Artykuł metodologiczny

Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu

11K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58152

⸱

29 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  , 
1Hotchkiss Brain Institute, Department of Cell Biology and Anatomy, Cumming School of Medicine, University of Calgary, 2Department of Developmental and Stem Cell Biology Program, Arthur and Sonia Labatt Brain Tumor Research Centre, The Hospital for Sick Children

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy techniki obrazowania żywych komórek, aby ilościowo zmierzyć migrację i inwazję komórek macierzystych glejaka mózgu w czasie i w wielu warunkach leczenia.

Streszczenie

Glejak wielopostaciowy (GBM) to agresywny guz mózgu, który jest słabo kontrolowany za pomocą obecnie dostępnych opcji leczenia. Kluczowe cechy GBM obejmują szybką proliferację i wszechobecną inwazję do normalnego mózgu. Uważa się, że nawroty wynikają z obecności opornych na promieniowanie i chemię komórek macierzystych guza mózgu (BTSC), które atakują z dala od początkowej masy nowotworowej, a tym samym unikają resekcji chirurgicznej. W związku z tym terapie ukierunkowane na BTSC i ich zdolności inwazyjne mogą poprawić złe rokowanie w tej chorobie. Nasza grupa i inne grupy z powodzeniem ustaliły i scharakteryzowały posiewy BTSC na podstawie próbek pacjentów z GBM. Te hodowle BTSC wykazują podstawowe właściwości nowotworowych komórek macierzystych, takie jak klonogenna samoodnowa, różnicowanie wieloliniowe i inicjacja guza u myszy z niedoborem odporności. W celu udoskonalenia obecnych podejść terapeutycznych w GBM konieczne jest lepsze zrozumienie mechanizmów migracji i inwazji BTSC. W GBM badania nad migracją i inwazją są ograniczone, częściowo ze względu na ograniczenia istniejących technik, które nie uwzględniają w pełni charakterystyki wzrostu in vitro BTSC hodowanych jako neurosfery. W tym miejscu opisujemy szybkie i ilościowe testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania zarówno właściwości migracyjnych, jak i inwazyjnych BTSC. Pierwszą opisaną metodą jest test migracji BTSC, który mierzy migrację w kierunku gradientu chemoatraktantu. Drugą opisaną metodą jest test inwazji BTSC, który obrazuje i określa ilościowo inwazję komórkową z neurosfer do macierzy. Opisane tutaj testy są wykorzystywane do ilościowego określenia migracji i inwazji BTSC w czasie i w różnych warunkach leczenia.

Wprowadzenie

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najczęstszą i najbardziej agresywną formą raka mózgu i, pomimo obecnej terapii obejmującej chirurgiczną resekcję, a następnie radioterapię i chemioterapię, mediana przeżycia pacjentów wynosi zaledwie 15 miesięcy1. GBM jest inwazyjną, wysoce lekooporną i ostatecznie nieuleczalną chorobą, która wymaga ciągłych badań nad jej wrodzoną biologią w celu zidentyfikowania nowych ścieżek terapeutycznych. Wysoka śmiertelność pacjentów z GBM jest spowodowana przede wszystkim rozległą inwazją komórkową do sąsiedniej normalnej tkanki mózgowej i migracją wzdłuż naczyń krwionośnych, co prowadzi do nawrotu choroby po leczeniu2,3. Przypuszcza się, że podzbiór komórek, określany jako komórki macierzyste guza mózgu (BTSC), które działają wolno i są oporne na leczenie, może prowadzić do nawrotu choroby. GBM BTSC wykazują właściwości klonogennej samoodnowy, multipotencji i potencjału inicjowania nowotworu4,5,6. BTSC zachowują również genetyczną, molekularną i fenotypową heterogeniczność swoich macierzystych guzów GBM7,8,9,10. Właściwości te sprawiają, że BTSC są niezwykle użytecznym systemem modelowym do badania GBM i do badania nowych strategii terapeutycznych. In vivo, te komórki macierzyste są zdolne do powstawania, wzrostu i inwazji guza po wszczepieniu do mózgów nowonarodzonych szczurów11 i nieotyłych myszy z cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID)4. Zdolność BTSC do wielokrotnego tworzenia inwazyjnych guzów in vivo, które podsumowują komórkowe i histologiczne cechy ich pierwotnych guzów, silnie wspiera ich rolę jako komórek inicjujących nowotwór12.

Opracowywane są nowatorskie podejścia terapeutyczne, które mają na celu poprawę długoterminowych wyników leczenia pacjentów z GBM. Obecnie wiedza na temat procesów migracji i inwazji komórek, które są związane z opornością na leczenie i nawrotami, jest ograniczona. Migracja i inwazja to odrębne zjawiska; Migracja jest procesem leżącym u podstaw ukierunkowanego ruchu komórek i obejmuje reorganizację cytoszkieletu, cząsteczki adhezyjne oraz montaż/demontaż ogniskowych punktów kontaktowych, podczas gdy inwazja wymaga również fizycznego zniszczenia barier, takich jak macierz zewnątrzkomórkowa13. Powszechnie akceptowaną metodologią badania migracji i inwazji komórek jest test Boydena Chamber assay14,15. W tej technice pożywka jest wypełniona pożywką, przy czym pożywka w dolnej komorze jest uzupełniona chemoatraktantem. Chemotaksja jest wywoływana za pomocą określonych czynników wzrostu lub cytokin lub płodowej surowicy bydlęcej jako niespecyficznego chemoatraktantu. Zgodnie z gradientem chemoatraktantu komórki migrują przez porowatą błonę. W punkcie końcowym migrowane komórki można zwizualizować i określić ilościowo na dnie błony poprzez barwienie barwnikami cytologicznymi lub fluorescencyjnymi. Test migracji Boydena można zmodyfikować do testu inwazji poprzez pokrycie porowatego filtra składnikami macierzy zewnątrzkomórkowej, takimi jak kolagen typu I lub matryca przypominająca błonę podstawną. Komórki inwazyjne degradują matrycę, przemieszczają się na dno porowatego filtra i mogą być oznaczane ilościowo w podobny sposób jak w teście migracji. Inne powszechnie stosowane testy migracji obejmują testy ran drapanych i stref wykluczenia komórek13. Test rany drapanej wykonuje się poprzez zadrapanie szczeliny w monowarstwie komórkowej i obserwację migracji komórek z krawędzi rany poprzez obrazowanie w regularnych odstępach czasu, aż rysa zostanie zamknięta. W teście wykluczania komórek stosuje się fizyczną barierę w celu utworzenia strefy wolnej od komórek przed wysiewem komórek. Bariera jest usuwana, gdy komórki zlewają się, a migracja komórek do strefy wolnej od komórek jest regularnie obrazowana16.

Te wcześniej ustalone testy są często używane do badania migracji lub inwazji przylegających i jednorodnych populacji komórek, ale stwarzają znaczne niedogodności podczas badania GBM BTSC lub innych heterogenicznych populacji komórek rakowych. Test w komorze Boydena może generować tylko pomiary punktów końcowych w porównaniu z kinetyczną oceną ruchu komórki. Obserwacja w czasie ma duże znaczenie dla pomiaru migracji BTSC, biorąc pod uwagę, że komórki z różnych kultur często migrują w różnym tempie. W związku z tym warunki i czas testu muszą być zoptymalizowane dla każdego typu kultury i wymagają czasochłonnego wysiłku w celu odpowiedniego pobrania próbek i oceny ilościowej. Testy zadrapań i wykluczenia komórek nie są dobrze dostosowane do hodowli BTSC, ponieważ nawet gdy BTSC są hodowane w warunkach jednowarstwowych na płytkach pokrytych lamininą, zaobserwowaliśmy, że BTSC wydają się opierać ruchowi na otwartej przestrzeni i wolą pozostać w bliskiej odległości od innych komórek. Co więcej, te ustalone testy migracji nie pozwalają na wizualizację i monitorowanie pojedynczych komórek w trakcie eksperymentu. Monitorowanie pojedynczych komórek w czasie jest cenne dla oceny migracji w heterogenicznych populacjach komórek, takich jak BTSC. Dodatkowymi wadami testów z komorą Boydena, zadrapaniem i strefą wykluczenia komórek dla kultur BTSC jest to, że wymagają one stosunkowo dużej liczby komórek, mogą być czasochłonne w konfiguracji i albo szybko się równoważą, albo nie mają gradientu chemoatraktantu. W związku z tym testy te nie są idealne do stosowania w rzadkich lub wolno rosnących populacjach komórek ani do badań przesiewowych leków. Co więcej, testy te nie nadają się do pomiaru inwazji w formacie trójwymiarowym (3D), co jest szczególnie ważne w przypadku BTSC hodowanych w warunkach neurosfery.

Tutaj opisujemy testy specjalnie zmodyfikowane do obserwacji i kwantyfikacji migracji dla poszczególnych BTSC oraz do inwazji GBM BTSC hodowanych jako neurosfery. Pierwszy test opisuje adaptację testu komory Boydena przy użyciu obrazowania poklatkowego żywych komórek i płytki migracyjnej chemotaksji do pomiaru chemotaktycznej migracji komórek13. Obrazowanie żywych komórek w formacie wielodołkowym pozwala na wizualizację i ilościowe określenie migracji komórek w wielu warunkach leczenia. Drugi opisany tutaj test to test inwazji sferoidów13,17, który mierzy właściwości inwazyjne BTSC hodowanych w warunkach neurosfery i osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej 3D w różnych warunkach leczenia. Ogólnie rzecz biorąc, testy te są znacznie bardziej kompatybilne niż wcześniej opisane metodologie badania właściwości migracyjnych i inwazyjnych heterogenicznych kultur BTSC. Oferują one również lepsze możliwości badania nowych strategii terapeutycznych ukierunkowanych zarówno na migrację, jak i inwazję, które w znacznym stopniu przyczyniają się do nawrotów choroby i śmiertelności.

Protokół

1. Hodowla komórek macierzystych guza mózgu wcześniej pochodzących z próbek ludzkiego glejaka

Uwaga: Kultury BTSC zostały wcześniej założone na podstawie próbek pobranych od pacjentów z GBM6,7,8,9,10.

  1. Rozmrozić fiolkę z kriogenicznie zakonserwowanymi BTSC w zlewce zawierającej 70% etanolu, umieszczoną w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, tylko do momentu rozmrożenia ostatniej części lodu. Rozcieńczyć rozmrożone komórki w 10 ml pożywki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml i odwirować komórki przy 150 względnej sile odśrodkowej (RCF) przez 7 min.
    Uwaga: W tych protokołach kompletne pożywki odnoszą się do standardowych pożywek używanych do hodowli BTSC (wcześniej opisanych przez Kelly'ego i wsp.)6, zazwyczaj z obecnymi czynnikami wzrostu. Pożywka bez czynników wzrostu odnosi się do pożywki bazowej ze wszystkimi składnikami, ale bez uzupełnionych żadnych czynników wzrostu.
  2. Odessać pożywkę, ponownie zawiesić komórki w 8 ml kompletnej pożywki i przenieść komórki i pożywkę do kolby T25.
  3. Po 1 tygodniu hodowli w warunkach nieprzylegających do zalegania należy codziennie monitorować kolbę i uzupełniać zawartość o 1 - 2 ml kompletnej pożywki w razie potrzeby, jeśli pożywka zacznie się wyczerpywać lub zacznie stawać się kwaśna, na co wskazuje pomarańczowo-żółta zmiana koloru. Komórki pasażowe, gdy neurosfery osiągają średnicę około 250 μm, zwykle między 10 - 14 d (Rysunek 1).
    Uwaga: Czas podwojenia różnych kultur BTSC jest bardzo zróżnicowany. Wielkość neurosfery można zmierzyć za pomocą mikrometru ocznego.
  4. Aby przejść przez BTSC, należy zebrać pożywkę i neurosfery, pipetując pożywkę po powierzchni kolby, aby zebrać wszystkie neurosfery i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować probówkę przez 7 minut przy 150 RCF.
    Uwaga: Kolby można sprawdzić pod mikroskopem, aby upewnić się, że wszystkie neurosfery zostały zebrane. Można przeprowadzić dodatkowe płukanie 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub pożywki, aby w razie potrzeby zebrać pozostałe neurosfery.
  5. Aby zdysocjować neurosfery BTSC na pojedyncze komórki, odessać pożywkę i dodać 1 ml wstępnie ogrzanego roztworu do odrywania komórek i inkubować go w temperaturze 37 °C przez 7 minut. Zawiesinę BTSC rozprowadzić 40-krotnie za pomocą mikropipety P1 000 o stężeniu 800 μl.
    Uwaga: Komórki mogą być inkubowane dłużej w temperaturze 37 °C, jeśli neurosfery nie dysocjują.
  6. Dodać 5 ml PBS (z antybiotykami penicyliną i streptomycyną) do zdysocjowanych BTSC i odwirować komórki przy 150 RCF przez 7 minut.
  7. Odessać supernatant i ponownie zawiesić BTSC w 1 - 4 ml kompletnej pożywki, w zależności od wielkości osadu komórkowego.
    Uwaga: Zawiesinę komórek należy dodatkowo rozcieńczyć, jeśli stężenie przekracza dokładną granicę wykrywalności dla dokładnego zliczania komórek.
  8. Używając barwnika, który wyklucza martwe komórki, takiego jak błękit trypanowy, policz liczbę żywotnych komórek i zasiej BTSC w kolbie lub płytce będącej przedmiotem zainteresowania - zwykle 200 000 - 300 000 komórek w 8 ml kompletnej pożywki w kolbie T25.

2. Test migracji komórek macierzystych guza mózgu

  1. Wysiewaj 200 000 komórek w kolbie T25 w 8 ml kompletnej pożywki na 1-2 tygodnie przed planowanym wykonaniem testu migracji.
    Uwaga: Czas między posiewem a wykonaniem testu będzie się różnić w zależności od tempa wzrostu użytej kultury BTSC.
    1. Aby przetestować wpływ leczenia farmakologicznego na migrację, należy wstępnie potraktować komórki odpowiednim nośnikiem, takim jak DMSO, i lekiem będącym przedmiotem zainteresowania, dodając odpowiednie objętości nośnika lub zapasu leku bezpośrednio do oddzielnych studzienek pożywki zawierającej komórki.
  2. Przygotuj płytkę migracyjną chemotaksji (Rysunek 2A), pokrywając ją cienką warstwą kolagenu.
    1. Oblicz liczbę dołków 96-dołkowej płytki chemotaksji, które będą musiały zostać pokryte kolagenem. Należy uwzględnić co najmniej trzy studzienki replikacji dla każdego warunku.
    2. Rozcieńczyć 5 mg/ml wywaru kolagenu typu I do 0,2 mg/ml w czystym kwasie octowym rozcieńczonym do 0,14% w wodzie klasy hodowlanej.
    3. Odpipetować 0,2 mg/ml kolagenu zarówno do studzienek wkładu membranowego, jak i do studzienek dolnego zbiornika, które są używane.
      Uwaga: Dolne zbiorniki płytki wymagają 225 μl, a studzienki wkładu membranowego wymagają 75 μl kolagenu do prawidłowego powlekania.
    4. Umieścić płytkę migracyjną w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę. Odessać roztwór kolagenu ze studzienek, nie rysując powłoki kolagenowej.
    5. Umyj studzienki 2x sterylnym 1x PBS. Jeśli płytka nie jest używana od razu, należy zassać PBS i przechowywać ją w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni. Przed użyciem ogrzej płytkę migracyjną chemotaksji do temperatury pokojowej.
  3. Przygotować dolny zbiornik płytki migracyjnej chemotaksji.
    1. Odpipetować 225 μL pożywki (bez czynników wzrostu), uzupełnionej 10% FBS jako chemoatraktantem, do dennych studzienek zbiornikowych płytki migracyjnej chemotaksji.
    2. Delikatnie umieść wkład membranowy w dolnym zbiorniku pod kątem, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
  4. Umieść komórki we wkładce membranowej płytki migracyjnej chemotaksji.
    1. Ponownie zawiesić zdysocjowane BTSC w pożywkach (bez czynników wzrostu) przy gęstości komórek 50 000 komórek/ml. Dodaj leki do pożywki, jeśli oceniasz migrację podczas różnych terapii odwykowych. Alternatywnie, wysiewaj równą liczbę komórek poddanych działaniu środka i komórek kontrolnych, zachowując końcowe stężenie leku podczas posiewu.
    2. Umieścić 50 μl BTSC z kroku 2.4.1 do każdej studzienki płytki migracyjnej w żądanych warunkach uzdatniania.
  5. Wyobraź sobie migrację chemotaksji.
    1. Umieść płytkę migracyjną chemotaksji w systemie obrazowania żywych komórek i ustaw oprogramowanie do automatycznego obrazowania tak, aby uzyskiwało obrazy mikroskopowe płytki co 1-2 godziny przez okres do 72 godzin. Korzystając z komercyjnego oprogramowania (patrz Spis materiałów), kliknij prawym przyciskiem myszy oś czasu i ustaw interwał skanowania na co 2 godziny przez 24 godziny
      Uwaga: Przedział czasu i całkowity czas, który upłynął, będą się różnić w zależności od użytych kultur BTSC; Rozpoczynać w odstępach 2-godzinnych przez 72 godziny, aż do zdobycia doświadczenia z poszczególnymi kulturami BTSC. Jeśli zautomatyzowany system obrazowania jest niedostępny, obrazy o tym samym polu widzenia można uzyskać ręcznie za pomocą mikroskopu i kamery podłączonej do oprogramowania do obrazowania.
    2. Po zakończeniu akwizycji obrazu uzyskaj obrazy dla całego eksperymentu i utwórz definicję przetwarzania za pomocą oprogramowania analitycznego, które odróżnia komórki od tła błony i porów migracyjnych (Rysunek 2B, czerwona maska). Korzystając z komercyjnego oprogramowania (patrz Tabela materiałów), wybierz nową definicję przetwarzania i ustaw ustawienia definicji przetwarzania dla BTSC na próg początkowy 52, próg wzrostu 85, dostosowanie rozmiaru (pikseli) o -1 i minimalny obszar 200 μm2. Zastosuj tę definicję przetwarzania do dolnej strony membrany. Zmodyfikuj tę analizę, jeśli nie odróżnia ona dokładnie komórek od błony tła.
    3. Zbierz dane jako obszar powierzchni komórki na dolnej stronie błony dla każdej z trzech studzienek replikacji, które zliczają tylko komórki, które migrowały przez pory. Wykres migracji komórek w μm2 (obszar migrowanych komórek) w czasie (Rysunek 2C, Rysunek 3).
      Uwaga: Upewnij się, że względna liczba komórek posianych i policzonych na górnej powierzchni membrany w pierwszym punkcie czasowym jest podobna (mniej niż 20% odchylenia we wszystkich studzienkach) we wszystkich warunkach obróbki, aby uniknąć jakichkolwiek skutków nierównomiernego powlekania. Zbieranie danych za pomocą komercyjnego oprogramowania (patrz tabela materiałów) można przeprowadzić, uruchamiając definicję przetwarzania utworzoną w kroku 2.5.2, klikając Metryki, następnie Wykres/eksport, a następnie Eksport danych.

3. Test inwazji neurosfery komórek macierzystych guza mózgu

  1. Wysiewaj 200 000 komórek w 8 ml kompletnej pożywki w kolbie T25 na 1-2 tygodnie przed planowanym wykonaniem testu inwazji.
    Uwaga: Czas od posiewu do wykonania testu będzie zależał od tempa proliferacji użytej kultury BTSC.
    1. W przypadku komórek poddanych wstępnej obróbce, dodaj interesujący nas związek do kolby w żądanym stężeniu przez z góry określony czas, zanim neurosfery będą gotowe do posiewu do inwazji.
  2. Poczekaj, aż średni rozmiar neurosfery wyniesie około 150 - 200 μm; zazwyczaj zajmuje to 7 - 14 dni, w zależności od używanej kultury BTSC.
    Uwaga: Typowe jest obserwowanie rozkładu rozmiarów kul w kolbie.
  3. Przechylić i delikatnie wymieszać kolbę pipetą i przenieść 500 μl neurosfer BTSC do stożkowej probówki o pojemności 1,5 ml dla każdego warunku leczenia; zostanie ona wykorzystana do płytki trzech powtórzonych studzienek.
    Uwaga: Kroki 3.3.1 - 3.3.2 są opcjonalne, ale zalecane dla pierwszego eksperymentu z inwazją na nowej kulturze BTSC.
    1. Aby określić gęstość neurosfer, które trafią do studzienki, przygotuj probówkę o pojemności 1,5 ml, jak w kroku 3.3. Delikatnie wymieszaj neurosfery i przenieś 100 μl do oddzielnej 96-dołkowej płytki i pozwól neurosferom osiąść grawitacyjnie przez 5 minut.
    2. Sprawdź liczbę neurosfer pod mikroskopem, aby upewnić się, że wiele neurosfer znajduje się w obszarze studni, który zostanie zobrazowany bez jej przepełnienia.
      Uwaga: Atakujące neurosfery wymagają wystarczająco dużo miejsca, aby potroić swoją średnicę bez interakcji z sąsiednimi neurosferami. Liczbę neurosfer w studzience można dostosować, licząc liczbę neurosfer w studzience i dodając więcej lub mniej neurosfer z kolby T25 do stożkowej rurki o pojemności 1,5 ml w kroku 3.3.
  4. Umieść stożkową probówkę o pojemności 1,5 ml z komórkami z kroku 3.3 na lodzie i wykonaj kroki 3.5 - 3.7 na lodzie.
  5. Pozwól neurosferom osiąść grawitacyjnie na dnie stożkowej probówki o pojemności 1,5 ml przez 5 minut i wstępnie schłodzić oznakowaną 96-dołkową płytkę na lodzie.
  6. Ponownie zawiesić neurosfery w białku macierzy zewnątrzkomórkowej.
    1. Przygotuj 500 μl 0,4 mg/ml roztworu kolagenu typu I na lodzie dla każdego warunku leczenia: dodać 459 μl pożywki (bez czynników wzrostu), 40 μl roztworu podstawowego kolagenu 5 mg/ml i 0,92 μl sterylnego 1N NaOH (Tabela 1).
      Uwaga: Wymagane jest 500 μl roztworu kolagenu na warunek leczenia: 100 μl na każdą z trzech studzienek replikowanych i 200 μl nadmiaru. W tym miejscu należy dodać leczenie farmakologiczne w pożądanym stężeniu końcowym, odjętym od składnika pożywki roztworu. Protokół ten opisuje zastosowanie kolagenu typu I jako białka macierzy zewnątrzkomórkowej; Można jednak przetestować każde białko macierzy zewnątrzkomórkowej. Ponadto w przypadku kultur BTSC, które mają wolniejsze tempo inwazji, czynniki wzrostu lub FBS mogą być uzupełniane w pożywkach w celu zwiększenia szybkości inwazji.
    2. Po ustabilizowaniu się neurosfer z kroku 3.5, odessaj jak najwięcej pożywki, nie tracąc przy tym granulki neurosfery, która osiadła na dnie. Delikatnie zawiesić neurosfery w 500 μl roztworu kolagenu przygotowanego w kroku 3.6.1.
  7. Dodaj 100 μl mieszaniny kolagenu i neurosfery do trzech powtórzonych dołków 96-dołkowej płytki na lodzie. Pozwól neurosferom osiąść na lodzie przez 5 minut.
  8. Przenieść 96-dołkową płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C na 5 minut, aby umożliwić polimeryzację kolagenu.
  9. Natychmiast przygotuj się do zobrazowania 96-dołkowej płytki.
    1. Umieść 96-dołkową płytkę na tacy systemu obrazowania żywych komórek lub na stoliku mikroskopu, aby uzyskać obraz jako odniesienie dla rozmiaru neurosfery w momencie posiewu, przed rozpoczęciem inwazji.
    2. Zdjęcia należy wykonywać co godzinę, aż tempo inwazji ustabilizuje się; zazwyczaj dzieje się to w ciągu 24 godzin
      Uwaga: Interwał obrazowania może być modyfikowany w zależności od używanego sprzętu. Interwał obrazowania i całkowity czas, który upłynął, można również modyfikować dla kultur BTSC, które mają różne szybkości inwazji.
  10. Określ rosnącą powierzchnię BTSC w miarę ich inwazji na matrycę w czasie.
    Uwaga: Powierzchnia komórek w czasie posiewu, obliczona jako średnia z trzech dołków replikowanych, musi być podobna (mniej niż 20% zmienności we wszystkich dołkach) między różnymi warunkami obróbki, aby zapewnić, że na różnice w inwazji BTSC nie będzie silnie wpływała liczba lub rozmiar platerowanych neurosfer.
    1. W przypadku systemu analizy żywych komórek należy użyć obiektywu 10X do akwizycji obrazu i uzyskać cztery obrazy na studzienkę dla trzech dołków replikowanych. Aby określić względną powierzchnię komórki, reprezentowaną jako procentowa zbieżność studzienki, należy skonfigurować definicję przetwarzania, która wyraźnie wyróżnia komórki na tle studni. Korzystając z komercyjnego oprogramowania (patrz tabela materiałów), wybierz nową definicję przetwarzania i ustaw korektę segmentacji na 0,8, minimalną powierzchnię na 300 μm2, a maksimum mimośrodu na 0,99. Zmodyfikuj tę analizę, jeśli nie odróżnia ona dokładnie komórek od tła.
      Uwaga: W przypadku stosowania innych metod do obrazowania inwazji neurosfery w czasie, zaleca się uzyskanie wielu pól widzenia dla trzech powtórzonych dołków w czasie. Jednak nieobrazowanie dokładnie tego samego pola widzenia w każdym interwale zwiększy błąd standardowy zebranych danych. Oprogramowanie komputerowe może być użyte do pomiaru powierzchni atakujących komórek na każdym obrazie.
    2. Zbierz dane jako całkowitą powierzchnię komórki (względną lub bezwzględną) dla każdej studzienki w każdym punkcie czasowym i określ średnią z trzech studzienek replikowanych. Wykres inwazji BTSC można narysować na wykresie zwiększającą się powierzchnię komórki w czasie.
      Uwaga: Zbieranie danych za pomocą komercyjnego oprogramowania (patrz tabela materiałów) można przeprowadzić, uruchamiając definicję przetwarzania utworzoną w kroku 3.10.1, klikając Metryki, następnie Wykres/eksport, a następnie Eksport danych.

Wyniki

W niniejszej sekcji opisano przykłady danych, które można uzyskać za pomocą analiz obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji BTSC. BTSC są wysiewane jako pojedyncze komórki i mogą być hodowane w formie wolno pływających neurosfer (Rysunek 1). Wykazano, że BTSC można dysocjować i wysiewać do studni wkładki membranowej w płytce do migracji chemotaktycznej, która jest pokryta cienką warstwą kolagenu typu I (Rysunek 2A). Na początku analizy pojedyncze komórki BTSC są równomiernie rozproszone na górnej powierzchni wkładki membranowej. W okresie od 24 do 72 h komórki przylegają do membrany, przemieszczają się wzdłuż pokrytej kolagenem powierzchni i migrują przez jeden z 96 małych porów na dolną stronę membrany, w kierunku chemoatraktanta znajdującego się w studni zbiornika. Po zaznaczeniu komórek na górnej części membrany kolorem żółtym, porów kolorem niebieskim, a komórek na dolnej części membrany kolorem czerwonym, można zaobserwować komórki wchodzące do poru od góry (żółta komórka zbliżająca się do niebieskiego poru) oraz opuszczające por od dołu (czerwona komórka opuszczająca niebieski por) (Rysunek 3). Co istotne, komórki mogą być poddane działaniu leku i wysiane na tę samą płytkę do migracji chemotaktycznej co komórki kontrolne traktowane nośnikiem, aby zbadać wpływ interwencji terapeutycznych na migrację BTSC (Rysunek 2B). Płytka do migracji chemotaktycznej umożliwia obrazowanie komórek zarówno na górnej, jak i na dolnej stronie wkładki membranowej. Dzięki temu możliwa jest ilościowa ocena migracji komórek w czasie poprzez zliczanie komórek, które przemieściły się na dolną stronę membrany (Rysunek 2C).

Stwierdziliśmy, że jeśli BTSCs nie zostaną w pełni zdysocjowane, komórki nie migrują przez pory i pozostają w formie małych neurosfer (Rysunek 4A). Ważne jest również, aby nie wysiewać więcej niż 2 500 BTSCs/studzienkę, ponieważ prowadzi to do zlepiania się komórek zamiast ich migracji na dolną stronę membrany (Rysunek 4B). Wreszcie, podczas wysiewania komórek oraz umieszczania wkładu z membraną w dolnym zbiorniku, należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza w studzienkach wkładu, ponieważ uniemożliwia to dokładne obrazowanie i kwantyfikację (Rysunek 4C).

Następnie wykazujemy, że inwazję komórek BTSC z neurosfer do otaczającej macierzy można obrazować i kwantyfikować w czasie w formacie płytki 96-dołkowej (Rysunek 5A). Inwazję można mierzyć poprzez kwantyfikację powierzchni komórek w miarę jak wnikają one w macierz w czasie. Przy użyciu oprogramowania do analizy obrazu zastosowano definicję przetwarzania, która nakłada maskę na powierzchnię komórek, co umożliwia automatyczną kwantyfikację w czasie (Rysunek 5B). Można również tworzyć filmy poklatkowe z inwazji BTSC, aby łatwo obserwować cały proces inwazji BTSC (Rysunek 6). Dodatkowo mikroskopia fluorescencyjna może być wykorzystana do obrazowania komórek BTSC wykazujących ekspresję białek fluorescencyjnych, takich jak zielone białko fluorescencyjne (GFP) lub czerwone białko fluorescencyjne (RFP). Tutaj stworzyliśmy film poklatkowy z komórkami BTSC wykazującymi ekspresję cytozolowej formy GFP, aby pomóc w śledzeniu poszczególnych komórek BTSC podczas inwazji na macierz przypominającą błonę podstawną (Rysunek 7). Ten test inwazji neurosfer BTSC pozwala również na dodawanie leków w powtórznych dołkach, aby bezpośrednio ocenić ich wpływ na inwazję BTSC z neurosfer do macierzy (Rysunek 8A). Kwantyfikacja wielu neurosfer w powtórznych dołkach może być obliczana i przedstawiana na wykresie w czasie, aby ocenić działanie leków w wielu stężeniach (Rysunek 8B).

Nieprzestrzeganie opisanego powyżej protokołu może uniemożliwić uzyskanie wiarygodnych i dokładnych danych. Osadzanie neurosfer BTSC, które są zbyt duże, o średnicy przekraczającej 200 µm, prowadzi do powstania płaszczyzny ostrości zbyt szerokiej, aby dokładnie ilościowo ocenić wszystkie sfery w jednym polu widzenia (Rysunek 8C). Podobnie, nieutrzymywanie macierzy w temperaturze 4 °C podczas osadzania neurosfer może spowodować, że sfery nie będą znajdować się w tej samej płaszczyźnie ostrości, a macierz zewnątrzkomórkowa nie zastygnie równomiernie, co uniemożliwi zebranie dokładnych danych (Rysunek 8D).

Wzrost komórek w ciągu 14 dni; obrazy mikroskopowe dokumentują stopniowy wzrost agregacji; pasek skali 300μm.
Rycina 1: Hodowla BTSCs. Panele te stanowią reprezentatywny przykład BTSCs hodowanych z pojedynczych komórek do postaci neurosfer w okresie 14 dni hodowli. Neurosfery pokazane tutaj w dniu 14 osiągnęły odpowiednią wielkość do pasażowania. Aby wyświetlić większą wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Wyniki testu migracji komórek; schemat przedstawiający układ płytki 96-dołkowej, obrazy mikroskopowe komórek, analiza wykresu.
Rycina 2: Obrazowanie żywych komórek podczas migracji BTSC. (A) Przykład 96-dołkowej płytki do testów chemotaksji, pokrytej cienką warstwą kolagenu typu I przed przeprowadzeniem testu migracji z użyciem BTSC. Obrazy przedstawiają i) płytkę z trzema elementami (pokrywką, wkładem membranowym i zbiornikiem) złożonymi razem, ii) wszystkie trzy elementy rozdzielone, iii) zbliżenie widoku z góry wkładu membranowego, iv) zbliżenie widoku z dołu wkładu membranowego oraz v) zbliżenie dolnego zbiornika. (B) Reprezentatywne obrazy migracji BTSC na początku (0 h) eksperymentu oraz po 24 h. Ostrość obrazu ustawiono na górnej części wkładu membranowego, gdzie pierwotnie wysiano komórki. Komórki, które przemieściły się na dno płytki do testów chemotaksji, są zaznaczone na czerwono. W czasie 0 h tylko kilka komórek przemieściło się na dolną stronę membrany. Po 24 h liczba migrujących komórek gwałtownie wzrosła. Porównanie obrazów po 24 h dla komórek traktowanych nośnikiem vs. lekiem X wykazuje, że leczenie lekiem zmniejsza migrację BTSC. Paski skali odpowiadają 600 µm. (C) Panel ten przedstawia ilościową analizę migracji BTSC po wstępnym traktowaniu nośnikiem lub lekiem X. Wykres pokazuje, że leczenie lekiem ma silny wpływ na migrację BTSC. Punkty danych stanowią średnią z trzech technicznych powtórzeń w dołkach, a słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe (SD). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy analizy hodowli komórkowej przedstawiający zabarwione na żółto komórki z niebieskimi jądrami do celów badawczych.
Animowany Rysunek 3: Film time-lapse z migracji BTSC. Film ten przedstawia migrację BTSC z wykorzystaniem płytki do migracji chemotaktycznej pokrytej kolagenem typu I. Komórki znajdujące się na górnej stronie wkładki membranowej są wyróżnione na żółto, komórki, które przemieściły się na dolną stronę wkładki membranowej, są wyróżnione na czerwono, a pory w membranie są wyróżnione na niebiesko. Płaszczyzna ostrości została ustawiona tak, aby obrazować komórki na dolnej stronie membrany. Film został stworzony z obrazów time-lapse pobieranych co godzinę przez 51 h i zmontowany w tempie 4 klatek na sekundę. Pasek skali reprezentuje 200 µm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Obrazy mikroskopowe kultur bakteryjnych o różnych gęstościach do analizy wzrostu drobnoustrojów.
Rycina 4: Przykłady błędów w przygotowaniu testu migracji. (A) Ten panel przedstawia przykład BTSC, które nie zostały w pełni rozdzielone przed wysianiem na górny wkład membranowy płytki do migracji chemotaktycznej. Ze względu na duży rozmiar sfer oraz mały rozmiar porów membrany, komórki nie są w stanie migrować do dolnego zbiornika. (B) Ten panel przedstawia przykład testu migracji, w którym wysiano zbyt wiele komórek. Agregacja komórek utrudnia ich migrację i upośledza kwantyfikację. (C) Ten panel przedstawia przykład powstania pęcherzyków powietrza na wkładzie membranowym, na którym wysiano BTSC. Pęcherzyki powodują niską jakość obrazu i uniemożliwiają dokładną kwantyfikację migracji. Paski skali reprezentują 600 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Time-lapse hodowli komórkowych w kontraście fazowym, po lewej kontrast fazowy, po prawej analiza maski, 0-6 godzin.
Rycina 5: Test inwazji neurosfer BTSC. Panele te przedstawiają przykład inwazji BTSC z neurosfery do macierzy z kolagenu typu I o stężeniu 0,4 mg/mL w okresie 6 h. Tutaj (A) pokazano obrazy w kontraście fazowym dla każdego punktu czasowego (B) z nałożoną reprezentatywną ilościową maską, zgodnie ze szczegółowym opisem w kroku 3 protokołu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Klastry neuralnych komórek macierzystych, mikroskopia w kontraście fazowym, różnicowanie komórek, medycyna regeneracyjna.
Rysunek 6: Wideo time-lapse inwazji neurosfer BTSC w kolagenie typu I. To wideo przedstawia inwazję BTSC z neurosfery do macierzy z kolagenu typu I o stężeniu 0,4 mg/mL (pokazano również jako obrazy statyczne na Rysunku 5A). Obrazy były pozyskiwane za pomocą obiektywu 10X w odstępach godzinnych przez 12 h i zostały zestawione w tempie 4 klatek na sekundę. Pasek skali odpowiada 300 µm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć to wideo. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać).

Obraz mikroskopii fluorescencyjnej sfer neuronowych komórek macierzystych, ocena rozkładu komórkowego.
Rysunek 7: Film time-lapse przedstawiający inwazję neurosfer BTSC w macierzy przypominającej błonę podstawną. Ten film pokazuje inwazję BTSC wykazujących ekspresję cytozolowego GFP z neurosfery do macierzy przypominającej błonę podstawną. Obrazy były pozyskiwane za pomocą obiektywu 4X co 30 min przez 48 h i zostały zestawione w tempie 8 klatek na sekundę. Pasek skali reprezentuje 800 µm. Kliknij tutaj, aby obejrzeć ten film. (Kliknij prawym przyciskiem myszy, aby pobrać.)

Test inwazji komórek: obrazy mikroskopowe z 0, 1, 5 μM leku, wykres konfluencji w ciągu 20 godzin.
Rycina 8: Test inwazji neurosfer BTSC z zastosowaniem leczenia. (A) Neurosfery BTSC osadzono w macierzy przypominającej błonę podstawną, przygotowanej z użyciem nośnika lub wskazanych stężeń leku X. Obrazy pozyskiwano co godzinę; przedstawiono tutaj obrazy wykonane w momencie wysiewania oraz po 16 h. Pasek skali reprezentuje 200 µm. (B) Inwazję BTSC z neurosfer do otaczającej macierzy ilościowano co godzinę, zgodnie z opisem w kroku 3 protokołu. Punkty danych stanowią średnią z trzech technicznych powtórzeń w dołkach, a słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej (SEM). (C) Ten panel przedstawia neurosfery BTSC osadzone w kolagenie typu I z sferą, która jest zbyt duża do kwantyfikacji. Pasek skali reprezentuje 300 µm. (D) Ten panel przedstawia neurosfery BTSC osadzone w kolagenie typu I, który nie zgęstniał całkowicie. Pasek skali reprezentuje 300 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przygotowanie roztworu kolagenu
Stężenie zapasowe [Collagen] (mg/ml)5
Stężenie końcowe [Collagen] (mg/ml)0.4
Liczba potrzebnych studzienek:5
Objętość całkowita (μl)500
Objętość kolagenu zapasowego (μl)40
Objętość 1N NaOH (μl)0.92
Objętość pożywki (μl)459

Tabela 1: Przygotowanie 0,4 mg/mL roztworu kolagenu typu I. Wymieniono znane stężenia początkowe i pożądane stężenia końcowe roztworu kolagenu typu I. Wymienione objętości są wystarczające do wysiania neurosfer do trzech powtórnych dołków, plus dwóch zapasowych, i mogą obejmować pojedynczy warunek traktowania, zgodnie z opisem szczegółowym w kroku 3 protokołu.

Dyskusja

Biorąc pod uwagę, że komórki nowotworowe aktywnie się namnażają, stanowi to potencjalne wyzwanie techniczne dla badań nad migracją komórek. W opisanym tutaj teście migracji BTSC są posiewane bez czynników wzrostu, co ogranicza proliferację, a gradient chemoatraktantu na płytce chemoatraktsji nie ulega pełnej równowadze w ciągu 72 godzin. Ponadto, ponieważ komórki są monitorowane za pomocą obrazowania żywych komórek w czasie, komórki mogą być monitorowane wizualnie, aby upewnić się, że nie dochodzi do powszechnego podziału komórek. Aby test migracji zakończył się sukcesem, ważne jest, aby całkowicie zdysocjować neurosfery na pojedyncze komórki i dokładnie policzyć liczbę komórek przed posiewem. Posiewanie kulek lub powlekanie zbyt wielu komórek, co powoduje zlepianie się, może uniemożliwić komórkom migrację przez małe pory (ryc. 4A i 4B). Ważne jest również, aby unikać tworzenia się pęcherzyków podczas powlekania komórek na płytce migracyjnej chemotaksji lub podczas umieszczania wkładu membranowego na dolnym zbiorniku. Bąbelki mogą zmieniać płaszczyznę ostrości i uniemożliwiać dokładne określenie ilościowe (rysunek 4C). Cała płytka musi być pokryta cienką warstwą kolagenu, ponieważ daje to komórkom powierzchnię do poruszania się po porach w płytce, ponieważ ten test wymaga, aby komórki przylegały, a następnie migrowały przez biologicznie istotną powierzchnię w kierunku chemoatraktantu.

Opisany tutaj protokół migracji BTSC pozwala na kinetyczną ocenę migracji poszczególnych komórek, co wymaga mniejszej liczby komórek do testowania różnych warunków leczenia w porównaniu z istniejącymi protokołami. Jest to ważne w przypadku kultur, które rosną bardzo wolno, ponieważ zebranie dużej liczby komórek do eksperymentów może być trudne. Niska gęstość porów płytki migracyjnej chemotaksji pozwala na wolniejsze równoważenie gradientu chemoatraktantu, większe niż 72 godziny, i skuteczniej naśladuje biologiczny proces migracji chemotaktycznej w dłuższym okresie czasu. Protokół został zoptymalizowany tak, aby zawierał bardzo cienką warstwę powłoki kolagenowej na płytce migracyjnej chemotaksji, aby zapewnić, że test mierzy migrację, a nie inwazję. Ułatwia również obrazowanie i kwantyfikację pojedynczych komórek, ponieważ przylegają one do macierzy kolagenowej pokrywającej wkładkę membranową. Jednak jednym z ograniczeń tej techniki jest to, że kwantyfikacja migracji przez wiele odwiertów w czasie jest znacznie uproszczona i przyspieszona przy użyciu komercyjnego oprogramowania (patrz tabela materiałów). Godną uwagi zaletą opisanego tutaj testu migracji jest szeroka zdolność adaptacji protokołu do innych typów komórek. Będzie to szczególnie przydatne do ilościowego określenia chemotaktycznej migracji linii komórkowych, które albo rosną powoli, albo są trudne do przylegania, albo migrują powoli.

Aby zapewnić powodzenie testu inwazji BTSC, konieczne jest zebranie neurosfer, zanim osiągną one wielkość większą niż 200 μm. Większe kule mają płaszczyznę ostrości, która jest zbyt duża, aby można było w sposób spójny obrazować i określać ilościowo (ryc. 5C). Co więcej, neurosfery mogą zacząć zlepiać się i agregować z innymi neurosferami. Wpływa to na pozyskiwanie dokładnych i spójnych danych. Ponadto ważne jest, aby neurosfery mogły osiąść na dnie studzienki, podczas gdy kolagen jest nadal na lodzie, aby umożliwić obrazowanie neurosfer w jednej płaszczyźnie ostrości (ryc. 5D). Podobnie ważne jest, aby kolagen mógł się w pełni związać bez przesuwania płytki, ponieważ może to zakłócić tworzenie równej matrycy, co może negatywnie wpłynąć na jakość obrazu (ryc. 5D). W przypadku opisanego tutaj testu inwazji BTSC jedną z głównych zalet jest to, że BTSC hodowane jako neurosfery mogą być oceniane pod kątem inwazji bezpośrednio, bez konieczności uprawy adherentnej. Co więcej, neurosfery BTSC mogą być osadzone w dowolnej macierzy zewnątrzkomórkowej, albo przy użyciu pojedynczych składników macierzy zewnątrzkomórkowej z określonej tkanki, albo przy użyciu dostępnej na rynku mieszaniny błon podstawnych. Określenie macierzy zewnątrzkomórkowej może pomóc w identyfikacji lub przetestowaniu określonych mechanizmów inwazji. Na przykład za pomocą tego protokołu można ocenić efekt celowania w poszczególnych członków rodziny genów metallopeptydazy macierzy, o których wiadomo, że degradują określone składniki macierzy. Alternatywnie, chociaż protokół ten jest specyficzny dla neurosfer BTSC, wszelkie komórki wyhodowane jako kule mogą być używane w podobny sposób. Przykłady obejmują komórki raka piersi hodowane jako mammosfery lub komórki pierwotnego raka jelita grubego hodowane jako guzy; Ogranicza to jednak technikę do typów komórek, które mogą rosnąć jako kule w kulturze. Inne zalety zarówno testów migracji, jak i inwazji to to, że są łatwe do skonfigurowania, działają w formacie 96-dołkowym, a dane są policzalne w czasie.

Ogólnie rzecz biorąc, aby zapobiec nawrotom GBM po leczeniu, konieczne jest opracowanie metodologii, które ułatwią badanie migracji i inwazji BTSC. Opisany tutaj protokół migracji ma wiele zalet w porównaniu z wcześniej ustalonymi testami migracji, zwłaszcza w przypadku badania GBM BTSC. Ten ulepszony protokół migracji obejmuje dysocjację BTSC hodowanych w warunkach neurosfery i posiew pojedynczych komórek na 96-dołkowej płytce migracyjnej chemotaksji pokrytej kolagenem. Korzystając z systemu obrazowania żywych komórek, można monitorować i określać ilościowo migrację BTSC w czasie. Opisany tutaj test inwazji pozwala na monitorowanie inwazji BTSC z neurosfer do matrycy. Test ten polega na osadzeniu neurosfer w macierzy kolagenowej lub innej bogatej w białko macierzy zewnątrzkomórkowej w 96-dołkowej płytce. Obrazowanie płytki za pomocą systemu obrazowania poklatkowego żywych komórek pozwala na analizę inwazji BTSC w różnych warunkach leczenia w czasie. Testy te stanowią zatem cenne narzędzie dla naukowców, którzy mają nadzieję lepiej zrozumieć mechanizmy leżące u podstaw migracji i inwazji BTSC.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują Rozinie Hassam i Orsolyi Cseh za wsparcie techniczne. Ten projekt badawczy był częściowo wspierany przez granty z Canada Foundation for Innovation (dla H. Artee Luchmana i Samuela Weissa) oraz Stem Cell Networks of Canada (również dla H. Artee Luchmana i Samuela Weissa).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rat Collagen ITrevigen3440-100-01
Matrigel matrixCorning356230
NaOHVWRBDH3247-1
Kwas octowyMillipore SigmaAX0073-6
96-dołkowe płytkiEppendorf30730119
T25 Nunc EasYFlaskThermoFisher156367
Stożkowa tubka Falcon 15 mlThermoFisher352096
Incucyte ClearView 96-dołkowa płytka chemotaksjiEssen Bioscience4582
IncuCyte Zoom System analizy żywych komórekEssen Bioscience4545
IncuCyte Zoom Oprogramowanie do analizy żywych komórekEssen Bioscience2016A Rev1
Rozwiązaniedo odłączania komórek AccumaxInnowacyjne technologie komórkoweAM105
Penicylina, streptomycyna SigmaP4333
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)SigmaD8537
Woda klasy hodowlanejLonza BioWhittaker17-724Q
Surowica bydlęca płodu (FBS)Invitrogen12483-020

Bibliografia

  1. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).
  2. Holland, E. C. Glioblastoma multiforme: the terminator. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6242-6244 (2000).
  3. Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Current Pharmaceutical Design. 17 (23), 2386-2401 (2011).
  4. Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432 (7015), 396-401 (2004).
  5. Galli, R. Isolation and Characterization of Tumorigenic, Stem-like Neural Precursors from Human Glioblastoma. Cancer Research. 64 (19), 1-12 (2004).
  6. Kelly, J. J. P., et al. Proliferation of Human Glioblastoma Stem Cells Occurs Independently of Exogenous Mitogens. STEM CELLS. 27 (8), 1722-1733 (2009).
  7. Cusulin, C., et al. Precursor States of Brain Tumor Initiating Cell Lines Are Predictive of Survival in Xenografts and Associated with Glioblastoma Subtypes. Stem Cell Reports. 5 (1), 1-9 (2015).
  8. Luchman, H. A., et al. Dual mTORC1/2 Blockade Inhibits Glioblastoma Brain Tumor Initiating Cells In Vitro and In Vivo and Synergizes with Temozolomide to Increase Orthotopic Xenograft Survival. Clinical Cancer Research. 20 (22), 5756-5767 (2014).
  9. Jensen, K. V., Cseh, O., Aman, A., Weiss, S., Luchman, H. A. The JAK2/STAT3 inhibitor pacritinib effectively inhibits patient-derived GBM brain tumor initiating cells in vitro and when used in combination with temozolomide increases survival in an orthotopic xenograft model. PLoS ONE. 12 (12), e0189670(2017).
  10. Nguyen, S. A., et al. Novel MSH6 Mutations in Treatment-Naive Glioblastoma and Anaplastic Oligodendroglioma Contribute to Temozolomide Resistance Independently of MGMT Promoter Methylation. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4894-4903 (2014).
  11. Hemmati, H. D., et al. Cancerous stem cells can arise from pediatric brain tumors. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (25), 15178-15183 (2003).
  12. Lee, J., et al. Tumor stem cells derived from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell. 9 (5), 391-403 (2006).
  13. Menyhárt, O., et al. Guidelines for the selection of functional assays to evaluate the hallmarks of cancer. BBA - Reviews on Cancer. 1866 (2), 300-319 (2016).
  14. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
  15. Albini, A., et al. A Rapid in Vitro Assay for Quantitating the Invasive Potential of Tumor Cells. Cancer Research. 47 (12), 3239-3245 (1987).
  16. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
  17. Naber, H. P., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., van Laar, T. Spheroid Assay to Measure TGF-β-induced Invasion. Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

BTSC glejaka wielopostaciowegotest migracji BTSCtest inwazji BTSChodowla neurosferanaliza chemotaksjiinwazja w macierz kolagenowąprotokół dysocjacji komórekefekty leczenia farmakologicznegoilościowa analiza time-lapse
Testy obrazowania żywych komórek w celu zbadania migracji i inwazji komórek macierzystych glejaka wielopostaciowego guza mózgu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.