Artykuł metodologiczny

Indukcja blaszek miażdżycowych poprzez aktywację receptorów mineralokortykoidowych u myszy z niedoborem apolipoproteiny E

DOI:

10.3791/58303

⸱

26 września 2018

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cardiovascular Endocrinology, IRCCS San Raffaele Pisana, Rome, Italy, 2Department of Human Sciences and Promotion of the Quality of Life, San Raffaele Roma Open University, Rome, Italy

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół indukowania miażdżycy w korzeniu aorty myszy ApoE-/- karmionych dietą aterogenną, poprzez ciągłe uwalnianie aldosteronu. Opisano również metody charakteryzowania składu płytki nazębnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miażdżyca jest spowodowana przewlekłą reakcją zapalną wpływającą na śródbłonek naczyń krwionośnych i jest promowana przez kilka czynników, takich jak nadciśnienie, dyslipidemia i cukrzyca. Do tej pory istnieją dowody potwierdzające rolę krążącego aldosteronu jako czynnika ryzyka rozwoju chorób sercowo-naczyniowych. Stworzono transgeniczne modele myszy w celu zbadania procesów komórkowych i molekularnych prowadzących do miażdżycy. W tym manuskrypcie opisujemy protokół, który wykorzystuje ciągły wlew aldosteronu u myszy ApoE-/- i generuje blaszki miażdżycowe w korzeniu aorty po 4 tygodniach leczenia. W związku z tym ilustrujemy metodę kwantyfikacji i charakterystyki zmian miażdżycowych na poziomie korzenia aorty. Wartością dodaną wlewu aldosteronu jest powstawanie zmian miażdżycowych bogatych w komórki lipidowe i zapalne po 4 tygodniach leczenia. Szczegółowo opisujemy procedury barwienia w celu ilościowego określenia zawartości lipidów i makrofagów w płytce nazębnej. Warto zauważyć, że w tym protokole przeprowadzamy osadzanie tkanki serca w OCT w celu zachowania antygenowości tkanki serca i ułatwienia wykrywalności interesujących nas antygenów. Analiza fenotypu blaszki miażdżycowej stanowi ważne podejście do badania patofizjologii rozwoju miażdżycy i identyfikacji nowych celów farmakologicznych dla rozwoju leków przeciwmiażdżycowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miażdżyca jest jedną z głównych przyczyn śmiertelności i zachorowalności na całym świecie1. Charakteryzuje się przewlekłym stanem zapalnym, w którym naczynia krwionośne są naciekane przez lipidy i leukocyty, które decydują o tworzeniu się blaszek miażdżycowych. Większość ostrych zdarzeń sercowych jest związana ze zdarzeniami zakrzepowymi spowodowanymi pęknięciem blaszki miażdżycowej. Blaszki miażdżycowe podatne na pękanie są określane jako "wrażliwe" i charakteryzują się zwiększoną infiltracją leukocytów prozapalnych, martwiczego rdzenia i cienkiej włóknistej czapeczki 2. W ostatnich dziesięcioleciach badania kliniczne i eksperymentalne wyjaśniły złożoną patofizjologię choroby. Do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z indukcją miażdżycy wykorzystano kilka modeli zwierzęcych3. Obecnie mysz jest najczęściej wykorzystywanym gatunkiem do badania miażdżycy, pomimo pewnych różnic gatunkowych istniejących w jej patofizjologii w porównaniu z ludźmi. W szczególności krążący cholesterol składa się głównie z lipoprotein o dużej gęstości (o właściwościach przeciwmiażdżycowych) w modelach mysich, podczas gdy u ludzi krążący cholesterol jest głównie transportowany w postaci lipoprotein o niskiej gęstości (LDL), co prawdopodobnie stanowi główny powód, dla którego myszy typu dzikiego nie rozwijają spontanicznej miażdżycy4. Co więcej, myszy typu dzikiego są ogólnie odporne na wchłanianie cholesterolu z diety, podczas gdy ludzie wchłaniają około 50% cholesterolu w diecie4. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, stworzono kilka genetycznie zmodyfikowanych modeli myszy. Szeroko stosowane są myszy z niedoborem apolipoproteiny E (ApoE−/−) i myszy z niedoborem receptora LDL (LDLr−/−). Na diecie wysokotłuszczowej i wysokiej cholesterolu myszy ApoE−/− rozwijają płytkę nazębną szybciej w porównaniu z myszami LDLr−/− i z tego powodu stosowanie myszy ApoE−/− jest bardziej rozpowszechnione niż myszy LDLr−/−myszy5,6. U myszy ApoE−/− zmiany chorobowe rozwijają się na każdym etapie miażdżycy i są one porównywalne do tych obserwowanych u ludzi, chociaż blaszki mysie nie wykazują niestabilnego fenotypu7. Ogólnie rzecz biorąc, myszy ApoE−/− spontanicznie rozwijają miażdżycę, a proces ten jest przyspieszany przez zachodnią dietę3. Nasilenie miażdżycy można ocenić na poziomie tętnicy szyjnej, płucnej, udowej i ramienno-głowowej oraz korzenia aorty6. W szczególności korzeń aorty stanowi anatomiczne miejsce podatne na rozwój zmian miażdżycowych u myszy. Z tego powodu powszechną praktyką jest ocena powstawania blaszek miażdżycowych w tym regionie.

Kilka badań wykazało, że aldosteron jest zamieszany w rozwój miażdżycy8,9,10. Napar aldosteronu u myszy ApoE−/− karmionych dietą miażdżycową przyspiesza rozwój zmian miażdżycowych korzenia aorty, wywołując stan zapalny i tworzenie się płytki nazębnej bogatej w lipidy10.

Podsumowując, opisujemy protokół obejmujący infuzję aldosteronu, karmienie dietą aterogenną, osadzanie tkanek serca, kwantyfikację i charakterystykę zmian miażdżycowych u myszy ApoE-/-. Procedura ta sprzyja efektywnemu tworzeniu zapalnych, bogatych w lipidy blaszek miażdżycowych i stanowi cenny model do badania miażdżycy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie zostało zatwierdzone przez włoskie Narodowe Instytuty Opieki Zdrowotnej i Komitety Użytkowania, numer autoryzacji 493/2016-PR. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Wspólnoty Europejskiej dotyczącymi wykorzystywania zwierząt doświadczalnych (Dyrektywa Europejska 2010/63/UE).

Uwaga: Podskórne wszczepienie minipompy osmotycznej zawierającej nośnik (etanol w roztworze soli fizjologicznej) lub aldosteron (240 μg · kg-1 · d-1) u 8-10 tygodniowych samców myszy z niedoborem genu ApoE. Ogólnie rzecz biorąc, 8-10-tygodniowe samce myszy ApoE−/− ważą około 25-26 g.

1. Rozpuszczanie aldosteronu

  1. Rozpuścić 5 mg aldosteronu w proszku w 1 ml absolutnego alkoholu etylowego.
  2. Dodać 56,7 μl aldosteronu (rozpuszczonego w etanolu) do 68,3 μl roztworu soli w celu uzyskania stężenia 2,27 μg/μL. Całe minipompy osmotyczne napełnić całkowicie 125 μL tego roztworu (maksymalna wydajność każdej minipompy to 125 μL).
  3. Stosować minipompkę o natężeniu przepływu 0,11 μl/h, dlatego co 24 godziny uwalnia się 2,64 μl roztworu. Podawaj każdej myszy około 6 μg · d-1 aldosteronu przez 28 dni.

2. Napełnianie i implantacja pompy osmotycznej

Uwaga: Pompy są dostarczane w dwóch oddzielnych częściach: głównym korpusie pompy i regulatorze przepływu.

  1. Napełnianie minipomp i obchodzenie się z nimi za pomocą rękawic chirurgicznych.
    Uwaga: Oleje skórne mogą zakłócać działanie minipomp. Poniższe czynności należy wykonać w sterylnym okapie z przepływem laminarnym.
  2. Podłączyć rurkę do napełniania (dostarczoną z minipompami) do strzykawki o pojemności 1 ml i pobrać roztwór aldosteronu lub nośnik.
    Uwaga: Ważne jest, aby unikać wpuszczania powietrza do wnętrza strzykawki podczas zasysania roztworów z rurki, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza do pompy.
  3. Włóż rurkę napełniającą przez otwór w górnej części minipompy, aż nie będzie mogła iść dalej (Rysunek 1A-1B). Powoli napełnij pompę aldosteronem lub pojazdem. Zwróć uwagę na ciemny cień wewnątrz pompy wskazujący poziom płynu. Obserwuj, jak ten poziom rośnie wraz z pompą napełniającą.
    1. Przestań napełniać pompę, gdy kropla płynu uniesie się z korpusu pompy.
  4. Ostrożnie wyjmij rurkę napełniającą i włóż regulator przepływu do korpusu minipompy (Rysunek 1C). Upewnij się, że regulator jest mocno osadzony na korpusie pompy. Pozostawić napełnione pompy osmotyczne w zlewce zawierającej sterylny roztwór soli fizjologicznej w temperaturze 37 °C przez maksymalnie 24 godziny przed implantacją u myszy (procedura zalewania).
  5. Przeprowadź operację w zdezynfekowanym miejscu z 70% etanolem, który sprzyja aseptyce.
  6. Nałóż 1-3 krople na miejsce nacięcia 0,25% bupiwakainy i znieczulij zwierzę 3% izofluranem. Włącz gaz zasilający i ustaw przepływomierz na 500-1000 ml/min. Umieść zwierzę w komorze indukcyjnej i uszczelnij górę. Włącz waporyzator na 5% izofluranu i monitoruj mysz aż do momentu, gdy znajdzie się w pozycji leżącej.
    1. Przełącz system tak, aby przepływał na stożek nosowy. Wyjmij zwierzę z komory i umieść w stożku. Po 2-3 minutach mysz zaczyna się budzić. Wznów przepływ gazu za pomocą przepływomierza o prędkości 100-200 ml/min i parownika przy 3% izofluranu.
    2. Upewnij się, że przed wykonaniem zabiegów należy zapewnić odpowiednią głębokość znieczulenia, badając odruch pedałowania i powiekowy. Monitoruj oddech i reakcję na stymulację podczas zabiegu i dostosuj waporyzator w razie potrzeby.
    3. Chroń rogówki przed wysuszeniem, nakładając maść okulistyczną.
  7. Przygotuj zwierzę, usuwając sierść z miejsca operowanego za pomocą maszynki do golenia (ryc. 1D). Typowe miejsce do podskórnej implantacji pomp znajduje się na plecach.
  8. Przygotować miejsce operacji za pomocą włókniny nasączonej alkoholem izopropylowym.
  9. Korzystaj z czystej i dedykowanej przestrzeni (zdezynfekowanej 70% etanolem) i przykrytej sterylnym serwetem. Umieść końcówkę narzędzi w sterylizatorze ze szklanych kulek. Rozpocznij operację od wysterylizowanych narzędzi i obchodź się z narzędziami w aseptyku.
  10. Użyj nożyczek chirurgicznych, aby wykonać nacięcie 0,8-1 cm (około 2 cm blisko ogona), jak pokazano na rysunkach 1E-1F. Zachowaj sterylność, nie dotykając niczego poza przeznaczoną do tego przestrzenią chirurgiczną sterylnymi rękawiczkami lub końcówkami narzędzi.
  11. Uważaj, aby przeciąć tylko skórę, ale nie tkanki znajdujące się pod nią. Jedną ręką przytrzymaj kleszcze, aby otworzyć nacięcie. Drugą ręką przytrzymaj trokar, aby rozłożyć skórę w celu stworzenia kieszeni na pompę od tyłu do góry do łopatki (po prawej lub lewej stronie myszy).
  12. Włóż pompę do nacięcia. Delikatnie wsuń pompkę całkowicie do kieszeni (Rysunek 1H). Powinno być wystarczająco dużo wolnej skóry, aby zamknąć ranę bez konieczności napinania lub rozciągania skóry. Po wprowadzeniu pompy zszyj nacięcie drutem chirurgicznym (poliglaktyna 910 o rozmiarze szwów 6-0)
    Uwaga: Głowica regulatora musi być skierowana do przodu myszy (Rysunek 1G).
  13. Nałóż miejscowo 10% maść powidonową/jodową za pomocą czystego wacika (ryc. 1I) i utrzymuj zwierzę w fazie rozgrzewki. Nie zostawiaj myszy bez opieki, dopóki nie odzyskają pozycji leżącej mostka. Oceń stan nawodnienia i w razie potrzeby podaj podskórnie 0,5 ml 0,9% roztworu soli fizjologicznej. Zwierzę należy umieścić z powrotem w jego rutynowym pomieszczeniu
    14. .
  14. Postępuj zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi dokumentacji (np. wypełnij formularz chirurgiczny informacjami operacyjnymi i pooperacyjnymi, zaktualizuj kartę klatki z procedurą i datą) i zapewnij leki przeciwbólowe (buprenorfina, 0,05 mg/kg) w celu zmniejszenia bólu pooperacyjnego i antybiotyki (enrofloksacyna 85 mg / kg), aby uniknąć infekcji pooperacyjnej.
    1. Kontynuuj codzienne monitorowanie i sprawdzaj, czy nie ma oznak bólu. Zwrócić uwagę, że rana jest całkowicie zamknięta, a minipompka jest utrzymywana w kieszonce podskórnej. Rana może się otworzyć, a mysz może zgubić minipompkę.

3. Sekcja serca

  1. W momencie składania ofiary należy znieczulić myszy 80-100 mg/kg leku Zoletil podawanego domięśniowo. Zoletil wywołuje głębokie znieczulenie. Uwaga: przed wykonaniem zabiegów sprawdź, czy myszy są pod odpowiednią głębokością znieczulenia, testując pedał i odruchy powiekowe; Myszy będą perfundowane podczas głębokiego znieczulenia. Otwórz klatkę piersiową za pomocą nożyczek i kleszczy, przecinając żebra bocznie do mostka, z mostkiem cofniętym w kierunku głowy.
  2. Ukrwić mysz przez lewą komorę za pomocą systemu perfuzji grawitacyjnej z 10-15 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanem Dulbecco (PBS), a następnie z 40-50 ml 10% neutralnej buforowanej formaliny w celu unieruchomienia układu krwionośnego. Fiksacja jest wskazana, gdy myszy wykazują silne skurcze mięśni i stają się sztywne.
    Uwaga: Proces utrwalania odbywa się w ciągu 10-20 minut. Możliwe jest wykorzystanie nieruchomych narządów i tkanek do wykonywania analiz immunofluorescencyjnych lub immunohistochemicznych. Co ważne, tak utrwalone tkanki nie mogą być wykorzystywane do analiz ekspresji genów i western blot.
  3. Oddziel serce od aorty, przytrzymując serce kleszczami i przecinając nożyczkami lub ostrzem skalpela, prostopadle do osi aorty, jak najbliżej serca, nie powodując uszkodzenia (ryc. 2A). Użyj ostrza skalpela, aby ciąć poprzecznie wzdłuż linii prostej, która łączy dolne punkty prawego i lewego przedsionka (rysunek 2B).
  4. Wypełnij górną część podzielonego na sekcje serca (przez jamę serca) optymalną masą tnącą (OCT) (Rysunek 2D-2E). Umieść tkankę w plastikowej formie do kriosekcji z osią aorty umieszczoną prostopadle do podstawy prostokątnej formy i przykryj OCT (ryc. 2F). Nie powinno być żadnych pęcherzyków powietrza. Jeśli pojawi się jakaś bańka, spróbuj przesunąć ją do krawędzi.
  5. Umieść metalową płytkę na suchym lodzie, a następnie ostrożnie umieść formę (Rysunek 2G). Gdy OCT stanie się biały, owiń formę srebrną folią, a następnie przechowuj w temperaturze –80 °C.

4. Wycinanie odcinków korzenia aorty

  1. Ustawić kriostat w temperaturze –20 °C. Przed cięciem umieść osadzoną tkankę i pozostaw ją tam na około 15 minut, aby dostosować się do tej temperatury. Ustawić temperaturę uchwytu próbki na -17 °C (Rysunek 3A).
  2. Umieść zamrożony blok serca w maszynie do kriostatu, aby zrównoważyć temperaturę bloku z temperaturą kriostatu (rysunek 3B) i wyjmij zamrożony blok serca z formy (rysunek 3C). Odetnij nadmiar OCT z zamrożonego bloku, aby lepiej dostosować wymiary bloku do uchwytu próbki (Rysunek 3D).
  3. Zamontuj zamrożony blok serca na uchwycie próbki zorientowany z komorą skierowaną na zewnątrz (Rysunek 3E-3I) i włóż uchwyt próbki do głowicy orientującej próbkę (Rysunek 3J). Dostosuj orientację uchwytu próbki, aby umożliwić przecięcie bloku, aby korzeń aorty był prostopadły do ostrza (Rysunek 3K).
  4. Odetnij blok i wyrzuć plasterki, aż dojdziesz do korzenia aorty (Rysunek 3L-3N). Zbierz sekcje szeregowe i umieść je na szkiełkach podstawowych (Rysunek 3O). Monitoruj profil anatomiczny korzenia aorty pod mikroskopem, aż pojawią się wszystkie 3 zastawki aortalne (Rysunek 3P-3Q).
  5. Zbieraj skrawki z prędkością 10 μm/sekcję w przypadku barwienia czerwienią olejową O i czerwienią Picro Sirius oraz z prędkością 6 μm/sekcję w przypadku barwienia MAC3 (rysunek 3R). Zbierz około 6-8 szkiełek (na każde serce), aż jedna z trzech zastawek zniknie lub nie będzie już nienaruszona.

5. Immunohistochemia

Uwaga: Wszystkie etapy barwienia opisane w poniższych protokołach są wykonywane w szklanych słoikach do barwienia Coplin.

  1. Barwnik Oil Red O do tłuszczów neutralnych
    1. Utrwal skrawki w 70 ml 37% formaldehydu przez 5 min. Dobrze umyj w wodzie z kranu i zetrzyj nadmiar wody.
    2. Rozcieńczyć 48 ml czerwonego oleju O (0,5% w izopropanolu) w 32 ml wody destylowanej, aby uzyskać olej czerwony O 0,3%.
    3. Zaplamić skrawki w 70 ml Oil Red O 0,3% przez 10 min. Myć sekcje w wodzie z kranu przez 10 min.
    4. Barwić przez 1 minutę w 70 ml hematoksyliny Mayera. Myj sekcje w wodzie z kranu przez 1 min.
    5. Zanurz skrawki w 70 ml 0,5% węglanu litu. Myć w wodzie z kranu przez 1 min.
    6. Zamontuj sekcje za pomocą wodnego medium montażowego i uchwyć obrazy za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na mikroskopie świetlnym.
  2. Picro Sirius Czerwona Bejca do Kolagenu
    1. Wytnij zamrożone odcinki o grubości 10 μm i zamontuj w dolnej części prowadnicy.
    2. Utrwalić skrawki w 70 ml acetonu na 5 minut, wysuszyć na powietrzu i krótko spłukać w wodzie destylowanej.
    3. Umieść skrawki w 70 ml 0,2% kwasu fosfomolibdynowego na 5 minut. Krótko spłucz w wodzie destylowanej.
    4. Umieścić skrawki w 70 ml 0,1% roztworu Picro Sirius na 90 minut. Spłukać jeden raz 70 ml 0,01 N HCl. Wyrzucić roztwór.
    5. Umieścić w 70 ml 0,01 N HCl na 2 min. Krótko spłukać w wodzie destylowanej. Suszyć na powietrzu.
    6. Umieścić na krótko w 70 ml 70% etanolu.
    7. Po całkowitym wyschnięciu umieścić w 70 ml środka czyszczącego pochodzenia terpenowego i zamontować sekcje za pomocą podłoża montażowego na bazie poli(metakrylanu butylu-kometakrylanu metylu) i uchwycić obrazy za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na mikroskopie świetlnym.
      Uwaga: Jedną z zalet barwienia Picro Sirius Red jest to, że możliwe jest rozróżnienie sieci włókien kolagenowych typu I (grube włókna, dwójłomność żółto-pomarańczowa) i typu III (cienkie włókna, zielona dwójłomność) za pomocą mikroskopii światła spolaryzowanego11.
  3. Barwienie Mac3 do barwienia makrofagów
    1. Wytnij zamrożone odcinki o grubości 6 μm i zamontuj w dolnej części prowadnicy.
    2. Utrwalić skrawki w 70 ml zimnego acetonu na 5 minut. Zanurzyć w 70 ml PBS na 2 minuty.
    3. Za pomocą pipety przykryj skrawki 1% roztworem dodecylosiarczanu sodu (SDS) i inkubuj przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) w celu pobrania antygenu. Zanurzyć w 70 ml PBS na 5 minut.
    4. Za pomocą pipety przykryj plastry 0,3% nadtlenkiem wodoru przez 20 minut. Umyj w 70 ml PBS 3 razy przez 5 minut.
    5. Użyj zestawu Avidin-Biotin Complexes (ABC)-HRP do wykonania następujących czynności.
    6. Za pomocą pipety blokuj skrawki w surowicy Normal Rabbit w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Nie spłukiwać.
    7. Barwieć MAC3 (1:300) przez 90 minut w temperaturze RT. Prać w 70 ml PBS 3 razy przez 5 minut.
    8. Barwienie wtórnie biotynylowaną anty-szczurzą IgG (1:200) przez 45 min w temperaturze pokojowej. Płukać 70 ml PBS 3 razy przez 5 min.
    9. Przykryj skrawki preparatem Rabbit IgG ABC przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Płucz 30 ml PBS 3 razy przez 5 minut.
    10. Przykryj skrawki 3-amino-9-etylokarbazolem (AEC) przez 10 minut. Płukać 70 ml wody destylowanej 10 razy.
    11. Barwić przez 1 minutę w 70 ml hematoksyliny Mayera. Myj sekcje w wodzie z kranu przez 1 min.
    12. Zanurz sekcje w 70 ml 0,5% węglanu litu. Myć w wodzie z kranu przez 1 min.
    13. Zamontuj sekcje za pomocą wodnego medium montażowego i uchwyć obrazy za pomocą kamery cyfrowej zamontowanej na mikroskopie świetlnym.

6. Analiza obrazu zmian miażdżycowych w odcinkach korzenia aorty

Uwaga: Odcinki korzenia aorty barwione Oil Red O lub MAC3 lub przeciwciałem będącym przedmiotem zainteresowania mogą być analizowane za pomocą odpowiedniego oprogramowania (wskazanego w Tabeli Materiałów). Całkowita liczba pikseli zabarwionych dodatnio dla składnika będącego przedmiotem zainteresowania jest normalizowana do całkowitej powierzchni płytki nazębnej. Obrazy zostały zebrane i przeanalizowane przez badacza zaślepionego leczeniem.

  1. wzorcowanie
    1. Otwórz oprogramowanie, a następnie wybierz obraz (w formacie jpg), który chcesz przeanalizować.
    2. Wybierz punkt menu Strona główna | Utwórz | Szybka kalibracja.
    3. Skonfiguruj kalibrację obrazu, rysując linię wzdłuż paska skali obrazu.
    4. Zapisz konfigurację kalibracji.
  2. Analiza obrazu
    1. Wybierz zapisaną kalibrację ustawień z menu Opcje | Opcja kalibracji przestrzennej.
    2. Wybierz punkt menu Kalibracja | Złóż wniosek.
    3. Wybierz narzędzie wielokąta z menu Wybierz i narysuj obwód wzdłuż wszystkich zmian miażdżycowych.
    4. Wybierz opcję Liczba/Rozmiar | Rodzaje. Z menu dodaj pole Obszar i Procent powierzchni.
    5. Z menu Liczba/Rozmiar wybierz Ręcznie, a otworzy się nowe okno.
    6. W tym oknie kliknij narzędzie Wybierz kolor na obrazie i wybierz tryb HSI.
    7. Skieruj kursor myszy na dodatnie piksele interesującego Cię znacznika, aby utworzyć zakres kolorów.
    8. Kliknij na Policz, a wartość Suma, zaobserwowana w Tabeli Pomiarów, wskazuje procentowy udział powierzchni markera (również wyrażony w μm2) w stosunku do całkowitej powierzchni zmian miażdżycowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu 8-10 tygodni myszy Apo-/- wszczepiono minipompy do infuzji nośnika lub aldosteronu (Rysunek 1E-1I) i karmione dietą aterogenną (dieta o dostosowanych kaloriach 42% z tłuszczu) przez 4 tygodnie. Pod koniec leczenia myszy zostały poddane eutanazji i perfuzji PBS i 10% formaliny, jak opisano powyżej. Korzeń aorty został oddzielony od wierzchołkowej części serca i osadzony w OCT (Ryc. 2). Przekroje korzeni aorty przyg...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miażdżyca jest przewlekłą chorobą zapalną związaną z dużymi i średnimi naczyniami krwionośnymi, obejmującą interakcje między wieloma typami komórek, takimi jak makrofagi, limfocyty T, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich1. Pomimo ograniczeń mysich modeli aterogennych, dostępnych jest wiele dowodów na temat procesu miażdżycowego. Modele te mają tę zaletę, że szybko generują kohorty eksperymentalne w określonym wieku i płci. Myszy wykazują również określone i jednorodne tło genetyczne.

<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez dotacje z włoskiego Ministerstwa Zdrowia (Ricerca Corrente, GR-2009-1594563 i PE-2011-02347070 dla M.C.)

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dieta o dostosowanych kaloriach (42 % z tłuszczu)EnvigoTD.88137dieta miażdżycowa
Minipompa osmotyczna z rurką napełniającąAlzetmodel 1004do ciągłego realazy
AldosteronSIGMAA9477hormon
EtanolSIGMA34852-Mrozpuszczalnik
Alchol Preps nasycony 70% alkoholem izopropylowymKendal Webcol6818do dezynfekcji
(Vicryl 6.0)Demas500004surgery
10% maść powidonowa/jodowaAplicare-Meriden52380-0026-1Antyseptyczna
formalina 10%SIGMAHT5012do naprawy naczyń krwionośnych
CryomoldBio-Optica07-MP1515do zatapiania
O.C.T. CompoundSakura Finetek4583do zatapiania
CryostatPrzyrząd LeicaCM1900do cięcia
buforowegoDulbecco's Phosphat Buffered SalineAurogeneAU-L0615-500
Szkiełka adhezyjne PolisynaVWR631-0107okulary mikroskopowe
Okulary nakrywkoweBio-Optica72015
Formaldehyd 37%SIGMA252549rozpuszczalnik
Roztwór czerwieni olejowej O (0,5 % w izopropanolu)SIGMAO1391roztwór barwiący
Mayer' s HematoksylinaSIGMAMHS32roztwór barwiący
Bufor myjącyz węglanu lituSIGMA62470
Wodne medium montażoweThermo ScientificTA-125-AMroztwór montażowy
AcetonSIGMA179124rozpuszczalnik
kwasu fosfomolibdenowegoSIGMAHT153do histologii
Czerwień bezpośrednia 80 (Picrosirius czerwony)SIGMA365548roztwór barwiący
Bio Clear (środek klarujący pochodzenia terpenowego)Bio-Optica06-1782Dprodukt do przygotowania próbek histologicznych
Eukitt Szybkoutwardzalne medium montażowe (Poli(metakrylan butylu-ko-metakrylan metylu)SIGMA3989montażowy
Dodecyl Siarczan SoduFluka71725w proszku
Roztwór nadtlenku wodoru (30 %)SIGMAH1009
roztwór Vectorstain ABC KIT zawierający: anty-królicze IgG ABC, normalna surowica królicza, Wtórnie biotynylowana anty-Rat IgG,Vector LaboratoriesPK-6100roztwór barwiący
3-amino-9-etylokarbazolVector LaboratoriesSK-4200barwiący
Przeciwciało Mac3BD Biosciences553322przeciwciało
Oprogramowanie ImagePro Premier 9Media Cybernetics050910000-2534do analizy obrazów
Drut chirurgiczny roztworu Roztwór roztwór roztwór

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ross, R. Atherosclerosis--an inflammatory disease. New England Journal of Medicine. 340 (2), 115-126 (1999).
  2. Lafont, A. Basic aspects of plaque vulnerability. Heart. 89 (10), 1262-1267 (2003).
  3. Getz, G. S., Reardon, C. A. Animal models of atherosclerosis. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (5), 1104-1115 (2012).
  4. Bentzon, J. F., Falk, E. Atherosclerotic lesions in mouse and man: is it the same disease? Current Opinion in Lipidology. 21 (5), 434-440 (2010).
  5. Getz, G. S., Reardon, C. A. Do the Apoe-/- and Ldlr-/- Mice Yield the Same Insight on Atherogenesis? Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 36 (9), 1734-1741 (2016).
  6. Emini Veseli, B., et al. Animal models of atherosclerosis. European Journal of Pharmacology. 816, 3-13 (2017).
  7. Schwartz, S. M., Galis, Z. S., Rosenfeld, M. E., Falk, E. Plaque rupture in humans and mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27 (4), 705-713 (2007).
  8. de Rita, O., Hackam, D. G., Spence, J. D. Effects of aldosterone on human atherosclerosis: plasma aldosterone and progression of carotid plaque. Canadian Journal of Cardiology. 28 (6), 706-711 (2012).
  9. Ivanes, F., et al. Aldosterone, mortality, and acute ischaemic events in coronary artery disease patients outside the setting of acute myocardial infarction or heart failure. European Heart Journal. 33 (2), 191-202 (2012).
  10. McGraw, A. P., et al. Aldosterone increases early atherosclerosis and promotes plaque inflammation through a placental growth factor-dependent mechanism. Journal of the American Heart Association. 2 (1), e000018(2013).
  11. Rittie, L. Method for Picrosirius Red-Polarization Detection of Collagen Fibers in Tissue Sections. Methods in Molecular Biology. 1627, 395-407 (2017).
  12. Caprio, M., et al. Functional mineralocorticoid receptors in human vascular endothelial cells regulate intercellular adhesion molecule-1 expression and promote leukocyte adhesion. Circulation Research. 102 (11), 1359-1367 (2008).
  13. Marzolla, V., et al. Essential role of ICAM-1 in aldosterone-induced atherosclerosis. International Journal of Cardiology. 232, 233-242 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wlew aldosteronuanaliza korzenia aortybarwienie Oil Red Okwantyfikacja makrofag wzatapianie tkanki sercakonserwacja w OCTtechnika kriosekcjonowania

Powiązane artykuły