Neurogeneza z wykorzystaniem komórek raka zarodkowego P19

Podsumowanie

Linia komórkowa raka embrionalnego myszy P19 (linia komórkowa P19) jest szeroko stosowana do badania molekularnego mechanizmu neurogenezy z dużym uproszczeniem w porównaniu do analizy in vivo. W tym miejscu przedstawiamy protokół neurogenezy indukowanej kwasem retinowym w linii komórkowej P19.

Streszczenie

Linia komórkowa P19 pochodząca z teratocarcinoma pochodzącego z zarodka myszy ma zdolność różnicowania się na trzy listki zarodkowe. W obecności kwasu retinowego (RZS) linia komórkowa P19 z hodowli zawiesinowej jest indukowana do różnicowania się w neurony. Zjawisko to jest szeroko badane jako model neurogenezy in vitro. Dlatego linia komórkowa P19 jest bardzo przydatna w badaniach molekularnych i komórkowych związanych z neurogenezą. Jednak opisane w literaturze protokoły różnicowania neuronalnego linii komórkowej P19 są bardzo złożone. Metoda opracowana w tym badaniu jest prosta i odegra rolę w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych w nieprawidłowościach neurorozwojowych i chorobach neurodegeneracyjnych.

Wprowadzenie

Podczas rozwoju embrionalnego, pojedyncza warstwa komórki przekształca się w trzy oddzielne warstwy zarodkowe^1,2,3. Aby zwiększyć możliwości badawcze zjawisk zachodzących in vivo, jako wygodny model opracowano generowanie trójwymiarowych agregatów (ciał embrionalnych). Powstałe w ten sposób agregaty komórkowe mogą być narażone na różne warunki powodujące różnicowanie komórek, które odzwierciedlają rozwój zarodka^4,5. Linia komórkowa mysiego raka zarodkowego P19 (linia komórkowa P19) jest powszechnie stosowana jako model komórkowy do badań neurogenezy in vitro^6,7,8. Linia komórkowa P19 wykazuje typowe cechy pluripotencjalnych komórek macierzystych i może różnicować się w neurony w obecności kwasu retinowego (RZS) podczas agregacji komórek, a następnie wzrostu neurytów w warunkach przylegania. Co więcej, niezróżnicowana linia komórkowa P19 jest również zdolna do tworzenia komórek podobnych do mięśni i kardiomiocytów pod wpływem dimetylosulfotlenku (DMSO)^9,10,11,12.

Wiele metod^13,14,15,16 zostało zgłoszonych dotyczących różnicowania neuronów, ale metodologia jest czasami skomplikowana i niełatwa do zrozumienia poprzez samo czytanie opisów. Na przykład, protokoły czasami wymagają kombinacji pożywki Modified Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej mieszaniną surowicy cielęcej (CS) i płodowej surowicy bydlęcej (FBS)¹³. Co więcej, pożywki używane do rozwoju neuronów często składają się z suplementów Neurobasel i B27^13,14,15,16. W związku z tym istniejące metody są skomplikowane w ich przygotowaniu, a naszym celem jest uproszczenie protokołów. W tym badaniu wykazaliśmy, że DMEM z FBS może być wykorzystany do utrzymania linii komórkowej P19 (DMEM + 10% FBS), a także do rozwoju neuronów (DMEM + 5% FBS + RA). Ta uproszczona metoda neurogenezy wykorzystująca linię komórkową P19 pozwala nam badać molekularny mechanizm rozwoju neuronów. Co więcej, badania nad chorobami neurodegeneracyjnymi, takimi jak choroba Alzheimera, są również prowadzone przy użyciu linii komórkowej P19^17,18 i wierzymy, że metoda opracowana w tym badaniu odegra rolę w wyjaśnieniu mechanizmów molekularnych w nieprawidłowościach neurorozwojowych i chorobach neurodegeneracyjnych.

Protokół

1. Utrzymanie kultury

1. Hodowla linii komórkowej P19 w pożywce podtrzymującej (zmodyfikowana pożywka Eagle's firmy Dulbecco z 4500 mg / L glukozy uzupełnionej 10% FBS, 100 jednostek / ml penicyliny i 100 jednostek / ml streptomycyny). Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ .

2. Komórki podhodowlane

1. Gdy komórki osiągną około 80% zbieżności, należy usunąć zużytą pożywkę z kolb do hodowli komórkowych (powierzchnia 25^cm2).
2. Umyj komórki 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) wolnej od wapnia i magnezu.
3. Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy) na monowarstwę komórki.
4. Umieścić kolbę w inkubatorze CO₂ (37 °C i 5% CO₂ ) na 2-3 minuty.
5. Ocenić przyłączenie komórek do powierzchni kolby. Upewnij się, że wszystkie komórki są odłączone i unoszą się w podłożu.
6. Dodaj 9 ml pożywki podtrzymującej, aby zatrzymać aktywność enzymatyczną trypsyny.
7. Ponownie zawieś komórki w pożywce konserwacyjnej.
8. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 200 x g i temperaturze pokojowej (RT).
9. Odrzucić sklarowany osad i dodać 10 ml świeżej pożywki do probówki o pojemności 15 ml.
10. Użyj zawiesiny ogniwa, aby określić numer ogniwa za pomocą licznika komórek zgodnie z instrukcjami producenta.
11. Komórki nasienne w proporcjach 2 x 10⁴ komórki/cm2 w nowej kolbie^{o średnicy 25 cm2}.
12. Dodaj pożywkę konserwacyjną do 10 ml.
13. Umieścić kolbę z komórkami w inkubatorze CO₂ (37 °C i 5% CO_{2 )} na 2-3 dni.

3. Trawienie trypsyny

1. Odessać pożywkę konserwacyjną z kolby komórkowej. Umyj komórki raz 2 ml PBS bez wapnia i magnezu.
2. Dodaj 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA.
3. Umieścić kolbę z komórkami w inkubatorze CO₂ w temperaturze 37 °C na 2-3 minuty.
4. Użyj pipety o pojemności 1 ml, aby oddzielić komórki, pipetując je dziesięć razy.
5. Zneutralizuj trypsynę, dodając do komórek 9 ml pożywki różnicującej (zmodyfikowanej pożywki Eagle'a firmy Dulbecco z 4500 mg / l glukozy uzupełnionej 5% FBS, 100 jednostek / ml penicyliny i 100 jednostek / ml streptomycyny) bez RZS.
6. Przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut przy 200 x g i RT.
7. Odrzucić sklarowany osad i dodać 1 ml pożywki różnicującej bez kwasu retinowego (RA). Ponownie zawiesić osad komórkowy.
8. Użyj zawiesiny ogniwa, aby określić numer ogniwa za pomocą licznika ogniw zgodnie z instrukcją producenta.

4. Generowanie agregatów

1. Dodać 5 μl RA (1 mM bulion rozpuszczony w 99,8% etanolu, przechowywany w temperaturze -20 °C) do 10 ml pożywki różnicującej i dobrze wymieszać (końcowe stężenie 0,5 μM RA).
   nuta: RZS jest wrażliwy na światło. Niskie stężenie EtOH nie wpływa na różnicowanie komórek^19,20,21.
2. Dodać 10 ml pożywki różnicującej (z RA) do niepoddanego działaniu substancji naczyń hodowlanych o średnicy 100 mm (przeznaczonej do hodowli zawiesinowych).
3. Wysiewaj 1 x 10⁶ komórek w naczyniu o średnicy 100 mm (powierzchnia naczynia 56,5 cm²).
4. Umieścić kolbę z komórkami w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ na 2 dni w celu pobudzenia tworzenia się agregatów.
5. Po 2 dniach wymień podłoże różnicujące. Odessać pożywkę zawierającą agregaty za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieść do probówki o pojemności 15 ml w temperaturze pokojowej.
6. Pozwól kruszywu osiadać grawitacyjnie przez 1,5 minuty przy suchej temperaturze względnej.
7. Odrzucić supernatant.
8. Dodać świeże 10 ml pożywki różnicującej z 0,5 μM RZS za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml.
   ostrożność: Nie należy pipetować agregatów komórek w górę iw dół.
9. Wysiewać kruszywa do nowego 100 mm niepoddanego działaniu substancji naczyń hodowlanych (przeznaczonych do hodowli zawiesinowych).
10. Umieścić płytkę w inkubatorze (w temperaturze 37 °C i 5% CO_{2 )} na 2 dni.

5. Dysocjacja agregatów

1. Odessać agregaty komórek za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
2. Przenieść kruszywa do probówki o pojemności 15 ml. Pozwól agregatom komórek osiąść grawitacyjnie przez 1,5 minuty.
3. Usunąć supernatant.
4. Umyj agregaty samym DMEM (bez surowicy i antybiotyków).
5. Pozwól, aby agregaty komórek osiadły przez sedymentację grawitacyjną przez 1,5 minuty w temperaturze pokojowej.
6. Odessać supernatant i dodać 2 ml trypsyny-EDTA (0,25%).
7. Umieść agregaty komórkowe w łaźni wodnej (37 °C) na 10 minut. Delikatnie mieszaj agregaty co 2 minuty, stukając ręką.
8. Zatrzymaj proces trypsynizacji, dodając 4 ml pożywki konserwacyjnej.
9. Pipeta agreguje się w górę i w dół 20 razy za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
10. Odwirowywać komórki przez 5 minut przy 200 x g i RT.
11. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml pożywki konserwacyjnej.
12. Określ numer komórki za pomocą licznika komórek.

6. Komórki poszycia

1. Dodać 3 ml pożywki konserwacyjnej na dołek do płytki 6-dołkowej.
2. Komórki nasienne w 6-dołkowej płytce hodowlanej o gęstości 0,5 x 10⁶/dołek.
3. Inkubować w temperaturze 37 °C przy stężeniu 5% CO_{2 .}
4. Wysiewaj komórki na szkle przykrywkowym na 6-dołkowej płytce hodowlanej i wykonaj barwienie immunologiczne przeciwciałem anty-MAP2 (konfluencja 20%). Użyj płytki 6-dołkowej, aby wyizolować RNA i wykonaj RT-PCR dla Map2, NeuN, Oct4, Nanog i Gapdh (konfluencja 20%).

Wyniki

Uproszczony schemat protokołu indukcji neurogenezy w linii komórkowej P19 jest przedstawiony w Rysunek 1. W celu określenia charakteru linii komórkowej P19 w stanie niezróżnicowanym oraz w trakcie neurogenezy zastosowano metodę RT-PCR (odwrotna reakcja łańcuchowa polimerazy). Niezróżnicowana linia komórkowa P19 wykazywała ekspresję genów pluripotencji, takich jak organiczny transporter kationów/karnityny4 (Oct4) i homeobox Nanog (Nanog). Neu...

Dyskusja

W tym miejscu opisujemy prosty protokół neurogenezy z wykorzystaniem linii komórkowej P19. Chociaż opublikowano wiele doniesień w tym zakresie, szczegółowa metodologia indukcji neurogenezy z wykorzystaniem linii komórkowej P19 pozostaje niejasna. Co więcej, w całym eksperymencie wykorzystaliśmy prostą pożywkę DMEM o wysokiej zawartości glukozy (4,500 mg / L) z 10% FBS. Pozwoliło nam to na przeprowadzenie eksperymentu neurogennego w sposób przyjazny dla użytkownika i rozszerzenie zastosowania tej metody na przyszłość.

...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
6x Barwnik ładujący DNA	EURx	E0260-01
Agaroza	Sigma- Aldrich	A9539
zestaw do syntezy cDNA	EURx	E0801-02
DAPI (4&,6-Diamidine-2′-dichlorowodorek fenyloindolu)	Sigma- Aldrich	10236276001	Stężenie robocze: 1 μ g/ml
DMEM o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g/l) z L-glutaminą	Lonza	BE12-604Q
Etanol 99,8%	Chempur	CHEM*613964202
Surowica bydlęca płodu (FBS)	EURx	E5050-03
Przeciwciało MAP2	Thermo Fisher Scientific	PA517646	Rozcieńczenie 1:100
Zestaw reakcyjny	PCR EURx	E0411-03
Penicylina/Streptomycyna 10K/10K	Lonza	DE17-602E
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 1x zagęszczona bez Ca2+, Mg2+	Lonza	BE17- 517Q
Kwas retinowy	Sigma- Aldrich	R2625-50MG	rozpuszczony w 99,8% etanolu; Przechowywać w temperaturze -20 & C do 6 miesięcy
Przeciwciało drugorzędowe (Alexa Fluor 488)	Thermo Fisher Scientific	A11034	Rozcieńczenie 1:500
Mleko odtłuszczone	Sigma- Aldrich	1153630500
Bufor TBE	Thermo Fisher Scientific	B52
Triton-X 100	Sigma- Aldrich	T8787-100ML
Trypsyna 0,25% - EDTA w HBSS, bez  Ca2+, Mg2+, z czerwienią fenolową	sztuczne	LM-T1720/500
Tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych Pipety
serologiczne 1 ml	Profilab	515.01
10 ml Pipety serologiczne	Profilab	515.10
100 mm naczynie dedykowane do hodowli zawiesinowych	Corning	C351029
Probówki wirówkowe 15 ml	Sigma-Aldrich	CLS430791-500EA
Pipety serologiczne 5 ml	Profilab	515.05
Płytka 6-dołkowa	Corning	CLS3516
Kolby do hodowli komórkowych, powierzchnia 25 cm2	Sigma- Aldrich	CLS430639-200EA