Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby

11.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58285

⸱

25 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Janssen R&D, 2Department of Microbiology and Immunology, University of North Carolina, 3UNC Food Allergy Initiative, University of North Carolina, 4Department of Pediatrics, University of North Carolina, 5Department of Chemistry, University of Alberta, 6Department of Molecular Medicine, Scripps Research Institute, 7Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Alberta

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisano przygotowanie antygenowych nanocząsteczek liposomalnych i ich zastosowanie w stymulowaniu aktywacji komórek B in vitro i in vivo. Spójne i silne odpowiedzi przeciwciał doprowadziły do opracowania nowego modelu alergii na orzeszki ziemne. Protokół generowania liposomów antygenowych można rozszerzyć na różne antygeny i modele immunizacji.

Streszczenie

Odpowiedzi przeciwciał zapewniają krytyczną odporność ochronną na szeroki wachlarz patogenów. Nadal istnieje duże zainteresowanie wytwarzaniem silnych przeciwciał do szczepień, a także zrozumieniem, w jaki sposób rozwijają się patogenne odpowiedzi przeciwciał w alergiach i chorobach autoimmunologicznych. Generowanie silnych odpowiedzi przeciwciał specyficznych dla antygenu nie zawsze jest trywialne. W modelach mysich często wymaga wielu rund szczepień z adiuwantem, co prowadzi do dużej zmienności poziomów indukowanych przeciwciał. Jednym z przykładów są mysie modele alergii na orzeszki ziemne, gdzie korzystne byłyby bardziej solidne i powtarzalne modele, które minimalizują liczbę myszy i zastosowanie adiuwantu. Przedstawiono tutaj wysoce powtarzalny mysi model anafilaksji alergicznej na orzeszki ziemne. Ten nowy model opiera się na dwóch kluczowych czynnikach: (1) splenocyty specyficzne dla antygenu są adoptywnie przenoszone z myszy uczulonej na orzeszki ziemne do naiwnej myszy biorcy, normalizując liczbę komórek B i T pamięci specyficznych dla antygenu u dużej liczby myszy; oraz (2) myszy biorcze są następnie wzmacniane silnym wielowartościowym immunogenem w postaci liposomalnych nanocząstek wykazujących główny alergen orzeszków ziemnych (Ara h 2). Główną zaletą tego modelu jest jego powtarzalność, co ostatecznie obniża liczbę zwierząt wykorzystywanych w każdym badaniu, jednocześnie minimalizując liczbę zwierząt otrzymujących wielokrotne wstrzyknięcia adiuwantu. Modułowy montaż tych immunogennych liposomów zapewnia stosunkowo łatwą zdolność adaptacji do innych modeli alergicznych lub autoimmunologicznych, które obejmują przeciwciała chorobotwórcze.

Wprowadzenie

Alergia pokarmowa dotyka 8% dzieci w Stanach Zjednoczonych i stała się częstsza w ciągu ostatniej dekady1. Alergia na orzeszki ziemne dotyka 1% dzieci i zazwyczaj nie jest wyrastająca z grupy2. Chociaż prowadzonych jest kilka obiecujących badań klinicznych dotyczących leczenia alergii pokarmowej, w tym immunoterapii doustnej (OIT), immunoterapii podjęzykowej (SLIT) i immunoterapii naskórnej (EPIT), obecnie nie ma zatwierdzonych przez FDA strategii leczenia osób uczulonych na orzeszki ziemne3,4,5,6,7,8. Dlatego osoby uczulone muszą bezwzględnie unikać alergenów, aby uniknąć anafilaksji. Pozostaje wiele pytań dotyczących dróg uczulenia i mechanizmów leżących u podstaw rozwoju alergii pokarmowej.

Modele myszy są cennym narzędziem do badania mechanizmów alergii, jak również opracowywania nowych terapii tolerogennych i desensytyzujących9,10,11,12. Jest to szczególnie prawdziwe, ponieważ główny alergen orzeszków ziemnych (Ara h 2; Ah2) u ludzi jest również dominującym alergenem w kilku opisanych modelach myszy13,14. Podczas gdy mysie modele alergii na orzeszki ziemne są nieocenione w badaniu mechanizmów uczulenia i tolerancji, wadą jest to, że mogą być zmienne i wymagać stosowania adiuwantów. Silniejsze immunogeny byłyby jednym ze sposobów na zminimalizowanie wewnętrznej zmienności takich modeli. Ponieważ limfocyty B są silnie aktywowane przez antygeny wielowartościowe, liposomy antygenowe wykazujące alergen są dobrym rozwiązaniem ze względu na ich zdolność do potencjalnej aktywacji komórek B przez receptor komórek B (BCR), a jednocześnie mają właściwość skutecznego pobudzania przedziału komórek T poprzez niespecyficzne pobieranie przez komórki prezentujące antygen.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół koniugacji antygenów białkowych z liposomalnymi nanocząstkami przy użyciu łatwej i modułowej strategii. Używając zastępczego antygenu, fragmentu anty-IgM Fab, pokazujemy, jak silne mogą być takie antygenowe liposomy w stymulowaniu aktywacji komórek B. Liposomy antygenowe wykazujące antygen Ah2 wykorzystano do opracowania nowego mysiego modelu o nadanej czułości. W tym modelu splenocyty od zweryfikowanych myszy alergicznych na orzeszki ziemne, zawierające komórki B i T pamięci specyficzne dla orzeszków ziemnych, są przenoszone do naiwnych myszy kongenicznych. Odpowiedzi przeciwciał pamięciowych są indukowane przez wstrzyknięcie liposomów sprzężonych z Ah2 do myszy biorcy w celu indukcji przeciwciał przeciwko Ah2. Po którym następuje tylko jedno wzmocnienie rozpuszczalnym Ah2, przeciwciała specyficzne dla Ah2 wywołują silną odpowiedź anafilaktyczną, gdy myszy te są następnie prowokowane Ah2. Ponieważ myszy poddawane reakcji alergicznej reagują w bardzo jednolity sposób i nie otrzymały adiuwanta, podejście to jest pożądanym modelem alergii na orzeszki ziemne, a wyniki sugerują, że może mieć zastosowanie w innych modelach mysich napędzanych antygenami skierowanymi na alergeny i ewentualnie autoantygeny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ogólna metoda łączenia białka z lipidem i włączania do liposomów opiera się głównie na wcześniejszych pracach15. Wszystkie opisane poniżej procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez University of North Carolina at Chapel Hill Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Wszystkie myszy użyte w modelu alergii na orzeszki ziemne to samice BALB/cJ zakupione w wieku 3 tygodni. Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Alberty (ACUC) zatwierdził eksperymenty z wykorzystaniem śledziony myszy do analizy ex vivo od myszy C57Bl/6 w wieku co najmniej 6 tygodni

.

1. Koniugacja antygenu białkowego z pegylowanym lipidem

  1. Dodać 3 g usieciowanych kulek żelu dekstranowego o zakresie frakcjonowania 1 500–30 000 daltonów (Da) do kolby próżniowej o pojemności 250 ml. Dodać 60 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i ciągle mieszać za pomocą mieszadła magnetycznego. Uszczelnić kolbę i podłączyć do próżni, aby rozpocząć odgazowywanie na płytce mieszającej przez co najmniej 1 godzinę.
  2. W szklanej kolumnie chromatograficznej o wymiarach 1,0 cm x 30 cm z zamkniętym korkiem obrotowym dodać PBS do kolumny w celu przemycia. Otwórz korek obrotu i opróżnij kolumnę. Po umyciu dodaj do kolumny gnojowicę z odgazowanych kulek. Ciągle dodawaj gnojowicę, aż kolumna zostanie upakowana do wysokości około 24 cm.
  3. Gdy kolumna będzie miała "główkę" około 4–5 cm PBS nad upakowanymi kulkami, przygotuj następujące kroki.
    1. Utwórz syfon przepływu grawitacyjnego, mierząc kawałek rurki wystarczająco długiej, aby dotrzeć do półki 1–2 stopy nad górną częścią kolumny i utwórz pętlę, która opada w pobliżu dolnej części kolumny i wraca na górę kolumny. Dodaj korek obrotowy do jednego końca rurki, pozostawiając jedną stronę rurki otwartą. Umieść otwarty koniec probówki w butelce PBS o pojemności 500 ml i umieść na półce nad kolumną.
    2. Weź koniec z korkiem obrotowym i podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml. Otwórz zawór zatrzymujący obrót na przewodzie rurowym i przeciągnij PBS przez rurkę. Gdy PBS dotrze do trzech czwartych drogi przez rurkę, szybko wyjmij strzykawkę i dodaj korek obrotowy do górnej części kolumny — płyn powinien spływać na kolumnę.
      UWAGA: Ilość "głowy" PBS pozostawiona na górze kolumny powinna wynosić od 1 do 3 cm. Minimalna ilość do umycia kolumny to 3 objętości kolumny.
  4. Określ ilość białka (moli), które ma być powiązane z lipidem na podstawie jego masy cząsteczkowej (MW).
    UWAGA: Fragment Fab koziej anty-mysiej IgM (sam w sobie IgG) jest tutaj używany jako uniwersalny antygen zastępczy do poliklonalnej stymulacji limfocytów B. W związku z tym fragment Fab koziej IgG ma MW około 48 kilodaltonów (kDa) i jest dostępny w handlu w całkowitej ilości 1,3 mg. Zatem ilość białka do połączenia wynosi 27,1 μmol.
  5. Określ współczynnik ekstynkcji białka będącego przedmiotem zainteresowania. Jeżeli nie jest znana, zmierzyć absorbancję białka przy długości fali 280 nm za pomocą spektrofotometru i podzielić wartość A280 przez liczbę moli obliczoną w kroku 1.4.
    UWAGA: Współczynnik ekstynkcji Fab koziej IgG przy 280 nm wynosi 64 600 M-1.
  6. Aby upewnić się, że śladowe ilości buforu zawierającego aminy zostały usunięte, należy odsolić białko na kolumnie utworzonej w krokach 1.1–1.3 i zebrać frakcje białkowe do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml (~500 μl na frakcję).
    1. Zamknij zawór zatrzymujący obrót podłączony do górnej części kolumny i zdejmij górną część kolumny. Jeśli nie jest jeszcze otwarty, otwórz zawór zatrzymujący obrót w dolnej części kolumny i poczekaj, aż "głowica" PBS uderzy w górną część koralików.
    2. Powoli dodawaj interesujące Cię białko do górnej części kulek za pomocą szklanej pipety Pasteura, uważając, aby zminimalizować zakłócenia górnej części kulek.
    3. Gdy "główka" roztworu białkowego dotrze do górnej części kulek, delikatnie dodaj 1 ml PBS za pomocą pipety Pasteura. Powtórz trzy razy. Dodaj PBS, aby utworzyć wysokość podnoszenia 4–5 cm i powtórz krok 1.3, aby umyć kolumnę.
      UWAGA: Ten krok można pominąć, jeśli jest pewne, że nie ma buforu zawierającego aminy.
  7. Określ frakcje zawierające białko, mierząc wartości A280 i połącz frakcje, które dają około 90% odzysku białka.
    UWAGA: To zwykle rozcieńcza białko 1,5-2-krotnie. Określ stężenie białka po łączeniu. Na tym etapie należy zagęścić białko, jeśli to konieczne, za pomocą koncentratora wirowego.
  8. Dodać do białka 2,5-molowy odpowiednik heterobifunkcyjnego środka sieciującego.
    1. Najpierw odważyć około 5 mg 3-(2-pirydyloditio)propionianu sukcynimidylu (SPDP, MW = 314 g/mol) do probówki mikrowirówkowej. Aby określić objętość do rozpuszczenia SPDP, weź stężenie białka molowego i pomnóż je przez 250x, aby uzyskać 100-krotny roztwór, który da 2,5-molowy nadmiar w reakcji.
      UWAGA: Na przykład, jeśli stężenie białka wynosi 50 μM, potrzebny jest roztwór SPDP o stężeniu 12,5 mM. W przypadku 5 mg SPDP odpowiada to 1,27 ml dimetylosulfotlenku (DMSO).
  9. Dodaj SPDP do interesującego nas białka w rozcieńczeniu 1:100. Umieścić reakcję na wytrząsarce oscylacyjnej w temperaturze pokojowej (RT) na około 1 godzinę.
  10. Aby usunąć nadmiar SPDP i chronić endogenne wiązania dwusiarczkowe w białku w kolejnym etapie redukcji, należy zrównoważyć i przepłukać kolumnę utworzoną w krokach 1,1–1,3 w 100 mM octanu sodu (NaOAc) o pH 5,5 lub utworzyć identyczną kolumnę wyłącznie do użycia w tym buforze.
  11. Po 1 godzinie inkubacji z SPDP odsolić białko na kolumnie zrównoważone w 100 mM NaOAc. Przeprowadzić ten etap w identyczny sposób jak w kroku 1.6, z wyjątkiem użycia 100 mM NaOAc (pH 5,5) jako eluentu. Zbierz ułamki, określ A280 i połącz górne frakcje. Umyj kolumnę w PBS.
  12. Przygotować roztwór 2,5 M naziemnej telewizji cyfrowej (MW = 154 g/mol) w wodzie podwójnie destylowanej (ddH2O). Dodaj 25 mM DTT do połączonych frakcji białka przez 5-10 minut.
  13. Zmierz A280 białka i podziel go przez współczynnik ekstynkcji. Określ również A343. Obliczyć współczynnik wiązania na podstawie molowości białka (A280) i łącznika (A343).
    UWAGA: Wyłącz automatyczną kalibrację A340 w przypadku korzystania ze spektrofotometru nanokroplowego. Pomiar A343 reprezentuje absorbancję grupy 2-tionowej pirydyny (współczynnik ekstynkcji = 7550 M-1), która jest usuwana z sieciownika SPDP przez naziemną telewizję cyfrową. Stosunek molowy łącznika do białka wynoszący 1,2–1,5 jest na ogół osiągany podczas przeprowadzania reakcji z 2,5-molowym nadmiarem SDPD na szerokim zakresie białek.
  14. Uruchom ułamki w puli na kolumnie umytej w PBS zgodnie z powyższym opisem. Zbierz frakcje, określ A280 i połącz ułamki górne. Oznaczyć stężenie białka przez A280 po połączeniu frakcji.
  15. Przygotować DSPE-PEG(2000)-maleimid(1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000)-maleimid. Zostanie on dodany do białka w stosunku molowym 10:1. Przygotuj 100-krotny zapas DSPE-PEG(2000)-Maleimidu, aby osiągnąć pożądane stężenie.
    1. Na przykład, jeśli stężenie białka wynosi 10 μM po kroku 1.14, przygotuj zapas DSPE-PEG(2000)-Maleimidu w temperaturze 10 mM. Ostrożnie odważyć DSPE-PEG(2000)-Maleimid (MW = 3000 g/mol) i dodać odpowiednią ilość DMSO. Wiele rund delikatnego wirowania i sonikacji może spowodować jego całkowite rozpuszczenie.
  16. Oznaczyć całkowitą objętość frakcji z kroku 1.14 i ostrożnie przenieść roztwór do małej (10-25 ml) kolby okrągłodennej (RBF). Dodaj odpowiednią ilość 100x DSPE-PEG(2000)-Maleimidu do białka, aby uzyskać 1x, 10-krotny nadmiar molowy, końcowe stężenie. Delikatnie zamieszaj roztwór, aby upewnić się, że DMSO jest w pełni rozproszone.
  17. Przeprowadzić reakcję przez noc pod azotem w szczelnym RBF. Użyj gumowej przegrody i umieść w dygestorium.
    1. Usuń atmosferę, nakłuwając przegrodę igłą 20 G przymocowaną do strzykawki o pojemności 3 ml na końcu rurki podłączonej do próżni i włącz próżnię na 3–5 sekund.
    2. Zastąp atmosferę azotem. Napełnij balon dołączony do strzykawki o pojemności 3 ml przeciętej na pół azotem i podłącz igłę 20 G. Przebić przegrodę, aby wypełnić atmosferę wewnątrz kolby okrągłodennej azotem. Powtórz usuwanie atmosfery i ponowne zastąpienie azotem i pozostaw przymocowany balon z azotem na noc.
  18. Przygotować oddzielną kolumnę perełkową z usieciowanego żelu dekstranowego o zakresie frakcjonowania 4 000–150 000 Da w szklanej kolumnie chromatograficznej o wymiarach 1,0 cm x 50 cm (zgodnie z krokami 1.1-1.3).
  19. Następnego dnia usunąć białko z kolby okrągłodennej przygotowanej w kroku 1.17 i przejechać (zgodnie z metodą zastosowaną w kroku 1.6) na kolumnę z kulkami w żelu dekstranowym usieciowanym (od kroku 1.18).
    UWAGA: Całkowita ilość do załadowania do kolumny nie powinna przekraczać 2 ml. Jeśli zastosowano większą reakcję, podziel na dwie części i uruchom na oddzielnych kolumnach lub uruchom na kolumnie o większej średnicy.
    1. Zbierz frakcje, określ A280, frakcje puli i określ stężenie białka. Obecność lipidu nie będzie miała wpływu na pomiary.
  20. Końcowe frakcje białka związanego z lipidami należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.

2. Przygotowanie liposomów

  1. Odważyć lipidy: DSPE-PEG(2000) (1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosphoethanolamine-N-[metoksy(glikol polietylenowy)-2000, MW = 2805,5 g/mol; Cholesterol (3b-hydroksy-5-cholesten, 5-cholesten-3b-ol), MW = 386,7 g/mol; i DSPC (1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina), MW = 790,1 g/mol. Stworzyć 5 mg / ml roztwór DSPC, 4 mg / ml roztwór cholesterolu i 2 mg / ml roztwór DSPE-PEG (2000) w chloroformie.
  2. Upewnij się, że stosunek molowy lipidów w liposomach wynosi: 57% DSPC, 38% cholesterolu i 5% DSPE-PEG (2000), jak przedstawiono w tabeli 1.
    UWAGA: Ważne jest, aby kontrolować ilość antygenu na liposomie, która zwykle waha się od 0,01–0,1%. W Tabeli 1 użyto 0,1% koziego anty-mysiego fragmentu IgM Fab połączonego z pegylowanym lipidem. Bardzo ważne jest, aby wziąć pod uwagę 10-krotny nadmiar molowy DSPE-PEG(2000)-maleimidu, który został dodany do białka w kroku 1.15, aby zapewnić, że całkowita ilość pegylowanego lipidu nie przekracza 5%.
  3. Weź pod uwagę końcowe ilości lipidów (μmol) podczas tworzenia lipidów do wytłaczania. W tabeli 1 przedstawiono przykład obliczania molowych stężeń lipidów w celu wytworzenia liposomów przy całkowitym stężeniu lipidów 1,25 μM.
  4. Po obliczeniu prawidłowej ilości każdego lipidu, który ma zostać dodany, połącz wszystko w probówce ze szkła borokrzemianowego o pojemności 12 ml.
  5. Ostrożnie zdmuchnij chloroform.
    1. Za pomocą rurki i strzykawki z igłą o pojemności 3 ml, przygotowanych w kroku 1.17.1, ostrożnie zdmuchnąć chloroform z probówki z azotem. Delikatnie wydmuchaj strumień azotu na roztwór, jednocześnie obracając rurkę drugą ręką. Uważaj, aby zminimalizować rozpryskiwanie lub powodowanie spływania cieczy po boku rurki, ponieważ w następnym kroku może być trudniej wprowadzić ją do roztworu.
  6. Dodaj 100 μl DMSO do każdej probówki i liofilizuj ten roztwór przez noc. Przykryj górną część probówki niestatyczną chusteczką laboratoryjną, zabezpiecz gumką recepturką i zamroź w temperaturze -80 °C.

3. Ekstruzja liposomów

  1. Dodać 1 ml PBS zawierającego białko związane z lipidami do 12 ml probówki zawierającej lipidy. Sonikować roztwór przez około 30 s do 1 minuty w kąpieli wodnej sonikującej. Odpoczywaj przez 5 minut lub dłużej między każdą rundą i powtórz 3-4 razy.
  2. Przygotuj ekstruder zgodnie z zaleceniami producenta.
    1. Dodaj wsporniki filtra do wewnętrznego wspornika membrany, umieść kilka kropli (po 10 μl każda) PBS na folii parafinowej. Za pomocą pęsety chwyć krawędź wspornika filtra i zanurz go w kropli o pojemności 10 μl.
    2. Umieść filtr wewnątrz O-ringu. Zrób to dla obu stron. Za pomocą pęsety chwyć filtr 0,8 μm na krawędzi i zanurz w kropli 10 μl i pokryj zewnętrzną stronę O-ringu PBS. Delikatnie umieść filtr 0.8 μm na O-ringu, aby filtr nie wystawał poza wewnętrzny wspornik membrany.
  3. Umieść blok grzewczy ekstrudera na płycie grzejnej, aby wstępnie podgrzać ekstruder. Ustaw płytę grzejną na niskim poziomie i pozwól, aby blok grzewczy ekstrudera osiągnął żądaną temperaturę. Aby uniknąć potencjalnych problemów z agregacją białek, nie podgrzewaj bloku powyżej 37 °C.
  4. Załaduj sonifikowaną próbkę do jednej ze strzykawek wytłaczających umieszczonych w wytłaczarce. Umieść strzykawkę ekstrudera na drugim końcu ekstrudera. Upewnić się, że tłok pustej strzykawki jest ustawiony na zero. Pusta strzykawka wypełni się, gdy lipid zostanie wytłoczony przez membranę poliwęglanową 0,8 μm. Staraj się unikać przepuszczania pęcherzyków tam iz powrotem przez membranę.
  5. Umieść w pełni zmontowaną wytłaczarkę w bloku grzewczym. Delikatnie wcisnąć tłok napełnionej strzykawki z lipidami do pustej strzykawki. W zależności od stężenia lipidów będzie to trudne do przeforsowania. Powtórz 20 razy.
  6. Wyjmij w pełni zmontowaną wytłaczarkę z bloku grzewczego. Powoli wyjmij napełnioną strzykawkę z ekstrudera, pamiętaj, aby zebrać wszelkie lipidy, które mogą wyciekać podczas wyjmowania. Umieść liposomy w czystej fiolce. Powtórz kroki 3.4–3.6, używając membran poliwęglanowych 0,2 μm i 0,1 μm.
  7. Stwórz usieciowaną kolumnę z kulkami agarozowymi o wymiarach 0,7 x 50 cm2 o zakresie separacji 0,7-10 megadaltonów (MDa) zrównoważonych w PBS. Dodaj liposomy i uruchom jak w kroku 1.6. Frakcje zawierające liposomy będą miały zmniejszoną przepuszczalność światła w zakresie 250–400 nm.
  8. Przechowuj liposomy w temperaturze 4 °C i nie zamrażaj.

4. Strumień wapnia do monitorowania aktywacji limfocytów B przez antygenowe liposomy

  1. Eutanazja myszy przez przedawkowanie dwutlenku węgla (CO2 ) lub izofluranu, zgodnie ze standardowymi procedurami operacyjnymi obowiązującymi w instytucjach. Potwierdź eutanazję myszy przez zwichnięcie szyjki macicy.
  2. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne i tuszę myszy przy użyciu 70% etanolu. Użyj zakrzywionych kleszczyków do tęczówki o długości 10 cm i końcówce 0,8 mm, aby oddzielić skórę pokrywającą klatkę piersiową od klatki piersiowej. Użyj prostych nożyczek preparacyjnych o długości 10 cm, aby wykonać dystalne nacięcie z obustronnym nacięciem.
  3. Użyj zakrzywionych kleszczyków tęczówkowych i nożyczek preparacyjnych, aby usunąć śledzionę z jamy brzusznej. Usuń tkankę tłuszczową otaczającą śledzionę, a następnie umieść ją w stożkowej probówce polistyrenowej RPMI1640 o pojemności 15 ml wypełnionej pożywką zawierającą 1% płodową surowicę cielęcą (FCS) i penicylinę-streptomycynę.
  4. Przenieść śledzionę i pożywkę przez sitko o wielkości 40 μm zamontowane na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Używając gumowej końcówki tłoka strzykawki o pojemności 3 ml, delikatnie zmiażdżyć śledzionę. Umyj sitko komórkowe 40 μm pożywką. Powtarzaj ten proces, aż w sitku do komórek 40 μm pozostanie tylko tkanka tłuszczowa. Przepłucz sito 3-5 ml pożywki, aby zwiększyć regenerację komórek.
  5. Odwirować homogenat komórek przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i dodać 10 ml 1x buforu do lizy RBC do osadu. Pipetować w górę i w dół, pozostawić na 2–3 minuty w temperaturze pokojowej, a następnie odwirować w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  6. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić splenocyty zubożone w krwinki czerwone w 10 ml pożywki. Określ całkowitą liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub innego urządzenia do liczenia komórek. Osadzać komórki przez odwirowanie, jak opisano powyżej.
    UWAGA: Idealne stężenie końcowe niezbędne do obciążenia splenocytów Indo-1 wynosi 10–20 x 106 komórek/ml, ale można zastosować niższe stężenie komórek.
  7. Zawiesić splenocyty w 15 x 106 komórek/ml w buforze ładującym strumień wapnia (pożywka RPMI1640 zawierająca 1% FCS, 10mM kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES), 1mM chlorek magnezu (MgCl2), 1mM glikol etylenowy-bis(β-aminoetylowy eter)-N,N,N',N'--tetraoctowy kwas (EGTA) i 5% penicyliny-streptomycyny). Dodać 1,5 μM Indo-1 z 1 mM roztworu podstawowego DMSO, kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu wymieszania. Chronić przed światłem i inkubować komórki w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  8. Po 30 minutowej inkubacji dodać 5x większą ilość buforu ładującego topnik wapnia. Wirować przy 300 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
  9. Do bramkowania na komórkach B wybarwić komórki 1:200 anty-mysim CD5-PE i anty-mysim 1:200 B220-PE/Cy7 w 0,5 ml buforu ładującego w temperaturze 4 °C przez 20 minut, chroniąc przed światłem.
  10. Przemyć splenocyty w buforze ładującym strumień wapnia i odwirować przy 300 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić komórki przy 10–20 x 106 komórek/ml w buforze do pracy strumienia wapnia (zrównoważony roztwór soli Hanka (HBSS) zawierający 1% FCS, 1 mM MgCl2 i 1 mM chlorku wapnia (CaCl2)). Przechowywać na lodzie, chronić przed światłem do czasu gotowości do pracy na cytometrze przepływowym.
  11. Konfiguracja cytometrii przepływowej z kontrolą niebarwionego i pojedynczego barwienia w celu kompensacji.
    1. Uruchom poplamione komórki, aby odpowiednio ustawić bramki (patrz Rysunek 2A). Ustaw wykres Indo-1 (fioletowy) kontra Indo-1 (niebieski), dostosuj napięcia w kanałach Indo-1, aby umieścić barwienie komórek pod kątem 45–60°, aby zmaksymalizować stosunek sygnału do szumu Indo-1 fioletowy : niebieski zmiana proporcji po stymulacji komórek B.
      UWAGA: Upewnij się, że napięcia nie są zbyt wysokie, tak aby znaczny procent ogniw (>5%) znajdował się na górze wykresu.
    2. Utwórz bramkę ukośną, która otacza lewą górną część (fioletową + niebieską-) wykresu, tak aby bez stymulacji <10% komórek znajdowało się w bramce, która powinna wzrosnąć do >75% po stymulacji.
  12. Dodać 0,5 ml komórek do zakorkowanej probówki z polistyrenu o okrągłym dnie o pojemności 5 ml (probówka do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS)) i ogrzewać komórki do 37 °C przez 3–5 minut w łaźni wodnej. Umieść rurkę FACS w komorze z płaszczem wodnym o temperaturze 37 °C, która jest podłączona do recyrkulacyjnej łaźni wodnej.
    1. Uruchom rurkę w płaszczu wodnym cytometru przepływowego i rozpocznij akwizycję, bez przechowywania danych, przy około 5 000–10 000 zdarzeń / s. Gdy komórki się ustabilizują (15–30 s), zainicjuj akwizycję danych i zbieraj dane przez co najmniej 10 sekund, aby ustalić tło.
    2. Po upływie 10 sekund szybko wyjmij rurkę z cytometru przepływowego, dodaj stymulację (5-50 μM antygenowych liposomów w 2-20 μl), wir impulsowy i włóż probówkę FACS z powrotem do cytometru przepływowego. Utrzymuj akwizycję i przechowywanie danych przez ten czas i zbieraj dane przez 3–5 minut.
  13. Analizuj dane w odpowiednim oprogramowaniu analitycznym w ramach funkcji kinetycznych.

5. Przygotowanie ekstraktu z orzeszków ziemnych

  1. Ekstrahować białka orzeszków ziemnych przez zmieszanie mąki z orzeszków ziemnych w stosunku 1:5 (wag. do obj.) soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) z 1 M chlorkiem sodu (NaCl). Mieszać roztwór na mieszadle magnetycznym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, utrzymując pH 8,5.
  2. Odwirować roztwór przy 3 000 x g przez 45 minut w temperaturze 4 °C. Dekantować i sterylizować filtrem – sterylizować kolejno przez filtr 0,4 μm, a następnie przez filtr 0,2 μm. Oznaczyć stężenie białka za pomocą testu kwasu bicinchoninowego (BCA), używając albuminy surowicy bydlęcej (BSA) jako wzorca.
  3. Zredukować i zdenaturować próbkę białek orzeszków ziemnych za pomocą 50 mM ditiotreitolu (DTT) w buforze zawierającym dodecylowy siarczan litu o pH 8,4, co pozwala na maksymalną aktywność środka redukującego i ogrzewać w temperaturze 70 °C przez 10 minut.
  4. Uruchom 10 μg denaturowanego białka orzeszków ziemnych na prefabrykowanym żelu poliakrylamidowym Bis-Tris 4–12%, zaprojektowanym w celu uzyskania optymalnego gradientu separacji żelu z wstępnie wybarwionym wzorcem o masie cząsteczkowej.
  5. Zabarwić żel dwusiarczanowanym trifenylometanem i odbarwić ddH2O. Zidentyfikować znane główne alergeny orzeszków ziemnych Ara h 1, 2 i 3 w preparatach ekstraktowych. Ara h 1 pojawia się przy 63 kDa, Ara h 2 powinna pojawić się jako dwie izoformy przy 17 i 19 kDa, a Ara h 3 pojawia się przy 37 kDa (podjednostka kwasowa).

6. Uczulenie myszy na orzeszki ziemne

  1. Zawiesić 1 mg toksyny w 1 ml ultraczystej wody. Przygotuj 200 μl rozcieńczonego ekstraktu z orzeszków ziemnych zawierającego 2 mg białka orzeszków ziemnych i 10 μg toksyny w PBS.
  2. Każdej 4-5 tygodniowej samicy myszy BalB/cJ należy podać 200 μl ekstraktu z orzeszków ziemnych zawierającego toksynę (2 mg białka orzeszków ziemnych i 10 μg toksyny) przez zgłębnik doustny. Powtarzaj raz w tygodniu przez trzy tygodnie (tj. Dni 0, 7 i 14).
  3. Podawać 300 μl rozcieńczonego ekstraktu z orzeszków ziemnych (zawierającego 5 mg białka orzeszków ziemnych i 10 μg toksyny) przez zgłębnik doustny każdej myszy w czwartym tygodniu (tj. w dniu 21).

7. Rzuć wyzwanie myszom z ekstraktem z orzeszków ziemnych

  1. W 28 dniu przygotuj ekstrakt z orzeszków ziemnych do końcowego stężenia 1 mg/ml w PBS. Zmierz wyjściową temperaturę ciała za pomocą termometru doodbytniczego (około 37,5–38,5 °C). Podawać 200 μl (200 μg) ekstraktu z orzeszków ziemnych we wstrzyknięciu dootrzewnowym (i.p.).
  2. Mierz temperaturę ciała termometrem doodbytniczym co 15 minut przez 1 godzinę po wstrzyknięciu. Spadek temperatury ciała wskazuje na alergię na orzeszki ziemne.
    UWAGA: Hipotermia jest cechą charakterystyczną anafilaksji u myszy. To wyzwanie wykaże, że myszy są uczulone na orzeszki ziemne. Zazwyczaj u 90% myszy Balb/cJ, które przechodzą protokół uczuleniowy, rozwijają się reakcje alergiczne podczas prowokacji, charakteryzujące się spadkiem temperatury o co najmniej 2-3 °C.

8. Izolacja splenocytów od myszy alergicznych i transfer adopcyjny

  1. Wyizoluj splenocyty od myszy naiwnych i alergicznych na orzeszki ziemne.
    1. W 30 dniu poddaj eutanazji zarówno naiwne, jak i potwierdzone myszy uczulone na orzeszki ziemne, podając 3 l / min CO2 w komorze gazowej. Potwierdź eutanazję myszy przez obustronną torakotomię. Sterylizuj narzędzia chirurgiczne i tuszę myszy przy użyciu 70% etanolu. Użyj kleszczy, aby oddzielić skórę pokrywającą klatkę piersiową od klatki piersiowej. Użyj prostych nożyczek preparacyjnych, aby wykonać obustronne nacięcie, łamiąc lewe i prawe żebro.
    2. Użyj kleszczy i nożyczek preparacyjnych, aby wydobyć śledzionę z jamy brzusznej. Usuń tkankę tłuszczową otaczającą śledzionę przed umieszczeniem w stożkowej probówce polistyrenowej o pojemności 15 ml, wypełnionej 10 ml pożywki RPMI 1640.
    3. W sterylnym okapie z przepływem laminarnym wlej śledzionę i pożywkę do polistyrenowej szalki Petriego o średnicy 35 mm. Przechowuj naiwne i alergiczne splenocyty na oddzielnych szalkach Petriego i pożywkach podczas izolacji komórek. Użyj wysterylizowanych kleszczy i nożyczek preparacyjnych, aby pokroić śledzionę na trzy części i wrócić na szalkę Petriego.
    4. Używając szorstkiej, matowej krawędzi dwóch szklanych szkiełek mikroskopowych, delikatnie homogenizuj (w RPMI) kawałki śledziony, aż między szkiełkami pozostanie biała tkanka. Zmienianie slajdów między grupami.
    5. Przenieść homogenat komórek z płytki Petriego przez sitko o wielkości 70 μm umieszczone na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Przepuścić pozostałe fragmenty śledziony przez sitko za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 1 ml. Przepłucz sito 5 ml RPMI, aby zmaksymalizować regenerację komórek. Przenieść filtrat do polistyrenowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml i odwirować (450 x g, 10 min, RT).
    6. Odessać supernatant i dodać osad komórek zawiesić do 2 ml buforu do lizy czerwonych krwinek (0,83% chlorku amonu w 10 mM buforze Tris, pH 7,2). Mieszać i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2–3 minuty. Dodać 10 ml PBS-2% FBS i odwirować przy 300 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej.
    7. Ponownie umyj komórki 12 ml PBS-2% FBS, aby całkowicie usunąć wszelkie pozostałości chlorku amonu i odwiruj przy 300 x g przez 7 minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki RPMI 1640. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego analizatora hematologicznego.
  2. Za pomocą igły o wadze 27 G, 5/8 cala na strzykawce insulinowej o pojemności 1 ml, wstrzyknij dożylnie 15 x 106 alergicznych lub nieuszkodzonych splenocytów wyekstrahowanych zgodnie z powyższym opisem (w 200 μl) przez żyłę ogonową naiwnym (niewrażliwym) myszom.

9. Wstrzykiwanie myszom 2 liposomów antygenowych

  1. Przygotuj liposomy Ah2 zawierające 0,1% Ah2 w 2,5 mM lipidu. Do obliczenia stężenia białka współczynnik ekstynkcji Ah2 wynosi 15 000 M-1. Rozcieńczyć liposomy do 300 μM w sterylnym PBS.
  2. Jednego dnia po przybranym przeniesieniu (dzień 31) alergicznych lub nieleczonych splenocytów, wstrzyknij dożylnie 200 μl PBS lub liposomów antygenowych Ah2 (300 μM) zawierających łącznie 1,38 μg Ah2 przez żyłę ogonową myszy BALB/cJ, które otrzymały splenocyty w kroku 8.2.

10. Wzmocnienie i wyzwanie myszy z Ara h 2

  1. Dwa tygodnie po wstrzyknięciu liposomów Ah2, w 45 dniu, użyj lancetu zwierzęcego o średnicy 4 mm, aby zebrać 50–200 μl krwi z połączenia podżuchwowego myszy. Zebrać krew do probówki separatora surowicy bez heparyny; Oddzielić surowicę przez odwirowanie w stężeniu 6 000 x g przez 15 minut. Pobraną surowicę należy później wykorzystać do pomiaru przeciwciał specyficznych dla antygenu.
  2. W 46 dniu, dwa tygodnie po wstrzyknięciu myszom liposomów (krok 9.2), wzmocnij myszy przez wstrzyknięcie dożylnie 200 μl PBS lub 200 μg rozpuszczalnego Ah2 (oczyszczonego zgodnie z wcześniejszym opisem16).
  3. W 60 dniu zbierz 50-200 μl krwi z połączenia podżuchwowego myszy i przetwarzaj krew zgodnie z wcześniejszym opisem.
  4. W 61 dniu należy rzucić wyzwanie każdej grupie myszy za pomocą wstrzyknięcia dożylnego 200 μl 300 μg rozpuszczalnego Ah2. Mierz temperaturę ciała za pomocą sondy doodbytniczej co 15 minut, jak w sekcji 7.

11. Kwantyfikacja Ara h 2-specyficznych IgE i IgG1 metodą ELISA

  1. Pokryć 96-dołkową płytkę zgodną z testem immunoenzymatycznym (ELISA) 100 μL HSA-DNP (hapten 2,4-dinitrofenylowy sprzężony z albuminą surowicy ludzkiej, 20 μg/ml) dla krzywej wzorcowej lub Ah2 (5 μg/ml) dla próbek surowicy pobranych w krokach 10.1 i 10.3, rozcieńczonych w buforze powlekającym (50 mM bufor węglanowo-wodorowęglanowy, pH 9,6) w temperaturze 4 °C przez noc lub 37 °C przez >1 h.
  2. Przemyć trzykrotnie 200 μL PBS-T (PBS z 0,05% Tween-20) i zatkać studzienki 200 μL PBS-T zawierającymi 2% BSA w temperaturze 37 °C przez >2 h.
  3. W przypadku testu ELISA IgE swoistego dla Ah2 dodać 50 μl wzorców IgE-anty-DNP (2–0,002 μg/ml, przygotowanych z seryjnych rozcieńczeń 1:2) lub próbki surowicy myszy (rozcieńczenie 1:20) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. W przypadku testu ELISA IgG1 specyficznego dla Ah2 dodać 100 μl oczyszczonych wzorców IgG1-anty-DNP (2–0,002 μg/ml, przygotowanych z seryjnych rozcieńczeń 1:2) lub próbek surowicy myszy (rozcieńczenie 1:500) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  4. Umyć trzykrotnie 200 μl PBS-T. W przypadku testu ELISA IgE swoistego dla Ah2 dodać 100 μl owczych anty-mysich IgE (0,5 μg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę. W przypadku testu ELISA IgG1 specyficznego dla Ah2 dodać 100 μl HRP Goat anty-mysiej IgG1 (rozcieńczonej 1:40 000 w PBS-T-2% BSA). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  5. Umyć trzykrotnie 200 μl PBS-T. W przypadku testu ELISA IgE swoistego dla Ah2 dodać 100 μl biotynylowanej IgG przeciwko owcom (0,5 μg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut. W przypadku testu ELISA IgG1 specyficznego dla Ah2 przejdź do kroku 11.7.
  6. Umyć trzykrotnie 200 μl PBS-T. W przypadku testu ELISA IgE specyficznego dla Ah2 dodać 100 μl neutralnie naładowanej peroksydazy awidynowo-chrzanowej (np. NeutrAvidin-HRP, 0,3 μg/ml) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 min.
  7. Dodać 100 μl substratu 3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB), inkubować 10-15 minut lub do momentu, aż próbki zmienią kolor na ciemnoniebieski, a następnie dodać 100 μl roztworu zatrzymującego TMB. Odczytać tabliczkę przy długości fali 450 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Koniugację białka docelowego z DSPE-PEG(2000) można wykazać poprzez przeprowadzenie redukującego elektroforezy, co wykaże wzrost masy cząsteczkowej w porównaniu z niekoniugowanym białkiem. Rycina 1A przedstawia reprezentatywny żel z koniugacją fragmentu F(ab) przeciwciał antymysich IgM z PEG-DSPE, wykazując przesunięcie prążka o 2–3 kDa dla zdenaturowanego białka. Należy zauważyć, że zmodyfikowanych wydaje się być około 50% białka, co jest spodziewane, biorąc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawione tutaj metody są ogólnym protokołem koniugacji białka z lipidem, który umożliwia wyświetlanie białka na liposomalnych nanocząstkach. W przypadku bardzo dużych białek wielopodjednostkowych protokół ten może mieć ograniczoną użyteczność. Idealną metodą byłoby wprowadzenie znacznika specyficznego dla miejsca, który umożliwia zastosowanie biorthogonalnej strategii łączenia chemicznego. W przypadku rekombinowanej ekspresji białka można to osiągnąć przy użyciu dostępnych strategii specyficznych dla miejsca

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie było wspierane przez granty z Departamentu Obrony (W81XWH-16-1-0302 i W81XWH-16-1-0303).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolektor frakcji model 2110BioRad7318122
CholestrolSigmaC8667Sigma grade 99%
SPDPThermo Fisher Scientific21857
DSPC Avanti850365
DSPE-PEG 18:0Avanti880120
DSPE-PEG MaleimideAvanti880126
EkstruderAvanti6100001 mL strzykawka z uchwytem/blokiem grzewczym
Filtry 0,1 i mikro; mAvanti
Filtry 0,8 i mikro; mAvanti610009
10 mm Wsporniki filtracyjneAvanti6100014
Szklana kolba okrągłodennaSigmaZ100633
Korki obrotoweThermo Fisher ScientificP-301398
RurkaThermo Fisher ScientificP-198194
Leur LockThermo Fisher Scientifick4201634503
Koraliki Sephadex G50GE Life Sciences17004201
Koraliki Sephadex G100GE Life Sciences17006001
Inaktywowana termicznie surowica dla cieląt płodowychThermo Fisher Scientific10082147
HEPES (1 m)Thermo Fisher Scientific15630080
EGTASigmaE3889
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140122
1x bufor do lizy RBCThermo Fisher Scientific00-4333-57
Indo-1InvitrogenI1203
CD5-PEBioLegend100608
B220-PE-CY7BioLegend103222
HBSSThermo Fisher Scientific14170112bez wapnia i magnezu
MgCl2SigmaM8266
CaCl2SigmaC4901
Fab anty-mysie IgMJackson ImmunoResearch115-007-020
F(ab')2 anty-mysie IgMJackson ImmunoResearch115-006-020
Mąka orzechowaGolden Peanut Co.52127112% tłuszczu jasne pieczenie, 50% białka
Igły do karmienia zwierzątCadence Science792022g x 1,5", 1,25 mm - proste
Termometr z mikrosondąPhysitempBAT-12
Sonda doodbytnicza dla myszyPhysitempRet-3
Toksyna, od VibrioList Biological Laboratories, Inc.100B
Zestaw do oznaczania białek BCAPierce23225
Bufor węglanowo-wodorowęglanowySigmaC3041
Roztwór zatrzymujący TMBKPL50-85-06
SureBlue TMB Podłoże peroksydazy mikrostudzienkowejKPL5120-0077
96-dołkowa płytka Immulon 4HBXThermo Scientific3855
Oczyszczony rozpuszczalny Ara h 2N / AN / Aoczyszczony jak w: Sen, et al., 2002, Journal of Immunology
HSA-DNPSigmaA-6661
Mysia IgE anty-DNPDokładny chemicznyBYA60251
owce anty-mysie IgEMiejsce wiązaniaPC284
Biotynylowany osioł anty-owczy IgGDokładnyJNS065003 chemiczny
Białko NeutrAwidyna, HRPThermoFisher Scientific31001
Mysia IgG1 anty-DNPDokładnychemiczny MADNP105
HRP Goat anty-mysie IgG1Southern Biotech1070-05
1 mL Strzykawki insulinoweBD329412U-100, 0,40 mm (27 G) x 16,0 mm (5/8")
Szkiełka mikroskopowe SuperfrostFisher Scientific12-550-1425 mm x 75 mm x 1,0 mm
ACK Lysing Buffergibco firmy Life TechnologiesA10492-01100 mL
RPMI 1640 MediumThermo Fisher Scientific11875093500 mL
Sitko do komórekCorning35235070 μ m Nylon, Biały, Sterylny, Pakowany pojedynczo
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Żele białkoweInvitrogenNP0322BOX10 żeli
Bufor NuPAGE LDS, 4xInvitrogenNP0008250 mL
SeeBlue Plus2 Wstępnie barwiony standardInvitrogenLC5925500 µ L
Bufor do biegania NuPAGE MES/SDS, 20xInvitrogenNP0002500 mL
GelCode Blue StainThermo Scientific24590500 mL
610005 bez azydku

Bibliografia

  1. Gupta, R. S., et al. The prevalence, severity, and distribution of childhood food allergy in the United States. Pediatrics. 128 (1), e9-e17 (2011).
  2. Sicherer, S. H., Munoz-Furlong, A., Godbold, J. H., Sampson, H. A. US prevalence of self-reported peanut, tree nut, and sesame allergy: 11-year follow-up. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (6), 1322-1326 (2010).
  3. Kim, E. H., et al. Sublingual immunotherapy for peanut allergy: clinical and immunologic evidence of desensitization. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 640-646 (2011).
  4. Vickery, B. P., et al. Sustained unresponsiveness to peanut in subjects who have completed peanut oral immunotherapy. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 133 (2), 468(2014).
  5. Jones, S. M., et al. Epicutaneous immunotherapy for the treatment of peanut allergy in children and young adults. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (4), 1242(2017).
  6. Varshney, P., et al. A randomized controlled study of peanut oral immunotherapy: clinical desensitization and modulation of the allergic response. Journal of Allergy Clinical Immunology. 127 (3), 654-660 (2011).
  7. Anagnostou, K., et al. Assessing the efficacy of oral immunotherapy for the desensitisation of peanut allergy in children (STOP II): a phase 2 randomised controlled trial. Lancet. 383 (9925), 1297-1304 (2014).
  8. Sampson, H. A., et al. Effect of Varying Doses of Epicutaneous Immunotherapy vs Placebo on Reaction to Peanut Protein Exposure Among Patients With Peanut Sensitivity: A Randomized Clinical Trial. The Journal of the American Medical Association. 318 (18), 1798-1809 (2017).
  9. Bednar, K. J., et al. Human CD22 Inhibits Murine B Cell Receptor Activation in a Human CD22 Transgenic Mouse Model. Journal Immunology. 199 (9), 3116-3128 (2017).
  10. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. Journal Clinical Investigation. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  11. Orgel, K. A., et al. Exploiting CD22 on antigen-specific B cells to prevent allergy to the major peanut allergen Ara h 2. Journal Allergy Clinical Immunology. 139 (1), 366-369 (2017).
  12. Smarr, C. B., Hsu, C. L., Byrne, A. J., Miller, S. D., Bryce, P. J. Antigen-fixed leukocytes tolerize Th2 responses in mouse models of allergy. Journal of Immunology. 187 (10), 5090-5098 (2011).
  13. Kulis, M., et al. The 2S albumin allergens of Arachis hypogaea, Ara h 2 and Ara h 6, are the major elicitors of anaphylaxis and can effectively desensitize peanut-allergic mice. Clinical and Experimental Allergy. 42 (2), 326-336 (2012).
  14. Dang, T. D., et al. Increasing the accuracy of peanut allergy diagnosis by using Ara h 2. Journal of Allergy Clinical Immunology. 129 (4), 1056-1063 (2012).
  15. Loughrey, H. C., Choi, L. S., Cullis, P. R., Bally, M. B. Optimized procedures for the coupling of proteins to liposomes. Journal Immunological Methods. 132 (1), 25-35 (1990).
  16. Sen, M., et al. Protein structure plays a critical role in peanut allergen stability and may determine immunodominant IgE-binding epitopes. Journal of Immunology. 169 (2), 882-887 (2002).
  17. Krall, N., da Cruz, F. P., Boutureira, O., Bernardes, G. J. Site-selective protein-modification chemistry for basic biology and drug development. Nature Chemistry. 8 (2), 103-113 (2016).
  18. Jimenez-Saiz, R., et al. Lifelong memory responses perpetuate humoral TH2 immunity and anaphylaxis in food allergy. Journal Allergy and Clinical Immunology. 140 (6), 1604-1615 (2017).
  19. Moutsoglou, D. M., Dreskin, S. C. Prolonged Treatment of Peanut-Allergic Mice with Bortezomib Significantly Reduces Serum Anti-Peanut IgE but Does Not Affect Allergic Symptoms. International Archives of Allergy and Immunology. 170 (4), 257-261 (2016).
  20. LaMothe, R. A., et al. Tolerogenic Nanoparticles Induce Antigen-Specific Regulatory T Cells and Provide Therapeutic Efficacy and Transferrable Tolerance against Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Frontiers in Immunology. 9, 281(2018).
  21. Srivastava, K. D., et al. Investigation of peanut oral immunotherapy with CpG/peanut nanoparticles in a murine model of peanut allergy. J Allergy Clin Immunol. 138 (2), 536-543 (2016).
  22. Bellinghausen, I., Saloga, J. Analysis of allergic immune responses in humanized mice. Cellular Immunology. 308, 7-12 (2016).
  23. Pillai, S., Mattoo, H., Cariappa, A. B cells and autoimmunity. Curr Opin Immunol. 23 (6), 721-731 (2011).
  24. Mantegazza, R., Cordiglieri, C., Consonni, A., Baggi, F. Animal models of myasthenia gravis: utility and limitations. International Journal of General Medicine. 9, 53-64 (2016).
  25. Berman, P. W., Patrick, J. Experimental myasthenia gravis. A murine system. J Exp Med. 151 (1), 204-223 (1980).
  26. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  27. Derksen, V., Huizinga, T. W. J., van der Woude, D. The role of autoantibodies in the pathophysiology of rheumatoid arthritis. Seminars in Immunopathology. 39 (4), 437-446 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Nanocząsteczki liposomalnealergen Ara h 2model alergii na orzeszki ziemnetransfer adopcyjnyizolacja splenocytówcytometria przepływowapomiar przepływu wapniadetekcja metodą ELISAekstruzja liposomów
Liposomy antygenowe do wytwarzania przeciwciał specyficznych dla choroby
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.