Ocena działania przeciwdepresyjnego Xiaoyaosan na przewlekle zestresowane myszy

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do stworzenia modelu depresyjnego myszy, obserwacji zmian w zachowaniu związanych z przewlekłym nieprzewidywalnym łagodnym stresem (CUMS) i oceny działania przeciwdepresyjnego Xiaoyaosan.

Streszczenie

Oprócz standardowego stosowania leków przeciwdepresyjnych i psychoterapii, stosowanie tradycyjnej medycyny chińskiej doprowadziło do ogólnej poprawy stanu pacjentów z dużymi zaburzeniami depresyjnymi (MDD). Dlatego celem tego badania było ustalenie mysiego modelu depresyjnego, obserwacja zmian w zachowaniu związanych z przewlekłym nieprzewidywalnym łagodnym stresem (CUMS), a następnie ocena działania przeciwdepresyjnego Xiaoyaosan. Myszy zostały losowo podzielone na cztery grupy: grupę kontrolną, grupę modelową, grupę leczoną Xiaoyaosan i grupę leczoną fluoksetyną. Wszystkie myszy były indywidualnie trzymane w klatkach, a depresję wywołano u myszy poprzez wystawienie ich na kilka zaprojektowanych manipulacji CUMS przez 21 dni, jak opisano w protokole. Myszy w grupie kontrolnej i grupie modelowej otrzymały 0,5 ml wody destylowanej, podczas gdy myszy w grupach leczonych otrzymywały Xiaoyaosan (0,25 g / kg / dzień) lub fluoksetynę (2,6 mg / kg / dzień). Leki stosowane w badaniu podawano dożołądkowo codziennie przez całe trzy tygodnie. Aby oszacować zachowania podobne do depresyjnych, zarejestrowano szereg parametrów, w tym stan sierści, masę ciała, wynik testu w otwartym polu i wynik testu preferencji sacharozy. Analiza danych wykazała, że zachowania myszy modelowych uległy znacznej zmianie w porównaniu z zachowaniami myszy w grupie kontrolnej, które uległy poprawie dzięki leczeniu Xiaoyaosan i fluoksetyną. Obecne odkrycia wykazały przeciwdepresyjne działanie Xiaoyaosan na zachowania myszy wywołanych CUMS i ujawniły, że związki z recepty Xiaoyaosan mogą być warte zachodu w leczeniu depresji, biorąc pod uwagę ich korzystny wpływ na zachowania podobne do depresji.

Wprowadzenie

MDD jest przewlekłą, bardzo nawracającą chorobą psychiczną, która objawia się uporczywym obniżonym nastrojem, depresją, niską samooceną, upośledzeniem umysłowym, utratą zainteresowań, zaburzeniami snu, głęboko pesymistycznymi lub samobójczymi tendencjami; wyrządziła wielką szkodę ludzkiemu zdrowiu i stabilizacji społecznej¹. Stała się jedną z głównych przyczyn niepełnosprawności na świecie i może być jedną z głównych przyczyn obciążenia chorobami do 2030 roku według Światowej Organizacji Zdrowia^2,3. Obecnie leki przeciwdepresyjne i psychoterapia są uważane za leki pierwszego wyboru w leczeniu MDD. Niemniej jednak, ogromna liczba pacjentów, u których zdiagnozowano MDD, nie reaguje na ciągłe leki lub terapię i są wymienieni jako cierpiący na depresję oporną na leczenie⁴.

Xiaoyaosan to klasyczny chiński złożony class5, który jest powszechnie stosowany w leczeniu chorób psychicznych od tysięcy lat od czasów dynastii Song w Chinach⁶. Składa się z 8 chińskich ziół: Radix Bupleuri, Radix Paeoniae Alba, Radix Angelicae Sinensis, Poria, Rhizoma Atractylodis Macrocephalae, Radix Glycyrrhizae, Rhizoma Zingiberis Recens i Herba Menthae. Xiaoyaosan zawiera wiele składników, ma wiele celów i wykorzystuje wiele ścieżek⁷. Powszechnie wykazano, że Xiaoyaosan jest bezpieczną i skuteczną formułą leczenia różnych chorób związanych z zaburzeniami psychicznymi, a nowoczesne badania koncentrowały się również na mechanizmie przeciwdepresyjnym tego związku^8,9,10. Patogeneza MDD jest jeszcze niejasna, mimo że istnieje wiele hipotez, w tym hipoteza monoaminowa, hipoteza receptora neuroprzekaźnika, hipoteza zmiany funkcji neuroendokrynnej, hipoteza nieprawidłowości układu odpornościowego itp. Kilka badań wykazało, że przeciwdepresyjne działanie Xiaoyaosan ma związek z materialnymi podstawami powyższych hipotez^11,12, a jego działanie terapeutyczne przejawia się jako poprawa zachowań depresyjnych¹³.

Ponadto, wraz z rozpowszechnieniem depresji, nowoczesne społeczeństwo cierpi z powodu redukcji siły roboczej, wcześniejszych emerytur i kosztownych metod leczenia¹⁴. Kosztowne leczenie wymaga ścisłej opieki medycznej, co oznacza szereg zwiększonych kosztów medycznych i precyzyjne przewidywanie precyzyjnych działań niepożądanych, a także skutków ubocznych¹⁵. Chińskie zioło Xiaoyaosan ma dostępne składniki, unikalne działanie i niewielkie skutki uboczne. Jego zastosowanie może odegrać rolę w zmniejszeniu obciążenia związanego z nowoczesnym leczeniem. Dlatego, aby zapewnić bardziej teoretyczne podstawy do stosowania Xiaoyaosan, należy zaproponować alternatywną terapię kliniczną w leczeniu depresji, której częstość występowania wzrasta z roku na rok, a jednocześnie powinna poprawić zdrowie ludzi. W artykule opisano protokół obejmujący stosowanie Xiaoyaosan w celu zapobiegania zachowaniom podobnym do depresji poprzez ustanowienie depresyjnego modelu myszy. Test otwartego pola i test preferencji sacharozy zostały wykorzystane do zweryfikowania działania przeciwdepresyjnego Xiaoyaosan.

Protokół

Ten protokół został zatwierdzony przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Chińskiego w Pekinie i był zgodny ze wszystkimi wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych w Chinach. Nie było przypadkowej śmierci podczas procedury eksperymentalnej i żadne zwierzę nie musiało być poddawane eutanazji w tym badaniu.

1. Przygotowanie leków do eksperymentu

UWAGA: Chińskie zioła zostały zakupione, a następnie uwierzytelnione przez dr B. Liu z Pekińskiego Uniwersytetu Medycyny Chińskiej. Xiaoyaosan zawiera następujące osiem tradycyjnych chińskich leków w stosunku 6:6:6:6:3:6:2:2: Radix Angelicae Sinensis, Radix Paeoniae Alba, Poria, Radix Bupleuri, Radix Glycyrrhizae, Rhizoma Atractylodis Macrocephalae, Herba Menthae i Rhizoma Zingiberis Recens,.

1. Przygotuj Xiaoyaosan zgodnie z wcześniejszym opisem¹⁶.
   Uwaga: Wyekstrahowaliśmy te związki w pomieszczeniu przygotowawczym medycyny chińskiej Szpitala Przyjaźni Chińsko-Japońskiej, a wydajność ekstrakcji wyniosła 18,8%.
2. Sprawdź jakość Xiaoyaosan za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i analizy spektrometrii mas (LC-MS/MS)¹⁷.

2. Przygotowanie myszy do procedury eksperymentalnej

UWAGA: Do procedury eksperymentalnej wybrano 60 zdrowych samców myszy C57BL/6J w wieku 12 tygodni, z których każda ważyła od 18 do 22 g.

1. Myszy należy trzymać pojedynczo w klatkach w typowym pomieszczeniu laboratoryjnym wolnym od specyficznych patogenów (SPF) (22 ± 1 °C, 12 godzin/12 godzin cykl ciemny/jasny, wilgotność względna: 30–40%) przez tydzień przed zabiegiem CUMS.
2. Losowo podziel wszystkie myszy na grupę kontrolną, grupę modelową, grupę leczoną Xiaoyaosan lub grupę leczoną fluoksetyną w zależności od ich masy ciała. Każda grupa składa się z 15 myszy.
3. Przed rozpoczęciem eksperymentu ponumeruj myszy w każdej grupie na ogonie za pomocą pisaka.
4. Przetestuj wszystkie myszy za pomocą pięciodniowego testu preferencji sacharozy (patrz krok 5) i testu w terenie otwartym (patrz krok 6).

3. Indukcja depresji u myszy

UWAGA: Aby wywołać depresję, myszy w grupie modelowej i dwóch grupach terapeutycznych przeszły CUMS przez 21 dni¹⁸. Plan można zmieniać w zależności od sytuacji praktycznej, ale należy przestrzegać zasady, że ten sam stresor nie może być używany w sposób ciągły.

1. Codziennie wystawiaj myszy na działanie dowolnych dwóch z następujących siedmiu czynników stresogennych przez 21 kolejnych dni¹⁹. Nasz plan modelowania jest zaprojektowany w następujący sposób:
   1. W poniedziałek należy wystawić myszy na deprywację pokarmową (opróżnij karmę z każdej klatki na 24 godziny, od 8:00 do 8:00) i pozbawioną wody (wyjmij butelkę do picia z każdej klatki na 24 godziny, od 8:00 do 8:00
   ).
   2. We wtorek wystaw myszy na stres związany z ograniczeniami (trzymaj myszy w małej plastikowej wannie przez 3 godziny, od 8:00 do 11:00) i puste klatki (usuń wyściółkę z każdej klatki na 11 godzin, od 8:00 do 19:00
   ).
   3. W środę wystaw myszy na działanie mokrych i zabrudzonych klatek (wlej wodę do każdej klatki i trzymaj mokre przez 24 godziny, od 8:00 do 8:00) i zatłoczonych klatek (umieść pięć myszy w jednej klatce na 24 godziny, od 8:00 do 8:00
   ).
   4. W czwartek wystaw myszy na stres związany z ograniczeniami i lodowate pływanie^20,21 (zmuś każdą mysz do pływania w przezroczystym szklanym akwarium z lodowatą wodą przez 5 minut).
   5. W piątek wystawiaj myszy na mokre i zabrudzone klatki oraz pozbawienie jedzenia.
   6. W sobotę wystawiaj myszy na stres związany z ograniczeniami i zatłoczonymi klatkami.
   7. W niedzielę wystawiaj myszy na puste klatki i lodowate pływanie.
2. Rejestruj stan sierści i masę ciała co tydzień, aż do końca modelowania (dzień 21). Oblicz całkowity wynik stanu sierści jako sumę wyników z siedmiu różnych części ciała: głowy, szyi, sierści grzbietowej, sierści brzusznej, łap przednich, ogona i łap tylnych. Wynik jeden oznacza zadbaną sierść, a wynik zero oznacza zaniedbaną sierść²².
3. Na koniec eksperymentu wykonaj pięciodniowy test preferencji sacharozy (patrz krok 5) i test w terenie otwartym (patrz krok 6).

4. Administracja Xiaoyaosan

UWAGA: Dawka Xiaoyaosan (0,25 g/kg/dzień) została wybrana na podstawie jej zadowalającej skuteczności, jak opisano wcześniej⁹.

1. Podczas eksperymentu użyj wody destylowanej do przygotowania zawiesin Xiaoyaosan i fluoksetyny i upewnij się, że użyjesz natychmiast.
2. Podawaj 0,5 ml wody destylowanej myszom w grupie kontrolnej i grupie modelowej przez podawanie dożołądkowe codziennie przed modelowaniem. W międzyczasie podaj Xiaoyaosan (0,25 g/kg/dzień) lub fluoksetynę (2,6 mg/kg/dzień) myszom w dwóch grupach leczenia.

5. Test preferencji sacharozy

UWAGA: Przed testem nie zastosowano żadnych środków do pozbawienia wody ani jedzenia. Protokół został wykonany zgodnie z wcześniejszymi raportami²³.

1. Przez pierwsze dwa dni trzymaj myszy pojedynczo w dwóch butelkach wypełnionych wodą z kranu.
2. W ciągu następnych dwóch dni podawaj myszom dwie butelki wypełnione 1% roztworem sacharozy.
3. Ostatniego dnia podawaj myszom dwie butelki przez 24 godziny, jedną z wodą z kranu, a drugą z 1% roztworem sacharozy. Aby wyeliminować uboczne preferencje myszy w zachowaniu związanym z piciem, po 12 godzinach zamień położenie dwóch butelek.
4. Zapisz objętość (ml) zarówno spożytego roztworu sacharozy, jak i wody z kranu. Oblicz preferencję sacharozy w następujący sposób: preferencja sacharozy (%) = spożycie sacharozy/całkowite spożycie płynów × 100%.

6. Test w otwartym terenie

1. Przeprowadź test w otwartym polu w słabo oświetlonym i cichym pomieszczeniu z czterostronnym drewnianym czarnym pudełkiem bez połysku. Podziel podłogę na 25 równych kwadratów niebieskimi liniami.
2. Wyczyść pudełko na otwartym polu 5% alkoholem przed uzyskaniem dostępu do każdej myszy. Następnie delikatnie umieść mysz na środku otwartego pola.
3. Zawieś kamerę cyfrową o wysokiej rozdzielczości około 200 cm tuż nad polem i nagrywaj zachowanie każdej myszy przez 5 minut.
4. Oceń wideo behawioralne myszy za pomocą oprogramowania systemu śledzenia wideo i zarejestruj dane dotyczące całkowitego dystansu biegu i liczby wejść do strefy środkowej.
5. Analizuj dane dotyczące całkowitej przebytej odległości i liczby wejść do strefy środkowej za pomocą oprogramowania statystycznego.

Wyniki

Zauważ, że wyniki zostały wcześniej opublikowane przez Dr. Xiu-Fang Ding, et al.¹⁸

Dane zostały wyrażone jako średnia ± błąd standardowy średniej (SEM). Jednoczynnikowy test ANOVA lub test nieparametryczny zastosowano do danych ogólnych opartych na teście normalności i teście jednorodności wariancji. Test LSD został użyty do porównań między grupami. Ponadto do przeprowadzenia jednokierunkowej...

Dyskusja

Model CUMS zastosowany w tym badaniu jest powszechną metodą ustalania modelu skazy stresowej depresji²⁴. Większość objawów CUMS można przywrócić za pomocą leków przeciwdepresyjnych, co wskazuje, że ta metoda modelowa ma silną trafność predykcyjną²⁵. Dzięki tej metodzie zwierzęta otrzymują przewlekłe, nieprzewidywalne, stresujące bodźce i rozwijają podstawowe objawy poważnej depresji, w tym zmniejszone warunkowanie preferencji miejsca, anhedonię i upośledzone zachowania podo...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chinese Herbs	Tongrentang (Bozhou, AnHui) Decoction Pieces Limited Company	-	Leki zostały wyekstrahowane przez pomieszczenie przygotowania medycyny chińskiej w Szpitalu Przyjaźni Chińsko-Japońskiej, do przygotowania zawiesiny Xiaoyaosan użyto wody destylowanej, a dawka wynosiła 0,25 g / kg / d.
Fluoksetyna	PATHEON FRANCJA	5545A	Do przygotowania zawiesiny fluoksetyny użyto wody destylowanej, a dawka 2,6 mg/kg/d.
Myszy C57BL/6j	Beijing Vital River firmy Charles River	Company SCXK 2011-0004	60 zdrowych samców myszy C57BL/6J w wieku 12 tygodni zakupiono w Beijing Vital River należącej do Charles River Company.
Klatka dla myszy	Stylizacja Biotechnologia	34853016	318 razy; 202 razy; Woda destylowana 135 mm
	-		Woda była używana w całym eksperymencie.
Sacharoza		Sigma-Sacharoza została użyta w teście preferencji sacharozy w celu przygotowania 1% roztworu sacharozy.
Waga elektroniczna ACS-2EAS	Pekin Hengzhongheng Electronic Technology Co., Ltd.	-	Używano go do ważenia avoirdupois myszy na różnych etapach.
Drewniane czarne pudełko bez połysku	-		(40 cm x 40 cm x 15 cm), podzielone na 25 równych kwadratów niebieskimi liniami.
WV-CP470 Kamera	Panasonic, Japonia-Kamera		cyfrowa HD, która została użyta do nagrania całego procesu testu w terenie otwartym.
Oprogramowanie Etho Vision 3.0	Noldus, Wageningen, Holandia	-	System śledzenia wideo, który został wykorzystany do oceny funkcji lokomotorycznych i emocjonalności myszy.
Oprogramowanie SPSS Statistics 21.0 Do	analizy danych wykorzystano oprogramowanie IBM-SPSS 21.0, do danych ogólnych w oparciu o test normalności i test jednorodności dla wariancji zastosowano jednoczynnikową ANOVA lub test nieparametryczny, a do porównań między grupami zastosowano metodę LSD.
Oprogramowanie Graphpad Prism 6.0	Oprogramowanie Graphpad Software,Inc.USA-Graphpad		Prism 6.0 zostało użyte do rysowania wykresów statystycznych.