measure'. Wybierz opcje "Zmierz wszystkie plasterki" i "Jeden rząd na plasterek" i naciśnij "OK".
- Za pomocą opcji "Plik | Zapisz jako', aby zapisać arkusz kalkulacyjny z danymi tła w innym pliku CSV.
UWAGA: Poniższe obliczenia można wykonać za pomocą arkusza kalkulacyjnego. Użyliśmy R software18. Prosty przykładowy skrypt, który odczytuje komórkę i dane tła z plików "cell.csv" i "background.csv", wykonuje obliczenia i wykreśla przebieg czasowy sygnału potencjału błonowego, jest dostarczany jako plik kodu uzupełniającego 1. - Na podstawie nagrania w tle oblicz średnią intensywność w kanale czerwonym i zielonym. Odejmij ten sygnał tła od sygnałów reprezentujących komórkę w kanale czerwonym i zielonym, aby obliczyć odpowiednio sygnały RFP i GFP z korektą tła.
- Jako substytut potencjału błonowego oblicz stosunek RFP/GFP.
UWAGA: Ten stosunek jest bezwymiarowy. Alternatywnie można go znormalizować do wartości początkowej (tj. ΔR/R0). Co ważne, użyteczne informacje zawarte są w zmianach czasowych, a nie w wartościach bezwzględnych tego stosunku. Ze względu na nierównomierne fotobielenie GFP i RFP może wystąpić odchylenie linii bazowej w tym stosunku. W razie potrzeby taki dryft linii bazowej można skorygować, konstruując krzywą linii bazowej i odejmując ją od współczynnika RFP/GFP10.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Na Ryc. 4a przedstawiono typową pojedynczą iPSC-CM, przy czym białe przerywane linie oznaczają ROI wyznaczone podczas analizy obrazów w kanale RFP (lewa strona) i GFP (prawa strona). Sygnał z kanału RFP pokazuje okresowe zwiększenie intensywności fluorescencji podczas każdego potencjału czynnego (Ryc. 4b, górny panel). Jak opisano we Wprowadzeniu, wynika to ze wzrostu FRET spowodowanego zmianami potencjału membranowego (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda umożliwia optyczny zapis AP z określonego podtypu (tj. komórek komoropodobnych) CM generowanych z ludzkich iPSC. Ludzkie iPSC-CM są nowym narzędziem do rozwiązywania ogromnej różnorodności problemów biologicznych i medycznych, a różnicowanie do różnych podtypów CM jest ważnym źródłem zmienności eksperymentalnej. Dzięki zastosowaniu określonych elementów promotorowych, ekspresja GEVI jest osiągana w CM reprezentujących podtyp zainteresowania, które są następnie obrazowane optycznie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z Niemieckiej Fundacji Badawczej (Si 1747/1-1), Else Kröner-Fresenius-Stiftung i Deutsche Stiftung für Herzforschung.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| ß-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
| DMEM-F12 Medium | Invitrogen | 21331046 | |
| FBS (Fetal Bull Bull Surure) | Invitrogen | 16141079 | |
| MEM Aminokwasy endogenne | Invitrogen | 11140050 | |
| Suplement GlutaMax-I | Invitrogen | 35050061 | alternatywa L-glutamina |
| Penicylina-Streptomycyna | Invitrogen | 15140122 | |
| Fibronektyna osocze bydlęce | Sigma-Aldrich | F1141 | |
| Kolagenaza typu II | Worthington Biochem | LS004174 | |
| Bromek heksadimetryny (polibren) | Sigma-Aldrich | H9268 | wzmacniający infekcję lentiwirusową |
| Mikronaczynia 3,5 cm ze szklanym dnem | MatTek corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-14-C | |
| Statyw mikroskopowy | Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy | DMI6000B | |
| Obiektyw mikroskopu | Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy | HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Olejowa | |
| kamera sCMOS | Andor Technology, Belfast, Wielka Brytania | Zyla V | |
| Kostka filtra mikroskopu: filtr wzbudzenia | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | ET480/40X | pasmo przepustowe 480/40 |
| Kostka filtra mikroskopu: lustro dichroiczne | Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA | T505lpxr | długoprzepustowy 505 nm |
| Rozdzielacz obrazu | Cairn Research, Faversham, Wielka Brytania | OptoSplit II | |
| Kostka filtrująca rozdzielacza obrazu: zwierciadło dichroiczne | AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Niemcy | 568LPXR | longpass 568 nm |
| Kostka filtra rozdzielacza obrazu: filtr emisyjny 1 (emisja GFP) | AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Niemcy | 520/28 BrightLine HC | pasmo przepustowe 520/28 nm |
| Kostka filtrująca rozdzielacza obrazu: filtr emisyjny 2 (emisja RFP) | AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Niemcy | 630/75 ET Pasmo przepustowe pasma | przepustowego 630/75 nm |
| Wkładka do stymulacji | Warner Instruments, Hamden, CT, USA | RC-37FS |
Bibliografia
- Sinnecker, D., Laugwitz, K. L., Moretti, A. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug development and toxicity testing. Pharmacology & Therapeutics. 143 (2), 246-252 (2014).
- Goedel, A., My, I., Sinnecker, D., Moretti, A. Perspectives and Challenges of Pluripotent Stem Cells in Cardiac Arrhythmia Research. Current Cardiology Reports. 19 (3), 23(2017).
- Rocchetti, M., et al. Elucidating arrhythmogenic mechanisms of long-QT syndrome CALM1-F142L mutation in patient-specific induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 113 (5), 531-541 (2017).
- Sinnecker, D., et al. Modeling long-QT syndromes with iPS cells. Journal of Cardiovascular Translational Research. 6 (1), 31-36 (2013).
- Talkhabi, M., Aghdami, N., Baharvand, H. Human cardiomyocyte generation from pluripotent stem cells: A state-of-art. Life Sciences. , 98-113 (2016).
- Ben-Ari, M., et al. Developmental changes in electrophysiological characteristics of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Heart Rhythm. 13 (12), 2379-2387 (2016).
- Den Hartogh, S. C., Passier, R. Concise Review: Fluorescent Reporters in Human Pluripotent Stem Cells: Contributions to Cardiac Differentiation and Their Applications in Cardiac Disease and Toxicity. Stem Cells. 34 (1), 13-26 (2016).
- Schweizer, P. A., et al. Subtype-specific differentiation of cardiac pacemaker cell clusters from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 229(2017).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. The New England Journal of Medicine. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Chen, Z., et al. Subtype-specific promoter-driven action potential imaging for precise disease modelling and drug testing in hiPSC-derived cardiomyocytes. European Heart Journal. 38 (4), 292-301 (2017).
- Lam, A. J., et al. Improving FRET dynamic range with bright green and red fluorescent proteins. Nature Methods. 9 (10), 1005-1012 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
- Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010(2014).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. Journal of Visualized Experiments. (32), e1499(2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- R Development Core Team. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: http://www.R-project.org (2008).
- Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4 (3), 180-191 (2012).
- Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scientific Reports. 7, 5464(2017).
- Dorn, T., et al. Direct nkx2-5 transcriptional repression of isl1 controls cardiomyocyte subtype identity. Stem Cells. 33 (4), 1113-1129 (2015).
- Kaestner, L., et al. Genetically Encoded Voltage Indicators in Circulation Research. International Journal of Molecular Sciences. 16 (9), 21626-21642 (2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
