Kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source

Podsumowanie

Ten protokół opisuje bezkalibracyjne podejście do ilościowego określania homo-oligomeryzacji białek in vitro na podstawie spektroskopii fluktuacji fluorescencji przy użyciu komercyjnej mikroskopii skaningowej światła. Wyświetlane są prawidłowe ustawienia akwizycji i metody analizy.

Streszczenie

Liczba i jasność to technika spektroskopii fluktuacji fluorescencji (FFS) bez kalibracji do wykrywania homooligomeryzacji białek. Może być stosowany przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w detektory cyfrowe. Protokół stosowania tej techniki in vitro przedstawiono za pomocą przypadku użycia, w którym można zobaczyć liczbę i jasność w celu dokładnego ilościowego określenia stanu oligomerycznego FKBP12F36V znakowanych mVenus przed i po dodaniu AP20187 leku dimeryzującego. Omówiono znaczenie stosowania prawidłowych parametrów akwizycji mikroskopowej oraz prawidłowych metod wstępnego przetwarzania i analizy danych. W szczególności podkreślono znaczenie wyboru korekcji fotowybielania. Ta niedroga metoda może być stosowana do badania interakcji białko-białko w wielu kontekstach biologicznych.

Wprowadzenie

Interakcje białko-białko invitro

Tradycyjnie, eksperymenty z krystalografią i magnetycznym rezonansem jądrowym w połączeniu z mikroskopią krioelektronową (cryoEM) są technologiami wybranymi do dokładnego opisania trójwymiarowej architektury białek i wnioskowania o ich funkcji poprzez analizę ich szczegółów strukturalnych o wysokiej rozdzielczości. Białka nie są jednak strukturami statycznymi i mogą ulegać różnorodnym zmianom konformacyjnym i wibracjom w czasie i przestrzeni. Z tego powodu informacje strukturalne pochodzące z danych krystalograficznych lub krioelektromagnetycznych muszą być uzupełnione innymi technikami (np. symulacjami dynamiki molekularnej i technikami pojedynczych cząsteczek): funkcja białka jest związana z jego zmianami konformacyjnymi i interakcjami, a informacje te nie są obecne w strukturze statycznej. W celu zbadania dynamiki wewnątrzcząsteczkowej bardzo skuteczne są techniki oparte na transferze energii rezonansu Forstera (smFRET) w pojedynczej cząsteczce¹. Podejścia te są w stanie ocenić różne subpopulacje cząsteczek w złożonych podłożach. Jest to bardzo ważne, ponieważ zmiany te są szybkie i zachodzą podczas pozyskiwania danych (tj. zakres od nanosekundy do sekundy).

Do wykrywania i ilościowego określania tych zmian powszechnie stosuje się dwa główne podejścia: białka w roztworze i immobilizacja powierzchniowa. Do wykrywania oddziaływań międzycząsteczkowych, a w szczególności procesu dimeryzacji indukowanego przez ligandy, smFRET nie zawsze jest najlepszym narzędziem. Rzeczywiście, FRET zależy nie tylko od odległości (≈10 nm), ale także od orientacji dwóch dipoli (donora i akceptora, χ²) oraz nakładania się emisji donorowej z widmami absorpcyjnymi akceptora², ale być może ten ostatni warunek jest mniej ważny, pod warunkiem, że eksperymentator może wybrać odpowiednią parę FRET. Szczególną wadą smFRET do sondowania homo-dimeryzacji jest znakowanie białka będącego przedmiotem zainteresowania: w przypadku hetero smFRET dimeryzację można wykryć tylko do 50% (tj. hetero-FRET będzie w stanie wykryć tylko homo-dimery donor-akceptor i akceptor-donor, ale nie donor-donor lub akceptor-akceptor, który jest pozostałymi 50% dimerów). Inną alternatywą jest zastosowanie spektroskopii korelacji fluorescencji (FCS) i pochodnych (FCCS, etc.³) do ustalenia stałych dyfuzji białek i stałych wiązania in vitro. Podejścia te również nie są w stanie w pełni określić ilościowo homodimeryzacji, ponieważ w FCS mierzy się stężenie i dyfuzję, a promień i współczynnik dyfuzji cząstki dyfuzyjnej są bardzo słabo zależne od masy cząsteczkowej; Na przykład 10-krotny wzrost masy cząsteczkowej będzie oznaczał tylko 2,15-krotną zmianę współczynnika dyfuzji4. W przypadku dwukolorowych FCS lub FCCS tylko 50% homo-dimerów będzie widocznych z tego samego powodu, co powyżej. Najbardziej praktycznymi i ilościowymi podejściami do wykrywania homodimeryzacji in vitro i in vivo są homo-FRET⁵ oraz liczba i jasność (N&B)⁶. Biorąc pod uwagę fakt, że homo-FRET wymaga specyficznego odzyskiwania wartości anizotropii przez oprzyrządowanie (tj. elementów optycznych/analizatorów w celu odzyskania polaryzacji równoległej i prostopadłej), N&B jest tutaj przedstawiany jako korzystna technika wykrywania homodimeryzacji i agregacji białek. Może być stosowany zarówno in vitro, jak i in vivo w konfiguracji komercyjnej.

Liczba i jasność

N&B zostało niedawno sprawdzone⁷. Przegląd ten koncentrował się na zastosowaniu tej techniki w żywych komórkach. Warto w tym miejscu odtworzyć formalizm matematyczny, ponieważ równania te zostaną zastosowane do danych zebranych in vitro. Po pierwsze, konieczne jest zdefiniowanie kilku pojęć i wielkości matematycznych:

• Jednostka to zestaw cząsteczek, które są ze sobą związane.
• ε jasności bytu to liczba fotonów, które emituje w jednostce czasu (na klatkę).
• n to liczba obecnych jednostek.
• Dla danego piksela w ciągu serii obrazów to jego średnia intensywność, a σ² to wariancja jego intensywności.

Następnie, z detektorami zliczającymi fotony i zakładając byty mobilne bez tła,

gdzie N to pozorna liczba, a B to pozorna jasność. Powoduje to

Dalal et al.⁸ pokazał, że w przypadku sprzętu analogowego potrzebne są trzy warunki korekcyjne: współczynnik S, przesunięcie tła i szum odczytu σ₀². Następnie, ponownie zakładając jednostki mobilne,

dawanie

Zauważ, że powyższe równanie dla jest inne niż podane w Dalal et al.⁸ i późniejsza recenzja. ⁷ W Dalal et al. litera S w mianowniku została pominięta z powodu literówki, a błąd ten został powtórzony w recenzji. Powyższe równanie jest poprawne. Instrukcje dotyczące pomiaru S, przesunięcia i σ₀² - wraz z wyjaśnieniem ich znaczenia - podają Dalal i wsp.⁸

jasności jest proporcjonalna do oligomerycznego stanu jednostek dyfuzyjnych: ε będzie dwa razy większa dla dimerów niż dla monomerów, trzy razy większa dla trimerów niż dla monomerów, dwa razy większa dla heksamerów niż dla trimerów i tak dalej. W ten sposób, mierząc jasność ε, można określić ilościowo dowolny rodzaj multimeryzacji.

Jeśli występuje mieszanina stanów oligomerycznych, liczba i jasność nie są w stanie przywrócić obecnych poszczególnych stanów oligomerycznych. Jest to ograniczenie techniki.

Algorytm Detrenda i oprogramowanie nandb

Znaczenie korekty fotowybielania zostało wcześniej podkreślone⁹. Fotowybielanie nieuchronnie występuje podczas eksperymentów z mikroskopią świetlną w trybie poklatkowym; zarówno w żywych komórkach, jak i in vitro. W literaturze opisano wiele podejść do korygowania wybielania⁷. Technika filtrowania wykładniczego z automatycznym wyborem parametru detrendingu T jest obecnie najlepsza. Jest zintegrowany z darmowym oprogramowaniem open source nandb⁹. Rzeczywiście, oprogramowanie, które wymaga od użytkownika ręcznego wybrania parametru detrendingu, może prowadzić do nieprawidłowych wyników, ponieważ ten wybór parametrów będzie prawdopodobnie arbitralny i nieprawidłowy. Automatyczny algorytm sprawdza dane i określa dla nich odpowiedni parametr, bez konieczności interwencji użytkownika⁹. Nawet przy najlepszym doborze parametrów wygładzania, detrending ma swoje ograniczenia i działa dobrze tylko przy procentach fotowybielania niższych niż 25%, jak pokazano w symulacjach⁹. Co ciekawe, podczas korzystania z procedury automatycznego odtrendowywania, jej dokładność jest taka, że można pracować z niskimi wartościami jasności (nawet B <1,01), a co za tym idzie z niską intensywnością, a jednocześnie być wystarczająco precyzyjnym, aby określić ilościowo homodimeryzację.

Fotowybielanie powoduje również inny problem: obecność fotobielonych fluoroforów w kompleksie multimerów. To sprawia, że np. trymer wygląda jak dimer, gdy jedna z trzech jednostek w trymerze jest niefluorescencyjna. Hur i Mueller¹⁰ pokazali, jak to poprawić, a poprawka ta została również podkreślona w kolejnym przeglądzie⁷. Oprogramowanie nandb zawiera następującą poprawkę⁹.

System FKBP12F36V

FKBP12F36V jest białkiem, które naturalnie nie oligomeryzuje, ale wiadomo, że dimeryzuje po dodaniu AP20187 leku (potocznie znanego jako ligand dimeryzujący BB)^11,12. To sprawia, że jest to idealny przypadek testowy dla liczby i jasności: przy znakowanych FKBP12F36V należy zaobserwować podwojenie stanu oligomerycznego po dodaniu BB.

Protokół

1. FKBP12 F36V -mVenus Oczyszczanie

1. Przekształć (DE3) komórki pLysS za pomocą wektora pET22b zawierającego monomeryzowane ludzkie FKBP12F36V¹² oraz N-końcowe znaczniki His6 i mVenus (wektor dostępny na życzenie). Płytki na agarze LB uzupełnione 50 μg/ml ampicyliny i 34 μg/ml chloramfenikolu.
2. Przenieść przekształcone kolonie do 100 ml kultury starterowej LB i rosnąć przez 16 - 20 godzin w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem.
3. Rozcieńczyć gęstą kulturę starterową (OD600 >1) w stosunku 1:100 w podłożu LB (2 x 500 ml partie) i rosnąć przez 2 - 3 godziny do OD600 = 0,6 - 0,8 (37 °C, 200 obr./min).
4. Fajne kultury na lodzie. Indukować za pomocą 250 μM IPTG i rosnąć przez 16 - 20 godzin w temperaturze 21 °C, 200 obr./min.
5. Zbieraj komórki przez odwirowanie przy 2 000 x g przez 20 minut.
6. Zawiesić osad w 40 ml buforu A IMAC (20 mM fosforanu sodu o pH 7,5, 500 mM NaCl, 3 mM imidazolu, 1 mM β-merkaptoetanolu) uzupełnionego inhibitorami proteazy wolnymi od EDTA (1 tabletka na komórkę).
7. Sonikować komórki (500 watów, 20 kHz, amplituda 40%, 9 s wł., 11 s wyłączone na 15 min) na lodzie i zebrać rozpuszczalny materiał przez odwirowanie przy 20 000 x g.
8. Przenieść rozpuszczalny lizat do kolby stożkowej i dodać 2 ml żywicy (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 1 godzinę z obrotem 105 obr./min
   UWAGA: Sefaroza niklu może być również użyta do tego etapu IMAC.
9. Zebrać żywicę i przemyć 250 ml buforu A IMAC, a następnie 500 ml buforu B IMAC (20 mM fosforanu sodu pH 7,5, 500 mM NaCl, 7 mM imidazolu, 1 mM β-merkaptoetanolu).
   UWAGA: Zwiększ do 50 mM imidazolu, jeśli używasz żywicy sefarozy niklowej.
10. Elute białko znakowane His6 za pomocą buforu C IMAC (20 mM fosforan sodu pH 7,5, 500 mM NaCl, 300 mM imidazol, 1 mM β-merkaptoetanol).
11. Wstrzyknąć do kolumny wykluczającej wielkość (patrz tabela materiałów) zrównoważonej w 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. FKBP12F36V ma swoją szczytową elucję przy 87,71 ml na użytej przez nas kolumnie.
12. Oceń czystość za pomocą SDS-PAGE i połącz i skoncentruj zgodnie z wymaganiami.

2. Przygotowanie tablicy płyt wielodołkowych

1. Rozmrozić oczyszczony FKBP12F36V (lub znakowane białko będące przedmiotem zainteresowania) w temperaturze od -80 °C.
2. Przygotować roztwór 100 nM oczyszczonego FKBP12F36V (pożywka, 10 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Sonikacja i wirowanie (szybkie wirowanie 13 000 obr./min), aby zapobiec tworzeniu się agregatów.
3. Pipetę 100 - 200 μL do 8-dołkowej komory obserwacyjnej ze szklanym dnem.
4. Dodaj dimeryzator BB do końcowych stężeń 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 i 500 nM^12,13.
5. Jako odniesienie przygotuj roztwór 100 nM samego mVenus, aby ocenić potencjalne efekty agregacji i opadów oraz odzyskać wartość jasności monomeru przy tych samych ustawieniach akwizycji.

3. Akwizycja konfokalna bez kalibracji

1. Uruchom system konfokalny (Rysunek 1). Działałby dowolny system konfokalny mikroskopu skaningowego ze światłem wyposażony w detektory cyfrowe lub dobrze scharakteryzowane detektory analogowe⁸ i zdolny do utrzymywania stałego czasu przebywania dla każdego uzyskanego piksela.
2. Ustaw ścieżkę wiązki wzbudzenia:
   1. Włącz laser 514 nm i ustaw go na moc 20 - 100 nW na wyjściu z obiektywu (dla FKBP12F36V-mVenus).
   2. Wybierz obiektyw 63X1.4NA lub obiektyw z korekcją kołnierza do zanurzenia w wodzie przeznaczony do FCS.
   3. Włącz jeden detektor HyD, APD lub skalibrowany PMT. Preferowane są detektory zdolne do zliczania fotonów, ponieważ w tym przypadku obliczanie S, przesunięcia i σ₀² nie jest konieczne.
   4. Wybierz okno emisji od 520 do 560 nm
   5. Ustawić otwór na 1 jednostkę Airy dla odpowiedniej emisji ~545 nm.
   6. Ustaw tryb akwizycji na 16 x 16 pikseli
   7. Ustaw czas zatrzymania piksela t_w taki sposób, aby spełniał t_klatki >> T_D >> _{t zatrzymania}, gdzie _D jest czasem przebywania białka dyfuzyjnego, a t_klatka jest liczbą klatek na sekundę. Odpowiadało to ustawieniu czasu przebywania na ~13 μs.
      Uwaga: Niektórzy producenci komercyjni mieli skanery, które nie utrzymywały stałego czasu przebywania na pikselu. Ta stałość jest kluczowa, aby metoda działała.
   8. Ustaw rozmiar piksela na ~120 nm.
   9. Wybierz tryb akwizycji xyt i wybierz liczbę klatek, które mają zostać pozyskane na akwizycję i studnię (na przykład 5,000).
   10. Jeśli system jest wyposażony w tryb wysokiej przepustowości, wprowadź współrzędne każdego odwiertu i liczbę akwizycji na odwiert, aby zautomatyzować proces.
       Uwaga: Uważaj, aby upewnić się, że jest dostępny dystrybutor wody w przypadku korzystania z obiektywu zanurzeniowego.
   11. Jeśli system jest wyposażony w system perfuzyjny, załaduj roztwór BB i zaprogramuj perfuzję tak, aby rozpoczynała się zaraz po 5000^klatce, aby ocenić kinetykę dimeryzacji podczas uzyskiwania np. 10 000 obrazów.
3. Dodaj kroplę oleju do obiektywu zanurzeniowego w oleju / wody, jeśli używasz obiektywu do zanurzenia w wodzie z korekcją kołnierza przeznaczonego do FCS.
4. Zamontuj 8-dołkową komorę obserwacyjną w scenie.
5. Wybierz odpowiednią studnię i skup się na rozwiązaniu.
   Uwaga: WAŻNE: Unikaj ustawiania ostrości blisko dolnej szyby, aby uniknąć odbicia i rozproszenia. Podczas ustawiania ostrości głębiej na rozwiązaniu odłącz opcję automatycznego ustawiania ostrości.
6. Rozpocznij pobieranie i zapisz wynikowy stos obrazów w formacie TIFF.

4. Detrend i analiza jasności przy użyciu pakietu R nandb

1. W ramach wstępnego sprawdzania jakości przetwarzania użyj ImageJ¹⁴, aby przyjrzeć się obrazom i odzyskać profil intensywności, jak pokazano w Rysunek 2a. Jest to przydatne do określenia, czy wystąpiło zbyt dużo fotowybielania. Jeśli bielenie jest zbyt duże, dane nie nadają się do dalszej analizy.
   Uwaga: ImageJ może być również przydatny do konwersji obrazów do formatu TIFF z formatów komercyjnych. Opisane poniżej oprogramowanie nandb może pracować tylko z plikami TIFF.
2. Pobierz i zainstaluj R i RStudio^15,16. Najlepiej jest najpierw pobrać i zainstalować R, a następnie RStudio.
   UWAGA: Poniżej znajduje się opis sposobu korzystania z pakietu nandb R. Znajomość języka R nie jest wymagana do korzystania z nandb, jednak ułatwi życie.
3. Zainstaluj pakiet nandb.
   1. Otwórz program RStudio i w konsoli wpisz install.packages("nandb") i poczekaj na instalację.
4. Poznaj nandb
   1. Przejrzyj instrukcję¹⁷.
   2. Zapoznaj się z wbudowaną pomocą programu RStudio, aby uzyskać informacje o różnych funkcjach. Najbardziej prawdopodobną funkcją, która zostanie użyta, będzie brightness(). Wyświetl plik pomocy dla tej funkcji, wpisując ? brightness() na konsoli.
5. Obliczanie jasności
   1. Powiedzmy, że na pulpicie znajduje się plik obrazu o nazwie img001.tif (zauważ, że "nandb" działa tylko z plikami TIFF). Można obliczyć jasność tego obrazu:
      b <- jasność("~/Pulpit/img001.tif", tau = "auto")
      1. Spowoduje to przypisanie jasności obrazu do zmiennej b w R. Tau = "auto" zapewnia, że obraz jest prawidłowo detrendowany przed obliczeniem jasności. Najczęstszą czynnością, którą należy wykonać z tego miejsca, jest obliczenie średniej lub mediany jasności obrazu. Można to zrobić, wpisując średnią(b) lub medianę(b). Można również zapisać obraz jasności na pulpicie za pomocą
         ijtiff::write_tif(b, "~/Pulpit/whatever_img_name")
   2. Powiedzmy, że na pulpicie znajduje się folder pełen obrazów, images_folder i trzeba obliczyć jasność tych obrazów i zapisać obrazy jasności jako pliki TIFF. Następnie zobacz ?brightness_folder(). Ta funkcja przetwarza cały folder jednocześnie:
      brightness_folder("~/Pulpit/images_folder", tau = "auto")
      Jest to szczególnie dobre dla tych, którzy mają oprogramowanie, które wolą od R, ponieważ wszystkie pliki są przetwarzane w jednym poleceniu, a następnie można kontynuować pracę z obrazami TIFF o jasności wyjściowej w wybranym przez siebie oprogramowaniu, czy to ImageJ¹⁴, Python czy coś innego.

Wyniki

Detrending i jasność monomeryczna

Po zebraniu danych, można rozpocząć obliczenia jasności w celu określenia oligomerycznego stanu białka będącego przedmiotem zainteresowania w roztworze. Nawet jeśli efekt wybielania w roztworze może nie być tak drastyczny, jak może być in vivo, ślad intensywności nadal prawdopodobnie nie będzie miał średniej stacjonarnej, prawdopodobnie z powodu efektów fotofizycznych z...

Dyskusja

N&B to technika wykrywania multimeryzacji przy użyciu komercyjnych skaningowych mikroskopów konfokalnych wyposażonych w detektory cyfrowe. To podejście jest dość atrakcyjne w porównaniu z jednopunktowymi FCS, FCCS i smFRET, ponieważ nie wymaga kalibracji, a obliczanie jasności jest proste i niezależne od stężenia⁶. Niezwykle ważne jest jednak, aby przed wykonaniem obliczeń jasności skorygować bielenie i długotrwałe wahania intensywności⁹; Niewielki wzrost jasności spowodowa...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Komórki pLysS RosettaTM (DE3)	Novagen	70956-3
Ampicillin	Sigma	Aldrich PubChem Identyfikator substancji 329824407
Chloramfenikol	Sigma Aldrich	PubChem Identyfikator substancji: 24892250
LB kultura starterowa	QIAGEN
LB podłoże	QIAGEN
IPTG	Sigma Aldrich	PubChem Identyfikator substancji 329815691
bufor IMAC	Medicago	09-1010-10
Inhibitory proteazy wolne od EDTA	Żywica Sigma Aldrich	11873580001
TALON	Clonetech
Sefaroza niklowa	GE Healthcare
S200 16/60 kolumna	GE Healthcare
Naczynie obserwacyjne 8-dołkowe ze szklanym dnem	Ibidi	80827