Specyficzne dla podtypu zapisy optycznego potencjału czynnościowego w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych kardiomiocytach komorowych pochodzących z komórek macierzystych

Summary

Tutaj prezentujemy metodę optycznego obrazowania potencjałów czynnościowych, szczególnie w indukowanych komorowo indukowanych pluripotencjalnych kardiomiocytach pochodzących z komórek macierzystych. Metoda opiera się na sterowanej przez promotor ekspresji wrażliwego na napięcie białka fluorescencyjnego.

Abstract

Kardiomiocyty generowane z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-CMs) są nowym narzędziem w badaniach sercowo-naczyniowych. Zamiast być jednorodną populacją komórek, iPSC-CM generowane przez obecne protokoły różnicowania reprezentują mieszaninę komórek o fenotypach komorowych, przedsionkowych i węzłowych, co komplikuje analizy fenotypowe. W tym artykule przedstawiono metodę optycznego zapisu potencjałów czynnościowych pochodzących z podobnych do komór iPSC-CM. Osiąga się to poprzez transdukcję lentiwirusową z konstruktem, w którym genetycznie kodowany wskaźnik napięcia jest pod kontrolą specyficznego dla komory elementu promotorowego. Gdy iPSC-CM są transdukowane za pomocą tego konstruktu, czujnik napięcia ulega ekspresji wyłącznie w komórkach podobnych do komór, umożliwiając rejestrację potencjału błony optycznej specyficznej dla podtypu za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej.

Introduction

Kardiomiocyty (CM) pochodzące z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) są nowym narzędziem do analizy molekularnych mechanizmów chorób serca, badania nowych terapii i badań przesiewowych pod kątem niekorzystnych skutków leków na serce^1,2,3. Od samego początku choroby arytmogenne, takie jak kanałopatie, były ważnym przedmiotem zainteresowania tego obszaru badawczego⁴. W związku z tym metody badania fenotypów elektrycznych CM, takich jak arytmie lub zmiany morfologii potencjału czynnościowego (AP), są sercem tej technologii.

Ważnym czynnikiem w zastosowaniu iPSC-CMs jest to, że obecne protokoły różnicowania serca nie prowadzą do jednorodnej populacji komórek. Zamiast tego są raczej mieszaniną komórek przypominających węzły zatokowe, przedsionkowe i komorowe CM na różnych poziomach dojrzewania^5,6,7,8. Ta niejednorodność może być istotnym źródłem zmienności eksperymentalnej, zwłaszcza jeśli badane są takie parametry, jak czas trwania APD (APD), które wewnętrznie różnią się między podtypami CM (np. APD jest krótsze w CM przedsionkowym niż w komorowym). Konwencjonalnym podejściem do rozwiązania tego problemu jest zbadanie pojedynczych iPSC-CM przy użyciu metody zacisku krosowego i sklasyfikowanie każdej komórki jako węzłowej, przedsionkowej lub komorowej, na podstawie jej morfologii AP⁹. Wszelka późniejsza analiza może być następnie ograniczona do komórek reprezentujących podtyp CM będący przedmiotem zainteresowania. Główną wadą tej strategii jest jej ograniczona przepustowość i brak skalowalności. Co więcej, inwazyjny charakter elektrofizjologii patch clamp nie pozwala na sekwencyjne obrazowanie tych samych komórek przez dłuższy czas.

Tutaj podajemy szczegóły eksperymentalne metody¹⁰ opracowanej do optycznego obrazowania punktów dostępowych w określonych podtypach iPSC-CMs. Pozwala to przezwyciężyć problem heterogeniczności podtypów i radykalnie zwiększyć przepustowość w porównaniu z konwencjonalnymi metodami, umożliwiając szybkie fenotypowanie iPSC-CM zawierających warianty genetyczne lub narażonych na działanie środków farmakologicznych.

Przegląd podejścia do obrazowania optycznego specyficznego dla podtypu

Genetycznie kodowany wskaźnik napięcia (GEVI), którego właściwości fluorescencyjne zmieniają się po depolaryzacji i repolaryzacji błony komórkowej, służy do optycznego obrazowania zmian potencjału błonowego CM. Zastosowane tutaj GEVI to białko fluorescencyjne VSFP-CR¹¹, które składa się z transbłonowej domeny wykrywającej napięcie połączonej z parą zielonego (Clover) i czerwonego (mRuby2) białka fluorescencyjnego (Figura 1A). Ze względu na bliskie sąsiedztwo dwóch fluoroforów, wzbudzenie białka zielonej fluorescencji powoduje, że część energii wzbudzenia jest przekazywana do białka czerwonej fluorescencji za pośrednictwem transferu energii rezonansu Förstera (FRET). Dlatego wzbudzenie białka zielonej fluorescencji powoduje emisję zarówno z białek zielonej, jak i czerwonej fluorescencji (ryc. 1A, górny panel). Kiedy ogniwo ulega depolaryzacji, następuje strukturalne przegrupowanie czujnika napięcia, które przekłada się na reorientację dwóch białek fluorescencyjnych, zwiększając wydajność FRET. W ten sposób jeszcze więcej energii wzbudzenia jest przenoszone z białka fluorescencyjnego zielonego do czerwonego (ryc. 1A, dolny panel). W rezultacie w zdepolaryzowanej komórce emisja zielonej fluorescencji jest ciemniejsza, a emisja czerwonej fluorescencji jest jaśniejsza niż w komórce o spoczynkowym potencjale błonowym (ryc. 1B).

Rysunek 1: Obrazowanie optyczne potencjału błonowego za pomocą VSFP-CR. (A) Pokazano schemat przedstawiający działanie wrażliwego na napięcie białka fluorescencyjnego VSFP-CR. Po depolaryzacji błony komórkowej przegrupowanie strukturalne w domenie transbłonowej wykrywającej napięcie przekłada się na reorientację białka fluorescencyjnego zielonego (GFP) i czerwonego (RFP), zwiększając wydajność wewnątrzcząsteczkowego transferu energii rezonansu Förstera (FRET). (B) Przedstawiono widma emisyjne VSFP po wzbudzeniu GFP w komórkach o spoczynkowym potencjale błonowym (górny panel) i w komórkach zdepolaryzowanych (dolny panel). Zmiana widma po depolaryzacji jest przesadzona dla jasności. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Zmiany w wydajności FRET odzwierciedlające fluktuacje potencjału membranowego są obrazowane za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w rozdzielacz obrazu, który rozdziela emisje czerwonej i zielonej fluorescencji i rzutuje je na dwa sąsiadujące obszary chipa kamery sCMOS (Rysunek 2). Dzięki takiemu układowi emisja fluorescencji w dwóch różnych pasmach długości fal może być rejestrowana jednocześnie, co pozwala na obliczenie stosunku fluorescencji czerwonej do zielonej w celu odzwierciedlenia potencjału błony na każdym zdjęciu serii poklatkowej.

Rysunek 2: Konfiguracja systemu obrazowania. Przedstawiono główne elementy systemu obrazowania wykorzystywanego do obrazowania zmian widmowych wrażliwego na napięcie białka fluorescencyjnego, odzwierciedlające zmiany potencjału błonowego w wysokiej rozdzielczości czasowej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ekspresja VSFP-CR w CMs jest osiągana przez transdukcję lentiwirusową. Aby skierować ekspresję do podtypu CM będącego przedmiotem zainteresowania, lentiwirus zawiera element promotora (wzmacniacz MLC2v), który specyficznie steruje transkrypcją w podobnych do komór iPSC-CMs¹⁰. Gdy iPSC-CM, które reprezentują mieszaninę komórek przedsionkowych, węzłowych i komorowych, są transdukowane tym lentiwirusem, VSFP-CR ulega ekspresji tylko w komórkach podobnych do komór. Ponieważ obrazowanie optycznego potencjału czynnościowego zależy od tego czujnika fluorescencyjnego, zarejestrowane potencjały czynnościowe reprezentują wyłącznie podtyp CM będący przedmiotem zainteresowania (ryc. 3).

Rysunek 3: Ekspresja VSFP sterowana promotorem dla obrazowania potencjału błonowego specyficznego dla podtypu. (a) Ten schemat pokazuje, w jaki sposób uzyskuje się zapisy potencjału czynnościowego specyficznego dla podtypu kardiomiocytów. (b) Pokazano iPSC-CM zakażone VSFP pod kontrolą specyficznego dla komór wzmacniacza MLC2v. Ekspresję czujnika napięcia obserwuje się tylko w CM podobnych do komorowych w kanale GFP (lewy panel). Dostępne są również kontrast fazowy (panel środkowy) i obraz nakładki (prawy panel). Białe przerywane linie oznaczają granice komórek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

1. Przygotowanie kardiomiocytów pochodzących z iPSC do obrazowania

UWAGA: Metody hodowli iPSC i różnicowania serca zostały wcześniej opublikowane^12,13,14 i nie są tutaj szczegółowo omawiane. W zależności od zastosowanego protokołu różnicowania zaleca się oczyszczanie iPSC-CM poprzez ręczną mikrodysekcję, magnetyczną separację komórek lub selekcję mleczanu. W przypadku poniższego protokołu, mikrowypreparowane eksplantaty z obszarów bicia, wygenerowane przy użyciu protokołu różnicowania jednowarstwowego¹³, pobrano w 15 dniu różnicowania serca i hodowano do 30 dnia na płytkach pokrytych fibronektyną, jak opisano wcześniej¹⁰.

1. Wyjąć płytki z hodowli komórkowych z inkubatora i ręcznie zebrać eksplantaty serca do probówek mikrowirówkowych za pomocą pipety o pojemności 200 μl. Po sedymentacji odessać supernatant hodowli komórkowej i delikatnie przemyć eksplantaty 2x zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS).
2. Dysocjować iPSC-CM przez dodanie kolagenazy typu II (430 U/ml w HBSS) i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
3. Po sedymentacji pozostałych dużych grudek komórkowych zebrać supernatant zawierający zdysocjowane pojedyncze iPSC-CM i dodać go do świeżej pożywki podtrzymującej CM zawierającej wysokie stężenie płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (DMEM-F12, 20% FBS, 2 mM L-glutamina, 1:100 MEM aminokwasy endogenne, 100 U/ml penicylina-streptomycyna i 0,1 mM β-merkaptoetanolu).
4. Powtórz dysocjację, jeśli pozostaną duże grudki komórek. Zebrać pojedyncze iPSC-CM przez odwirowanie i ponownie zawiesić je w pożywce CM o niskim stężeniu FBS (2% FBS).
5. Ponownie zasiewać pojedyncze iPSC-CM w gęstości umożliwiającej późniejsze obrazowanie pojedynczych komórek na mikronaczyniu do hodowli komórek ze szklanym dnem o średnicy 3,5 cm, która została pokryta fibronektyną (2 μg/^cm2). Zoptymalizuj gęstość wysiewu przed przystąpieniem do eksperymentów o wysokiej przepustowości. Zwykle wystarczy 5–10 eksplantatów sercowych na 3,5 cm naczynie; Jednak zależy to w dużej mierze od wielkości i czystości eksplantatu.
6. Hodowla pojedynczych iPSC-CM po ich dysocjacji w pożywce podtrzymującej CM zawierającej 2% FBS przez co najmniej 48 godzin, aby zapewnić wystarczający odzysk.
   Uwaga: W kolejnych krokach iPSC-CM są transdukowane lentiwirusem kodującym GEVI VSFP-CR pod kontrolą wzmacniacza MLC2v ¹⁰ w celu uzyskania specyficznej dla komory ekspresji GEVI. Alternatywnie można użyć konstruktów lentiwirusowych pozwalających na ekspresję GEVI specyficznie w komórkach węzłowych lub przedsionkowych lub niespecyficznych konstruktów, zawierających wszechobecnie wyrażany promotor PGK¹⁰. Plazmidy lentiwirusowe są dostępne na życzenie.
   UWAGA: Podczas pracy z cząstkami lentiwirusa należy upewnić się, że środowisko pracy ma odpowiedni poziom bezpieczeństwa biologicznego, przestrzegać instrukcji bezpieczeństwa dotyczących pracy z potencjalnie zakaźnymi czynnikami i podjąć niezbędne środki ostrożności.
7. Przygotuj pożywkę infekcyjną, mieszając supernatant z hodowli komórkowych zawierający lentivirus¹⁰, który został wytworzony w komórkach HEK293 zgodnie z wcześniejszym opisem ¹⁵, z pożywką podtrzymującą CM (patrz krok 1.3) w stosunku 1:1.
8. Dodać bromek heksadimetryny w końcowym stężeniu 8 μg/ml, aby zwiększyć skuteczność infekcji.
   UWAGA: Ze względu na wysoką skuteczność infekcji iPSC-CM, wcześniejsze zagęszczenie lentiwirusa poprzez ultrawirowanie zwykle nie jest konieczne.
9. Odessać pożywkę podtrzymującą CM z pojedynczych iPSC-CM i zastąpić ją pożywką infekcyjną przygotowaną w krokach 1.7 i 1.8. Hodowlę zakażonych pojedynczych iPSC-CM w pożywce infekcyjnej przez 12 godzin w temperaturze 37 °C. Następnie odessać pożywkę i ponownie zastąpić ją pożywką konserwacyjną CM.
   UWAGA: Sygnał fluorescencyjny z GEVI pojawia się 48 godzin po infekcji. Zaleca się obrazowanie zapisów potencjału błonowego, najwcześniej 72 godziny po zakażeniu, aby zapewnić odpowiednią siłę sygnału. Pojedyncze zakażone iPSC-CM można hodować przez co najmniej 3 tygodnie i obrazować sekwencyjnie. Jeśli podczas sesji obrazowania dojdzie do rozległego fotowybielania, sygnał fluorescencji odzyskuje się z czasem.
10. Przed obrazowaniem należy wymienić pożywkę do hodowli komórkowej roztworem Tyrode'a uzupełnionym Ca²⁺ (135 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 10 mM glukozy, 1,8 mM CaCl₂ i 10 mM HEPES; pH 7,35).

2. Zapisy potencjału membrany optycznej

1. Umieścić komorę obrazowania zawierającą iPSC-CM na stoliku odwróconego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w rozdzielacz obrazu, odpowiednie zestawy filtrów i kamerę (np. kamerę sCMOS) zdolną do szybkiego obrazowania z wysoką czułością.
   UWAGA: Na przykład w rozgałęźniku obrazu należy użyć filtra wzbudzenia pasmowo-przepustowego 480/40 nm w połączeniu z długoprzepustowym zwierciadłem dichroicznym 500 nm oraz długoprzepustowego zwierciadła dichroicznego 568 nm w połączeniu z filtrami emisji pasmowo-przepustowej 520/28 nm i 630/75 nm. W przypadku obrazowania jednokomórkowego obiektyw zanurzeniowy z olejkiem o dużym powiększeniu i dużej aperturze numerycznej zapewnia najlepszy stosunek sygnału do szumu.
2. Jeśli wymagana jest stymulacja elektryczna, zainstaluj elektrody stymulujące w komorze obrazowania i podłącz je do generatora bodźców.
   UWAGA: Użyliśmy wkładki stymulatorskiej, która zawierała dwie platynowe elektrody i pasowała do 3,5 cm naczyń do hodowli komórek ze szklanym dnem. Zobrazowano ogniwa znajdujące się między elektrodami. Typowymi parametrami stymulacji są impulsy prostokątne o czasie trwania 5 ms, o amplitudzie 10 V/cm odległości między elektrodami.
3. Opcjonalnie można użyć podgrzewanego stolika mikroskopowego, aby zapewnić stabilną temperaturę iPSC-CM podczas obrazowania, a nawet ustawić komorę inkubacyjną mikroskopu, jeśli planowane jest obrazowanie długotrwałe.
4. Ustaw ostrość komórek i umieść komórkę wyrażającą GEVI w środku pola widzenia.
   UWAGA: Najwygodniej jest to zrobić za pomocą okularów mikroskopu wykorzystujących zestaw filtrów z zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) lub czerwonym białkiem fluorescencyjnym (RFP) do identyfikacji komórek wykazujących ekspresję GEVI.
5. Ustaw ścieżkę optyczną tak, aby emitowane światło było kierowane do rozdzielacza obrazu. Zmień kostkę filtra w mikroskopie na tę, która ma być połączona z filtrami w rozdzielaczu obrazu (patrz Tabela materiałów).
6. W oprogramowaniu sterującym kamerą ustaw ustawienia akwizycji tak, aby możliwe było szybkie obrazowanie (np. 100 klatek na sekundę, z czasem naświetlania 10 ms na klatkę).
   Uwaga: Zwykle wiąże się to z binowaniem pikseli aparatu (np. 8 x 8 pikseli układu aparatu jest łączonych w binacje, aby wygenerować jeden piksel w filmie poklatkowym).
7. Skonfiguruj rozdzielacz obrazu zgodnie z instrukcją producenta. Dwa obrazy reprezentujące dwa różne pasma długości fal emisji powinny przylegać do siebie, a każdy z nich powinien zajmować połowę obrazu.
   UWAGA: Ten krok należy wykonać tylko 1 raz na początku każdej sesji obrazowania.
8. Sprawdź i, jeśli to konieczne, wyreguluj ostrość obrazu wytwarzanego przez aparat.
9. Dostosuj jasność światła podświetlanego tak, aby uniknąć nasycenia pikseli; najłatwiej można to zrobić, używając palety kolorów, w której nasycone piksele są reprezentowane przez unikalny kolor.
   UWAGA: Podczas wszystkich tych przygotowań przed obrazowaniem należy ograniczyć ekspozycję próbki na światło wzbudzające do niezbędnej ilości (tj. nie pozostawiać światła włączonego przez dłuższy czas), aby uniknąć fotowybielania GEVI.
10. Ustaw akwizycję szeregów czasowych (np. 5 000 obrazów przy 100 klatkach na sekundę przez czas trwania serii wynoszący 50 sekund). Przyciemnij światło w pomieszczeniu (w tym monitory komputerowe), aby światło rozproszone nie wpływało na pomiar. Jeśli przesłona światła wzbudzenia nie jest kontrolowana przez oprogramowanie do obrazowania, otwórz ją tuż przed rozpoczęciem akwizycji.
11. Rozpocznij akwizycję serii obrazów. Jeśli wymagana jest stymulacja elektryczna, rozpocznij sekwencję stymulacji w odpowiednim punkcie czasowym, chyba że jest ona automatycznie inicjowana przez oprogramowanie do obrazowania. Jeżeli pożądane jest zastosowanie środka farmakologicznego, należy to zrobić ręcznie (np. poprzez odpipetowanie 100 μl środka w dziesięciokrotnym stężeniu końcowym do komory rejestrującej zawierającej 900 μl buforu i delikatne wymieszanie go z pipetą) lub przy użyciu systemu perfuzji o stałym przepływie.
12. Po zakończeniu akwizycji zamknij migawkę światła wzbudzenia, jeśli to konieczne. Zapisz nagranie na dysku twardym.
13. Pozostawiając ustawienia zapisu (tj. czas ekspozycji, liczbę klatek na sekundę i natężenie światła) bez zmian, wykonaj zapis fluorescencji tła (jak w kroku 2.11) na obszarze szkiełka nakrywkowego niezawierającym komórek lub na innym szkiełku nakrywkowym, na którym nie zasiano żadnych komórek.
    UWAGA: Jeśli pomiary sekwencyjne są wykonywane bez zmiany ustawień akwizycji, dla wszystkich tych pomiarów konieczny jest tylko jeden zapis fluorescencji tła.
14. W razie potrzeby należy przeprowadzić dodatkowe eksperymenty (kroki 2.4–2.13) na różnych iPSC-CM znajdujących się na tym samym szkiełku nakrywkowym. Należy pamiętać, że w przypadku zastosowania leku wszystkie CM na szkiełku nakrywkowym zostaną naruszone.

3. Analiza

>UWAGA: W zależności od używanego oprogramowania do obrazowania (które zazwyczaj jest zastrzeżonym pakietem oprogramowania dostarczanym przez producenta kamery lub całego systemu obrazowania fluorescencyjnego), możliwe jest przeprowadzenie analizy uzyskanych obrazów częściowo lub nawet całkowicie w ramach tego pakietu oprogramowania. Jednak tutaj opisano przepływ pracy analizy obrazu, który można wykonać za pomocą oprogramowania open source (>tj. platformy do analizy obrazów ImageJ)¹⁶, który można wygodnie zainstalować za pomocą dystrybucji, takiej jak Fiji¹⁷, oraz pakiet R do obliczeń statystycznych¹⁸. Krótko mówiąc, obszary zainteresowania (ROI) reprezentujące komórki lub tło są rysowane w ImageJ, a średnia fluorescencja w tych ROI w czasie jest eksportowana do pliku, który następnie jest dalej analizowany w R lub, alternatywnie, za pomocą oprogramowania do arkuszy kalkulacyjnych.

1. W oprogramowaniu do obrazowania zapisz lub wyeksportuj uzyskane szeregi czasowe obrazu (zarówno nagranie zawierające komórki, jak i odpowiadające mu nagranie w tle) do formatu (np. TIF), który może być odczytany przez ImageJ. Alternatywnie można użyć wtyczki BioFormats (https://imagej.net/Bio-Formats), która udostępnia procedury umożliwiające ImageJ odczytywanie zastrzeżonych formatów plików różnych marek producentów systemów obrazowania.
   UWAGA: W poniższych krokach założono, że interwały obrazowania są takie same w całym nagraniu. Jeśli tak nie jest, może być konieczne wyeksportowanie informacji o taktowaniu z oprogramowania do obrazowania i uwzględnienie ich w dalszej analizie.
2. Otwórz stos TIF zawierający komórki w obrazie ImageJ.
3. Użyj narzędzia do zaznaczania odręcznego, aby narysować ROI nad fluorescencyjnym kardiomiocytem w czerwonym kanale. Upewnij się, że zwrot z inwestycji jest wystarczająco duży, aby komórka nie wysunęła się z obszaru zwrotu podczas zawierania umowy.
4. Otwórz wtyczkę menedżera ROI ("Analizuj | Narzędzia | ROI Manager") i naciśnij przycisk "Dodaj [t]", aby dodać ten ROI jako ROI1.
5. Przeciągnij ROI na tę samą komórkę w zielonym kanale i dodaj ten ROI jako ROI2.
6. W oknie "Analizuj | Ustaw pomiary, odznacz wszystkie opcje z wyjątkiem "Średnia wartość szarości".
   UWAGA: Należy to zrobić tylko 1 raz w sesji ImageJ.
7. W menedżerze ROI naciśnij przycisk "Więcej | Przycisk Multi Measure'. Wybierz opcje "Zmierz wszystkie plasterki" i "Jeden rząd na plasterek" i naciśnij "OK". Otworzy się okno zawierające arkusz kalkulacyjny z trzema wierszami (numer wycinka i średnia fluorescencja w dwóch ROI reprezentujących komórkę odpowiednio w kanale czerwonym i zielonym).
8. Za pomocą opcji "Plik | Zapisz jako', aby zapisać arkusz kalkulacyjny w pliku z wartościami rozdzielanymi przecinkami (CSV).
9. Zamknij okno ze stosem obrazów i oknem arkusza kalkulacyjnego bez zamykania okna menedżera ROI. Otwórz stos TIF zawierający pomiar tła.
10. W menedżerze ROI naciśnij przycisk "Więcej | Przycisk Multi Measure'. Wybierz opcje "Zmierz wszystkie plasterki" i "Jeden rząd na plasterek" i naciśnij "OK".
11. Za pomocą opcji "Plik | Zapisz jako', aby zapisać arkusz kalkulacyjny z danymi tła w innym pliku CSV.
    UWAGA: Poniższe obliczenia można wykonać za pomocą arkusza kalkulacyjnego. Użyliśmy R software¹⁸. Prosty przykładowy skrypt, który odczytuje komórkę i dane tła z plików "cell.csv" i "background.csv", wykonuje obliczenia i wykreśla przebieg czasowy sygnału potencjału błonowego, jest dostarczany jako plik kodu uzupełniającego 1.
12. Na podstawie nagrania w tle oblicz średnią intensywność w kanale czerwonym i zielonym. Odejmij ten sygnał tła od sygnałów reprezentujących komórkę w kanale czerwonym i zielonym, aby obliczyć odpowiednio sygnały RFP i GFP z korektą tła.
13. Jako substytut potencjału błonowego oblicz stosunek RFP/GFP.
    UWAGA: Ten stosunek jest bezwymiarowy. Alternatywnie można go znormalizować do wartości początkowej (tj. ΔR/R₀). Co ważne, użyteczne informacje zawarte są w zmianach czasowych, a nie w wartościach bezwzględnych tego stosunku. Ze względu na nierównomierne fotobielenie GFP i RFP może wystąpić odchylenie linii bazowej w tym stosunku. W razie potrzeby taki dryft linii bazowej można skorygować, konstruując krzywą linii bazowej i odejmując ją od współczynnika RFP/GFP¹⁰.

Results

W Rysunek 4a, reprezentatywny pojedynczy iPSC-CM jest przedstawiony białymi przerywanymi liniami oznaczającymi ROI narysowany podczas analizy obrazowej w kanale RFP (po lewej stronie) i GFP (po prawej stronie). Sygnał z kanału RFP pokazuje okresowy wzrost intensywności fluorescencji podczas każdego potencjału czynnościowego (Rysunek 4b, górny panel). Jak opisano we Wprowadzeniu, jest to spowodowane rosnącym FRET spowodowanym zmianami poten...

Discussion

Opisana tutaj metoda umożliwia optyczny zapis AP z określonego podtypu (tj. komórek komoropodobnych) CM generowanych z ludzkich iPSC. Ludzkie iPSC-CM są nowym narzędziem do rozwiązywania ogromnej różnorodności problemów biologicznych i medycznych, a różnicowanie do różnych podtypów CM jest ważnym źródłem zmienności eksperymentalnej. Dzięki zastosowaniu określonych elementów promotorowych, ekspresja GEVI jest osiągana w CM reprezentujących podtyp zainteresowania, które są następnie obrazowane optycznie.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ß-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
DMEM-F12 Medium	Invitrogen	21331046
FBS (Fetal Bull Bull Surure)	Invitrogen	16141079
MEM Aminokwasy endogenne	Invitrogen	11140050
Suplement GlutaMax-I	Invitrogen	35050061	alternatywa L-glutamina
Penicylina-Streptomycyna	Invitrogen	15140122
Fibronektyna osocze bydlęce	Sigma-Aldrich	F1141
Kolagenaza typu II	Worthington Biochem	LS004174
Bromek heksadimetryny (polibren)	Sigma-Aldrich	H9268	wzmacniający infekcję lentiwirusową
Mikronaczynia 3,5 cm ze szklanym dnem	MatTek corporation, Ashland, MA, USA	P35G-1.5-14-C
Statyw mikroskopowy	Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy	DMI6000B
Obiektyw mikroskopu	Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy	HCX PL APO 63X/1.4-0.6 Olejowa
kamera sCMOS	Andor Technology, Belfast, Wielka Brytania	Zyla V
Kostka filtra mikroskopu: filtr wzbudzenia	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	ET480/40X	pasmo przepustowe 480/40
Kostka filtra mikroskopu: lustro dichroiczne	Chroma Technology Corp, Bellows Falls, VT, USA	T505lpxr	długoprzepustowy 505 nm
Rozdzielacz obrazu	Cairn Research, Faversham, Wielka Brytania	OptoSplit II
Kostka filtrująca rozdzielacza obrazu: zwierciadło dichroiczne	AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Niemcy	568LPXR	longpass 568 nm
Kostka filtra rozdzielacza obrazu: filtr emisyjny 1 (emisja GFP)	AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Niemcy	520/28 BrightLine HC	pasmo przepustowe 520/28 nm
Kostka filtrująca rozdzielacza obrazu: filtr emisyjny 2 (emisja RFP)	AHF Analysentechnik GmbH, Tü bigen, Niemcy	630/75 ET Pasmo przepustowe pasma	przepustowego 630/75 nm
Wkładka do stymulacji	Warner Instruments, Hamden, CT, USA	RC-37FS