Artykuł metodologiczny

Izolacja i decelularyzacja całej trzustki świni

11.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58302

⸱

10 października 2018

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, Institute of Clinical Sciences, Sahlgrenska Academy, University of Gothenburg, 2The Transplant Institute, Sahlgrenska University Hospital

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Inżynieria tkankowa całej trzustki jest wyzwaniem ze względu na jej funkcje zewnątrzwydzielnicze i endokrynne. Przedstawiamy metodę preparacji nienaruszonej trzustki świni oraz proces udanej decelularizacji poprzez perfuzję detergentów Triton X-100, deoksycholanu sodu i dezoksyrybonukleazy.

Streszczenie

Inżynieria tkankowa całej trzustki może poprawić obecne metody leczenia cukrzycy. Ostatecznym celem jest inżynieria tkankowa trzustki z allogenicznego lub ksenogenicznego źródła z komórkami ludzkimi. Demonstracja metod skutecznego preparowania, decelularyzacji i recelularyzacji trzustki świń może przynieść korzyści w tej dziedzinie. Podobnie jak ludzka trzustka, trzustka świni ma specjalny układ anatomiczny z trzema płatami (śledzionowym, dwunastnicy i połączeniem) zaokrąglonymi przez dwunastnicę i jelito cienkie. Płat dwunastnicy trzustki łączy się z dwunastnicą kilkoma małymi naczyniami krwionośnymi. Inżynieria tkankowa trzustki jest skomplikowana ze względu na jej zewnątrzwydzielniczy i endokrynologiczny charakter. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół preparacji całej trzustki świni i decelularizacji jej detergentami, zachowując jednocześnie jej strukturę i niektóre składniki macierzy zewnątrzkomórkowej. Aby uzyskać całkowitą perfuzję, aortę wybiera się jako wlot, a żyłę wrotną jako ujście. Pozostałe naczynia krwionośne (tętnica wątrobowa, żyła śledzionowa, tętnica śledzionowa, tętnica krezkowa i drzewo żyłowe) oraz przewód żółciowy są podwiązane. Aby zapobiec tworzeniu się skrzepliny, świnia jest heparynizowana i natychmiast po rozbiorzeniu narząd jest przepłukiwany zimną heparyną. Aby zahamować działanie enzymów zewnątrzwydzielniczych, decelularyzacja trzustki jest ustawiona na 4 °C. Decelularyzacja odbywa się przez perfuzję Triton X-100, deoksycholanu sodu i dezoksyrybonukleazy, z przerywanym i końcowym intensywnym płukaniem. Przy udanej decelularyzacji trzustka wydaje się biała, a ocena histologiczna z hematoksyliną i eozyną wykazuje brak jąder z zachowaną strukturą macierzy zewnątrzkomórkowej. W ten sposób proponowana metoda może być stosowana do skutecznego preparowania i decelularyzacji całej trzustki świni.

Wprowadzenie

Cukrzyca charakteryzuje się obecnością podwyższonego poziomu glukozy we krwi. Jest uznawany za główne wyzwanie dla zdrowia publicznego w większości krajów1. Wysoki poziom glukozy we krwi wpływa na naczynia krwionośne i układ nerwowy, powodując uszkodzenie oczu, serca i nerek oraz niedokrwienie kończyn. Tradycyjne metody leczenia obejmują zastrzyki z egzogennej insuliny, leki i zmiany stylu życia. Odkładając na bok lekarstwo na tę chorobę, w niektórych przypadkach dostępne metody leczenia nie są w stanie utrzymać insuliny na poziomie terapeutycznym, co prowadzi do hiperglikemii. Chociaż przeszczepienie wysp trzustkowych lub całej trzustki eliminuje chorobę, nie jest to powszechne z powodu niedoboru odpowiednich narządów dawcy oraz z powodu ryzyka i trudności związanych z immunosupresją i enkapsulacją2.

Obecne ulepszenia w dziedzinie inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej są w stanie dostarczyć rozwiązania tych problemów. Dzięki technice decelularyzacji materiał komórkowy od dawcy ludzkiego lub zwierzęcego może zostać usunięty, podczas gdy ważne białka macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), czynniki wzrostu i cząsteczki sygnałowe są zachowane w rusztowaniu. Takie rusztowania mogą być potencjalnie przeszczepiane bez konieczności immunosupresji, w celu przywrócenia funkcji narządu po recelularyzacji własnymi nieimmunogennymi komórkami macierzystymi biorcy3,4. Organy inżynierii tkankowej ze źródeł allogenicznych lub ksenogenicznych mogą być wykorzystane w transplantacji klinicznej, ponieważ główne białka macierzy zewnątrzkomórkowej są zachowane między gatunkami i mogą nie zostać odrzucone po przeszczepie5.

Decelularyzacja to dobrze zbadana metoda polegająca na optymalnym wykorzystaniu sił fizycznych, chemicznych detergentów i enzymów w warunkach fizjologicznych w celu usunięcia komórek i materiału jądrowego z tkanki lub organu. Recelularyzacja to procedura polegająca na wysiewaniu komórek z powrotem do narządu bezkomórkowego. Jest to intelektualnie trudna procedura, wymagająca dużej liczby komórek, optymalnej strategii wysiewu komórek i systemu bioreaktora do hodowli narządu w fizjologicznie akceptowalnych warunkach, takich jak temperatura, ciśnienie i gazy6.

Trzustka może być uważana za trudną tkankę dla inżynierii tkankowej ze względu na jej zdolności zewnątrzwydzielnicze i endokrynologiczne. Tkanka zewnątrzwydzielnicza wydziela kilka enzymów trawiennych, podczas gdy część endokrynna wydziela hormony, w tym insulinę. Decelularyzacja nienaruszonych trzustek z mouse7,8, human9 i pig10 została już zgłoszona przy użyciu enzymów (trypsyna, dezoksyrybonukleaza [DNaza]) i niejonowych (Triton X-100) oraz detergentów jonowych (deoksycholan sodu [SDC] i dodecylosiarczan sodu [SDS]). Jednak postępując zgodnie z opublikowanymi protokołami, zmagaliśmy się z udaną sekcją oraz całkowitą perfuzją i decelularyzacją przy zachowaniu struktury ECM. Spekulowaliśmy, że detergenty stosowane podczas decelularyzacji powodują lizę komórek, uwalniając w ten sposób enzymy trawienne do narządu. Uwolnione enzymy spowodują nieodwracalne uszkodzenie rusztowania ECM i sprawią, że będzie ono nieefektywne w decelularyzacji i recelularyzacji. Opracowanie metody, która skutecznie decellularyzacja trzustki przy jednoczesnym hamowaniu działania enzymów trawiennych może rozwiązać ten problem. Wybraliśmy strategię Peloso i wsp., polegającą na decelularyzacji trzustki w niskiej temperaturze, chociaż nie poinformowali, dlaczego stosuje się niską temperaturę9. W tym samym czasie zaprojektowaliśmy strategię preparacji z modyfikacjami Taylor i wsp., wybierając aortę jako wlot perfuzyjny nad pniem trzewnym (CT) i tętnicą krezkową górną (SMA)11.

W niedawno opublikowanym artykule12, demonstrujemy metodę skutecznej izolacji i decelularyzacji trzustki świń przy jednoczesnym zachowaniu niektórych składników ECM. W tym artykule przedstawiono szczegółowy opis, jak przeprowadzić sekcję całej trzustki świni zawierającej płaty śledziony, dwunastnicy i połączeń, a także przedstawiono krok po kroku protokół udanej decelularyzacji.

Protokół

Przeprowadzona tutaj sekcja trzustki świni oraz procedura decelularyzacji są zgodne z wytycznymi etycznymi Uniwersytetu w Göteborgurgu.

1. Przygotowanie układu do decelularyzacji

  1. Za pomocą silikonowych rurek o wymiarach 3 x 5 mm należy połączyć szeregowo pojemnik wlotowy z detergentem z pompą perystaltyczną, a następnie z trzustką znajdującą się w komorze organowej. poprzez odgazowywacz (patrz Rysunek 1). Podłącz złącze Luer male do wolnego końca rurki w komorze organowej.
  2. Używając kolejnej rurki silikonowej o wymiarach 3 x 5 mm, połącz komorę z organem z pojemnikiem odpływowym detergentu poprzez pompa perystaltyczna do zbierania przepłukanego detergentu.
  3. Podłączyć nieoznakowaną pipetę o pojemności 2 ml do wolnych końców rurek w pojemniku wlotowym i pojemniku wylotowym detergentu.
  4. Utrzymać cały układ w temperaturze 4 °C.

Układ do decelularyzacji organu; pompa perystaltyczna, degazer, komora organowa do przetwarzania tkanki.
Rysunek 1: Przygotowanie układu perfuzyjnego. Za pomocą silikonowej rurki o wymiarach 3 x 5 mm, zgodnie z przedstawionym schematem, należy połączyć szeregowo pojemnik z detergentem wlotowym z pompą perystaltyczną, degazerem i komorą organową. Czarne strzałki wskazują kierunek przepływu z pojemnika z detergentem wlotowym do komory organowej. W celu odprowadzenia detergentu należy użyć drugiej silikonowej rurki 3 x 5 mm i połączyć komorę organową poprzez pompę perystaltyczną z pojemnikiem z detergentem wylotowym. Czerwone strzałki wskazują kierunek przepływu z komory organowej do pojemnika z detergentem wylotowym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie roztworów do decelularyzacji

  1. Roztwór 1 (bufor fosforanowo-solny [PBS]): do 1 L wody ultrapure dodać 8 g (137 mM) chlorku sodu, 0,2 g (2,7 mM) chlorku potasu, 1,44 g (10 mM) fosforanu sodu oraz 0,24 g (1,8 mM) fosforanu potasu i mieszać do całkowitego rozpuszczenia. pH dostosować do poziomu 7,4 za pomocą kwasu solnego (HCl). Łącznie wymagane jest 3,2 L tego roztworu.
  2. Roztwór 2 (PBS + heparyna): do 1 L Roztworu 1 dodać 3,4 mL heparyny (17 jednostek międzynarodowych [IU]/mL). Roztwór przygotować bezpośrednio przed użyciem i przechowywać w lodzie do schłodzenia. Łącznie wymagane jest 1,2 L tego roztworu.
  3. Roztwór 3 (woda ultrapure + azydki sodu + etylenodiaminotetraoctan sodu [EDTA]): do 1 L wody ultrapure dodać 1,86 g (5 mM) EDTA oraz 200 mg (0,02%) azydku sodu. Mieszać do rozpuszczenia soli. Przed użyciem schłodzić roztwór do 4 °C. Łącznie wymagane jest 22 L tego roztworu.
  4. Roztwór 4 (PBS + azydki sodu + EDTA): do 1 L Roztworu 1 dodać 200 mg (0,02%) azydku sodu oraz 1,86 g (5 mM) EDTA. Mieszać do rozpuszczenia soli. Przed użyciem schłodzić roztwór do 4 °C. Łącznie wymagane jest 1 L tego roztworu.
  5. Roztwór 5 (woda ultrapure + azydki sodu): do 1 L wody ultrapure dodać 200 mg (0,02%) azydku sodu. Mieszać do rozpuszczenia soli. Przed użyciem schłodzić roztwór do 4 °C. Łącznie wymagane jest 260 L tego roztworu.
    UWAGA: EDTA tworzy osad w obecności SDC, dlatego został pominięty w Roztworze 5, ponieważ będzie on stosowany do bezpośredniego przemywania przed i po obróbce SDC.
  6. Roztwór 6 (SDC + Triton X-100): do 940 mL wody ultrapure dodać 40 g (4%) SDC, 60 mL (6%) Triton X-100, 200 mg (0,02%) azydku sodu oraz 69,6 mg (0,4 mM) fluorku fenylometylosulfonylowego (PMSF). Mieszać do rozpuszczenia. Przed użyciem schłodzić roztwór do 4 °C. PMSF dodać bezpośrednio przed użyciem. Łącznie wymagane jest 9,6 L tego roztworu.
  7. Roztwór 7 (DNaza): dodać 10 000 jednostek Kunitza DNazy-I do 250 mL (40 jednostek Kunitza/mL) PBS Dulbecco zawierającego CaCl2 i MgCl2. Przygotować bezpośrednio przed użyciem i zużyć niezwłocznie. Przed użyciem ogrzać roztwór do 37 °C.
  8. Roztwór 8 (PBS + azydki sodu): do 1 L Roztworu 1 dodać 200 mg (0,02%) azydku sodu. Mieszać do rozpuszczenia soli. Przed użyciem schłodzić roztwór do 4 °C. Łącznie wymagane jest 1 L tego roztworu.

3. Disekcja trzustki świńskiej

UWAGA: W niniejszym badaniu trzustki świńskie pobrano z uśpionych, poddanych heparynizacji (400 IU/kg) loch o masie 45 kg pochodzących z gospodarstwa rolnego.

  1. Umieść świnię na stole sekcyjnym w pozycji na plecach.
  2. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie w linii środkowej od wyrostka mieczykowatego do kości łonowej (około 40 cm), odsłaniając wszystkie narządy jamy brzusznej.
  3. Zlokalizuj płat śledzionowy, dwunastniczy oraz łączący.
  4. Zlokalizuj poziom dużego brodawkowania dwunastnicy i podwiąż dwunastnicę w kierunku ustnym od tego miejsca, używając dwóch oddzielnych szwów.
  5. Podwiąż dolny odcinek przełyku dwoma oddzielnymi szwami i przetnij go nożyczkami pomiędzy więzadłami, aby wyciągnąć żołądek.
  6. Oddziel tkankę łączną od okrężnicy, aby dotrzeć do jelita cienkiego.
  7. Oddziel tkankę łączną okrężnicy, która przylega do płata śledzionowego trzustki.
  8. Usuń okrężnicę z jelita cienkiego po podwiązaniu tętnic.
  9. Znajdź żyłę krezkową dolną oraz drzewo tętnicy krezkowej dolnej i podwiąż je jednym szwem w miejscu, gdzie pojawiają się gudałowo od trzustki.
  10. Podwiąż wspólnie tętnicę i żyłę śledzionową jednym szwem w wnęce, blisko śledziony, a następnie przetnij je dystalnie nożyczkami, aby usunąć śledzionę.
  11. Postępuj wzdłuż dwunastnicy, aż płaty dwunastniczy i łączący zostaną uwolnione, a następnie podwiąż dwunastnicę na końcu dwoma oddzielnymi szwami.
  12. Wypreparuj żyłę wrotną, podwiąż ją jednym szwem, aby zapobiec wyciekowi krwi z wątroby, i przetnij proksymalnie od podwiązania. Żyła wrotna służy jako ujście podczas decelularyzacji.
  13. Wypreparuj i podwiąż przewód żółciowy oraz tętnicę wątrobową dwoma szwami. Przetnij je dystalnie od szwów.
  14. Znajdź aortę pod żyłą nerkową i wypreparuj ją w kierunku kranialnym z mięśni i tkanki łącznej, aż dotrze do obszaru trzustki.
  15. Ostrożnie odwróć trzustkę i wypreparuj aortę, pozostawiając nienaruszone SMA oraz CT, a następnie przetnij aortę nożyczkami powyżej CT i poniżej SMA.
  16. Przetnij nożyczkami pozostałe otaczające tkanki i wyjmij trzustkę.
  17. Używając strzykawki 50-mL podłączonej do 4-mm kaniuli do arteriotomii, przepłucz narząd przez aortę Roztworem 2, aż zostanie on w pełni przepłukany lub aż cały narząd stanie się zimny.

4. Przygotowanie trzustki świńskiej do decelularyzacji

  1. Przez cały proces trzymać trzustkę w temperaturze 4 °C lub w lodzie.
  2. Przeciąć szwy dwunastnicy za pomocą nożyczek, oczyścić ją z treści pokarmowej poprzez przepłukanie 50 - 150 mL wody ultrapurej przy użyciu pipety 25-mL, a następnie ponownie podwiązać szwami.
  3. Podwiązać szwami jeden koniec aorty oraz wszystkie odgałęzienia z wyjątkiem SMA i CT, aby zapobiec wyciekom.
  4. Wprowadzić z drugiego końca aorty kaniulę do arteriotomii 4-mm i podwiązać ją szwami.
  5. Przeprowadzić perfuzję trzustki Roztworem 3 przez 1 h z przepływem 20 mL/min, korzystając z zestawu do decelularyzacji.
    UWAGA: Wypełnić rurki pompy Roztworem 3 w taki sposób, aby do trzustki nie dostały się pęcherzyki powietrza. Sprawdzić, czy nie występują wycieki z żadnej strony narządu i podwiązać szwami wszystkie otwarte odgałęzienia naczyniowe, z wyjątkiem żyły wrotnej.
  6. Zamrozić trzustkę w temperaturze -20 °C w Roztworze 4 do czasu rozpoczęcia decelularyzacji.

5. Decelularyzacja trzustki świni

  1. rozmrozić trzustkę w temperaturze 4 °C.
  2. Uruchomić pompę perystaltyczną w układzie do decelularyzacji z użyciem roztworu 3 z przepływem 20 mL/min do momentu, aż w rurce doprowadzającej detergent przestaną być widoczne pęcherzyki powietrza.
  3. Umieścić trzustkę w pojemniku do decelularyzacji i podłączyć rurkę doprowadzającą detergent do aorty trzustki. Przepłukać organ poprzez perfuzję roztworem 3 przez noc z przepływem 20 mL/min w temperaturze 4 °C.
  4. Odlać roztwór pozostały w komorze z organem.
  5. Zastąpić roztwór 3 roztworem 5 i perfundować trzustkę przez 30 min z przepływem 20 mL/min w temperaturze 4 °C. Odlać roztwór z komory z organem.
  6. Dodać roztwór 6 i perfundować trzustkę przez 8 h z przepływem 20 mL/min w temperaturze 4 °C. Odlać roztwór z komory z organem.
  7. Przepłukać organ poprzez perfuzję roztworem 5 przez 96 h z przepływem 20 mL/min w temperaturze 4 °C. Odlać roztwór z komory z organem.
  8. Przygotować trzustkę do traktowania DNazą poprzez recyrkulację 500 mL buforu PBS Dulbecco zawierającego CaCl2 i MgCl2 przez 30 min w temperaturze 37 °C. Odlać roztwór z komory z organem.
  9. Dodać 250 mL roztworu 7 i perfundować trzustkę przez 4 h z przepływem 20 mL/min w temperaturze 37 °C. Odlać roztwór z komory z organem.
  10. Przepłukać organ poprzez perfuzję roztworem 5 przez 120 h z przepływem 20 mL/min w temperaturze 4 °C.
  11. Przechowywać organ w roztworze 8 w temperaturze 4 °C przez krótki czas lub w temperaturze -20 °C przez dłuższy czas.

6. Weryfikacja decelularyzacji

  1. Za pomocą nożyczek wyciąć biopsje o wielkości od 3 do 10 mm ze wszystkich płatów trzustki i utrwalić je w formaldehydzie przez 48 h w temperaturze pokojowej.
  2. Przemyć fragmenty w wodzie ultrazczystej przez 15 min, przetworzyć je w procesorze do tkanek zgodnie ze standardowymi protokołami, a następnie zalać w parafinie.
  3. Przygotować skrawki o grubości 5 µm za pomocą mikrotomu i zabarwić je hematoksyliną Meyera oraz 0,2% alkoholową eozyną (HE) zgodnie ze standardowymi protokołami.
  4. Obejrzeć preparaty pod mikroskopem świetlnym w celu sprawdzenia, czy nie doszło do utraty jąder komórkowych.
    UWAGA: Jako kontrolę w celu sprawdzenia obecności jąder komórkowych można wykorzystać fragment świeżej tkanki przetworzonej w ten sam sposób.

Wyniki

Reprezentatywne zdjęcia sekcji trzustki świńskiej, które mogą pomóc w zlokalizowaniu i wypreparowaniu drzewa tętnicy i żyły krezkowej dolnej, żyły wrotnej, tętnicy wątrobowej, przewodu żółciowego oraz rozgałęzienia aorty do CT i SMA, przedstawiono odpowiednio na Ryc. 2A, 2B oraz 2C (żółte strzałki). Ryc. 3A przedstawia morfologię makroskopową prawidłowej trzustki, która ma jasnoróżowy kolor i składa się z płatów śledzionowego, łączącego oraz dwunastniczego. Po decelularyzacji różowy kolor zanika, a decelularyzowana trzustka staje się bladobiała. Zdjęcie morfologii makroskopowej przedstawiające płaty śledzionowy, łączący i dwunastniczy decelularyzowanej trzustki pokazano na Ryc. 3B. Ryc. 3C wykazuje obecność wielu niebieskich jąder w prawidłowej trzustce po barwieniu HE. W decelularyzowanej trzustce barwienie HE wykazało utratę jąder, gdyż nie obserwuje się żadnych niebieskich jąder (Ryc. 3D).

Schemat sekcji pokazujący anatomię naczyniową z zaznaczonymi tętnicami, żyłami i przewodem żółciowym.
Rycina 2: Zdjęcia z sekcji trzustki świni. (A) Lokalizacja drzewa tętnicy i żyły krezkowej dolnej (żółta strzałka). (B) Podwiązanie żyły wrotnej, tętnicy wątrobowej i przewodu żółciowego (żółta strzałka). (C) Aorta rozgałęziająca się na pień trzewny i tętnicę krezkową górną (żółta strzałka). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Anatomia próbek tkanek z obrazami histologicznymi; porównanie struktury morfologicznej; mikroskopia.
Rycina 3: Morfologia makroskopowa i barwienie HE prawidłowych i decelularyzowanych trzustek. (A) Morfologia makroskopowa prawidłowej trzustki. (B) Morfologia makroskopowa decelularyzowanej trzustki. (C) Barwienie HE wykazuje obecność niebieskich jąder w prawidłowej trzustce. (D) Barwienie HE wykazuje brak niebieskich jąder w decelularyzowanej trzustce. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Dyskusja

Proponowany protokół, wykorzystujący perfuzję SDC i Triton X-100 w temperaturze 4 °C, pozwoli na skuteczną decelularyzację całej trzustki świni. Wyzwaniem w tej technice jest wypreparowanie nienaruszonej trzustki zawierającej wszystkie trzy płaty bez uszkodzenia miąższu i jego naczyń zasilających, a także podwiązanie pozostałych gałęzi naczyniowych próbki w celu perfuzji narządu bez wycieku. Trzustka świni ma inną anatomię w porównaniu z trzustką ludzką. Składa się z trzech płatów i pozostaje w ścisłym kontakcie z jelitem cienkim, częściowo je otaczając. Rozcięliśmy dwunastnicę razem z trzustką, ponieważ kilka małych naczyń krwionośnych z trzustki łączy jelito. Podczas badań optymalizacyjnych cięcie tych naczyń krwionośnych wykazało nieszczelność i niepełną perfuzję roztworów.

Ponieważ aorta łączy się z trzustką przez tętnice trzewne i krezkowe górne, wybraliśmy aortę jako wlot, aby uprościć perfuzję, używając tylko jednej kaniuli, a zatem jednego wlotu. Z naszego doświadczenia wynika, że podwiązanie aorty powyżej CT i poniżej SMA skróci czas rozwarstwienia i zmniejszy ryzyko uszkodzenia któregokolwiek z dwóch naczyń. Oprócz świni poddanej heparyniźnie zauważyliśmy również, że perfuzja zimnej heparyny przez aortę bezpośrednio po rozwarstwieniu pomaga w uzyskaniu perfuzji roztworów w całym narządzie. Spekulujemy, czy dzieje się tak poprzez zapobieganie tworzeniu się skrzepów krwi w naczyniach krwionośnych. Początkowa perfuzja trzustki ultraczystą wodą po rozbiorze spowoduje lizę czerwonych krwinek i usunięcie resztek krwi w narządzie, zapobiegając w ten sposób tworzeniu się skrzepów krwi. Okres ten można również wykorzystać do znalezienia wszelkich niezwiązanych małych odgałęzień żył i tętnic, ponieważ przepływ krwi można łatwo zauważyć nad tłem.

Zdecydowaliśmy się na przeprowadzenie całej procedury decelularyzacji w niskich temperaturach (4 °C), ponieważ utrudni to działanie enzymów zewnątrzwydzielniczych, które uwalniają się z komórek zewnątrzwydzielniczych trzustki. Enzymy egzokrynne, jeśli nie są hamowane, mogą powodować szkodliwy wpływ na komórki i ECM, ponieważ mogą trawić błony komórkowe i białka12. Ponieważ zamrażanie i rozmrażanie może skutecznie rozerwać komórki, uwzględniliśmy etap zamrażania/rozmrażania, początkowo nawet przed perfuzją detergentów 4,13. Wstępne mycie po rozmrożeniu usunie pozostałości po pęknięciach komórek. Zastosowany przez nas detergent to mieszanka SDC i Triton X-100 w niezwykle wysokich stężeniach i przy dużej prędkości perfuzji. Wybraliśmy to podejście, aby osiągnąć szybszą decelularyzację poprzez usunięcie komórek zewnątrzwydzielniczych, które uszkadzają ECM. Spekulujemy, że twardy i szybki protokół jest korzystny dla decelularyzacji trzustki, ponieważ enzymy trzustkowe będą miały mniej czasu na interakcję z ECM, zachowując w ten sposób dobre składniki ECM. Aby zachować składniki ECM, dodaliśmy również inhibitor proteazy serynowej (PMSF) do roztworów detergentów, ponieważ hamuje to aktywację enzymów uwalnianych z komórek zewnątrzwydzielniczych14. Azydek sodu jest dodawany do wszystkich roztworów decelularyzacyjnych, ponieważ działa jako środek bakteriostatyczny, hamując w ten sposób ryzyko skażenia bakteryjnego15.

Trzustka pozbawiona komórek zgodnie z tym protokołem wykazała zachowanie struktur ECM oraz białek ECM, kolagenu i elastyny. Zauważono jednak znaczny ubytek glikozaminoglikanów w trzustce pozbawionej komórek. Trzustka pozbawiona komórek w ten sposób okazała się również obiecująca pod względem przyłączania ludzkich płodowych komórek macierzystych trzustki oraz ekspresji markerów zewnątrzwydzielniczych i endokrynnych w kawałkach rekomórkowych przez 14 dni. Jednak, aby wytworzyć nienaruszoną i funkcjonalną trzustkę, potrzebne są dalsze badania w celu oceny prawidłowych źródeł komórek, typów komórek, strategii wysiewu komórek i hodowli w bioreaktorze.

Oświadczenia

S.S.H. posiada udziały w Verigraft, spółce, która uzyskała licencję na technologię inżynierii tkanek naczyń krwionośnych. Pozostali autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane z grantu rządu szwedzkiego LUA ALF dla S.S.H.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kaniula arteriotomijna 4 mm DLPMedtronic31104
2ml Nieoznakowana pipetavWR612-3720
DegasserBiotech AB0001-6484
DNase-IWorthingtonLS0020007
PBS firmy Dulbecco z CaCl2 i MgCl2Sigma AldrichD8662
EDTA sól disodowa dwuwodnaAlfaAesarA15161. OB
HeparynaLeo387107
Luer męska z 1/8 "ID BarbOinaLM-2PP-QCDo rurki silikonowej 3X5mm
Pompa perystaltycznaOinaSP-1X4
PMSFRoche10837091001Niestabilny w roztworze wodnym. Należy dodać świeże przed perfuzją.
Chlorek potasuSigma AldrichP5405
Wodorofosforan potasuSigma AldrichP9791
SDCSigma Aldrich30970
Rurka silikonowa 3X5mmVWR2280706
Azydek soduSigma Aldrich71290
Chlorek soduSigma Aldrich13423
Wodorofosforan soduMerck71640-M
szewVö mel14817
Strzykawka 50 mlBecton Dickinson300137
Triton-X-100AlfaAesarA16046. Z

Bibliografia

  1. Federation, I. D. IDF Diabetes Atlas. , Available from: http://www.diabetesatlas.org (2016).
  2. Yang, H. K., Yoon, K. H. Current status of encapsulated islet transplantation. Journal of Diabetes and its Complications. 29 (5), 737-743 (2015).
  3. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: Decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
  4. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  5. Hynes, R. O. The evolution of metazoan extracellular matrix. Journal of Cell Biology. 196 (6), 671-679 (2012).
  6. Scarritt, M. E., Pashos, N. C., Bunnell, B. A. A review of cellularization strategies for tissue engineering of whole organs. Frontiers in Bioengineering and Biotechnol. 3, 43(2015).
  7. Goh, S. K., et al. Perfusion-decellularized pancreas as a natural 3D scaffold for pancreatic tissue and whole organ engineering. Biomaterials. 34 (28), 6760-6772 (2013).
  8. Wu, D., et al. 3D Culture of MIN-6 Cells on Decellularized Pancreatic Scaffold. In Vitro and In Vivo Study. Biomed Research International. 2015, 432645(2015).
  9. Peloso, A., et al. The Human Pancreas as a Source of Protolerogenic Extracellular Matrix Scaffold for a New-generation Bioartificial Endocrine Pancreas. Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).
  10. Mirmalek-Sani, S. H., et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).
  11. Taylor, M. J., Baicu, S., Greene, E., Vazquez, A., Brassil, J. Islet isolation from juvenile porcine pancreas after 24-h hypothermic machine perfusion preservation. Cell Transplantation. 19 (5), 613-628 (2010).
  12. Elebring, E., Kuna, V. K., Kvarnstrom, N., Sumitran-Holgersson, S. Cold-perfusion decellularization of whole-organ porcine pancreas supports human fetal pancreatic cell attachment and expression of endocrine and exocrine markers. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417738145(2017).
  13. Gilpin, A., Yang, Y. Decellularization Strategies for Regenerative Medicine: From Processing Techniques to Applications. Biomed Research International. 2017, 9831534(2017).
  14. James, G. T. Inactivation of the protease inhibitor phenylmethylsulfonyl fluoride in buffers. Analytical Biochemistry. 86 (2), 574-579 (1978).
  15. Lichstein, H. C., Soule, M. H. Studies of the Effect of Sodium Azide on Microbic Growth and Respiration: I. The Action of Sodium Azide on Microbic Growth. Journal of Bacteriology. 47 (3), 221-230 (1944).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Disekcja trzustki świnidecelularyzacja całego narząduperfuzja Tritonem X-100traktowanie deoksycholanem soduperfuzja przez kaniulację aortypłukanie narządu z heparynązachowanie macierzy zewnątrzkomórkowejprotokół inżynierii tkankowejdecelularyzacja w niskiej temperaturzekonfiguracja pompy perystaltycznej
Izolacja i decelularyzacja całej trzustki świni
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.