Elastyczne barwienie na szkiełkach zatopionych w parafinie tkanki raka żołądka pT3N0M0

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół elastycznego barwienia w celu identyfikacji elastycznych włókien w tkankach raka żołądka pT3N0M0 na odcinkach utrwalonych w formalinie, zatopionych w parafinie. Następnie opisujemy metodę określania, czy komórki nowotworowe atakują poza elastyczną blaszkę.

Streszczenie

Elastyczna blaszka, która zwykle znajduje się w warstwie podmiędzybłonkowej, przylegającej do komórek międzybłonka otrzewnej, jest amfifilowa na barwieniu hematoksyliną i eozyną (H&E), ale może być uwidoczniona przez barwienie elastyczne. Jedną z ważnych zalet elastycznego barwienia jest to, że ułatwia określenie, czy komórki nowotworowe zaatakowały poza elastyczną blaszkę. Pomaga to w badaniu stopnia inwazji powierzchni otrzewnej, rozróżniając w ten sposób etapy pT3 i pT4 w raku przewodu pokarmowego. W niniejszej pracy przedstawiono protokół identyfikacji włókien elastycznych w utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie skrawkach tkanki raka żołądka pT3N0M0. Przygotowujemy skrawki parafinowe 5 μm utrwalone na szkiełkach, a następnie wszystkie szkiełka są odparafinowane i ponownie uwodnione podczas procedury barwienia. Następnie wszystkie sekcje są utleniane nadmanganianem potasu, bielone kwasem szczawiowym, barwione elastycznym barwieniem i barwione przeciwwagowo przez Van Giesona. Na koniec badamy efekt barwienia; Blaszka elastyczna jest zabarwiona na niebiesko-czarno, a włókna kolagenowe są zabarwione na czerwono, podczas gdy komórki rakowe są zabarwione na różne odcienie żółtego. Szczegółowo opisano również metody stosowane do określania zależności pozycyjnej między komórkami nowotworowymi a blaszką elastyczną. Metoda ta jest prosta, tania i szeroko stosowana w identyfikacji inwazji powierzchni otrzewnej w raku przewodu pokarmowego ze względu na wyjątkową selektywność włókien elastycznych i autentyczne wyniki.

Wprowadzenie

Zgodnie z systemem oceny stopnia zaawansowania nowotworu, węzła i przerzutów (TNM), rokowanie raka żołądka w stadium patologicznym pT4 jest znacznie gorsze niż w pT3 (8. UICC/AJCC)¹. W przypadku raka żołądka klasyfikacja guza pierwotnego (pT) zwykle zależy od głębokości inwazji guza². Rak żołądka w stadium patologicznym pT3 definiuje się jako raka atakującego przez mięśnie właściwe do tkanek podsurowiczych, podczas gdy rak żołądka pT4 definiuje się jako raka przenikającego do powierzchni otrzewnej trzewnej. Obecność inwazyjności powierzchni otrzewnej jest kluczem do rozróżnienia tych dwóch etapów². Ponieważ jednak warstwa komórek międzybłonka otrzewnej jest bardzo cienka, może zostać uszkodzona podczas operacji, leczenia pooperacyjnego i utrwalenia³. Co więcej, zmiany zapalne i zwłóknienie związane z nowotworem mogą uszkodzić normalną anatomię otrzewnej, co bardzo utrudnia dokładną ocenę inwazji powierzchni otrzewnej przy użyciu tylko barwienia H&E⁴. Obecne pomocnicze metody diagnostyczne, takie jak cytologia i immunohistochemia, mają ograniczoną wartość diagnostyczną^5,6, ponieważ są fałszywie dodatnie lub mają niską opłacalność.

Błona surowicza obejmuje otrzewną, opłucną i osierdzie, i składa się z mezotelium, błony podstawnej i warstwy podmiędzybłonkowej⁷. Jedną z powszechnych cech histologicznych błony surowiczej jest obecność elastycznej blaszki w warstwie podmiędzybłonka, przylegającej do komórek międzybłonka^8,9. Blaszka elastyczna ma silne właściwości przeciwuszkadzające i może służyć jako alternatywny marker prognostyczny, jeśli komórki międzybłonka zostaną zniszczone przez ciężkie zapalenie związane z nowotworem lub zwłóknienie³. Blaszka elastyczna składa się głównie z elastyny i mikrofibryny¹⁰, które można uwidocznić za pomocą elastycznego barwienia. Głównym powodem stosowania barwienia elastycznego jest to, że elastyna tworzy wiązanie wodorowe z grupą fenolową rezorcyny w roztworze elastyny, powodując zabarwienie włókien elastycznych na niebiesko-czarno. Po barwieniu kontrastowym Van Giesona (VG) włókna kolagenowe mogą być zabarwione na czerwono, a włókna mięśniowe i czerwone krwinki mogą być zabarwione na żółto^8,11,12,13.

Ósma edycja oceny TNM dotyczącej raka płuc definiuje inwazję trzewnej opłucnej (T2) jako inwazję guza poza elastyczną blaszkę lub inwazję na powierzchni opłucnej trzewnej². Badania nad rakiem jelita grubego wykazały, że inwazja blaszki elastycznej w raku jelita grubego pT3 może być przyczyną złych rokowań. Udowodniono również, że 5-letni wskaźnik całkowitego przeżycia raka jelita grubego jest wolny od choroby i jest podobny do pT4a^13,14,15. Na podstawie naszych poprzednich badań nad barwieniem elastycznym stwierdzono, że inwazja blaszki elastycznej ma znaczący negatywny wpływ na rokowanie w raku żołądka pT3 i powinna być leczona w taki sam sposób, jak rak żołądka pT4a¹². W związku z tym ta prosta i opłacalna metoda może pomóc w wyeliminowaniu niepewności wyników uzyskanych za pomocą barwienia H&E oraz innych typowych ograniczeń związanych z innymi pomocniczymi metodami diagnostycznymi, w tym między innymi cytologią i immunohistochemią. Metoda ta może być skutecznie stosowana do diagnozowania inwazji powierzchni otrzewnej raka przewodu pokarmowego, zwłaszcza w niektórych niejednoznacznych przypadkach. Jest to wygodne, ponieważ plamy H&E i inne plamy zwykle utrudniają identyfikację takich inwazji. Metoda ta zapewnia również wiarygodność wyników, ponieważ jest bardzo selektywna, szczególnie w przypadku włókien elastycznych. Tutaj przeprowadzamy barwienie elastyczne, aby ustalić, czy komórki nowotworowe zaatakowały elastyczną blaszkę w pT3N0M0 rak żołądka¹².

Ta metoda jest używana do identyfikacji elastycznych włókien w tkankach na odcinkach utrwalonych formaliną, zatopionych w parafinie, i może być również używana do zamrożonych odcinków. Tutaj wybieramy skrawki zatopione w parafinie, aby jak najlepiej utrzymać morfologię komórek i tkanek. Wszystkie kroki w tym protokole odbywają się w temperaturze pokojowej. W prezentowanym badaniu zastosowano komercyjny zestaw do barwienia, który zawiera roztwór nadmanganianu potasu, roztwór kwasu szczawiowego, roztwór elastyny i roztwór Van Giesona.

Protokół

Między 1994 a 2005 rokiem, próbki pacjentów zostały wybrane przez dwóch doświadczonych patologów przewodu pokarmowego w Affiliated Cancer Hospital of Xiangya School of Medicine, Central South University, od pacjentów, którzy przeszli resekcję żołądka z powodu nowotworów żołądka, z pooperacyjnym patologicznym rozpoznaniem raka żołądka w stadium pT3N0M0 (zgodnie z siódmym stopniem zaawansowania TNM). Badanie to zostało zatwierdzone przez komisję ds. oceny etyki.

1. Podział na sekcje

1. Umieść blok parafiny w stałym uchwycie mikrotomu sań, który może poruszać się do tyłu i do przodu po ostrzu. Dostosuj optymalny kąt między blokiem a nożem do mikrotomów.
   UWAGA: Optymalny kąt zależy nie tylko od geometrii ostrza, ale także od prędkości i techniki cięcia.
2. W razie potrzeby przyciąć blok parafiny i pokroić go na przekroje o grubości 5 μm.
3. Umieścić odcinki parafiny 5 μm w łaźni wodnej o temperaturze około 40 - 45 °C, a następnie zamontować je z wody na szkiełku podstawowym, po jednej sekcji na szkiełko.
4. Ostrożnie dociśnij zamontowaną część do ręcznika papierowego, aby usunąć resztki wody i potencjalne pęcherzyki powietrza.
5. Pozostaw sekcje do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut, a następnie piecz je w piekarniku w temperaturze 45 - 50 °C przez 2 godziny.

2. Deparafinizacja i ponowne nawodnienie wszystkich preparatów

1. Zanurz szkiełka w ksylenie w słoiku Coplin na 10 minut.
2. Wyjmij szkiełka z pierwszego słoika z ksylenem i zanurz je w ksylenie w innym słoiku na 10 minut.
3. Teraz zanurz szkiełka w 100% etanolu w słoiku Coplin na 5 minut.
4. Zanurz szkiełka w 100% etanolu w innym słoiku Coplin, również na 5 minut.
5. Zanurz szkiełka w 95% etanolu w słoiku Coplin na 2 minuty.
6. Zanurz szkiełka w 70% etanolu w słoiku Coplin na 2 min.
   UWAGA: Upewnij się, że szkiełka są całkowicie zanurzone w roztworach podczas wykonywania powyższych kroków.
7. Krótko opłucz szkiełka wodą destylowaną w nowym słoiku.

3. Barwienie

1. Przed przystąpieniem do barwienia zetrzyj nadmiar roztworów wokół tkanki na szkiełku bibułą.
2. Umieść szkiełka w warunkach temperatury i wilgotności pokojowej, aby uniknąć wysuszenia tkanki na szkiełku przez cały proces barwienia.
3. Utleniać szkiełka kilkoma kroplami nadmanganianu potasu przez 5 minut. Upewnij się, że objętość nadmanganianu potasu jest wystarczająca do pokrycia części tkanki na każdym szkiełku.
4. Opłucz utlenione szkiełka wodą destylowaną w słoiku Coplin z 2 - 3 zmianami. Obserwuj niebieski kolor tkanki.
5. Teraz wybiel te szkiełka, dodając kilka kropli kwasu szczawiowego przez 5 minut. Upewnij się, że objętość kwasu szczawiowego jest wystarczająca, aby całkowicie pokryć część tkanki na każdym szkiełku.
6. Opłucz szkiełka, zanurzając je w słoiku Coplin wypełnionym wodą destylowaną. Wykonaj płukanie 2x - 3x.
7. Teraz umyj te szkiełka krótko w 95% alkoholu, a następnie zanurz je w roztworze elastyny (5 g/L) na 8 - 24 godziny < br /> UWAGA: Roztwór elastyny jest lotny, a jego czas barwienia jest stosunkowo długi, dlatego najlepiej zanurzyć szkiełka z elastycznym barwieniem w szczelnie zamkniętym pojemniku, takim jak przezroczysta szklana butelka z nakrętką uszczelniającą. Pojemność pojemnika i objętość roztworu elastyny zależy od liczby zanurzonych szkiełek, o ile umożliwia to całkowite zanurzenie wszystkich szkiełek.
8. Zanurz te szkiełka bezpośrednio w 95% etanolu na 1-2 minuty, aby dobrze rozróżnić każdy fragment tkanki.
   UWAGA: Różnicowanie odnosi się do zmiany ładunku sekcji tkankowej, która usuwa nadmiar zabarwienia wchłoniętego przez tkankę i sprawia, że kolory są wyraźniejsze. Po barwieniu roztworem elastyny próbek nie należy myć wodą destylowaną, aby uniknąć trudności w rozróżnieniu. W razie potrzeby sprawdź pod mikroskopem, czy nie ma niebiesko-czarnych elastycznych włókien i szarego tła. Lepiej jest nieco zaniżyć tkankę, ponieważ późniejsze przeciwbarwienie Van Giesona może również nieco usunąć elastyczną plamę.
9. Po rozróżnicowaniu całkowicie spłukać szkiełka wodą destylowaną.
10. Przeciwbarwić szkiełka roztworem Van Giesona przez 1 min.
    UWAGA: Objętość roztworu Van Giesona musi być wystarczająca, aby móc całkowicie zanurzyć wycinek tkanki na każdym szkiełku.
11. Szybko upuść 95% etanolu na te plastry na kilka sekund, aby dobrze rozróżnić każdy fragment tkanki.
    UWAGA: Nie spłukuj szkiełek żadną wodą po barwieniu Van Giesona, ponieważ może to osłabić lub nawet wymyć kolor barwienia Van Giesona.

4. Odwodnienie i narastanie

1. Zanurz szkiełka w 95% alkoholu na 5 minut, aby szybko się odwodniły.
2. Kontynuuj odwadnianie tych plastrów przez 2 zmiany 100% alkoholu, za każdym razem zanurzając szkiełka na 5 minut.
3. Zanurz szkiełka w 2 przemianach ksylenu, za każdym razem na 3 minuty.
4. Dodaj jedną kroplę żywicznego podłoża montażowego do szkiełka i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu.

5. Obserwacja mikroskopowa preparatów

1. Znajdź kierunek surowiczości i obserwuj wyniki barwienia elastycznego: włókna elastyczne (blaszka) są zabarwione na niebiesko-czarno, włókna kolagenowe są zabarwione na czerwono, a włókna mięśniowe są zabarwione na żółto.
2. Poszukaj komórek rakowych na całym slajdzie: komórki rakowe są zabarwione na żółto¹².
3. Określ zależność położenia między komórkami rakowymi a blaszką elastyczną.
   UWAGA: Będą tu dwie sytuacje. Tak długo, jak istnieje jedna komórka nowotworowa, która zaatakowała poza blaszkę elastyczną w całym szkiełku, to przypadek ten można uznać za inwazję blaszki elastycznej. Z drugiej strony, tylko wtedy, gdy nie ma komórki nowotworowej, która zaatakowała poza blaszkę elastyczną w całym szkiełku, przypadek ten można uznać za nieinwazję blaszki elastycznej.

Wyniki

Prawidłowe barwienie włókien elastycznych wyraźnie ujawnia błonę sprężystą oraz komórki nowotworowe w raku żołądka pT3. Rysunek 1 – pole przy małym powiększeniu, sprawdzone mikroskopowo po barwieniu roztworem elastyny, przed zastosowaniem barwienia kontrastowego metodą Van Gieson zgodnie z opisanym protokołem – pokazuje, że błona sprężysta znajduje się blisko komórek mezoteliów błony surowiczej i jest zabarwiona na kolor ciemnoniebieski w formie włókien, a po...

Dyskusja

Ta zaproponowana tutaj metoda zapewnia dokładne podejście do identyfikacji elastycznej blaszki podsurowiczej. Metodę można wykorzystać do oceny, czy komórki nowotworowe zaatakowały elastyczną blaszkę w raku żołądka pT3N0M0¹². Blaszka elastyczna jest czerwonawa w skrawkach zabarwionych H&E, których nie można było łatwo odróżnić od włókien kolagenowych, a inne istniejące pomocnicze metody diagnostyczne, takie jak cytologia i immunohistochemia, również miały ograniczoną wartość diagnostyczną. Stwierd...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Zestaw do barwienia Elastin-Van Gieson	Baso	BA4083B	Służy do barwienia włókien elastycznych, włókien kolagenowych i włókien mięśniowych
Medium montażowe Permount TM	MXB Biotechnologies	DAB-0033	Służy do montażu
etanolu	LMAI Bio	LM64-17-5	W 100%
Ksylen	LMAI Bio

LX820585