Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hodowla i manipulacja komórkami grzebienia nerwowego O9-1

11.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58346

⸱

9 października 2018

 ,  ,  , 
1Molecular Physiology and Biophysics, Baylor College of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Southern California

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

O9-1 to multipotencjalna linia komórek grzebienia nerwowego myszy. Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły krok po kroku dotyczące hodowli komórek O9-1, różnicowania komórek O9-1 w określone typy komórek i genetycznego manipulowania komórkami O9-1 za pomocą knockdownu za pośrednictwem siRNA lub edycji genomu CRISPR-Cas9.

Streszczenie

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to migrujące multipotencjalne komórki macierzyste, które mogą różnicować się w różne typy komórek i dawać początek wielu tkankom i organom. Linia komórkowa O9-1 pochodzi z endogennych embrionalnych NCC myszy i utrzymuje swoją multipotencję. Jednak w określonych warunkach hodowli komórki O9-1 mogą różnicować się w różne typy komórek i być wykorzystywane w szerokim zakresie zastosowań badawczych. Niedawno, dzięki połączeniu badań na myszach i badań na komórkach O9-1, wykazaliśmy, że efektory szlaku sygnałowego Hippo Yap i Taz odgrywają ważną rolę w rozwoju twarzoczaszki wywodzącej się z grzebienia nerwowego. Chociaż proces hodowli komórek O9-1 jest bardziej skomplikowany niż w przypadku innych linii komórkowych, linia komórkowa O9-1 jest potężnym modelem do badania NCC in vitro. W tym miejscu przedstawiamy protokół hodowli linii komórkowej O9-1 w celu utrzymania jej macierzystości, a także protokoły różnicowania komórek O9-1 w różne typy komórek, takie jak komórki mięśni gładkich i osteoblasty. Ponadto opisano protokoły przeprowadzania badań nad utratą funkcji genów w komórkach O9-1 przy użyciu delecji CRISPR-Cas9 i małego interferującego knockdownu, w którym pośredniczy RNA.

Wprowadzenie

Komórki grzebienia nerwowego (NCC) to multipotencjalne komórki macierzyste o niezwykłej zdolności migracyjnej i przejściowym istnieniu podczas rozwoju embrionalnego. NCC powstają między ektodermą powierzchniową a cewą nerwową i migrują do innych części zarodka podczas rozwoju embrionalnego1. Na podstawie ich domen funkcjonalnych, NCC można podzielić na kilka różnych typów, w tym NCC czaszkowe, tułowiowe, błędne, krzyżowe i sercowe. Ponadto NCC mogą różnicować się w wiele linii komórkowych, takich jak komórki mięśni gładkich, komórki kostne i neurony, i dawać początek różnym tkankom2,3. Rozwój NCC charakteryzuje się złożoną serią zdarzeń morfogenetycznych, które są precyzyjnie dostrojone przez różne sygnały molekularne. Biorąc pod uwagę złożoną regulację NCC i ich istotny wkład w liczne struktury, rozregulowanie rozwoju NCC może często prowadzić do wrodzonych wad wrodzonych, które stanowią prawie 30% wszystkich wrodzonych wad wrodzonych u ludzi. Nieprawidłowości podczas rozwoju grzebienia nerwowego mogą prowadzić do rozszczepu wargi/podniebienia, wadliwego kształtowania nosa, syndromów, wad, takich jak wadliwy przewód odpływu serca, a nawet śmiertelności niemowląt1,4,5,6,7. Zrozumienie molekularnych mechanizmów rozwoju NCC jest ważne dla opracowania metod leczenia chorób spowodowanych defektami w rozwoju NCC. Dzięki zastosowaniu różnych podejść in vitro i in vivo8,9,10,11,12,13,14,15, poczyniono znaczne postępy w badaniach NCC. In vivo, modele zwierzęce, w tym kurczaki,, danio pręgowany i myszy, zostały wykorzystane do zbadania NCCs1. Co więcej, ludzkie embriony zostały wykorzystane do zbadania procesu migracji NCC we wczesnym rozwoju ludzkich embrionów16. In vitro, modele komórkowe NCC, takie jak ludzkie NCC, które pochodzą z podskórnej tkanki tłuszczowej pacjenta, zostały wykorzystane do zbadania choroby Parkinsona17. Linia O9-1 NCC, która pierwotnie pochodziła z masowych hodowli endogennych NCC wyizolowanych z zarodków myszy E8.518, jest potężnym modelem komórkowym do badania NCC. Co ważne, w warunkach hodowli nieróżnicującej komórki O9-1 są multipotencjalnymi NCC podobnymi do łodyg. Jednak w różnych warunkach hodowli komórki O9-1 mogą być różnicowane w wyróżniające się typy komórek, takie jak komórki mięśni gładkich, osteoblasty, chondrocyty i komórki glejowe18. Biorąc pod uwagę te właściwości, komórki O9-1 są szeroko stosowane w badaniach związanych z NCC, takich jak badanie molekularnego mechanizmu wad czaszkowo-twarzowych19,20.

Tutaj podane są szczegółowe protokoły do utrzymywania komórek O9-1, różnicowania komórek O9-1 na różne typy komórek i manipulowania komórkami O9-1 poprzez przeprowadzanie badań utraty funkcji genów z edycją genomu CRISPR-Cas9 i technologiami knockdown za pośrednictwem małych interferujących RNA (siRNA). Jako reprezentatywny przykład opisano zastosowanie komórek O9-1 do badania utraty funkcji Yap i Taz. Yap i Taz są efektorami szlaku sygnałowego Hippo, który odgrywa kluczową rolę w proliferacji, różnicowaniu i apoptozie komórek. Wykazano również, że szlak hipopotama jest ważny w rozwoju i homeostazie kilku różnych tkanek i narządów, a także w patogenezie różnych chorób20,21,22,23,24,25,26,27,28. Podstawowe składniki sygnalizacji Hippo obejmują supresorowe sterylne kinazy 20-podobne Mst1 / 2, białko rusztowania Salvador zawierające domenę WW oraz kinazy homologu dużego guza supresorowego (Lats1/2). Sygnalizacja hipopotama hamuje aktywność Yap i Taz i sprzyja ich degradacji w cytoplazmie. Bez represji ze strony Hippo, Yap i Taz mogą przemieszczać się do jąder i funkcjonować jako koaktywatory transkrypcji. Niedawno wykazaliśmy, że specyficzna inaktywacja efektorów sygnalizacyjnych Hippo Yap i Taz w mysich NCC za pomocą sterowników Wnt1cre i Wnt1Cre2SOR spowodowała śmiertelność zarodka w E10.5 z poważnymi wadami twarzoczaszki20. Przeprowadziliśmy również badania z wykorzystaniem komórek O9-1 w celu zbadania roli Yap i Taz w NCC. Aby zbadać funkcję Yap i Taz w proliferacji i różnicowaniu NCC, komórki knockdown Yap i Taz zostały wygenerowane w komórkach O9-1 za pomocą siRNA, a komórki nokautujące Yap zostały wygenerowane przy użyciu edycji genomu CRISPR-Cas9. Te same strategie utraty funkcji genów mogą być stosowane do różnych genów docelowych w innych szlakach. Ponadto badania wzmocnienia funkcji i testy transfekcji mogą być również stosowane do komórek O9-1 w celu zbadania funkcji i regulacji genów. Opisane tutaj protokoły mają być wykorzystywane przez badaczy jako przewodniki do hodowli komórek O9-1 w celu utrzymania multipotencjalnej macierzystości, do różnicowania komórek O9-1 w inne typy komórek w różnych warunkach hodowli oraz do badania funkcji genów i mechanizmów molekularnych NCC.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie przed hodowlą komórkową O9-1

UWAGA: Pożywka bazowa używana do hodowli komórek O9-1 musiała być kondycjonowana przez myszy wsobne Sandos z tioguanine/ouabain-odpornymi (STO) mysimi komórkami fibroblastów; dlatego komórki STO muszą być uzyskane i przygotowane zgodnie z opisem poniżej przed rozpoczęciem hodowli komórek O9-1.

  1. Aktywna hodowla komórkowa STO
    1. Przygotuj pożywkę do hodowli aktywnych komórek STO, wytwarzając kompletną zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Abuse (DMEM) firmy Dulbecco z 7% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (stopień hodowli embrionalnych komórek macierzystych), 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy (wskazane są końcowe stężenia).
      UWAGA: Pożywka STO służy do hodowli aktywnych komórek zasilających STO. Penicylina, streptomycyna i L-glutamina mogą powodować wytrącanie się podczas przechowywania; Całkowicie rozpuścić przez pipetowanie przed użyciem.
    2. Pokryj standardową płytkę do hodowli komórkowej o średnicy 100 mm 0,1% żelatyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po okresie inkubacji odessać dodatkową żelatynę. Płytkę należy zużyć natychmiast po nałożeniu powłoki.
      UWAGA: Alternatywnie, przykryj płytkę pożywką STO i pozostaw płytkę w nawilżonym inkubatorze, aby uniknąć wysuszenia płytki (jest to przeznaczone tylko do krótkotrwałego przechowywania, a nie do przechowywania wstępnie powlekanych płytek).
    3. Szybko rozmrozić komórki STO w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; przed otwarciem przetrzeć kriowial 70% etanolem i natychmiast przenieść całą fiolkę z komórkami do probówki wirówkowej.
    4. Dodawać pożywkę STO kroplami do probówki wirówkowej; stosunek objętościowy komórek do pożywki wynosi 1:10.
    5. Odwirować komórki przy 180 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
    6. Wymieszać przez delikatne pipetowanie i przenieść komórki na płytkę pokrytą żelatyną.
    7. Pozostawić komórki STO do wzrostu przez 24 godziny w standardowym inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
    8. Zmień podłoże (dopiero po przyleganiu komórek) 24 godziny po wysianiu i wyrzuć stare podłoże.
    9. Codziennie sprawdzaj komórki STO pod mikroskopem i pasażuj z 80% zbieżnością.
      1. Przed rozpoczęciem pasażowania komórek STO pokryj płytki 0,1% żelatyny (objętość żelatyny odpowiada połowie objętości pożywki wzrostowej dla tego naczynia) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
      2. Aby przejść przez komórki STO, należy odessać pożywkę wzrostową i dwukrotnie przemyć komórki solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (dodać PBS w równej objętości pożywki wzrostowej).
      3. Odessać PBS i dodać 0,25% trypsyny-EDTA (dostosować objętość w zależności od wielkości naczynia); następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut
        UWAGA: W przypadku płytki o średnicy 100 mm użyj 10 ml pożywki wzrostowej i 3 ml roztworu trypsyny. Na płytkę o średnicy 150 mm użyj 20 ml pożywki wzrostowej i 8 ml roztworu trypsyny. Objętość użytego buforu do przemywania jest równa objętości pożywki wzrostowej.
      4. Dezaktywuj trypsynę równą objętością pożywki STO. Wysiewanie komórek STO na nowe płytki w stosunku od 1:3 do 1:10,
        UWAGA: Powszechnym schematem rozszerzania jest rozszerzanie się z jednej płytki kriowialnej na jedną płytkę 100 mm, następnie na jedną płytkę 150 mm, następnie na cztery płytki 150 mm, a na końcu na 16 płytek 150 mm.
  2. Inaktywacja i zamrażanie komórek STO
    1. Do przygotowania 2x pożywki do zamrażania należy dodać następujące składniki do pożywek STO (wskazane są końcowe stężenia): 20% FBS, 20% dimetylosulfotlenku (DMSO).
    2. Po wymieszaniu przefiltruj 2x środek do zamrażania (wielkość porów 0,22 μm) i przechowuj go w temperaturze 4 °C do czasu użycia. Przygotuj 2x środek do zamrażania tego samego dnia użycia i wyrzuć niewykorzystany środek do zamrażania.
    3. Przygotować roztwór mitomycyny C w PBS o stężeniu 0,5 mg/ml. Aby rozpuścić mitomycynę C w PBS, przyklej butelkę taśmą do wirownika i wiruj na niskim ustawieniu przez około 45 minut, aby całkowicie rozpuścić cząstki.
      UWAGA: Mitomycyna C jest wrażliwa na światło i trudno się rozpuszcza.
      Uwaga: Mitomycyna C jest silnie toksyczna i może powodować raka. Należy obchodzić się wyłącznie z odpowiednimi środkami ochrony osobistej.
    4. Inaktywować komórki STO, dodając końcowe stężenie 0,01 mg/ml mitomycyny C do istniejących pożywek. Inkubować przez 2 godziny w standardowym inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
    5. Przemyć płytki (150 mm) 20 ml PBS dwukrotnie po inaktywacji mitomycyną C.
    6. Odessać roztwór PBS, zdysocjować komórki za pomocą 8 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować przez 5 minut w standardowym nawilżanym inkubatorze (37 °C, 5% CO2).
    7. Dezaktywuj trypsynę za pomocą 8 ml pożywki STO.
    8. Przenieść roztwór komórkowy do probówki wirówkowej. Połącz więcej niż jedną płytkę w jedną probówkę wirówkową, aby zaoszczędzić czas. Wirować przez 5 minut przy 180 x g.
    9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 5 ml PBS.
    10. Użyj 10 μl roztworu komórkowego do zliczenia komórek za pomocą hemocytometru. Policz komórki w centralnym kwadracie z siatką i pomnóż otrzymaną liczbę przez 104, aby określić liczbę komórek na 1 ml. Policz dwa razy i uśrednij dwie liczby, aby uzyskać ostateczne oszacowanie liczby komórek na mililitr.
    11. Wirować komórki przez 5 minut przy 180 x g.
    12. Odessać PBS i dodać 1:1 (objętościowo) pożywkę STO i 2x pożywkę do zamrażania do osadu komórkowego. Dostosuj objętość do końcowego stężenia komórek 4 x 106 komórek/ml (ta ilość jest dobra na jedną płytkę 100 mm).
      UWAGA: Na przykład z czterech płytek o średnicy 150 mm, które dają łącznie 60 x 106 komórek, zamroź 4 x 106 komórek na kriowial, przy czym każdy kriowial zawiera 1 ml roztworu komórkowego. Cztery płytki dają około 15 kriowialiów (60/4=15). Dodaj 7,5 ml pożywki STO i 7,5 ml 2x pożywki do zamrażania do osadu komórkowego, ponownie zawiesić i podać 1 ml do każdego kriowialu.
    13. Zawiesić powoli, pipetując pożywkę do zamrażania z osadem komórkowym. Przenieść 1 ml roztworu komórkowego do każdego kriowialu i odpowiednio oznaczyć.
    14. Umieść kriowiale w pudełku z polistyrenu z pokrywką (zapewnia to powolne tempo chłodzenia, co poprawia przeżywalność komórek). Przenieść pudełko do zamrażarki o temperaturze -80 °C na co najmniej 24 godziny przed przeniesieniem kriowialu do ciekłego azotu.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, zminimalizuj czas zliczania komórek, a także czas między dodaniem 2x pożywki do zamrażania do komórek a przeniesieniem fiolek do -80 °C.

2. Hodowla komórkowa O9-1

  1. Przygotować podłoże podstawowe do hodowli komórek O9-1, dodając do DMEM następujące substancje (wskazane są końcowe stężenia): 15% FBS, 0,1 mM minimum pożywki niezbędnej (MEM) aminokwasów endogennych, 1 mM pirogronianu sodu, 55 μM beta-merkaptoetanolu, 100 μg/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 2 mM L-glutaminy, 103 jednostek/ml czynnika hamującego białaczkę (LIF; dodawane bezpośrednio przed użyciem, nie dodawać do butelki podstawowej) i 25 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF; dodawany bezpośrednio przed użyciem, nie dodawać do butelki podstawowej).
  2. Filtr, wysterylizuj podłoże podstawowe (wielkość porów 0,22 μm) i zawiń w folię, aby chronić przed światłem.
  3. Zbierz kondycjonowane podłoże podstawowe z inaktywowanych komórek STO.
    UWAGA: Kontynuuj dopiero po uzyskaniu inaktywowanych komórek STO. Pożywka podstawowa O9-1 pobrana z płytek komórkowych STO jest dalej określana jako kondycjonowane podłoże podstawowe.
    1. Szybko rozmrozić inaktywowane komórki STO, jak opisano powyżej (jeden kriowial zawierający 4 x 106 komórek jest dobry na jedną płytkę o średnicy 100 mm i daje około 100 ml kondycjonowanej pożywki podstawowej po 10 dniach pobrania). Wysiewaj inaktywowane komórki STO na płytkę pokrytą żelatyną za pomocą pożywki STO. Pozostawić komórki na noc w standardowym nawilżanym inkubatorze (37 °C, 5% CO2 ).
    2. 24 godziny po rozmrożeniu komórek STO wyrzuć istniejące pożywki STO i zastąp je pożywką podstawową.
      UWAGA: Nie dodawaj LIF i bFGF do inaktywowanych szalek do hodowli komórkowych STO; dodawać tylko do naczyń z kulturami komórkowymi O9-1.
    3. Co 24 godziny zmieniaj pożywkę za pomocą pożywki podstawowej O9-1 i zbieraj podłoże podstawowe z płytek komórkowych STO do butelki. Owiń butelkę zawierającą kondycjonowane podłoże podstawowe w folię w celu ochrony przed światłem. Przechowywać wszystkie zebrane media w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Ponieważ komórki zostały inaktywowane, mogą nie wyglądać tak zdrowo, jak po kilku dniach pobrania; Tego można się było spodziewać.
    4. Opcjonalnie, aby sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczenia, należy zebrać podłoże podstawowe na każdy dzień zbiórki w różnych probówkach (zamiast jednej butelki) owiniętych folią. Używając płytki 24-dołkowej, umieść 1 ml pożywki z każdego dnia w każdym dołku i inkubuj przez noc w standardowym inkubatorze, aby sprawdzić pod mikroskopem zanieczyszczenie bakteryjne.
      UWAGA: Pożywka pozostaje koloru czerwonego, jeśli nie ma zanieczyszczenia, ale zmienia kolor na żółty, jeśli występuje zanieczyszczenie bakteryjne.
    5. Po zebraniu kondycjonowanego podłoża podstawowego przez 10 dni wyrzuć komórki STO. Połączyć (w stosownych przypadkach) wszystkie zebrane warunkowe podłoża podstawowe i wysterylizować filtrem (wielkość porów 0,22 μm) do sterylnej butelki. Zawiń butelkę w folię, aby chronić ją przed światłem. Przefiltrowane, kondycjonowane media podstawowe należy przechowywać w temperaturze 4 °C maksymalnie przez jeden miesiąc od daty przefiltrowania.

3. Utrzymanie komórek O9-1

UWAGA: Robocza pożywka bazowa O9-1 to sterylizowane filtracyjnie kondycjonowane podłoże podstawowe, do którego LIF (stężenie końcowe 103 jednostki/ml) i bFGF (stężenie końcowe 25 ng/ml) są dodawane natychmiast do naczynia do hodowli komórkowej przed użyciem. Podłoże to należy chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze 4 °C.

  1. Odzyskiwanie komórek O9-1
    1. Powoli rozmrażać butelkę podstawową matrycy z membraną podstawną (np. Matrigel) przez noc w temperaturze 4 °C w celu przygotowania podwielokrotności.
    2. Dodaj 5 ml DMEM z 10% FBS do 5 ml podstawowej membrany macierzystej membrany. Dobrze wymieszać, pipetując za pomocą zimnych końcówek pipet przechowywanych w temperaturze -20 °C. Oryginalną butelkę i probówki z podwielokrotnościami należy przechowywać na lodzie. Zamrażać podwielokrotności w różnych objętościach (0,5 ml lub 1 ml porcji) w zależności od potrzeb eksperymentu. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania macierzy błony podstawnej.
      UWAGA: Matryca membrany podstawnej polimeryzuje szybko w temperaturze pokojowej; Używaj zimnych końcówek do pipet i utrzymuj rurki w niskiej temperaturze podczas pracy, aby uniknąć niezamierzonej polimeryzacji.
    3. Rozmrozić podwielokrotność matrycy błony podstawnej w temperaturze 4 °C lub na lodzie 2 godziny przed rozpoczęciem doświadczenia. Nie przechowywać matrycy w temperaturze 4 °C przez dłuższy czas.
    4. Użyj wysterylizowanego filtrem DMEM z 10% FBS, aby rozcieńczyć matrycę błony podstawnej do końcowego stężenia 0,5 mg / ml w celu pokrycia płytek. Pokryj płytki matrycą błony podstawnej (0,5 mg/ml) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Upewnij się, że całkowicie zakrywa płytkę (jak pokazano na Rysunek 1).
    5. Podczas zasysania matrycy membrany podstawnej przechylić płytkę, aby uniknąć dotykania powlekanej powierzchni; suszyć płytki w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Nie suszyć nadmiernie powlekanych płyt.
      UWAGA: Kontynuuj tylko wtedy, gdy wszystkie podłoża i odczynniki są gotowe do użycia (kondycjonowane podłoża podstawowe, sterylnie filtrowane 10% FBS w DMEM, LIF i bFGF).
    6. Szybko odzyskać komórki O9-1, umieszczając kriowial w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C; powoli obracać fiolkę, aż roztwór całkowicie zamieni się w płyn i natychmiast przejść do następnego kroku.
    7. Przenieść cały roztwór komórkowy z kriowialnego (około 1 ml) do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Dodać 5 objętości DMEM z 10% FBS (filtr sterylizowany o wielkości porów filtra 0,22 μm) i ponownie zawiesić.
    8. Wirować przez 3 minuty przy 180 x g. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy (przez opukiwanie) w kondycjonowanym podłożu podstawowym uzupełnionym LIF i bFGF. Policz komórki za pomocą hemocytometru.
      UWAGA: Kondycjonowane podłoża podstawowe uzupełnione LIF i bFGF mają kluczowe znaczenie dla utrzymania multipotencji linii komórkowej O9-1. Zachowaj ostrożność, aby dodać odpowiednią pożywkę, aby uniknąć niezamierzonego różnicowania komórek.
    9. Komórki nasienne od 10 000 do 15 000 komórek/cm2 na płytkę 6-dołkową. Pozwól komórkom przyczepić się i rosnąć w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ) przez noc przed zmianą pożywki.
    10. Upewnij się, że komórki są podłączone przed przystąpieniem do zmiany podłoża (zdrowe dołączone komórki wyglądają jak te pokazane na Rysunek 2).
    11. Zawsze zmieniaj pożywkę hodowlaną następnego dnia po odzyskaniu komórek O9-1 (użyj kondycjonowanej pożywki podstawowej uzupełnionej LIF i bFGF).
  2. Pasaż komórek O9-1
    1. Gdy komórki O9-1 osiągną 80% zbieżności, rozmrozić matrycę błony podstawnej i przygotować płytkę pokrytą matrycą błony podstawnej, jak opisano powyżej. Dodać do naczynia kondycjonowane podłoża podstawowe uzupełnione LIF i bFGF. Alternatywnie, dodaj DMEM bez FBS, aby zapobiec wyschnięciu matrycy membrany podstawnej i przechowuj w standardowym nawilżanym inkubatorze nie dłużej niż 3 dni.
    2. Przepłukać studzienki zawierające O9-1 (płytka 6-dołkowa) 2 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco dwukrotnie i delikatnie pipetować, aby uniknąć utraty komórek.
    3. Dysocjuj komórki za pomocą 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Zneutralizuj trypsynę z równą ilością DMEM z 10% FBS. Kilkakrotnie odpipetować płyn na całej powierzchni studzienki, aby oddzielić jak najwięcej komórek od płytki.
      UWAGA: Stężenie trypsyny wynosi 0,05% zamiast 0,25%. Użyć DPBS do rozcieńczenia z butelki bulionowej.
    4. Unikaj generowania pęcherzyków podczas dysocjacji komórek od płytki.
    5. Przenieść cały roztwór komórkowy do probówki wirówkowej i wirować przez 3 minuty przy 180 x g. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Zawiesić osad komórkowy w probówce wirówkowej przez delikatne pipetowanie w kondycjonowanym pożywce podstawowej uzupełnionej LIF i bFGF.
    6. Użyj hemocytometru, aby policzyć całkowitą liczbę komórek, jak opisano powyżej. Komórki nasienne (10 000 do 15 000 komórek/cm2) na powlekaną płytkę przygotowaną zgodnie z opisem w krokach 3.1.4-3.1.8. Jedna studzienka z 6-dołkowej płytki wymagałaby 100 000 komórek do wysiewu.
    7. Pozwolić komórkom przyczepić się i rosnąć w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ). Zawsze zmieniaj pożywkę hodowlaną następnego dnia po pasażowaniu komórek O9-1.
  3. Zamrażanie komórek O9-1
    1. Aby przygotować 2x pożywkę do zamrażania dla komórek O9-1, rozcieńczyć w DMEM (wskazane są końcowe stężenia): 40% FBS i 20% DMSO.
    2. Przefiltruj, wysterylizuj 2x środek do zamrażania i utrzymuj go w temperaturze 4 °C. 2x środek do zamrażania musi być przygotowany w dniu jego użycia. Wyrzuć wszystkie niewykorzystane środki zamrażające.
      UWAGA: Zamroź komórki O9-1 przy 80% konfluencji.
    3. Przepłukać studzienki dwukrotnie DPBS; delikatnie odpipetować, aby uniknąć utraty komórek.
    4. Dysocjuj komórki za pomocą 0,05% trypsyny-EDTA w temperaturze 37 °C przez 3 minuty, a następnie zneutralizuj trypsynę z równą ilością 10% FBS w DMEM. Kilkakrotnie odpipetuj płyn na całej powierzchni studzienki, aby oddzielić jak najwięcej komórek od płytki.
    5. Przenieść całą zawartość płytki do probówki wirówkowej i wirować przez 3 minuty przy 180 x g. Odessać supernatant i dodać 2 ml PBS i ponownie zawiesić przez stukanie.
    6. Użyj 10 μl roztworu komórkowego, aby policzyć komórki za pomocą hemocytometru, jak opisano powyżej.
    7. Odwirowywać roztwór komórek przez 3 minuty przy 180 x g. Odessać supernatant i dostosować ilość potrzebnej pożywki podstawowej; Następnie dodaj równą ilość 2x pożywki zamrażającej.
      UWAGA: Komórki zamraża się w stężeniu 1 x 106 komórek/ml (1 ml na kriowial).
    8. Przenieś komórki do kriowiali i odpowiednio oznacz. Umieść kriowiale w pojemniku z polistyrenu z pokrywą, aby powoli schładzać w temperaturze -80 °C przez co najmniej 24 godziny przed przeniesieniem do ciekłego azotu.
      UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, zminimalizuj czas zliczania komórek i czas między dodaniem 2x pożywki do zamrażania a przeniesieniem fiolek do -80 °C.

4. Manipulacja komórkami O9-1

  1. Przeprowadzanie knockdownu siRNA w komórkach O9-1
    1. Przed rozpoczęciem eksperymentu rozmrozić i pokryć 24-dołkową płytkę matrycą błony podstawnej, jak opisano powyżej (kroki 3.1.4–3.1.8). Odzyskaj i zasiew komórki O9-1, pozwalając im rosnąć do 60% do 80% konfluencji.
    2. Rozcieńczyć liposomy w pożywce bez surowicy zgodnie z odpowiednią objętością studzienki. Rozcieńczyć siRNA w pożywce bez surowicy do końca. Dodaj rozcieńczone siRNA do rozcieńczonych liposomów w proporcji zalecanej przez producenta. Dobrze wymieszać pipetując i inkubować.
      UWAGA: Postępuj zgodnie z instrukcją producenta dotyczącą używanej objętości, czasu i temperatury inkubacji.
    3. Dodać odpowiednią objętość kompleksu siRNA-lipid do komórek zgodnie z zaleceniami producenta.
    4. Inkubować komórki przez 24 godziny w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO2 ). W razie potrzeby wykonaj dalsze etapy (ekstrakcja RNA, ekstrakcja białek, barwienie itp.)
      UWAGA: czasy i stężenia siRNA mogą się różnić w zależności od indywidualnego eksperymentu.
  2. Przeprowadzanie nokautu genów w komórkach O9-1 za pomocą edycji genomu CRISPR-Cas9
    UWAGA: Zapoznaj się z wcześniej opublikowanym protokołem stosowania CRISPR-Cas9 w liniach komórkowych ssaków29. Poniżej znajduje się uproszczony opis edycji genomu CRISPR-Cas9 i powiązanych kroków.
    1. Uzyskaj sekwencje sgRNA za pomocą narzędzia do projektowania sgRNA.
    2. Zliguj sgRNA do wektora pSpCas9(bb)-2a-GFP30.
    3. Transfekcja komórek O9-1 z wektorem przy użyciu standardowego protokołu lipofekcji zgodnie z zaleceniami producenta.
    4. Inkubować komórki w standardowym inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 24 godziny.
    5. Przeprowadzić sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) w oparciu o GFP/7-AAD. Wysiewaj pojedyncze komórki GFP+ na płytki 96-dołkowe.
    6. Hoduj komórki w inkubatorze przez dodatkowe 4 dni. Wyrzuć wszystkie studnie, które mają więcej niż jedną kolonię.
    7. Wykonaj PCR ze starterami przeznaczonymi do wykrywania usunięcia. Po PCR uruchom produkty PCR na żelu agarozowym, aby ocenić rozmiar prążka. Sprawdź skuteczność nokautu osiągniętą za pomocą edycji CRISPR-Cas9, wykonując Western blot (przykład wyników nokautu Yap pokazano w Rysunek 3).

5. Różnicowanie komórek O9-1

  1. Różnicowanie komórek O9-1 w osteoblasty
    1. Aby przygotować pożywkę do różnicowania kości, rozcieńczyć w alfa-MEM następujące roztwory (wskazane są końcowe stężenia): 0,1 μM deksametazonu, 100 ng/ml białka morfogenetycznego kości 2 (BMP2), 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 10 mM b-glicerofosforanu, 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny.
    2. Wykryj marker osteoblastu, osteokalcynę, w zróżnicowanych osteoblastach za pomocą barwienia immunologicznego, jak pokazano na Rysunek 4.
      UWAGA: Różnicowanie osteogenne można również ocenić za pomocą innych markerów osteoblastów lub barwienia czerwienią alizarynową lub barwienia fosfatazą alkaliczną.
  2. Różnicowanie komórek O9-1 w chondrocyty
    1. Aby przygotować pożywkę do różnicowania chondrocytów, rozcieńczyć w alfa-MEM następujące roztwory (wskazane są końcowe stężenia): 5% płodowa surowica cielęca (FCS), 1% insulina-transferyna-selen (ITS), 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 10 ng/ml transformujący czynnik wzrostu beta (TGF-b3), 50 μg/ml kwasu askorbinowego, 10 ng/ml BMP2, 0,1 μM deksametazonu i 1 mM pirogronianu sodu.
    2. Najpierw hoduj monowarstwę komórek O9-1 z pożywką osteogenną przez 3 dni, a następnie trypsynizuj i hoduj jako format mikromasy w pożywce różnicującej chondrocyty przez dodatkowe 7 dni.
    3. Ocenia różnicowanie chondrogenne za pomocą barwienia błękitem alcjańskim lub markerami chondrocytów.
  3. Różnicowanie komórek O9-1 w komórki mięśni gładkich
    1. Aby przygotować pożywkę do różnicowania komórek mięśni gładkich, rozcieńczyć w DMEM następujące roztwory (wskazane są końcowe stężenia): 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 10% FBS.
    2. Ocenia różnicowanie komórek mięśni gładkich za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego przy użyciu przeciwciał przeciwko markerom komórek mięśni gładkich, takim jak aktyna mięśni gładkich (SMA), pokazana jako przykład w Rysunek 5.
  4. Różnicowanie komórek O9-1 w komórki glejowe
    1. Aby przygotować pożywkę do różnicowania komórek glejowych, rozcieńczyć następujące roztwory w DMEM/F12 (wskazane są końcowe stężenia): 1x suplement B-27, 2 mM L-glutamina, 50 ng/ml BMP2, 100 U/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 50 ng/ml LIF i 1% inaktywowany termicznie FBS.
    2. Oceń różnicowanie komórek glejowych, wykonując barwienie immunofluorescencyjne przeciwciałami przeciwko markerom komórek glejowych, takim jak białko wiążące kwasy tłuszczowe 7 (FABP7).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Celem naszych eksperymentów z wyciszeniem (knockdown) i wyeliminowaniem (knockout) było zbadanie efektów utraty funkcji Yap i Taz w komórkach O9-1. Przed przystąpieniem do eksperymentów z knockdown i knockout należy upewnić się, że przygotowano pożywkę podstawową i hodowlę komórek O9-1 zgodnie z powyższym opisem (na przykład macierz błony podstawnej musi pokrywać całą płytkę, jak pokazano na Ryc. 1, a komórki O9-1 muszą zostać odzyskane z ci...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

NCC jest wszechstronnym i kluczowym czynnikiem przyczyniającym się do różnych tkanek i narządów podczas morfogenezy embrionalnej. Linia komórkowa O9-1 zachowuje swój potencjał do różnicowania się w wiele różnych typów komórek i naśladuje charakterystykę NCC in vivo , co czyni ją użytecznym narzędziem in vitro do badania funkcji genów i regulacji molekularnej w NCC. Różny status komórek O9-1 może odpowiadać różnym potomstwu grzebienia nerwowego in vivo, w zależności od warunków hodowli komórek O...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Nicole Stancel, Ph.D., ELS, z Scientific Publications at the Texas Heart Institute, zapewniła wsparcie redakcyjne. Dziękujemy również następującym źródłom finansowania: Grantowi Naukowemu Amerykańskiego Towarzystwa Kardiologicznego (14SDG19840000 dla J. Wanga), Nagrodzie Badawczej Lawrence'a 2014 z Rolanette and Berdon Lawrence Bone Disease Program of Texas (dla J. Wanga) oraz National Institutes of Health (DE026561 i DE025873 dla J. Wanga, DE016320 i DE019650 dla R. Maxsona).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aktywne ogniwa zasilające STOATCC ATCC CRL-1503Dostępne również w postaci inaktywowanej mitomycyną C, katalog # ATCC 56-X
O9-1 mysia linia komórkowa grzebienia nerwowegoMillipore SigmaSCC049
DMEM, wysoka glukoza, bez glutaminyGibco11960-044
DMEM, hyklon o wysokiej zawartości glukozySH30243.01
FBS (płodowa surowica bydlęca)Millipore SigmaES-009-B
Penicylina - streptomycynaGibco15140-122
L-glutamina 200 mM (100x)Gibco25030-081
Żelatyna ze skóry świniSigmaG1890
Trypsyna-EDTA 0,25% w HBSSGenesee Scientific25-510
DPBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco) bez wapń lub magnezLonza17-512F
MEM aminokwasy endogenne (MEM NEAA) 100XxGibco11140-050
Pirogronian sodu (100 mM)Gibco11360-070
2-merkaptoetanolSigmaM-7522
ESGRO czynnik hamujący białaczkę (LIF) 106 jednostka/mlMillipore SigmaESG1106
Rekombinowany ludzki czynnik wzrostu fibroblastów-zasadowy (rhFGF-zasadowy)R& D Systems233-FB-025
Mitomycyna CRoche10107409001
Matrigel MatrixCorning356234
DMSO (dimetylosulfotlenek)Millipore SigmaMX1458-6
Lipofectamina RNAiMAXThermo Fisher Scientific13778-075
Opti-MEM I (1x)Gibco31985-070
Minimalna niezbędna pożywka, alfa 1x z solami Earle'a, rybonukleozydami, dezoksyrybonukleozydami i L-glutaminaCorning10-022-CV
ON-TARGETplus Wwtr1 siRNADharmaconL-041057
ON-TARGETplus Pula nieprzeznaczona do kierowaniaDharmaconD-001810
ON-TARGETplus Yap1 siRNADharmaconL-046247
FCS (płodowa surowica cielęca)
ITS (insulina-transferyna-selen)
TGF-b3
Kwas askorbinowy
BMP2 (białko morfogenetyczne kości 2)
Suplement
B-27
czaszki deksametazonu

Bibliografia

  1. Achilleos, A., Trainor, P. A. Neural crest stem cells: discovery, properties and potential for therapy. Cell Research. 22 (2), 288-304 (2012).
  2. Le Douarin, N. M., Dupin, E. Multipotentiality of the neural crest. Current Opinion in Genetics and Development. 13 (5), 529-536 (2003).
  3. Santagati, F., Rijli, F. M. Cranial neural crest and the building of the vertebrate head. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (10), 806-818 (2003).
  4. Cordero, D. R., et al. Cranial neural crest cells on the move: their roles in craniofacial development. American Journal of Medical Genetics. Part A. 155 (2), 270-279 (2011).
  5. Trainor, P. A. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. American Journal of Medical Genetics. Part A. 152 (12), 2984-2994 (2010).
  6. Bronner, M. E., Simoes-Costa, M. The neural crest migrating into the twenty-first century. Current Topics in Developmental Biology. , 115-134 (2016).
  7. Zurkirchen, L., Sommer, L. Quo vadis: tracing the fate of neural crest cells. Current Opinion in Neurobiology. 47, 16-23 (2017).
  8. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 9 (7), 557-568 (2008).
  9. Knecht, A. K., Bronner-Fraser, M. Induction of the neural crest: a multigene process. Nature Reviews. Genetics. 3 (6), 453-461 (2002).
  10. Steventon, B., Carmona-Fontaine, C., Mayor, R. Genetic network during neural crest induction: from cell specification to cell survival. Seminars in Cell and Developmental Biology. 16 (6), 647-654 (2005).
  11. Raible, D. W. Development of the neural crest: achieving specificity in regulatory pathways. Current Opinion in Cell Biology. 18 (6), 698-703 (2006).
  12. Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Developmental Biology. 366 (1), 83-95 (2012).
  13. Henion, P. D., Weston, J. A. Timing and pattern of cell fate restrictions in the neural crest lineage. Development. 124 (21), 4351-4359 (1997).
  14. Harris, M. L., Erickson, C. A. Lineage specification in neural crest cell pathfinding. Developmental Dynamics. 236 (1), 1-19 (2007).
  15. Luo, R., Gao, J., Wehrle-Haller, B., Henion, P. D. Molecular identification of distinct neurogenic and melanogenic neural crest sublineages. Development. 130 (2), 321-330 (2003).
  16. Betters, E., Liu, Y., Kjaeldgaard, A., Sundstrom, E., Garcia-Castro, M. I. Analysis of early human neural crest development. Developmental Biology. 344 (2), 578-592 (2010).
  17. Yang, S. Y., Beavan, M., Chau, K. Y., Taanman, J. W., Schapira, A. H. V. A human neural crest stem cell-derived dopaminergic neuronal model recapitulates biochemical abnormalities in GBA1 mutation carriers. Stem Cell Reports. 8 (3), 728-742 (2017).
  18. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21 (17), 3069-3080 (2012).
  19. Yumoto, K., et al. TGF-beta-activated kinase 1 (Tak1) mediates agonist-induced Smad activation and linker region phosphorylation in embryonic craniofacial neural crest-derived cells. Journal of Biological Chemistry. 288 (19), 13467-13480 (2013).
  20. Wang, J., et al. Yap and Taz play a crucial role in neural crest-derived craniofacial development. Development. 143 (3), 504-515 (2016).
  21. Heallen, T., et al. Hippo pathway inhibits Wnt signaling to restrain cardiomyocyte proliferation and heart size. Science. 332 (6028), 458-461 (2011).
  22. Wang, J., Martin, J. F. Hippo pathway: An emerging regulator of craniofacial and dental development. Journal of Dental Research. 96 (11), 1229-1237 (2017).
  23. Pan, D. The hippo signaling pathway in development and cancer. Developmental Cell. 19 (4), 491-505 (2010).
  24. Xiao, Y., Leach, J., Wang, J., Martin, J. F. Hippo/Yap signaling in cardiac development and regeneration. Current Treatment Options in Cardiovascular Medicine. 18 (6), 38(2016).
  25. Yu, F. X., Meng, Z., Plouffe, S. W., Guan, K. L. Hippo pathway regulation of gastrointestinal tissues. Annual Review of Physiology. 77, 201-227 (2015).
  26. Fu, V., Plouffe, S. W., Guan, K. L. The Hippo pathway in organ development, homeostasis, and regeneration. Current Opinion in Cell Biology. 49, 99-107 (2017).
  27. Moya, I. M., Halder, G. The Hippo pathway in cellular reprogramming and regeneration of different organs. Current Opinion in Cell Biology. 43, 62-68 (2016).
  28. Piccolo, S., Dupont, S., Cordenonsi, M. The biology of YAP/TAZ: hippo signaling and beyond. Physiological Reviews. 94 (4), 1287-1312 (2014).
  29. Bauer, D. E., Canver, M. C., Orkin, S. H. Generation of genomic deletions in mammalian cell lines via CRISPR/Cas9. Journal of Visual Experiments : JoVE. (95), e52118(2015).
  30. Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  31. Manderfield, L. J., et al. Hippo signaling is required for Notch-dependent smooth muscle differentiation of neural crest. Development. 142 (17), 2962-2971 (2015).
  32. Hindley, C. J., et al. The Hippo pathway member YAP enhances human neural crest cell fate and migration. Scientific Reports. 6, 23208(2016).
  33. Nejigane, S., Haramoto, Y., Okuno, M., Takahashi, S., Asashima, M. The transcriptional coactivators Yap and TAZ are expressed during early Xenopus development. International Journal of Developmental Biology. 55 (1), 121-126 (2011).
  34. Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel, but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7 (5), 055004(2012).
  35. Kang, B. J., et al. Effect of matrigel on the osteogenic potential of canine adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (7), 827-836 (2012).
  36. Uemura, M., et al. Matrigel supports survival and neuronal differentiation of grafted embryonic stem cell-derived neural precursor cells. Journal of Neuroscience Research. 88 (3), 542-551 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells
Posted by JoVE Editors on 11/30/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Culturing and Manipulation of O9-1 Neural Crest Cells. The Protocol section was updated.

Step 2.1 was updated from:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 mM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

to:

Prepare basal media for O9-1 cell culture by adding the following in DMEM (final concentrations are indicated): 15% FBS, 0.1 mM minimum essential media (MEM) nonessential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 55 µM beta-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 2 mM L-glutamine, 103 units/mL leukemia inhibitory factor (LIF; added immediately before use, do not add to stock bottle), and 25 ng/mL fibroblast growth factor-basic (bFGF; added immediately before use, do not add to stock bottle).

Step 5.1.1 was updated from:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 mM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 mg/mL streptomycin.

to:

To prepare osteogenic differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 0.1 µM dexamethasone, 100 ng/mL bone morphogenetic protein 2 (BMP2), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 mM b-glycerophosphate, 10% FBS, 100 U/mL penicillin, and 100 µg/mL streptomycin.

Step 5.2.1 was updated from:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 mg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 mM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

to:

To prepare chondrocyte differentiation media, dilute the following in alpha-MEM (final concentrations are indicated): 5% fetal calf serum (FCS), 1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 10 ng/mL transforming growth factor beta (TGF-b3), 50 µg/mL ascorbic acid, 10 ng/mL BMP2, 0.1 µM dexamethasone, and 1 mM sodium pyruvate.

Step 5.4.1 was updated from:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 mg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

to:

To prepare glial cell differentiation media, dilute the following in DMEM/F12 (final concentrations are indicated): 1x B-27 supplement, 2 mM L-glutamine, 50 ng/mL BMP2, 100 U/mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, 50 ng/mL LIF, and 1% heat-inactivated FBS.

Przeglądaj więcej artykułów

komórki O9-1hodowla komórkowamatryca błony podstawnejpożywka warunkowanaCRISPR-Cas9wyciszanie siRNAróżnicowanie osteogenneróżnicowanie w kierunku mięśni gładkichYap Taz
Hodowla i manipulacja komórkami grzebienia nerwowego O9-1
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.