Pomiar temperatury ciała myszy za pomocą termometru na podczerwień podczas pasywnej ogólnoustrojowej anafilaksji i oceny alergii pokarmowej

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy nową metodę dokładnego pomiaru różnic temperatur ciała w modelach myszy z pasywną anafilaksją układową (PSA) i alergią pokarmową za pomocą termometru na podczerwień. Procedura ta została dokładnie odwzorowana w poprzednich wynikach PSA.

Streszczenie

Pomiar temperatury ciała myszy ma ogromne znaczenie dla badania alergii i objawów anafilaktycznych. Sondy doodbytnicze do odczytów temperatury są powszechne i udowodniono, że są dokładne i nieocenione pod tym względem. Jednak ta metoda pomiaru temperatury wymaga znieczulenia myszy w celu wprowadzenia sondy bez obrażeń zwierzęcia. Ogranicza to możliwość jednoczesnej obserwacji innych fenotypów myszy. Aby zbadać inne fenotypy podczas pomiaru temperatury, sondy doodbytnicze nie są idealne i pożądana jest inna metoda. Tutaj wprowadzamy nieinwazyjną metodę pomiaru temperatury, która rezygnuje z konieczności znieczulenia myszy, zachowując przy tym równą niezawodność sond doodbytniczych w pomiarze temperatury ciała. Używamy termometru na podczerwień, który wykrywa temperaturę powierzchni ciała w zakresie od 2 do 150 mm. Ta metoda pomiaru temperatury ciała jest skuteczna w niezawodnym odtwarzaniu trendów zmian temperatury podczas eksperymentów z anafilaksją systemu pasywnego u myszy. Pokazujemy, że temperatury powierzchni ciała są o około 2,0 °C niższe niż pomiary sondą doodbytniczą, ale stopień spadku temperatury podąża za tym samym trendem. Co więcej, używamy tej samej techniki do obserwacji myszy w modelu alergii pokarmowej, aby jednocześnie ocenić temperaturę i poziom aktywności.

Wprowadzenie

Pomiar temperatury ciała był istotną częścią monitorowania skutków objawów anafilaktycznych w modelach zwierzęcych^1,2. Różnice temperatur były tradycyjnie mierzone za pomocą termometrów z sondą doodbytniczą u myszy^3,4. Dzięki tym pomiarom badacze wiarygodnie przedstawili różnice w temperaturze między zmiennymi; Jednak ta metoda jest czasochłonną procedurą i powoduje niepokój u myszy, co może zwiększyć temperaturę ciała. Sondowanie doodbytnicze może również powodować rozdarcie błony śluzowej i infekcję³. Ponadto myszy powinny być znieczulone w celu humanitarnego włożenia sondy doodbytniczej do pomiaru temperatury³. Jest to powolny proces i uniemożliwia pomiar kolejnych temperatur w krótkim czasie. Co więcej, fenotypy aktywności myszy nie mogą być obserwowane w tym czasie, dopóki środek znieczulający nie zostanie całkowicie zużyty, co jest kolejnym czasochłonnym procesem. Ostatnio inne niezawodne metody pomiaru temperatury ciała wykorzystują podskórnie wszczepiane pasywne znaczniki transponderów podczerwieni lub nadajniki radiowe, które zawierają czujnik temperatury^3,5,6. Chociaż niektóre badacze uznają je za idealną praktykę, metody te nie są powszechnie stosowane ze względu na wysokie koszty początkowe i stres dla myszy z powodu chirurgicznego wszczepienia czujnika temperatury pod skórę lub inną częścią ciała.

Aby wykazać, że różnica temperatur jest dokładnym odzwierciedleniem objawów w modelu choroby^1,2, myszy muszą być przytomne podczas pomiaru temperatury i być w stanie powrócić do swojej normalnej aktywności fenotypowej bezpośrednio przed i po pomiarze. W tym celu poszukiwaliśmy metody, za pomocą której można by to osiągnąć.

Naszym celem było dokładne i niedrogie mierzenie temperatury ciała myszy, bez potrzeby znieczulenia i bez ograniczeń aktywności, aby umożliwić obserwację fenotypów behawioralnych w trakcie i po czasie pomiaru temperatury. Aby osiągnąć ten cel, okazało się, że potrzebna jest technika mniej inwazyjna niż standardowe sondy temperatury doodbytniczej. Termometry na podczerwień są używane od dziesięcioleci w medycynie klinicznej, zwłaszcza w pediatrii, w celu uzyskania dokładnych odczytów temperatury. Była to alternatywna metoda, która pozwoliła klinicystom szybko i dokładnie uzyskać pomiary temperatury u niemowląt i wybrednych dzieci, które są aktywnie mobilne. Wdrożyliśmy tę samą technikę u myszy i opracowaliśmy skuteczną metodę uzyskiwania temperatury bez znieczulenia. Co ważne, pokazujemy, że metoda ta jest w stanie odtworzyć dobrze znane wyniki pasywnej ogólnoustrojowej anafilaksji w odniesieniu do zmian temperatury, a jednocześnie jest w stanie obserwować aktywność myszy przez cały czas trwania pomiaru. Co więcej, używamy tej samej metody do oceny temperatury ciała myszy z alergią pokarmową, jednocześnie badając inne objawy, aby wykazać, że temperatura ciała jest rzeczywiście dokładnym odzwierciedleniem poziomu aktywności i ogólnego fenotypu myszy.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytutu Alergii i Immunologii La Jolla.

1. Pomiar temperatury ciała myszy podczas znieczulenia

1. Umieść mysz w pudełku indukcyjnym do znieczulenia. Znieczulenie za pomocą przepływu tlenu o przepływie 1 l/min z 5% izofluranem.
   UWAGA: Znieczulenie jest potwierdzone, gdy mysz przestaje się poruszać dobrowolnie i jest unieruchomiona przez ponad 30 sekund. Alternatywnie, monitoruj częstość oddechów, a gdy myszy oddychają w tempie 1 oddechu na każde 2 s lub dłużej, potwierdzono znieczulenie.
2. Przytrzymaj mysz za kark palcem wskazującym i kciukiem, a ogon małym palcem, aby odsłonić dolną część brzucha.
3. Umieść czujnik termometru na podczerwień poniżej dolnej części brzucha, trzymając mysz ciałem równolegle do podłoża.
   UWAGA: Zewnętrzna płaska powierzchnia termometru (nie powierzchnia czujnika) powinna znajdować się w odległości około 2–5 mm od powierzchni brzucha. To powtórzenie wyników temperatur mierzonych, gdy myszy nie są znieczulone (opisane w sekcji 2). Ważne jest, aby określić docelowe miejsce brzucha. Celowanie między dwoma górnymi sutkami pozwala na uzyskanie spójnych rezultatów.
4. Przytrzymaj spust, aby zmierzyć temperaturę. Upewnij się, że mysz i termometr są stabilnie trzymane.

2. Pomiar temperatury ciała myszy bez znieczulenia

1. Podnieś mysz za środek ogona.
2. Odsłoń brzuch myszy.
   1. Pozwól myszy trzymać się przednimi łapami powierzchni o prostych krawędziach, takiej jak krawędź otwartej klatki lub górna część klatki.
      UWAGA: Dzięki temu mysz może rozciągnąć górną część ciała i odsłonić brzuch.
   2. Alternatywnie, pozwól myszy przytrzymać górną prostą krawędź termometru i spraw, aby mysz usiadła na zewnętrznej płaskiej powierzchni termometru brzuchem tuż nad czujnikiem podczerwieni.
      UWAGA: Za każdym razem, gdy tylne łapy spoczywają na powierzchni termometru, upewnij się, że stopy nie zasłaniają czujnika od strony brzucha. Termometry z przeszkodą w stopie będą mierzyć temperaturę niższą niż temperatura brzucha.
3. Przytrzymaj spust, aby zmierzyć temperaturę.
   UWAGA: Myszy mają tendencję do poruszania się; Zachowaj ostrożność w konsekwentnym mierzeniu tego samego miejsca ciała, wykonując pomiary temperatury, gdy myszy są stosunkowo mniej ruchliwe.

3. Pasywna anafilaksja układowa⁷

1. Dzień 0: Uczulić na immunoglobulinę E (IgE).
   1. Przygotować 200 μl (na mysz) IgE anty-dinitrofenylu (DNP) o stężeniu 100 μg/ml w PBS.
   2. Wstrzyknąć dootrzewnowo 200 μl anty-dinitrofenylu (DNP) IgE przygotowanej w kroku 3.1.1 lub tylko PBS (tylko PBS to kontrola ujemna). Do wstrzykiwań należy użyć igły 26 G. Wstrzyknięcia należy wykonywać tuż obok linii środkowej, mniej więcej między dwoma najniższymi sutkami.
2. Dzień 1: Wywołanie anafilaksji za pomocą DNP-HSA.
   1. Przygotuj 100 μl (na mysz) DNP-HSA o stężeniu 10 mg/ml w 0,9% NaCl.
   2. Znieczulij myszy zgodnie z opisem w kroku 1.1.
   3. Zmierz temperaturę ciała za pomocą techniki opisanej w kroku 1.
   4. Wstrzyknąć dożylnie 100 μl DNP-HSA przygotowanego w kroku 3.2.1. Do wstrzykiwań należy użyć igły 30 G. Wykonaj zastrzyki w zatokę żylną zaoczodołową. Wbić igłę po przyśrodkowej stronie oka pod płytkim kątem, celując za oko.
   5. Po wstrzyknięciu należy umieścić myszy w oddzielnych klatkach. Upewnij się, że myszy wyzdrowieją ze znieczulenia. Zauważ, że budzą się i stają się dobrowolnie mobilne.
   6. Mierz temperaturę ciała za pomocą termometru na podczerwień i obserwuj ich aktywność co 10 minut przez 70 minut.

4. Mysi model alergii pokarmowej^8,9

UWAGA: Schemat jest pokazany w Rysunek 2.

1. Dzień 0: Uczulij myszy za pomocą OVA/ałunu.
   1. Przygotuj 100 μl (na mysz) OVA (0,5 mg/ml) i ałunu (10 mg/ml) razem w PBS. Wirować na niskim ustawieniu przez 30 min.
   2. Znieczulij myszy zgodnie z opisem w kroku 1.1.
   3. Za pomocą igły 26 G wstrzyknąć dootrzewnowo każdej myszy 100 μl mieszaniny OVA/ałunu przygotowanej w kroku 4.1.1.
      UWAGA: Ponownie zmieszać mieszaninę OVA/ałun, na krótko przed każdym wstrzyknięciem, aby jak najlepiej zapewnić jednorodną mieszaninę. Patrz krok 3.1.3 w celu uzyskania szczegółowych informacji na temat miejsca wstrzyknięcia.
   4. Po wstrzyknięciu umieść myszy z powrotem w ich oryginalnych klatkach. Upewnij się, że myszy wyzdrowieją ze znieczulenia. Zauważ, że budzą się i stają się dobrowolnie mobilne.
2. Dzień 14: Wykonaj drugie uczulenie za pomocą OVA/ałunu.
   1. Powtórz kroki 4.1.1, 4.1.2 i 4.1.3.
3. Dni 28-46: Rzuć wyzwanie myszom za pomocą OVA co drugi dzień.
   1. Przygotować 100 μl (na mysz) OVA w stężeniu 250 mg/ml w PBS.
      UWAGA: Mieszaninę należy przygotować poprzez delikatne kołysanie w przód iw tył ręką, a nie za pomocą wiru, aby zminimalizować tworzenie się pęcherzyków.
      1. Jeśli używasz inhibitorów alergii pokarmowych, przygotuj inhibitory⁹. Przygotować 100 μl (na mysz) inhibitora o stężeniu 1 mg/ml w PBS. Pozwala to na dostarczenie 100 μg inhibitora na każdą mysz.
         UWAGA: Nie przekraczaj 100 μl inhibitora na mysz, ponieważ myszy są w stanie obsłużyć tylko 200 μl całkowitej objętości zgłębnika podczas jednego dnia wyzwania. Ponieważ 100 μl jest również niezbędne do prowokacji OVA, 100 μl jest maksymalną zalecaną objętością do stosowania inhibitora.
   2. Znieczulij myszy zgodnie z opisem w kroku 1.1.
   3. Doustnie pobrać zgłębnik każdej myszy ze 100 μl roztworu OVA (25 mg OVA w 100 μl PBS pobranego zgłębnika na mysz), który został przygotowany w kroku 4.3.1.
      1. W przypadku stosowania inhibitorów należy zastosować te same techniki, które opisano w poniższych krokach dla podawania inhibitora (lub kontroli PBS) przygotowanego w kroku 4.3.1.1 na 30 minut przed prowokacją OVA. Po 30 minutach przejdź do następnego kroku.
      2. Użyj igły do zgłębnika ze strzykawką o pojemności 1 ml. Pobrać 100 μl OVA do strzykawki.
      3. Włóż igłę do ust, a następnie, kierując igłę w stronę lewej lub prawej strony gardła, delikatnie wsuń igłę przez przełyk. Wstrzyknąć 100 μl OVA.
         UWAGA: Aby upewnić się, że igła nie znajduje się w tchawicy, przed wstrzyknięciem OVA należy obserwować aktywny oddech. Wkłucie igły będzie również wcześnie przeciwne, jeśli dostanie się ona do tchawicy, a nie do przełyku.
   4. Umieść myszy w ich indywidualnych klatkach. Aby ułatwić obserwację jakości stolca, używaj klatek bez ściółki.
   5. Zapewnij powrót do zdrowia po znieczuleniu. Obserwuj, że myszy budzą się i stają się dobrowolnie mobilne.
   6. Zmierz temperaturę ciała myszy w punktach czasowych 10, 20, 40 i 60 minut, stosując technikę opisaną w sekcji 2.

Wyniki

Pasywna anafilaksja ogólnoustrojowa: Do wstrzyknięcia dożylnego znieczulono 10-tygodniowe samice myszy BALB/c. Przed wstrzyknięciem zmierzyliśmy temperaturę ciała (Wideo 1) zgodnie z opisem w kroku 1. Rysunek 1 pokazuje trend temperatury w obu populacjach po wstrzyknięciu dożylnym. Mysz uczulona na IgE wykazała maksymalny spadek temperatury o 3,0 °C po 20 minutach, podczas gdy mysz kontrolna PBS miała maksymalny spadek o 1,1 °C po 20 minutach

Dyskusja

Opisany protokół został opracowany w celu pomiaru temperatury ciała bez użycia znieczulenia. Pomimo względnej łatwości, z jaką można uzyskać odczyty temperatury, istnieje kilka zastrzeżeń, które uwzględniają tę technikę, oprócz bardziej oczywistych efektów, takich jak stres związany z obsługą i różne temperatury otoczenia.

Po pierwsze, aby utrzymać spójne odczyty temperatury przez cały czas trwania eksperymentu, miejsce, w którym mierzona jest temperatura, musi być z góry określone za pomocą a...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bezdotykowy termometr na podczerwień	SinoPie	DT-8861
Antydinitrofenyl (DNP) IgE	Sigma Aldrich	D8406-.2MG
Igła PrecisionGlide 30 G	BD	305128
Igła PrecisionGlide 26 G		305111
1 ml	BD	309659
Dinitrofenyl - albumina surowicy ludzkiej	Biosearch Technologies	D-5059-10
Albumina jaja kurzego z białka jaja kurzego	Sigma Aldrich	A5503-50G
Imject Alum	ThermoFisher Scientific	77161
Igły do karmienia zwierząt, jednorazowe	Fisher Scientific	01-208-87