Artykuł metodologiczny

Test komórkowy do badania kurczliwości miozyny II niezwiązanej z mięśniami za pośrednictwem szlaku sygnałowego zagiętego gastrulacji w komórkach S2R + Drosophila

9.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58325

⸱

19 sierpnia 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biology, Reed College, 3Carolina Center for Genome Sciences, The University of North Carolina at Chapel Hill, 4Lineberger Comprehensive Cancer Center, The University of North Carolina at Chapel Hill

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy test kurczliwości z użyciem komórek Drosophila S2R+. Zastosowanie egzogennego liganda, gastrulacji fałdowej (Mgła), prowadzi do aktywacji szlaku sygnałowego Mgły i kurczliwości komórek. Test ten można wykorzystać do zbadania regulacji białek kurczliwości komórkowej w szlaku sygnałowym mgły.

Streszczenie

Opracowaliśmy test oparty na komórkach z wykorzystaniem komórek Drosophila, który podsumowuje zwężenie wierzchołkowe zainicjowane przez fałdowaną gastrulację (Fog), wydzielany morfogen nabłonkowy. W tym teście Fog jest używany jako agonista do aktywacji Rho poprzez kaskadę sygnalizacyjną, która obejmuje receptor sprzężony z białkiem G (Mist), białko Gα12/13 (Concertina / Cta) i czynnik wymiany nukleotydów guaniny zawierający domenę PDZ (RhoGEF2). Sygnalizacja mgły powoduje szybką i dramatyczną reorganizację cytoszkieletu aktynowego w celu utworzenia kurczliwego sznurka torebki. Rozpuszczalna mgła jest zbierana ze stabilnej linii komórkowej i stosowana ektopowo do komórek S2R +, co prowadzi do zmian morfologicznych, takich jak zwężenie wierzchołkowe, proces obserwowany podczas procesów rozwojowych, takich jak gastrulacja. Test ten nadaje się do wysokoprzepustowych badań przesiewowych, a przy użyciu RNAi może ułatwić identyfikację dodatkowych genów zaangażowanych w ten szlak.

Wprowadzenie

Badania embriogenezy przeprowadzone na modelowych organizmach genetycznych okazały się nieocenione dla naszego zrozumienia, w jaki sposób komórki są składane w tkanki. Badania nad Drosophila melanogaster, w szczególności, doprowadziły do identyfikacji kluczowych genów i zasad biologicznych, które kierują morfogenezą i rozwojem organizmów od zapłodnienia do dorosłości1,2,3. Równolegle do badań genetycznych prowadzonych na Drosophila, wyhodowane linie komórkowe pochodzące z tkanek muszek owocowych stały się również potężnym systemem do rozwiązywania szerokiego zakresu pytań molekularnych i biologicznych komórek4,5,6. Komórki hodowli tkankowej Drosophila mają minimalne wymagania dotyczące konserwacji, ponieważ są hodowane w temperaturze pokojowej i bez CO2 . W związku z tym są podatne na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości i mają wysoki stopień podatności na hamowanie genów przez RNAi6,7. Wiele grup wykorzystało komórki hodowli tkankowej Drosophila jako narzędzie do odkrywania genów zaangażowanych w definiowanie kształtu komórki, dynamiki cytoszkieletu, żywotności, fagocytozy i szlaków transdukcji sygnału4,8,9,10,11. Stosowane jako model wraz z całym zwierzęciem, hodowane linie komórkowe Drosophila oferują zestaw bardzo uzupełniających się podejść, które przyspieszają identyfikację cząsteczek ważnych dla rozwoju i zapewniają ramy, w których można określić ich mechanistyczne role12. W tym miejscu opisujemy test oparty na komórkach w celu zbadania szlaków sygnałowych, które wywołują zwężenie wierzchołkowe za pośrednictwem szlaku złożonego gastrulacji (mgły)13,14. Ten oparty na komórkach test kurczliwości pozwala naukowcom zbadać zarówno szlak sygnałowy mgły, jak i mechanizmy molekularne, które regulują kurczliwość miozyny II poza mięśniami.

Gastrulacja wczesnego zarodka Drosophila była badana przez wiele lat jako model genetyczny dla morfogenezy nabłonka i komórkowego przejścia od tożsamości komórki nabłonkowej do mezenchymalnej. Jednym z kluczowych zdarzeń gastrulacji jest morfogeneza podzbioru komórek nabłonkowych wzdłuż embrionalnej brzusznej linii środkowej od kształtu kolumnowego do piramidalnego15,16,17,18. Ta prosta zmiana kształtu komórki powoduje internalizację przypuszczalnych komórek mezodermalnych i jest napędzana przez aktywność motoryczną miozyny II niemięśniowej zwężającej sieć aktyny16,19,20. Dziesięciolecia badań genetycznych zidentyfikowały molekularne składniki tego szlaku i umieściły je kolejno w następującej kolejności: 1) Mgła jest wydzielana z domeny wierzchołkowej komórek nabłonka w brzusznej linii środkowej; 2) Mgła wiąże się z koreceptorami sprzężonymi z białkiem G, Mgłą i Smogiem, i sygnalizuje przez heterotrimeryczny kompleks białka G zawierający podjednostkę Gα12/13 Concertina (Cta), która jest nadzorowana przez niekanoniczny GEF Ric-8; 3) Cta aktywuje czynnik wymiany nukleotydów guaniny, RhoGEF2, który z kolei aktywuje małe białko G Rho1; 4) Rho1 aktywuje kinazę Rho (Rok); 5) Rok aktywuje kurczliwość miozyny II niemięśniowej w domenie wierzchołkowej poprzez fosforylację regulatorowego łańcucha lekkiego (RLC), powodując w ten sposób zwężenie wierzchołkowe (Rysunek 1)15,21,22,23,24,25,26,27,28,29. Mutacje w kilku z tych składników zakłócają normalne gastrulowanie i inne ruchy morfogenetyczne, w tym tworzenie krążka skrzydłowego i gruczołów ślinowych, co wskazuje, że szlak ten jest używany na kilku etapach embriogenezy Drosophila30,31,32. Szlak mgły jest jednym z najlepiej przebadanych modeli kształtowania nabłonka i dostarczył ważnych informacji na temat tego, w jaki sposób morfogeneza na poziomie tkanki jest regulowana od transkrypcji genów do ruchów komórek sterowanych cytoszkieletem14,15,21.

Opracowaliśmy test kurczliwości oparty na komórkach, który podsumowuje wiele odpowiedzi komórkowych poniżej Mgły, które zaobserwowano u rozwijających się zarodków much17. Zaprojektowaliśmy stabilną linię komórkową S2, która wyraża mgłę znakowaną na jej C-końcu za pomocą myc pod kontrolą indukowalnego promotora metallotioniny, który można zebrać po dodaniu siarczanu miedzi (CuSO4) do pożywki. Gdy pożywka kondycjonowana mgłą jest nakładana ektopowo na komórki Receptorów S2+ (S2R+), które są podlinią komórek S2 wyróżniających się różnicową ekspresją receptorów, takich jak podjednostki Frizzled i integryny, komórki przechodzą reorganizację cytoszkieletu bardzo przypominającą zwężenie wierzchołkowe12,17,27,33. Zmiany te można zaobserwować za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym, w której leczenie mgłą prowadzi do pojawienia się ciemnych fazowo zmarszczek wskazujących na promienisty wzrost kurczliwości miozyny II niemięśniowej, lub za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, w której leczenie mgłą prowadzi do powstania niemięśniowych pierścieni miozyny II w komórkach wyrażających RLC34 oznaczone EGFP. Pierścienie te zawierają fosforylowany przez miozynę regulatorowy łańcuch lekki (pRLC) widoczny za pomocą barwienia immunologicznego23,34,35. Ta reakcja wywołana mgłą wymagała Cta, RhoGEF2, Rho i Rok; w ten sposób, używając rekombinowanych komórek Fog-Myc i S2R+, ustaliliśmy sposób na zbadanie zwężenia wywołanego mgłą w systemie opartym na kulturze tkankowej24,25,34.

Protokół

1. Utrzymanie komórek hodowli tkankowej Drosophila

  1. Utrzymuj komórki S2R+, S2R+:RLC-EGFP i S2:Fog-Myc w temperaturze pokojowej, najlepiej między 20 °C a 25 °C, w pożywce dla owadów Shield i Sang M3 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 100 jednostkami/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 amfoterycyny B o gęstości nie mniejszej niż 5 x 105 komórek/ml.
    UWAGA: Niższe zagęszczenie komórek prowadzi do śmierci.
  2. Szybko rozmrozić kriokonserwowane fiolki z komórkami i przenieść je do kolby do hodowli tkankowej. Rozpocząć od małej kolby do hodowli tkankowych (12,5cm2 lub 25cm2) w objętości 4-5 ml pożywki do hodowli komórkowych, aż do ustabilizowania się kultury i ustąpienia objawów śmierci komórki w wyniku rozmrażania.
    UWAGA: Oznaki śmierci komórki w wyniku rozmrażania obejmują nieprzylegające komórki, które nie mają gładkiego, zaokrąglonego kształtu i małych ciemnych kawałków szczątków komórkowych w pożywce do hodowli tkankowej, co wskazuje na komórki martwicze.
  3. Powoli zwiększaj rozmiar hodowli tkankowej, pozwalając komórkom rosnąć bez zakłóceń przez kilka dni (4 - 8 dni) do 100% zgrywania, gdzie przestrzeń między komórkami jest niewielka lub nie ma jej wcale i zaczynają się one gromadzić jedna na drugiej. Przenieś wszystkie komórki z tej w 100% zlewającej się mniejszej kolby o średnicy 12,5 cm2 lub 25 cm2 do większej kolby do hodowli tkankowej (o długości 75 cm2) uzupełnionej 10 ml pożywki do hodowli komórkowych.
    UWAGA: Utrzymanie komórek w kolbie o średnicy 75cm2 zapewni wystarczającą ilość komórek do większości eksperymentów.
  4. Przepuszczaj komórki co 3 - 4 dni, pipetując pożywkę do hodowli komórkowych w górę iw dół, używając jej do usunięcia luźno przylegających komórek z plastiku do hodowli tkankowej. Przenieść to podłoże, zawierające teraz zawieszone komórki, do świeżej kolby. Rozcieńczyć komórki w stosunku 1:4 świeżą pożywką do hodowli komórkowych przy każdym pasażu i powtórzyć w razie potrzeby.

2. Leczenie RNAi komórek S2R+ Drosophila

UWAGA: Szczegółowe instrukcje znajdziesz w Rogers and Rogers6, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące produkcji dsRNA odpowiedniego do hodowli owadów.

  1. Przenieść komórki S2R + na 6-dołkową lub 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej o gęstości sprzyjającej żywotności, nie mniejszej niż 5 x 105 komórek/ml, przy użyciu kompletnych pożywek do hodowli komórkowych Shield i Sang M3 do zabiegów RNAi.
  2. Pracując w kapturze do hodowli tkankowych, usuń starą pożywkę do hodowli komórkowych, delikatnie przechylając 6-dołkową lub 12-dołkową płytkę do hodowli tkankowej i zasysając pożywkę do hodowli komórkowych za pomocą pipety. Szybko zastąp tę starą pożywkę do hodowli komórkowych 1 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych, pipetując ją do każdej studzienki.
    UWAGA: Można to zrobić bez znacznych strat po pozostawieniu komórek luźno przylegających przez 30 - 45 minut przed wymianą pożywki do hodowli komórkowych.
  3. Dodać 10 μg/ml dsRNA, które zostało wygenerowane zgodnie ze szczegółowym protokołem w Rogers and Rogers6, pipetując je bezpośrednio do pożywki do hodowli tkankowej każdej studzienki komórek na warunek RNAi.
  4. Powtarzaj tę procedurę codziennie, zastępując pożywkę do hodowli komórkowych 1 ml świeżej pożywki i 10 μg/ml dsRNA na warunek RNAi.
    UWAGA: Eksperymenty RNAi są zwykle przeprowadzane przez 7 dni; jednak dokładny czas zależy od obrotu białek i skuteczności dsRNA. Leczenie RNAi tak krótkie jak 3 d skutecznie wyczerpuje komórki z niektórych białek, podczas gdy inne cele wymagają dłuższych zabiegów6.

3. Produkcja i zbiór mgły

  1. Zwiększ wzrost komórek S2: Fog-Myc, pozwalając im rosnąć bez zakłóceń przez 4 - 8 dni, aby uzyskać prawie 100% zlewającą się 75-centymetrową kolbę komórek 2 w 10 ml pożywki do hodowli komórkowej (lub alternatywnie, 150-cm2 kolby w 20 ml pożywki do hodowli komórkowych), aby zmaksymalizować produkcję mgły.
  2. Dodać 50 μl 100 mMCuSO4 (lub 100 μL 100 mMCuSO4 dla kolby o średnicy 150cm2) do prawie 100% zlewającej się kolby o długości 75cm2 w celu indukcji promotora metalotioniny. Inkubować przez 48 godzin w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć pożywkę zawierającą Fog-Myc z kolby do hodowli tkankowych za pomocą pipetowania i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml. Wirować przy 2 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 - 15 minut w celu oczyszczenia podłoża z komórek i resztek komórkowych.
  4. Przenieś oczyszczoną pożywkę komórkową do nowej stożkowej probówki i utrzymuj ją na lodzie. Pracując partiami, przenieś 5 ml oczyszczonej pożywki do 15 ml koncentratorów o mocy 3 000 MW z membranami z regenerowanej celulozy i odwiruj je przy 2 500 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut za każdym razem, aby zagęścić pożywkę.
    UWAGA: Alternatywnie można użyć koncentratora o większej pojemności (50 ml). Podczas koncentracji na dnie filtra w kształcie litery V zacznie gromadzić się ciemniejsze zabarwione medium, które jest wzbogacone mgłą.
  5. Włóż końcówkę pipety do dolnej części litery "V" koncentratora i usuń ciemniejsze media między każdą rundą wirowania i przenieś je do świeżej probówki do mikrofugowania o pojemności 1,7 ml. Utrzymuj podłoże na lodzie.
  6. Używając tego samego koncentratora, powtórzyć kroki 3.4 i 3.5, usuwając ciemniejszą zabarwioną skoncentrowaną pożywkę Fog-Myc i zastępując ją bardziej wstępnie oczyszczoną pożywką, aż pożywka zostanie zagęszczona do 1/10 swojej pierwotnej objętości (tj. 1 ml z 10 ml materiału wyjściowego).
  7. Przechowywać skoncentrowany Fog-Myc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Po przechowywaniu należy monitorować zanieczyszczenie bakteryjne, które może wynikać z dłuższych okresów przechowywania.
  8. Wykonać SDS-PAGE, mieszając 10 μl skoncentrowanej pożywki Fog-Myc z 10 μl denaturującego buforu zawierającego SDS w celu wytworzenia lizatu. Uruchom żel SDS-PAGE przy natężeniu 35 mA przez około 1 godzinę. Przenieść żel na membranę nitrocelulozową (lub alternatywnie membranę PVDF) na 1 godzinę w temperaturze 120 mA. Wykonaj western blot przy użyciu dowolnego dostępnego na rynku przeciwciała Myc, aby wykryć pasmo 150 kDa.
    UWAGA: Stężenie Fog-Myc w kondycjonowanym podłożu może się różnić w zależności od partii. Nie jest konieczne określenie dokładnego stężenia Fog-Myc w celu przeprowadzenia testu, ale skuteczność każdej partii powinna zostać przetestowana przed przeprowadzeniem eksperymentu.
  9. Wykonując kroki 3.1 - 3.2, przygotować kontrolną pożywkę kondycjonowaną S2, zbierając 10 ml pożywki do hodowli komórkowych z prawie 100% zlewającej się kolby o długości 75cm2 komórek S2 (lub, alternatywnie, 20 ml z kolby o długości 150cm2) przez pipetowanie. Przenieś kontrolną pożywkę do hodowli komórek S2 do świeżej stożkowej probówki o pojemności 15 ml lub 50 ml.
  10. Wykonując kroki 3.4 - 3.7, oczyścić lizat z komórek i resztek komórkowych przez odwirowanie (przy 2 500 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut za każdym razem), a następnie przenieść oczyszczony lizat komórkowy do koncentratorów i odwirować je w celu zagęszczenia pożywki kontrolnej w partiach do 1/10 pierwotnej objętości.
    UWAGA: Zastosowanie pożywek kondycjonowanych S2 nie prowadzi do znacznej kurczliwości komórek w teście.
  11. Skoncentrowaną pożywkę kontrolną S2 należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
    UWAGA: Po przechowywaniu należy monitorować zanieczyszczenie.

4. Przygotowanie naczyń ze szklanym dnem pokrytych konkanawaliną-A i posiewanie komórek S2R+

  1. Uzupełnić 10 ml roztworu konkanawaliny A (con A), rozpuszczając 5 mg konu A w 10 ml wody, uzyskując końcowe stężenie 0,5 mg/ml. Roztwór ten podzielić na dogodniejsze objętości (od 500 μl do 1 ml) i przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Przygotować naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm, pokrywając szklaną część każdego naczynia 200 μl roztworu con A i inkubować szalki przez około 2 minuty w temperaturze pokojowej w okapie do hodowli tkankowych. Następnie usuń cały roztwór con A (który można zachować i ponownie wykorzystać do przyszłych eksperymentów) i pozostaw naczynia do całkowitego wyschnięcia na powietrzu.
    UWAGI: Potrawy można przygotowywać w dużych partiach i można je przechowywać do 6 miesięcy w suchym miejscu, takim jak szuflada stołu laboratoryjnego.
  3. Dodaj około 2 ml świeżej pożywki do hodowli komórkowych do każdego naczynia ze szklanym dnem. Ponownie zawiesić komórki S2R+, które mają być badane za pomocą testu, pipetując pożywkę do hodowli komórkowej w górę iw dół, używając jej do odłączenia luźno przylegających komórek.
  4. Przenieś ponownie zawieszone komórki S2R+ do 35-milimetrowych naczyń ze szklanym dnem zawierających pożywkę do hodowli świeżych komórek, tak aby zlewały się w 50% - 70%. Sprawdź gęstość komórek pod mikroskopem hodowli tkankowych, skupiając się w górę iw dół na kilku płaszczyznach komórek zawieszonych w pożywce, aby uzyskać szacunkową liczbę komórek.
    UWAGA: Metodą prób i błędów można osiągnąć odpowiednią gęstość komórek potrzebną do osiągnięcia 50% - 70% zbieżności.
  5. Pozwól komórkom przymocować się do naczyń ze szklanym dnem pokrytych kon-A przez 45 - 60 minut.
    UWAGA: W pełni przyłączone komórki S2R+ wyglądają jak jajko sadzone, są spłaszczone i ciemne fazowo.

5. Test skuteczności pożywki kondycjonowanej mgłą oraz test kurczliwości komórkowej

  1. W razie potrzeby potwierdź wydajność Fog-Myc wyprodukowanego i skoncentrowanego ze stabilnych linii komórek S2:Fog-Myc za pomocą SDS-PAGE i western blot. Dodać 10 μl buforu do próbki zawierającego SDS do 10 μl stężonego Fog-Myc i gotować przez 5 minut. Postępuj zgodnie ze standardowymi protokołami SDS-PAGE i western blotting i osusz anty-Myc, aby potwierdzić produkcję Fog-Myc.
  2. Delikatnie pipetując i delikatnie odpipetować wszystkie pożywki Shield i Sang M3 z dołączonych komórek S2R+ z kroku 4.3 i ostrożnie dodać z powrotem 75 μl świeżej pożywki Shield i Sang, aby ograniczyć ilość użytej pożywki kondycjonowanej mgłą.
  3. Dodać 75 μl pożywki kondycjonowanej mgłą do szklanej części naczynia ze szklanym dnem z kroku 5.2, aby uzyskać całkowitą objętość do 150 μl, w stosunku 1:1 między mediami kondycjonowanymi we mgle a pożywkami Shield i Sang M3.
    UWAGA: Całkowita objętość 150 - 200 μL jest potrzebna do pełnego pokrycia szklanej części typowego naczynia ze szklanym dnem; Będzie to jednak zależało od wymiarów użytego naczynia ze szklanym dnem.
  4. Monitoruj kurczliwość komórek za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym przy użyciu 20-krotnego lub 40-krotnego powiększenia, aby obserwować całe pole komórek. Śledź morfologię komórek i szukaj naprzemiennego wzoru fazy ciemnej i fazy jasnej wskazujący na zmianę kształtu.
    UWAGA: Zastosowanie mgły zazwyczaj prowadzi do zwężenia komórek S2R + u 30% - 50%, a po 10 minutach komórki zaczynają się rozluźniać, powracając do swojej gładkiej morfologii przypominającej jajko sadzone.
  5. Monitoruj odporność kurczliwości komórkowej. Jeśli odpowiedź komórki jest bardzo silna przy użyciu stosunku 1:1 pożywki kondycjonowanej mgłą do świeżej pożywki Shield i Sang, zmniejsz ilość pożywki kondycjonowanej mgłą, aby zachować skoncentrowaną pożywkę Fog-Myc do przyszłych eksperymentów. Użyć nierozcieńczonej pożywki kondycjonowanej mgłą, jeśli stosunek 1:1 nie prowadzi do silnego zwężenia komórek; Ogólnie rzecz biorąc, stosunek 1:3 daje wystarczającą odpowiedź, aby pomyślnie przeprowadzić eksperyment.
    UWAGA: Po ustaleniu odpowiedniego stosunku pożywki kondycjonowanej mgłą do świeżej pożywki Shield i Sang dla danej partii pożywki kondycjonowanej mgłą, należy użyć tego stosunku do wszystkich innych eksperymentów.
  6. Monitoruj dynamikę miozyny II niezwiązanej z mięśniami podczas testu kurczliwości komórkowej przy użyciu stabilnej linii komórkowej S2R +, która wyraża regulatorowy łańcuch lekki znakowany GFP (S2R+: Sqh-EGFP).
  7. Stosując ustalony stosunek pożywki kondycjonowanej we mgle do świeżej pożywki Shield i pożywki Sang M3 z kroków 5.2 - 5.5, usunąć pożywkę z hodowli komórkowej za pomocą pipety i dodać z powrotem świeżą pożywkę Shield i Sang do szklanej części naczynia ze szklanym dnem. Perfuse Pożywka kondycjonowana mgłą w określonym stosunku, uzyskując sekwencję obrazów żywych komórek; Uważaj, aby nie przesunąć naczynia ze szklanym dnem podczas perfuzji.

6. Utrwalanie i barwienie zwężonych komórek S2R+

  1. Napraw komórki S2R + za pomocą 10% roztworu paraformaldehydu w buforze PEM (rury 100 mM, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH 6,9).
    UWAGA: Bufor PEM jest zwykle wytwarzany w 2 x roztworze podstawowym i może być przechowywany przez miesiące w temperaturze 4 °C.
  2. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z komórek S2R + poddanych działaniu mgły za pomocą pipetowania i natychmiast zastąpić ją 1,5 - 2,0 ml 10% roztworu paraformaldehydu. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Utrwalone komórki można przechowywać w roztworze utrwalającym w temperaturze 4 °C przez kilka dni; Ważne jest jednak, aby początkowe 15-minutowe utrwalanie zostało wykonane w temperaturze pokojowej przed przeniesieniem komórek do 4 °C.
  3. Usunąć 10% roztwór paraformaldehydu za pomocą pipetowania i odpowiednio zutylizować ten organiczny produkt odpadowy. Wypłucz komórki, delikatnie pipetując 1,5 - 2,0 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Usuń stary PBS przez pipetowanie i zastąp go 1,5 - 2,0 ml świeżego PBS 2x więcej, aby usunąć resztki roztworu utrwalającego.
    UWAGA: Ważne jest, aby komórki nie wysychały od tego momentu w protokole.
  4. Zablokuj komórki około 200 μl 5% normalnej surowicy koziej rozcieńczonej w PBS, który został uzupełniony 0,1% niejonowym detergentem (PBST) przez 20 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Zazwyczaj roztwory blokujące zawierają surowicę pasującą do organizmu, w którym powstają przeciwciała drugorzędowe.
  5. Przygotować pierwszorzędowy roztwór przeciwciała, rozcieńczając go w PBST. Użyj objętości około 200 μl, aby całkowicie przykryć szklaną część naczynia ze szklanym dnem.
    1. Usunąć roztwór blokujący przez pipetowanie i dodać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała bezpośrednio do szklanej części naczynia. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub, alternatywnie, inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Podczas inkubacji przez noc w temperaturze 4 °C owinąć naczynie ze szklanym dnem o średnicy 35 mm w parafilm, aby zapobiec parowaniu.
  6. Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała przez pipetowanie i przepłukać komórki, pipetując 1,5 - 2,0 ml świeżego PBS do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Usunąć PBS przez pipetowanie i zastąpić go 1,5 - 2,0 ml świeżego PBS 2 razy więcej.
  7. Przygotować roztwór przeciwciała drugorzędowego, rozcieńczając go w PBST. Objętość 200 μl jest wystarczająca, aby przykryć tylko szklaną część naczynia.
    1. Dodaj roztwór przeciwciał wtórnych bezpośrednio do szklanej części naczynia. Inkubować komórki z roztworem przeciwciał drugorzędowych przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.
    2. Owiń 35-milimetrową naczynie parafilmem w przypadku inkubacji przez noc, aby zapobiec parowaniu.
  8. Usunąć roztwór przeciwciała drugorzędowego przez pipetowanie i przepłukać komórki PBS, pipetując 1,5 - 2,0 ml świeżego PBS do naczynia. Usuń stary PBS i wymień go jeszcze 2 razy, postępując zgodnie z tą samą procedurą.
  9. Zachowaj utrwalone i poplamione komórki, dodając wystarczającą ilość fluorescencyjnego medium montażowego zapobiegającego blaknięciu, aby pokryć szklaną część naczynia o średnicy 35 mm ze szklanym dnem.
  10. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C, z dala od światła.
    UWAGA: Sygnał fluorescencyjny będzie powoli zanikał przez miesiące, nawet jeśli jest prawidłowo przechowywany. Aby uzyskać najlepsze wyniki, zobrazuj w ciągu tygodnia.

7. Obrazowanie i kwantyfikacja testu kurczliwości komórkowej

  1. Obrazuj utrwalone komórki S2R+ za pomocą standardowego mikroskopu światła odwróconego z możliwością obrazowania kontrastu fazowego, DIC lub fluorescencji. Korzystając z powiększenia 20X lub 40X, uchwyć 10-30 nienakładających się na siebie pól obrazu komórek w zależności od gęstości komórek, w celu uzyskania obrazów 200 lub więcej komórek na warunek.
  2. Korzystając ze standardowego licznika komórek, policz i zapisz liczbę komórek zwężonych (z ciemną fazą, z maską) i nieskurczonych komórek na każde przechwycone pole.
    UWAGA: Najlepiej jest, aby dwóch badaczy dokonało niezależnego liczenia zakontraktowanych i niezakontraktowanych komórek na pole, lub alternatywnie, ten sam badacz może policzyć to samo pole obrazu komórek trzy razy, co pozwala na obliczenie średniej liczby zakontraktowanych i niezakontraktowanych komórek na pole.
  3. Przygotować kilka naczyń ze szklanym dnem pokrytych kon-A w każdym warunku doświadczalnym, jak opisano w kroku 4.2. Pipetować w górę iw dół pożywki do hodowli komórkowych, aby usunąć luźno przylegające komórki S2R+:Sqh-EGFP i pokryć je tak, aby zlewały się w 50% - 70% w 35-milimetrowych naczyniach ze szklanym dnem. Pozwól komórkom przyczepić się przez 30-45 minut.
  4. Zobrazuj komórki S2R+:Sqh-EGFP na żywo za pomocą mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem i polem zamiatanym lub mikroskopii z arkuszami świetlnymi przy powiększeniu 60X - 100X. Usuń całą pożywkę Shield i Sang M3 z naczynia ze szklanym dnem zawierającego przyłączone komórki S2R+:Sqh-EGFP.
    1. Za pomocą pipety należy przelać wcześniej ustalony stosunek pożywki kondycjonowanej Fog-Myc do świeżej pożywki Shield i Sang M3 z kroków 5.2 - 5.5 bezpośrednio na szklaną część naczynia ze szklanym dnem, uważając, aby nie zakłócić położenia naczynia na obiektywie. Rejestruj obrazy przez 12 - 15 minut, aby uchwycić inicjację i pełne kurczenie się komórek S2R+:Sqh-EGFP.
      Uwaga: W przypadku barwienia miozyny niemięśniowej lub miozyny-pRLC, tworzenie się ciasnego pierścienia miozyny na powierzchni komórek również wskazuje na kurczliwość. Jeśli obrazowanie komórek S2R+:Sqh-EGFP jest żywe, RLC oznaczone EGFP utworzą podobne ciasne pierścienie (patrz Rysunek 3) wskazujące na kurczliwość. Zmiana kształtu, która nastąpi, spowoduje, że komórki "zatkają się", przyjmując kształt 3D; Płaszczyzna ostrości mikroskopu może wymagać regulacji, aby śledzić tę zmianę kształtu komórki. W kontrolowanych warunkach RNAi zazwyczaj 30% - 50% komórek ulega zwężeniu po dodaniu mgły. Należy pamiętać, że niektóre warunki RNAi mogą prowadzić do zwężenia przy braku mgły.

Wyniki

Komórki S2 oraz S2:Fog-Myc hodowano do niemal pełnego stopnia zrastania w kolbach do hodowli tkankowej o powierzchni 150-cm2 i poddawano działaniu 25 - 75 µM CuSO4 przez okres 24 - 48 godzin w celu indukcji ekspresji Fog-Myc (Rysunek 2). Pobrano próbki z komórek S2 (Rysunek 2A) oraz komórek S2:Fog-Myc (Rysunek 2B), a produkcję Fog-Myc monitorowano za pomocą metody western blot. Zgodnie z przewidywaniami, nie wykryto Fog-Myc w pośrodkach pobranych z komórek S2 w żadnych warunkach. Jednakże wykryto Fog w pośrodkach pobranych ze stabilnej linii komórkowej S2:Fog-Myc już 24 godziny po indukcji 75 µM CuSO4. Komórki S2R+ przytwierdzono do szkiełek z dnem szklanym pokrytych kon-A, wykazując ekspresję regulatorowego łańcucha lekkiego (GFP-RLC) miozyny II niemięśniowej z etykietą EGFP (Rysunki 3A i 3B). Obrazowanie żywych komórek przeprowadzono przy użyciu mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw 10X/1,4 NA podczas perfuzji pośrodka warunkowanego białkiem Fog. Około 5 minut po podaniu Fog-Myc, RLC tworzyły pierścienie świadczące o skurczu miozyny II niemięśniowej. Pierścienie te można zaobserwować poprzez immunobarwienie komórek S2R+ przeciwciałem skierowanym przeciwko syntetycznemu fosfopeptydowi odpowiadającemu resztom otaczającym Ser19 ludzkiego RLC miozyny (Rysunki 4A i 4B). Przeciwciało to wykazuje reaktywność krzyżową z RLC Drosophila.

Poniżej przedstawiono reprezentatywny przykład analizy kurczliwości komórkowej po 7-dniowej inkubacji komórek z kontrolnym RNAi oraz dsRNA przeciwko Rho1 (Rycina 5A - 5E). Komórki S2R+ wysiano na szalki z szklanym dnem pokryte konkanawalną A (con-A) i poddano działaniu pożywki warunkowanej przez Fog (+Fog) lub pożywki kontrolnej (-Fog). Następnie, po utrwaleniu, określono liczbę skurczonych komórek. Gęste w fazie fałdy świadczące o konstrikcji były wyraźnie widoczne w komórkach z kontrolnym wyciszeniem traktowanych pożywką warunkowaną przez Fog (Rycina 5B). Na Rycynie 5C komórki z wyciszonym Rho traktowane pożywką warunkowaną przez S2 stanowią typowy przykład morfologii z gładkimi krawędziami, przypominającej „smażone jajko”. Należy zauważyć, że Rho odgrywa rolę zarówno w szlaku sygnalizacyjnym Fog, jak i w cytokinezie; w związku z tym komórki z wyciszonym Rho często nie dzielą się prawidłowo, co prowadzi do zwiększenia rozmiaru komórek i ploidalności. Traktowanie komórek z kontrolnym wyciszeniem pożywką warunkowaną przez Fog zazwyczaj prowadzi do konstrikcji u 30% - 50% komórek, podczas gdy w komórkach z wyciszonym Rho nie zaobserwowano istotnej konstrikcji.

Schemat transdukcji sygnału, obecność względem braku Fog, obejmuje aktywację RhoGEF2, Rok i NMII.
Rysunek 1:Domniemany szlak sygnalizacyjny Fog. Wobec braku Fog, białko Gα12/13 podjednostka Concertina (Cta), wraz z jej partnerami wiążącymi Gϒ i Gβ, pozostaje nieaktywna i jest związana z koreceptorami Mist i Smog. Białko Ric-8 pełni rolę chaperonu dla Cta i reguluje jego lokalizację wewnątrzkomórkową. Po związaniu Fog, Cta dysocjuje od Gϒ, a Gβ rekrutuje RhoGEF2 do błony komórkowej, gdzie katalizuje ono wymianę GDP na GTP w małej GTPazie Rho1. Rho1 związana z GTP, obecnie aktywna, aktywuje kinazę Rho (Rok), która fosforyluje lekki łańcuch regulacyjny (RLC) miozyny niemięśniowej, prowadząc do jej aktywacji i w konsekwencji do kurczliwości komórkowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza Western blot ekspresji αMyc po traktowaniu CuSO₄, z porównaniem pośrodków S2 oraz Fog-myc.
Rysunek 2Krzywa czasowa produkcji Fog-Myc. Panele te przedstawiają pożywkę hodowlaną pobraną z kolby z niemal 10% konfluencją (A) kontrolne komórki S2 lub (B) S2:stabilne komórki Fog-Myc. Komórki poddano działaniu 25 - 75 µM CuSO₄4 przez okres od 24 do 48 godzin. Pożywkę hodowli komórkowej zebrano i przygotowano do elektroforezy SDS-PAGE oraz analizy western blot. Białko Fog-Myc wykryto za pomocą przeciwciała anty-Myc. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat time-lapse struktury komórkowej; fluorescencja RLC-EGFP; dynamika lokalizacji białek.
Rysunek 3Obrazowanie żywych komórek w procesie zwężenia indukowanego przez Fog. Stabilne linie komórkowe S2R+ wykazujące ekspresję RLC miozyny II niemięśniowej z tagiem EGFP obrazowano za pomocą konfokalnej mikroskopii przeskanowanej (swept-field confocal microscopy) podczas perfuzji pożywki warunkowanej komórkami Fog. Czas podano w minutach i sekundach.A) Na tym panelu przedstawiono obraz płaszczyzny ogniskowej znajdującej się blisko styku komórki z szkiełkiem podstawnym w czasie 0:0, przed perfuzją Fog-Myc. (BTen panel przedstawia serię czasową (0:30 – 10:0) obrazów wykonanych w płaszczyźnie ogniskowej w pobliżu górnej części komórki. Białe strzałki wskazują reorganizację nie mięśniowej miozyny II (oznaczonej EGFP-RLC) w pierścienie kurczliwe podczas przewężenia. Pasek skali wynosi 10 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający barwienie aktyny, pRLC i DNA w próbkach komórkowych, porównanie.
Rysunek 4Fosforylowana RLC lokalizuje się w pierścieniach kurczliwych po indukowaniu skurczu przez Fog-Myc. Komórki S2R+ utrwalono i wybarwiono w celu wykrycia aktyny przy użyciu faloidyny (czerwony), fosforylowanej RLC przy użyciu przeciwciała przeciwko fosforylowej serynie-19 (zielony) oraz DAPI (DNA, niebieski), po zastosowaniuA) kontrolna lub (B) Pożywka warunkowana Fog-Myc. Zauważ reorganizację fosforylowanego RLC w pierścienie po dodaniu Fog-Myc. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Kurczliwość komórek, test RNAi Rho, obrazy mikroskopowe, efekt pożywki fog, wykres frakcji skurczu.
Rysunek 5Reprezentatywna analiza ilościowa testu kurczliwości komórkowej indukowanej przez Fog. Komórki S2R+ poddano działaniu (A i B) kontrolne RNAi lub (C i D) dsRNA przeciwko małej GTPazie Rho1 przez 7 dni. Po tym czasie komórki wysiano na szalki z szklanym dnem pokryte kon-A i poddano działaniu (A i C) pożywka kontrolna lub (B i D) Pośrodki warunkujące Fog-Myc. Pasek skali reprezentuje 10 µm. (E) Wykres punktowy przedstawia średnią oraz 95-procentowe przedziały ufności dla frakcji skurczonych komórek w zależności od warunków. Poszczególne punkty reprezentują frakcję skurczonych komórek w jednym polu widzenia przy powiększeniu 40X (10–120 komórek na pole), a liczby w nawiasach wskazują całkowitą liczbę policzonych komórek (zarówno skurczonych, jak i nieskurczonych) w trzech oddzielnych eksperymentach RNAi. Gwiazdkami oznaczono różnicę statystycznie istotną między warunkami z zastosowaniem RNAi a warunkami z zastosowaniem Fog, wyznaczoną za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA (p < 0,01) przy użyciu testu wielokrotnych porównań Tukeya post hoc analiza. Należy zauważyć, że nie stwierdzono statystycznie istotnej różnicy (n.s.) pomiędzy próbkami poddanymi RNAi Rho1 traktowanymi kontrolą a próbkami traktowanymi pożywką warunkowaną komórkami Fog-Myc. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ilustracji.

Dyskusja

W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół testu kurczliwości opartego na komórkach przy użyciu linii komórkowej hodowli tkankowej Drosophila (komórki S2R +), która ulega zwężeniu miozyny II bez mięśni w odpowiedzi na sygnalizację mgły. Ten test jest przydatny do badania szlaku mgły, a także mechanizmów regulujących kurczliwość miozyny II niemięśniowej.

Rozważania dotyczące hodowli komórkowych:
Warunki, w których utrzymywane są komórki S2R+, mają kluczowe znaczenie dla uzyskania wiarygodnych danych z tego testu. Planując wykonanie testu kurczliwości, najlepiej utrzymać komórki S2R+ w pożywce dla owadów Shield i Sang M3. Podczas gdy komórki S2R+ mogą rozwijać się w innych pożywkach do hodowli komórek owadów (np. SF900 lub pożywce dla owadów Schneidera), często tracą reakcję na mgłę. Komórki S2R +, które mają wysoką liczbę pasaży, zwykle ponad 20 - 25 pasaży, zaczynają tracić wrażliwość na RNAi. Do wszystkich eksperymentów najlepiej jest używać komórek wczesnego pasażu. Innym ważnym aspektem eksperymentów z detrukcją RNAi jest wybór odpowiednich kontroli. Typowe kontrole negatywne obejmują dsRNA ukierunkowane na EGFP lub pBlueScript, z których żaden nie jest homologiczny do genomu muchy. Celowanie w białka w szlaku mgły (Rho, Rok itp.), które po wyczerpaniu zapobiegają aktywacji kurczliwości miozyny niemięśniowej, są również użytecznymi kontrolami. S2: Komórki Fog-Myc mogą być utrzymywane w alternatywnym pożywce do hodowli komórek, takiej jak SF900 uzupełniona 100 jednostkami / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny i 0,25 amfoterycyny B. Należy pamiętać, że FBS nie jest wymagany podczas hodowli komórek w SF900. Gęstość komórek jest również kluczowym elementem wszystkich aspektów hodowli tkankowej komórek Drosophila . W przeciwieństwie do komórek hodowli tkankowych ssaków, komórki hodowli tkankowej pochodzące od Drosophila najlepiej rozwijają się w wyższych gęstościach komórek (gęstości nie mniejsze niż 5 x 105 komórek/ml). Jednak podczas wykonywania tego testu bardzo ważne jest, aby komórki nie były posiewane na naczyniach ze szklanym dnem pokrytych koncentrycznym A powyżej 80% konfluencji, ponieważ kwantyfikacja komórek skurczonych i nieskurczonych stanie się niezwykle żmudna.

Krytyczne aspekty i alternatywne podejścia do testu kurczliwości komórkowej:
Produkcja Fog, ligandu, który wyzwala kurczliwość miozyny II poza mięśniami, jest kluczowym elementem tego testu. Gen mgły koduje białko składające się z 730 aminokwasów o przewidywanej masie cząsteczkowej ~78 kDa26. Analiza hydropatii ujawniła odcinek 12 hydrofobowych reszt na końcu aminowym Fog, które mogą funkcjonować jako sekwencja sygnału wydzielania. Ponadto sekwencja kodująca zawiera również wiele miejsc dla potencjalnej glikozylacji sprzężonej z N i O, co dodatkowo sugeruje, że Fog jest wydzielanym białkiem26. Na poparcie tego faktu Fog zlokalizowano w pęcherzykach wydzielniczych w przypuszczalnych komórkach naskórka ulegających zwężeniu wierzchołkowemu16. Ekspresja Fog-Myc została indukowana po dodaniu siarczanu miedzi do pożywki, a przeciwciała przeciwko Fog lub Myc rozpoznały białko 150 kD z pożywki hodowlanej zebranej z indukowanych kultur, ale nie z indukowanych pożywek z komórek S2 pozbawionych konstruktu Fog-Myc. Ta masa cząsteczkowa była wyższa niż przewidywana masa cząsteczkowa Fog wynosząca 80 kD i sugeruje, że maszyneria wydzielnicza komórek S2 może glikozylować białko przed egzocytozą. Ze względu na potencjalną zmienność w oczyszczaniu mgły, zaleca się stosowanie tej samej partii pożywek kondycjonowanych we mgle do wszystkich eksperymentów. Tworzenie dużych partii skoncentrowanych pożywek Fog-Myc pomoże w utrzymaniu spójności podczas wszystkich rund eksperymentów.

Powodzenie tego testu zależy również od pewnej identyfikacji komórek, które uległy zwężeniu. Podczas gdy zwężone komórki można obserwować za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, barwienia aktyny lub miozyny II bez mięśni, najbardziej niezawodnym sposobem identyfikacji i ilościowego określenia zwężonych komórek jest mikroskopia z kontrastem fazowym lub mikroskopia DIC. Dokładne zliczenia można uzyskać przy użyciu powiększenia 20X - 40X w większości standardowych mikroskopów świetlnych. Chociaż w zapisanym tutaj protokole użyto naczyń ze szklanym dnem, test można również przeprowadzić przy użyciu standardowych szkiełek nakrywkowych 1,5 szklanych pokrytych kon A. Dodanie mgły można przeprowadzić w 35 mm hodowli tkankowej na szkiełku nakrywkowym umieszczonym na parafolii, w celu ograniczenia ilości mgły używanej do każdego testu. Jakość utrwalenia jest krytycznym elementem testu, ponieważ źle utrwalone komórki mogą prowadzić do wyników fałszywie dodatnich. Stosowanie świeżego roztworu utrwalającego i upewnienie się, że komórki nigdy nie wysychają po utrwaleniu, doprowadzi do bardziej wiarygodnych wyników. Na koniec ważne jest, aby policzyć dużą liczbę komórek. Zazwyczaj tylko 30% - 50% komórek nieleczonych lub kontrolnych traktowanych RNAi zwęża się po perfuzji mgły. Istnieje jednak podstawowy poziom zwężenia, który występuje w komórkach S2R +, więc potrzebna jest duża liczba komórek, aby zapewnić, że jakakolwiek zmiana frakcji zwężonych komórek jest spowodowana leczeniem. Co więcej, wyczerpanie niektórych białek biorących udział w regulacji kurczliwości miozyny II niezwiązanej z mięśniami może prowadzić do hiperkurczliwości, nawet przy braku Fog. Przedstawione tutaj dane pochodzą z ponad 3600 komórek, które zostały policzone w trzech kolejnych zabiegach RNAi przy użyciu tej samej partii pożywki kondycjonowanej mgłą.

Zastosowania testu kurczliwości komórkowej:
Ten test kurczliwości, w połączeniu z metodami przesiewowymi RNAi, oferuje potężny system do badania sygnalizacji komórkowej, morfogenezy i kurczliwości komórek. Wcześniej był używany do identyfikacji jednego z dwóch koreceptorów mgły21. Ukierunkowane badanie przesiewowe 138 receptorów sprzężonych z białkiem G (GPCR) jest zubożone przez RNAi w komórkach S2R +, a jego zdolność do reagowania na Fog została przetestowana zgodnie z opisem w przedstawionym tutaj protokole. Spośród 138 GPCR odkryto pojedynczy, wcześniej niescharakteryzowany gen, obecnie znany jako Mist. Dalsze badania nad funkcją mgły wykazały, że była ona nie tylko niezbędna do indukowanej mgłą kurczliwości komórkowej w komórkach S2R+, ale była również niezbędna do gastrulacji w rozwoju Drosophila21. Co więcej, test ten został wykorzystany do wykazania, że Ric-8, niekanoniczny GEF, jest również składnikiem szlaku sygnałowego mgły27. Seria eksperymentów z RNAi epistazy w połączeniu z testem kurczliwości wykazała, że Ric-8 oddziałuje z podjednostką Gα12/13 Cta i działa w celu zlokalizowania jej w komórce, co ma kluczowe znaczenie dla kurczliwości komórkowej wywołanej mgłą31.

Hodowla tkankowa Drosophila jest odpowiednia dla nowicjuszy, ponieważ komórki są łatwe do utrzymania w temperaturze pokojowej, nie wymagają CO2 ani buforowanej pożywki do hodowli komórkowych i są wytrzymałe, o ile utrzymywana jest odpowiednia gęstość hodowli komórek. Test kurczliwości komórkowej został z powodzeniem przeprowadzony przez sekcję laboratoryjną kursu biologii komórki na studiach licencjackich, gdzie studenci mieli niewielkie lub żadne doświadczenie z hodowlą komórek lub mikroskopią. Przedstawiony tutaj test kurczliwości komórkowej stanowi potężne, oparte na komórkach narzędzie, które można wykorzystać do odkrywania genów lub do badania szlaku sygnałowego mgły, pomagając nam lepiej zrozumieć procesy rozwojowe, takie jak zwężenie wierzchołkowe i kurczliwość miozyny II bez mięśni, w ogóle.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować członkom Rogers Lab i Applewhite, Grecie Glover, oraz studentom kursu biologii komórkowej Reed College na wiosnę 2018 roku, którzy przyczynili się do rozwoju tego protokołu. Ponadto autorzy pragną podziękować członkom laboratorium Ritz za uważne przeczytanie i zredagowanie tego manuskryptu. Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Science Foundation w ramach nagrody numer 716964 dla D.A.A. i A.R. oraz Wydziału Biologii Reed College.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Komórki S2R+Centrum Badań Genomicznych Drosophila 150wykazuje kurczliwość po potraktowaniu Fog
S2:Fog-myc cellsDrosophila Genomics Resorce Center 218, wytwarza Fog-myc pod promotorem pMT
S2R + : komórki Sqh-EGFPCentrum Badań Drosophila Genomics 196linia hodowli komórkowych, stabilnie wyraża Sqh (RLC miozyny II bez mięśni) oznaczona EGFP
Shield i Sang M3Pożywka do hodowli komórkowychSigma-AldrichS3652
Pożywka dla owadów SF900Thermofisher Scientific12658019alternatywna pożywka dla komórek
Schneider' s pożywka dla owadówThermofisher Scientific 21720024alternatywne podłoże do cięcia komórek
Surowica bydlęcapłodu Thermofisher Scientific16000044suplement na podłoża
Antybiotykowo-przeciwgrzybicze (100X)Thermofisher Scientific15240112suplement na podłoża przeciwbakteryjne/przeciwfugalne
Concanavalin AMP Biomedicals150710stosowany do powlekania naczyń i szkiełek nakrywkowych do adhezji komórkowej
Szklane płyty denneMaktekP35G-1.5-10stosowany do oznaczania oraz do utrwalania i barwienia komórek
Szkiełka nakrywkoweszklane Corning2940-225alternatywa dla naczyń ze szklanym dnem
Koncentratory białkaMilliporeUFC90300830 000 odcięcia masy cząsteczkowej, używane do zagęszczania pożywek
25 cm2, 75 cm2, 150 cm2 kolby do hodowli tkankowychGenessee25-204,25-206,25-208,25-210służy do hodowli komórek
6-dołkowych i 12-dołkowych naczyń do hodowli tkankowychGenessee25-105, 25-106służy do hodowli komórek
Fluorescencyjne podłoże montażoweDakoS3023do konserwacji utrwalonych komórek
32% ParaformaldehydEMS15714-Sstosowany do mocowania komórek
RuryEMS19240stosowane w buforze PEM dla komórki fiksacja
Przeciwciało anty-MycDrosophila Hybirdoma Bankcat# 9E10używane do wykrywania Fog-Myc 
Przeciwciało PhosphoSerine-19Cell Signaling3671przeciwciało przeciwko fosforylowanemu regulatorowemu łańcuchowi lekkiemu (RLC) seryna 19
488-falloidyna, 568-falloidynaThermofisher ScientificA12379, A12380do barwienia dla f-aktyny
Hawk-VT wielopunktowy skaningowy system konfokalny VisiTech InternationalUżywany do obrazowania żywych komórek S2R+:Sqh
Eclipse TE300 Mikroskop odwróconyNikonUżywany do obrazowania żywych komórek S2R+:Sqh
Linia hodowli komórkowych , Linia hodowli komórkowych

Bibliografia

  1. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  2. Bier, E. Drosophila, the golden bug, emerges as a tool for human genetics. Nature Reviews Genetics. 6 (1), 9-23 (2005).
  3. Millburn, G. H., Crosby, M. A., Gramates, L. S., Tweedie, S., FlyBase, C. FlyBase portals to human disease research using Drosophila models. Disease Model Mechanisms. 9 (3), 245-252 (2016).
  4. Perrimon, N., Mathey-Prevot, B. Applications of high-throughput RNA interference screens to problems in cell and developmental biology. Genetics. 175 (1), 7-16 (2007).
  5. Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
  6. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
  7. Applewhite, D. A., Davis, C. A., Griffis, E. R., Quintero, O. A. Imaging of the Cytoskeleton Using Live and Fixed Drosophila Tissue Culture Cells. Methods Molecular Biology. 1365, 83-97 (2016).
  8. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Stuurman, N., Vale, R. D. Molecular requirements for actin-based lamella formation in Drosophila S2 cells. The Journal of Cell Biology. 162 (6), 1079-1088 (2003).
  9. Yi, C. H., et al. A genome-wide RNAi screen reveals multiple regulators of caspase activation. The Journal of Cell Biology. 179 (4), 619-626 (2007).
  10. Philips, J. A., Rubin, E. J., Perrimon, N. Drosophila RNAi screen reveals CD36 family member required for mycobacterial infection. Science. 309 (5738), 1251-1253 (2005).
  11. Nir, O., Bakal, C., Perrimon, N., Berger, B. Inference of RhoGAP/GTPase regulation using single-cell morphological data from a combinatorial RNAi screen. Genome Research. 20 (3), 372-380 (2010).
  12. Manning, A. J., Peters, K. A., Peifer, M., Rogers, S. L. Regulation of epithelial morphogenesis by the G protein-coupled receptor mist and its ligand fog. Science Signaling. 6 (301), 98(2013).
  13. Leptin, M., Grunewald, B. Cell shape changes during gastrulation in Drosophila. Development. 110 (1), 73-84 (1990).
  14. Leptin, M. Gastrulation movements: the logic and the nuts and bolts. Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).
  15. Martin, A. C., Goldstein, B. Apical constriction: themes and variations on a cellular mechanism driving morphogenesis. Development. 141 (10), 1987-1998 (2014).
  16. Dawes-Hoang, R. E., et al. folded gastrulation, cell shape change and the control of myosin localization. Development. 132 (18), 4165-4178 (2005).
  17. Rogers, S. L., Wiedemann, U., Häcker, U., Turck, C., Vale, R. D. Drosophila RhoGEF2 associates with microtubule plus ends in an EB1-dependent manner. Current Biology. 14 (20), 1827-1833 (2004).
  18. Coravos, J. S., Martin, A. C. Apical Sarcomere-like Actomyosin Contracts Nonmuscle Drosophila Epithelial Cells. Developmental Cell. 39 (3), 346-358 (2016).
  19. Mason, F. M., Tworoger, M., Martin, A. C. Apical domain polarization localizes actin-myosin activity to drive ratchet-like apical constriction. Nature Cell Biology. 15 (8), 926-936 (2013).
  20. Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134 (3), 567-578 (2007).
  21. Manning, A. J., Rogers, S. L. The Fog signaling pathway: insights into signaling in morphogenesis. Developmental Biology. 394 (1), 6-14 (2014).
  22. Xie, S., Mason, F. M., Martin, A. C. Loss of Gα12/13 exacerbates apical area dependence of actomyosin contractility. Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3526-3536 (2016).
  23. Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. Dynamic myosin phosphorylation regulates contractile pulses and tissue integrity during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 206 (3), 435-450 (2014).
  24. Parks, S., Wieschaus, E. The Drosophila gastrulation gene concertina encodes a G alpha-like protein. Cell. 64 (2), 447-458 (1991).
  25. Barrett, K., Leptin, M., Settleman, J. The Rho GTPase and a putative RhoGEF mediate a signaling pathway for the cell shape changes in Drosophila gastrulation. Cell. 91 (7), 905-915 (1997).
  26. Costa, M., Wilson, E. T., Wieschaus, E. A putative cell signal encoded by the folded gastrulation gene coordinates cell shape changes during Drosophila gastrulation. Cell. 76 (6), 1075-1089 (1994).
  27. Peters, K. A., Rogers, S. L. Drosophila Ric-8 interacts with the Gα12/13 subunit, Concertina, during activation of the Folded gastrulation pathway. Molecular Biology of the Cell. 24 (21), 3460-3471 (2013).
  28. Jha, A., van Zanten, T. S., Philippe, J. M., Mayor, S., Lecuit, T. Quantitative Control of GPCR Organization and Signaling by Endocytosis in Epithelial Morphogenesis. Current Biology. 28 (10), 1570-1584 (2018).
  29. Kerridge, S., et al. Modular activation of Rho1 by GPCR signalling imparts polarized myosin II activation during morphogenesis. Nature Cell Biology. 18 (3), 261-270 (2016).
  30. Myat, M. M., Andrew, D. J. Organ shape in the Drosophila salivary gland is controlled by regulated, sequential internalization of the primordia. Development. 127 (4), 679-691 (2000).
  31. Kanesaki, T., Hirose, S., Grosshans, J., Fuse, N. Heterotrimeric G protein signaling governs the cortical stability during apical constriction in Drosophila gastrulation. Mechanisms of Development. 130 (2-3), 132-142 (2013).
  32. Nikolaidou, K. K., Barrett, K. A Rho GTPase signaling pathway is used reiteratively in epithelial folding and potentially selects the outcome of Rho activation. Current Biology. 14 (20), 1822-1826 (2004).
  33. Yanagawa, S., Lee, J. S., Ishimoto, A. Identification and characterization of a novel line of Drosophila Schneider S2 cells that respond to wingless signaling. Journal Biological Chemistry. 273 (48), 32353-32359 (1998).
  34. Mason, F. M., Xie, S., Vasquez, C. G., Tworoger, M., Martin, A. C. RhoA GTPase inhibition organizes contraction during epithelial morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (5), 603-617 (2016).
  35. Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Test restrykcji wierzchołkowejtraktowanie pożywką warunkowaną FOGmikroskopia kontrastowafiksacja paraformaldehydemwyciszanie genów metodą RNAianaliza morfologii komórektworzenie kurczliwego sznurka ściągającego
Test komórkowy do badania kurczliwości miozyny II niezwiązanej z mięśniami za pośrednictwem szlaku sygnałowego zagiętego gastrulacji w komórkach S2R + Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.