Artykuł metodologiczny

Test labiryntu Elevated Plus w połączeniu z oprogramowaniem do śledzenia wideo w celu zbadania przeciwlękowego działania egzogennych suplementów ketogenicznych

34.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58396

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Psychology, Hyperbaric Neuroscience Research Laboratory, University of South Florida, 2Department of Molecular Pharmacology and Physiology, Metabolic Medicine Research Laboratory, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 3Institute for Human and Machine Cognition, 4Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of South Florida, 5James A. Haley VA Medical Center, 6Shriners Hospital for Children, 7Savaria Department of Biology, ELTE Eötvös Loránd University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do badania zmian w poziomie lęku u modeli gryzoni. Test elevated plus maze (EPM), stosowany w połączeniu z oprogramowaniem do śledzenia wideo, zapewnia niezawodną metodę dokumentowania efektu różnych potencjalnych terapii przeciwlękowych w przedklinicznych scenariuszach laboratoryjnych.

Streszczenie

Ogólnym celem tego badania jest opisanie metodologii testu podwyższonego labiryntu (EPM) w połączeniu z oprogramowaniem do śledzenia wideo. Celem metody jest udokumentowanie wpływu różnych potencjalnych terapii przeciwlękowych na laboratoryjne modele gryzoni. Test EPM opiera się na skłonności gryzoni do chronionych, zamkniętych ciemnych przestrzeni i nieuwarunkowanym strachu przed otwartymi przestrzeniami i wysokościami, a także na ich wrodzonej intensywnej motywacji do odkrywania nowych środowisk. Test EPM jest szeroko stosowanym testem behawioralnym do badania reakcji przeciwlękowych lub przeciwlękowych gryzoni otrzymujących leki, o których wiadomo, że wpływają na zachowanie. Obserwacja wykazująca zmniejszony odsetek czasu spędzonego z zamkniętymi ramionami, zwiększony odsetek czasu spędzonego z otwartymi ramionami, zmniejszona liczba wejść do zamkniętych ramion i zwiększona liczba wejść do otwartych ramion mierzona testem EPM może odzwierciedlać obniżony poziom lęku. Za pomocą tej metody bada się wpływ egzogennych suplementów ketonowych na zachowania związane z lękiem na szczurach Sprague Dawley (SPD). Egzogenne suplementy ketonowe są przewlekle podawane szczurom przez 83 dni lub podchronicznie i ostro doustnie, codziennie przez 7 dni, przed przeprowadzeniem testu EPM. Zbieranie danych behawioralnych odbywa się za pomocą systemu śledzenia wideo SMART przez zaślepionego obserwatora po zakończeniu zabiegów. Główne wyniki wskazują, że test EPM jest skuteczną metodą wykrywania efektu przeciwlękowego wywołanego suplementem ketonów i może być uważany za czułą miarę do oceny zmian w zachowaniach lękowych związanych z terapiami opartymi na lekach lub metabolice.

Wprowadzenie

Celem tego artykułu jest opisanie metodologii testu EPM w połączeniu z oprogramowaniem do śledzenia wideo w celu monitorowania zmian w zachowaniu związanym z lękiem i nowatorskich metod leczenia w laboratoryjnych modelach gryzoni. Test EPM jest stosunkowo prostą metodą oceny behawioralnej, która została opracowana do badania ilościowego określania poziomu zachowań lękowych i reakcji lękowych szczurów po zastosowaniu leczenia farmakologicznego1. Rzeczywiście, wykazano, że test EPM jest szeroko stosowanym i skutecznym testem behawioralnym do badania zmian w poziomie lęku u gryzoni1,2. Możliwość zastosowania testu EPM u gryzoni (głównie szczurów i myszy) opiera się na ich skłonności do zamkniętych, ciemnych przestrzeni (podejście), bezwarunkowym lęku przed otwartymi przestrzeniami/wysokościami (unikanie) oraz wysokim poziomie wrodzonej motywacji do eksploracji nowych środowisk. W związku z tym test EPM jest dobrze ugruntowaną metodologią opartą na konflikcie podejścia-unikania2,3.

EPM to urządzenie w kształcie plusa, składające się z czterech podniesionych ramion, które zostało opisane przez Handleya i Mithani4 (Rysunek 1), i składa się z dwóch przeciwległych ramion, które są otwarte na otoczenie (otwarte ramiona), podczas gdy dwa zamknięte przeciwległe ramiona (zamknięte ramiona) są wyposażone w ściany. Jeśli po leczeniu na EPM zostanie wykryty dłuższy czas spędzony na otwartych ramionach i/lub zwiększona liczba wejść z otwartymi ramionami w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi (nieleczonymi), oznacza to efekt przeciwlękowy2,3. Najbardziej zdecydowaną reakcję unikania wykazano w ciągu pierwszych 5 minut po rozpoczęciu (umieszczenie szczurów w miejscu przecięcia czterech ramion EPM) testu EPM5; w związku z tym każde zachowanie po zabiegu jest zwykle rejestrowane przez 5 minut na EPM. Jako dodatkowe miary poziomu lęku, liczba zanurzeń głowy, tyłów (pionowe stanie gryzonia na dwóch tylnych nogach), boli kałowe, a także całkowite wejścia ramion (spontaniczna aktywność motoryczna) i różne pozycje (rozciąganie lub zamarzanie), mogą być również rejestrowane w EPM2. W ten sposób można skompilować wiele parametrów behawioralnych, aby zapewnić kompleksową ocenę zachowania związanego z lękiem.

Aby zwiększyć wiarygodność wyników, powszechnie stosuje się jednocześnie dwa do trzech testów behawioralnych, takich jak test wyboru jasnego i ciemnego, test interakcji społecznej i test EPM, do pomiaru poziomu lęku różnych modeli zwierzęcych6. Test EPM wykonywany samodzielnie na gryzoniach jest również odpowiednią metodą do badania działania przeciwlękowego lub przeciwlękowego różnych leków7. Test EPM jest czuły nie tylko na przeciwlękolityki typu benzodiazepinowego (np. diazepam)8, ale także m.in. na związki aminokwasowe, monoaminowe, peptydygiczne i nukleozydergiczne (np. antagonista N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) AP7, antagonista kwasu α-amino-3-hydroksy-5-metylo-4-izoksazolopropionowego (AMPA) CNQX, agonista receptora opioidowego μ morfina, antagonista NPY1 BIBP3226, substancja P, grelina, oksytocyna, agoniści i antagoniści receptora serotoninowego takie jak 8-OH-DPAT i WAY-100635 oraz antagonista β1-adrenergiczny betaksolol)9,10,11,12. W związku z tym test EPM na gryzoniach jest odpowiednią i czułą metodą do badania wpływu różnych metod leczenia, które wpływają na obszary mózgu zaangażowane w działanie przeciwlękowe (np. ciało migdałowate, hipokamp i obszary limbiczne) oraz mechanizmy działania (np. układ serotoninergyczny, GABA-ergiczny i adenozynergiczny) związane z lękiem2. Czynniki testowane w tych badaniach EPM obejmują egzogenne suplementy ketonowe, które zmieniają sygnalizację mózgową w subtelny sposób, który może wymagać czułej metody wykrywania zmian w zachowaniu.

W tym artykule opisujemy test EPM używany w połączeniu z oprogramowaniem do śledzenia wideo, który pomaga wyeliminować stronniczość eksperymentalną i ułatwia zbieranie i analizę zmian behawioralnych w odpowiedzi na nowe terapie przeciwlękowe.

Protokół

Procedury leczenia i pomiaru zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Południowej Florydy (IACUC) (Protokół #0006R). Dołożono wszelkich starań, aby zmniejszyć liczbę wykorzystywanych zwierząt.

1. Przygotowania

UWAGA: Protokół zazwyczaj wymaga laboratoryjnych testów na szczurach lub myszach do testów EPM. Jednak inne zwierzęta, takie jak świnki morskie, również były testowane na EPMs13. Ważne jest, aby wziąć pod uwagę kontrast kolorów między zwierzętami w labiryncie a kolorem labiryntu podczas korzystania ze śledzenia wideo. Kontrast jest mniej ważny dla badaczy obserwujących zwierzęta na żywo lub za pośrednictwem wideo. Ustawienia oprogramowania do śledzenia wideo muszą być skonfigurowane tak, aby udokumentować, że zwierzęta są czarne lub białe w czarnym lub białym labiryncie. Problemy z ustawieniami konfiguracji mogą wystąpić w przypadku przezroczystego labiryntu akrylowego, ale matowy szary labirynt może być optymalny dla obu kolorów gryzoni

.
  1. Wybierz zwierzęta do eksperymentu, biorąc pod uwagę potencjalne czynniki wpływające, takie jak napięcie, płeć, cykl rui i wiek, a także masa ciała2.
  2. Na podstawie indywidualnego eksperymentu określ liczbę zwierząt w grupie do testu.
    UWAGA: Wielkość grupy będzie zależała od wielkości efektu, który jest oczekiwany przy leczeniu testowym. Analizy mocy są zazwyczaj wykonywane przed rozpoczęciem eksperymentu w celu określenia minimalnej liczby badanych, którzy mają zostać włączeni, biorąc pod uwagę zmienność reakcji zwierzęcia w danym zadaniu, a także liczbę grup/warunków eksperymentalnych.
  3. Starannie zaprojektuj eksperyment (w którym zostanie użyty zestaw różnych testów behawioralnych, takich jak test na otwartym polu, test EPM, test z deską do dołków i test wymuszonego pływania).
    UWAGA: Wstępne wystawienie gryzoni na działanie nowego środowiska testowego (takiego jak test na otwartym polu) bezpośrednio przed testami EPM może zmienić zachowanie zwierząt w klasie EPM1,2.
  4. Ze wszystkimi zwierzętami należy obchodzić się w podobny sposób przed testem EPM.
    UWAGA: Wykazano, że różne czynniki stresowe, stosowanie leków (np. zastrzyków), stres związany z transportem i obchodzenie się z gryzoniami mogą zmieniać zachowanie i reakcje behawioralne gryzoni na EPM16. W związku z tym konieczne jest przyzwyczajenie zwierząt do pomieszczenia dla zwierząt (np. po wysyłce na 1 - 2 tygodnie przed badaniem EPM), warunki doświadczalne i procedury leczenia (np. zgłębnik). Ważne jest również, aby postępowanie z gryzoniami i wszelkie doświadczenia z wcześniejszymi czynnikami stresogennymi, szczególnie bezpośrednio przed badaniem, były spójne dla wszystkich zwierząt i grup badanych.
  5. Przeprowadź badania behawioralne na zwierzętach prowadzących nocny tryb życia, takich jak szczury i myszy, przy użyciu odwróconego cyklu światła, tak aby można było przeprowadzić ocenę behawioralną, gdy zwierzęta znajdują się w ciemnej, aktywnej fazie.
    UWAGA: Wpływ różnych warunków przetrzymywania i cyklu świetlnego/rytmu okołodobowego na zachowanie i ich wpływ na wyniki EPM został zademonstrowany wcześniej17, ponieważ hormony zwierząt są regulowane przez cykl świetlny.
  6. Używaj tych samych eksperymentatorów podczas zabiegów i poproś ich o unikanie perfum lub mydeł o silnym zapachu.
  7. Poproś eksperymentatorów, aby podczas eksperymentu nie rozmawiali w pobliżu zwierzęcia ani nie przesuwali przedmiotów w pobliżu środowiska EPM.
    UWAGA: Niezwykle ważne jest, aby obserwator wykonywał minimalne ruchy i nie hałasował podczas zbierania danych behawioralnych.
  8. Po każdej próbie należy oczyścić cały EPM, aby usunąć wszelkie zapachy poprzednich zwierząt, które mogłyby przeszkadzać badanemu zwierzęciu w eksploracji.
  9. (Zalecane) Utrzymuj zwierzęta przez kilka dni przed testem EPM (delikatnie podnosząc je za tułów i trzymając przez minutę lub dwie), aby przyzwyczaić je do eksperymentatora.
  10. Umieszczając zwierzęta na EPM, upewnij się, że obchodzisz się ze wszystkimi zwierzętami w spójny sposób i umieść każdego gryzonia w EPM w tej samej pozycji, zwrócony twarzą do tego samego ramienia (np. pośrodku, zwrócony otwartą ręką od eksperymentatora).

2. Zastosowanie egzogennych suplementów ketonowych

  1. Zmierzyć masę ciała zwierząt przed rozpoczęciem jakiegokolwiek leczenia w celu ustalenia sposobu obliczania dawki dla danego leczenia (np. zgłębnik dożołądkowy).
  2. Zapoznaj zwierzęta z metodą gajnika dożołądkowego (okres adaptacji) przy użyciu wody przez zgłębnik przez 5 dni przed suplementacją ketonami (standardowa karma dla gryzoni/standardowa dieta [SD] + zgłębnik wodny; np. 2,5 g/kg masy ciała wody/dzień). Wyklucz wykorzystanie jakiegokolwiek zwierzęcia, które nie przystosowuje się do metody podawania przez zgłębnik żołądkowy.
  3. Po okresie adaptacji karmić zwierzęta przewlekle przez 83 dni i podprzewlekle przez 7 dni z SD i zgłębnikami dziennie wodą (np. 5 g/kg masy ciała/dzień; grupa kontrolna: n = 8), suplementami ketonowymi, takimi jak ester ketonowy (KE; diester 1,3-butanodiolu-acetooctanu; np. 5 g/kg masy ciała/dzień; n = 8), sól ketonowa (KS; Na+/K+\u2012beta-hydroksymaślan [βHB] sól mineralna; np. 5 g/kg masy ciała/dzień; n = 8) lub trójglicerydy średniołańcuchowe KS+ (stosunek 1:1, KSMCT; n = 8)18,19,20.
    UWAGA: Zwierzęta, u których podano zgłębnik śródżołądkowy, badano na EPM 1 godzinę po leczeniu. Szczury karmione standardową karmą dla gryzoni i popijane wodą (z wyłączeniem suplementacji ketonami) służyły jako grupy kontrolne.

3. Test lęku

  1. Aparatura EPM
    1. Użyj tej samej aparatury w całym badaniu, aby ustandaryzować wyniki. EPM jest aparatem w kształcie plusa, który składa się z czterech ramion (np. ramiona mogą mieć 10 cm szerokości i 50 cm długości): dwa przeciwległe ramiona są otwarte, a dwa zamknięte przeciwległe ramiona są wyposażone w wysokie (np. 30 cm) ścianki. Urządzenie jest uniesione ponad podłogę (np. o 55 cm)2.
      UWAGA: Najczęściej stosowanymi parametrami są skumulowany czas spędzony w otwartych ramionach oraz liczba wejść do otwartych ramion; Mierzony jest jednak czas spędzony w zamkniętych ramionach i centrum oraz liczba wejść do zamkniętych ramion i środka, a także odległość przebyta w każdym obszarze.
    2. Zapal EPM za pomocą oświetlenia pośredniego (tj. skieruj źródło światła w stronę sufitu zamiast bezpośrednio oświetlać aparat EPM) i upewnij się, że wszystkie cztery ramiona są podobnie oświetlone (bez cieni, patrz Rysunek 2).
      UWAGA: Zmiany poziomu światła zmieniają zachowanie gryzoni na EPM. Dlatego podobne oświetlenie jest potrzebne w kolejnych zwierzętach doświadczalnych i dniach (np. 2 800 lumenów w pomieszczeniu)2.
  2. System śledzenia wideo
    UWAGA: Do zbierania danych należy użyć systemu śledzenia wideo z interfejsem komputerowym i kamerą wideo, która automatycznie zbierze dane behawioralne u szczurów (Rysunek 3). W systemie śledzenia wideo można zastosować szeroką gamę standardowych kamer analogowych lub źródeł obrazu zdefiniowanych przez użytkownika (kamery na podczerwień, kamery, kamery USB zgodne z WIA, kamery internetowe itp.). Podczas analizy nagranego wideo oprogramowanie do śledzenia ruchu obsługuje wszystkie popularne formaty wideo, takie jak .avi, .vob, .wmv, .asf, .mov, .qt, .mpg, .mpeg, .mp4, .3gp i .mkv. Jeśli wideo nie jest odtwarzane poprawnie, może wymagać określonego kodeka; Dodatkowe formaty wideo są obsługiwane, jeśli odpowiedni kodek jest zainstalowany w systemie. Oprogramowanie do śledzenia ruchu może być również używane do analizowania wcześniej pozyskanych filmów i przetwarzania obrazów z różnych źródeł, takich jak nagrywarki DVD/HD, cyfrowe pliki wideo (.avi, .divx, .mpeg itp.), kamery internetowe, kamery DV i urządzenia do obrazowania zgodne z WIA.
    1. Ustawienia systemu
      1. Podłącz klucz instalacyjny oprogramowania do śledzenia ruchu do portu USB 2.0 i uruchom narzędzie instalacyjne.
      2. Ustaw kamerę nad obszarem eksperymentu i upewnij się, że pozostanie nieruchoma przez cały czas trwania eksperymentu.
      3. Skonfiguruj nowy eksperyment w systemie oprogramowania do śledzenia ruchu, korzystając z instrukcji obsługi. Wybierz pozycję Nowy eksperyment. Kliknij dwukrotnie ikonę protokołu, zgodnie z którym powinien być przeprowadzony nowy eksperyment (Rysunek 3, Plik uzupełniający 1).
      4. Wprowadź szczegóły, aby oznaczyć etykietą/opisem eksperymentu w oknie dialogowym Informacje o eksperymencie.
      5. Określ źródło sekwencji wideo do przetworzenia.
      6. Zdefiniuj regułę transformacji dla prawidłowego pomiaru odległości. Proces kalibracji umożliwia oprogramowaniu śledzącemu ruch uzyskanie informacji o rzeczywistych wymiarach obszaru doświadczalnego w celu uzyskania wiarygodnych wartości odległości i prędkości.
      7. Określ obszary zainteresowania (strefy) w obszarze roboczym.
      8. Dostosuj parametry procesu wykrywania.
        1. Aby oprogramowanie do śledzenia ruchu mogło precyzyjnie wykryć pozycję zwierzęcia na obrazie, należy ustawić pewne korekty wykrywania.
        2. Proces śledzenia wymaga wyraźnego i dobrze skontrastowanego obrazu poprzez precyzyjne dostosowanie ogólnych parametrów jasności i kontrastu w sekcji Jasność i kontrast panelu Ustawienia wykrywania. W razie potrzeby dostosuj te ustawienia dla całego obrazu lub dla stref zdefiniowanych przez użytkownika.
      9. Umieść szczura na każdej arenie, aby przetestować proces wykrywania.
      10. Naciśnij przycisk Rozpocznij test, aby sprawdzić, czy proces wykrywania może poprawnie zidentyfikować obiekt. Upewnij się, że wykrywanie zostało aktywowane przez pojawienie się kropki na ekranie. Proces kalibracji należy przeprowadzić przed rozpoczęciem testu.
      11. Wykrycie jest uważane za potwierdzone, gdy jedyną czarną kropką pokazaną w odtwarzaczu jest śledzone zwierzę. Czerwona linia śledzenia musi ściśle podążać za wszystkimi przemieszczeniami zwierzęcia. Prawidłowe śledzenie jest również potwierdzone białą etykietą z numerem zwierzęcia i odpowiadającymi mu współrzędnymi w oparciu o przemieszczenie. Jeśli taka detekcja nie zostanie uzyskana, dostosuj parametry Próg i Erozje, aby zoptymalizować proces wykrywania i śledzenia.
      12. Dostosuj parametry Próg i Erozja, aby uzyskać ostrzejszy i pozbawiony szumów obraz testowy.
      13. Jeśli ścieżka śledzenia zostanie poprawnie wykryta, naciśnij przycisk Zatrzymaj test (Rysunek 4). Jeśli te zmiany mają być używane dla każdego nowego pliku eksperymentalnego, naciśnij przycisk Zapisz jako domyślny. Naciśnij przycisk Akceptuj, aby zapisać nowe ustawienia wykrywania.
      14. Ustaw warunki czasowe prób.
      15. Jeśli protokół eksperymentalny wymaga, aby proces akwizycji ścieżki rozpoczął się w tym samym czasie, gdy badany jest umieszczany w obszarze eksperymentalnym, możliwe jest skonfigurowanie jednostki zdalnej dołączonej do oprogramowania lub użycie myszy bezprzewodowej.
        UWAGA: Ta opcja zapewnia możliwość zdalnego sterowania startem i zatrzymaniem.
    2. Konfiguracja tematów w systemie
      1. Zarządzaj bazą danych osoby poddanej eksperymentom. Aby utworzyć bazę danych obiektów eksperymentalnych, przejdź do menedżera bazy danych tematów, naciskając przycisk Tematy na pasku Asystenta eksperymentowania.
      2. Naciśnij przycisk +, aby dodać nowe tematy do bazy danych.
      3. Gdy opcja jednego tematu jest już wybrana, wprowadź kod tematu.
      4. Wypełnij pozostałe informacje o temacie w sekcji Właściwości tematu.
      5. Naciśnij przycisk Utwórz, aby dodać nowy temat.
      6. Określ plan eksperymentowania. Użyj Harmonogramu, aby zdefiniować różne fazy, sesje, próby i tematy planowane do wykonania w ramach projektu eksperymentalnego. Próba jest wybierana automatycznie jako "następna próba" do wykonania. Ta właściwość jest wyświetlana jako zielony znacznik wyboru po lewej stronie nazwy wersji próbnej.
    3. Akwizycja danych poprzez jednoczesny zapis i śledzenie
      UWAGA: Po wybraniu źródła obrazu na żywo w panelu Odtwarzacz znajduje się wbudowany moduł nagrywania, który umożliwia łatwe przechwytywanie wideo pochodzącego z wybranej kamery.
      1. Przygotuj oprogramowanie do śledzenia ruchu do zbierania danych (kalibracja, definicja strefy, ustawienia wykrywania, ustawienia czasu, harmonogram).
      2. Otwórz panel Pozyskiwanie danych.
      3. Rozpocznij nagrywanie filmu z eksperymentu bez zwierzęcia, naciskając przycisk Rozpocznij nagrywanie dostępny w oprogramowaniu.
      4. Umieść zwierzę na obszarze doświadczalnym.
      5. Rozpocznij proces zbierania danych, naciskając przycisk Start na panelu sterowania Czas. Proces śledzenia będzie prowadzony równolegle z procesem nagrywania. W razie potrzeby poproś eksperymentatora, aby ręcznie zanotował zmienne behawioralne, takie jak tyły, pochylenia głowy i upadki (Rysunek 5).
      6. Zbieraj dane EPM ręcznie, jak również przez zaślepionego obserwatora (oddzielić obserwatora od EPM kurtyną) w pomieszczeniu testowym.
      7. Poczekaj do zakończenia nagrywania procesu śledzenia lub naciśnij przycisk Stop na panelu sterowania Czas.
      8. Usunąć zwierzę z obszaru doświadczalnego. Zatrzymaj proces nagrywania wideo, naciskając przycisk stop dostępny w odtwarzaczu oprogramowania do śledzenia ruchu.
      9. Przygotuj obszar doświadczalny dla następnego zwierzęcia, myjąc je i susząc. Powtórz cykl ponownie.
    4. analiza danych
      1. Aby uzyskać dostęp do narzędzia Analiza, naciśnij przycisk Analiza na pasku Asystenta eksperymentowania.
      2. Aby wygenerować raporty z analizy zakończonych prób, wybierz badania do analizy. Skonfiguruj i wybierz raport analizy. Ustaw przedziały czasowe, które mają być analizowane. Generuj i przeglądaj raporty. Wyeksportuj wyniki do arkusza kalkulacyjnego lub formatu obrazu (Rysunek 6).
  3. EPM do pomiaru poziomu lęku
    1. Eksperymenty EPM należy wykonywać w warunkach bezstresowych (w słabo oświetlonym i cichym pomieszczeniu) po zgłębniku ustnym.
      UWAGA: Upewnij się, że eksperymenty są przeprowadzane w krótkich odstępach czasu (np. między 1200 a 1400), ponieważ rytm okołodobowy może wpływać na zachowanie gryzoni w klasie EPM15,17. Unikaj niepotrzebnych ruchów i hałasu podczas eksperymentu.
    2. Przed rozpoczęciem testu upewnij się, że EPM jest wyczyszczony i wysuszony, a system śledzenia wideo jest gotowy do użycia.
    3. Przenieś szczury w ich domowej klatce do pomieszczenia doświadczalnego 30 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.
    4. Umieść szczura na przecięciu czterech ramion EPM, przodem do otwartego ramienia naprzeciwko eksperymentatora.
    5. Uruchom oprogramowanie do śledzenia wideo, a także ręcznie nagraj zachowanie zwierzęcia przez 5 minut.
    6. Jeśli zwierzę spadnie z EPM, podnieś je i umieść z powrotem w tym samym miejscu EPM, w którym spadło. Wyklucz dane behawioralne tego zwierzęcia z analizy.
      UWAGA: Głośny hałas lub ruch może unieruchomić/zamrozić zwierzęta na otwartych ramionach. Jeżeli podczas doświadczenia słychać głośny dźwięk, należy wykluczyć z analizy dane behawioralne zwierzęcia poddanego doświadczeniu w tym momencie.
    7. Pod koniec 5-minutowego testu zatrzymaj oprogramowanie do śledzenia wideo i usuń zwierzę z EPM. Umieść go z powrotem w jego domowej klatce.
    8. Przed kolejnym eksperymentem/zwierzęciem wyczyść EPM detergentem dezynfekującym (np. Quatricide), a następnie wodą z kranu. Osusz urządzenie ręcznikami papierowymi.

4. Analizy danych zbieranych przez system śledzenia wideo

  1. Na podstawie zarejestrowanych danych przeanalizuj ilość czasu spędzonego w otwartych ramionach i w zamkniętych ramionach; liczbę wejść dokonanych do otwartych ramion, zamkniętych ramion i do strefy środkowej; opóźnienie do wejścia w zamknięte ramiona; odległość przebytą w otwartych ramionach, zamkniętych ramionach i w strefie środkowej.
    UWAGA: Uważa się, że zwierzę znajduje się w obszarze, w którym środek masy ciała znajduje się w tym obszarze.
  2. Określ wpływ leczenia na zachowanie, korzystając z analizy wariancji (ANOVA) z testem najmniejszej istotnej różnicy (LSD) Fishera/testem wielokrotnych porównań Tukeya.

Wyniki

W niniejszym eksperymencie badano hipotezę, według której egzogenna suplementacja ketonami, podawana przewlekle (w diecie przez 83 dni) lub podostro (doustnie przez gavage przez 7 dni), wykazuje działanie przeciwlękowe u dwumiesięcznych samców szczurów Sprague-Dawley (SPD) (250 - 350 g). Przewlekłe podawanie obejmowało następujące suplementy ketonowe: ester ketonów w niskiej dawce (LKE; diester 1,3-butanodiolu i acetooctanu, ~10 g/kg/day, LKE), ester ketonów w wysokiej dawce (HKE; ~25 g/kg/day, HKE), sól mineralna beta-hydroksymaślanu (bHB-S; ~25 g/kg/day, KS) oraz bHB-S + triglicerydy średniołańcuchowe (MCT; ~25 g/kg/day, KSMCT). W eksperymentach podostrych zastosowano następujące grupy terapeutyczne: KE, KS oraz KSMCT (5 g/kg/day). Grupy kontrolne obejmowały SD lub SD z podawaniem wody przez gavage (kontrola). Wszystkie dane przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM). Wyniki uznano za istotne statystycznie przy p < 0.05. Istotność określono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA) z testem LSD Fishera.

Po chronicznym podawaniu paszy, szczury w grupie KSMCT spędzały znacznie więcej czasu w otwartych ramionach (p = 0.0094) w porównaniu z grupą kontrolną. Czas spędzony w zamkniętych ramionach był znacznie krótszy w grupach LKE, KS i KSMCT (p = 0.0389, 0.0077 i 0.0019 odpowiednio), podczas gdy grupa KS spędzała znacznie więcej czasu w centrum (p = 0.0239) w porównaniu z grupą kontrolną (SD) (Rysunek 7A)18.

Szczury w grupach KS i KSMCT pokonały znacząco dłuższe dystanse w otwartych ramionach (p = 0,036 i 0,0165), natomiast szczury w grupach LKE, KS i KSMCT pokonały znacząco mniejszy dystans w ramionach zamkniętych (p = odpowiednio 0,0252, 0,00041 i 0,0032) w porównaniu z grupą kontrolną (SD) (Rysunek 7B). W porównaniu z grupą kontrolną, w grupach KS i KSMCT odnotowano większy dystans pokonany w strefie centralnej (p = odpowiednio 0,0206 i 0,0482), natomiast w grupie KSMCT czas do pierwszego wejścia do ramion zamkniętych był znacząco dłuższy po przewlekłym podawaniu pokarmu (p = 0,0038)18 (Rysunek 7C).

Czas spędzony w otwartych ramionach był większy w grupie KE (p = 0,0281) po 7 dniach podawania doustnego, natomiast w grupach KE, KS i KSMCT czas spędzony w centrum uległ skróceniu (p = 0,0005, < 0,0001 i = 0,023, odpowiednio), w porównaniu z grupą kontrolną (Rycina 8A)18. W grupach KE i KS liczba wejść do zamkniętych ramion była znacząco niższa (p = 0,0436 i 0,0234, odpowiednio) po 7 dniach podawania (Rycina 8B), natomiast szczury w grupie KS rzadziej wchodziły również do centrum (p = 0,0193), w porównaniu z grupą kontrolną (SD).

Równowaga statyczna; abstrakcyjny model architektoniczny; powierzchnie odbijające; koncepcja równowagi; studium projektowe.
Rysunek 1: Podwyższony krzyżowy labirynt (EPM) wykorzystywany do testowania szczurów. Każdy ramion ma szerokość 10 cm i długość 50 cm, przy czym dwa przeciwległe ramiona są otwarte z podwyższoną krawędzią. Dwa przeciwległe ramiona zamknięte są wyposażone w ścianki o wysokości 30 cm. Wysokość pomostu nad podłogą wynosi 55 cm. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat oświetlenia bezpośredniego i pośredniego; przedstawia ścieżki światła dla metod oświetlenia w projektowaniu architektonicznym.
Rycina 2: Przykłady oświetlenia bezpośredniego i pośredniego. Należy upewnić się, że źródło światła jest skierowane w stronę sufitu, podczas gdy światło bezpośrednie nad obszarem eksperymentalnym jest zablokowane. Ważne jest stosowanie światła pośredniego podczas eksperymentów EPM, aby równomiernie oświetlić wszystkie cztery ramiona bez tworzenia cieni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Interfejs asystenta eksperymentowania; konfiguracja źródła danych, opcje analizy, pasek narzędzi konfiguracji eksperymentalnej.
Rysunek 3: Pasek asystenta eksperymentowania w oprogramowaniu do śledzenia ruchu. Został on zaprojektowany w celu zapewnienia dostępu do głównych operacji. Przyciski odpowiadają zadaniom w typowym procesie eksperymentalnym, przy czym aktywne są jedynie zadania dozwolone w danej chwili. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Śledzenie myszy w badaniu behawioralnym, schemat; eksperyment dotyczący nawigacji przestrzennej, analiza ruchu.
Rysunek 4: Ścieżka obiektu jest zaznaczona czerwoną linią podążającą za ruchem zwierzęcia. Poprzez regulację progu można zredukować tło do momentu, aż zostanie wykryte tylko zwierzę i zacznie być śledzone przez czerwoną linię. Ścieżka podąża za środkiem masy obiektu, a współrzędne aktualnej pozycji są wskazane. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Układ eksperymentu zachowania myszy; aparatura labiryntowa do wizualizacji badania procesu podejmowania decyzji.
Rycina 5: Podwyższony krzyżowy labirynt (EPM) ze szczurem Sprague Dawley (SPD) w otwartym ramieniu. Przedstawiono przykład układu eksperymentalnego. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat analizy ścieżki śledzenia obiektu z kolorowymi ramkami ograniczającymi; wizualizacja konfiguracji śledzenia.
Rysunek 6: Skumulowany tor ruchu zwierzęcia podczas próby. W ramach analizy danych można wyświetlić zebrany ślad trajektorii badanego obiektu w obszarze śledzenia. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Analiza behawioralna, wykresy słupkowe przedstawiające czas, dystans w strefach oraz wyniki latencji wejścia do ramion zamkniętych.
Rycina 7: Reakcje behawioralne szczurów SPD w teście EPM po 83 dniach chronicznego podawania egzogennych ciał ketonowych.** Panele te przedstawiają reprezentatywne wyniki uzyskane za pomocą EPM oraz systemu śledzenia ruchu18. (A) Grupa KSMCT spędziła większy procent czasu w ramionach otwartych, natomiast grupy LKE, KS i KSMCT spędziły mniej czasu w ramionach zamkniętych w porównaniu z grupą kontrolną (SD). (B) Grupy KS i KSMCT pokonały większy dystans w ramionach otwartych, podczas gdy grupy LKE, KS i KSMCT pokonały mniejszy dystans w ramionach zamkniętych, co wskazuje na zmniejszony lęk w porównaniu z grupą kontrolną (SD). (C) Grupa KSMCT weszła do ramion zamkniętych później, co wskazuje na zmniejszony lęk w porównaniu z grupą kontrolną (SD). Skróty: SD = standardowa karma dla gryzoni + woda (25 g/kg masy ciała (b.w.) wody/dobę); LKE = SD + LKE (diester 1,3-butanodiolu i acetooctanu, 10 g/kg b.w./dobę); HKE = SD + HKE (25 g/kg b.w./dobę); KS = SD + sól mineralna beta-hydroksymaślanu (bHB-S; 25 g/kg b.w./dobę); KSMCT = SD + bHB-S + triglicerydy średniołańcuchowe (MCT; 25 g/kg b.w./dobę); SPD = szczur Sprague-Dawley; EPM = wyniesiony labirynt krzyżowy (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Ari et al.18. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Czas spędzony i liczba wejść do stref; wykres słupkowy; analiza behawioralna; porównanie stref eksperymentalnych.
Rycina 8: Reakcje behawioralne szczurów SPD po 7 dniach doustnego podawania egzogennych suplementów ketonowych. Reprezentatywne wyniki zebrano za pomocą testu EPM, wykorzystując system oprogramowania do śledzenia ruchu18. (A) Grupa KE spędziła większy procent czasu w otwartych ramionach, natomiast grupy KE, KS i KSMCT spędziły mniej czasu w centrum (w porównaniu z grupą kontrolną [SD]), co wskazuje na zmniejszenie lęku. (B) W porównaniu z grupą kontrolną (SD), u szczurów z grup KE i KS odnotowano mniejszą liczbę wejść do ramion zamkniętych. Skróty: SD = standardowa karma dla gryzoni + woda (5 g/kg b.w. wody/dobę); KE = SD + ester ketonowy (diester 1,3-butanodiolu i acetoacetanu, 5 g/kg b.w./dobę); KS = SD + sól mineralna beta-hydroksymaślanu (bHB-S; 5 g/kg b.w./dobę); KSMCT = SD + bHB-S + MCT (5 g/kg b.w./dobę); SPD = szczur Sprague-Dawley; EPM = podwyższony labirynt krzyżowy (* p < 0,05; *** p < 0,001; **** p < 0,0001). Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Ari et al.18. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Ogólnie rzecz biorąc, kilka powszechnie stosowanych testów, takich jak test wyboru jasnego i ciemnego, test interakcji społecznej i test EPM, służy do pomiaru poziomu lęku w różnych modelach zwierzęcych. Jednak sam test EPM jest odpowiednią metodą do zbadania, na przykład, wpływu egzogennych suplementów ketonowych na poziom lęku u gryzoni18,20.

Główną zaletą metody EPM jest to, że opiera się ona na instynktownej skłonności gryzoni do ciemnych, zamkniętych przestrzeni, a także na nieuwarunkowanym lęku wysokości i unikaniu otwartych przestrzeni. Z drugiej strony, inne metody stosowane do badania zachowań podobnych do lęku opierają się na reakcjach behawioralnych na pewne szkodliwe bodźce, takie jak porażenie prądem, brak jedzenia/wody, głośne dźwięki i narażenie na zapach drapieżnika3. Testy te zwykle skutkują warunkową reakcją, podczas gdy EPM stanowi również bardziej humanitarną alternatywę. Co więcej, EPM może być użytecznym narzędziem do badania zaangażowania różnych regionów mózgu (np. regionów limbicznych, hipokampa) i mechanizmów leżących u podstaw (np. GABA, glutaminianu, serotoniny, adenozyny) zachowań lękowych2.

Podczas stosowania zabiegów, które są dość stresujące dla zwierząt (np. zgłębnik w jamie ustnej), ważne jest, aby wszystkie zwierzęta były traktowane w ten sam sposób i przez tę samą osobę, zwłaszcza przy ocenie potencjalnych, subtelnych efektów przeciwlękowych. Jeśli to możliwe, preferowaną metodą może być wprowadzenie leku/związku do wody pitnej lub w postaci smacznego "smakołyku". Aby upewnić się, że każdemu zwierzęciu podaje się taką samą ilość, można użyć zgłębnika doustnego. Opierając się na właściwościach farmakokinetycznych związku, zwykle zaleca się przetestowanie zwierząt na EPM w ciągu 1 godziny po zwerbowaniu. Przy wyborze uczestników eksperymentu ważne jest, aby wziąć pod uwagę ich szczep, płeć, cykl rujowy i wiek, a także masę ciała, zgodnie z celami i substancjami badanymi2. Jeśli chodzi o wiek, podczas projektowania badań EPM i interpretacji danych ważne jest, aby wziąć pod uwagę, że odsetek wejść z otwartym ramieniem rośnie liniowo wraz z wiekiem21 lat, a zmiany związane ze starzeniem się w zachowaniu EPM są specyficzne dla szczepu22.

Podczas przeprowadzania testu EPM istnieją potencjalne problemy, którymi należy się zająć. Czasami zwierzęta muszą zostać wyłączone z analizy ze względu na tendencje do odstających wartości (np. zwierzę nigdy nie opuszcza obszaru, w którym zostało umieszczone, prawie spada z aparatury, jest rozpraszane przez hałas lub zdarzenie poza aparaturą). Dalsze powikłania związane z badaniem EPM mogą obejmować leczenie, które powoduje sedację lub nadpobudliwość, ponieważ tego typu efekty muszą być oceniane za pomocą parametrów EPM.

Ważne jest, aby poddać zwierzęta badaniu EPM tylko raz, ponieważ przy drugim (powtarzającym) narażeniu gryzoni wykazano zmniejszoną aktywność na otwartych ramionach i skrócony całkowity czas spędzony na platformie centralnej w porównaniu z pierwszym narażeniem na EPM14,15. W związku z tym zdecydowanie zaleca się jednorazowe poddanie gryzoni testowi EPM. Jeżeli jednak między pierwszym a drugim narażeniem na EPM upływają co najmniej trzy tygodnie, a układ EPM zostaje przeniesiony do innego pomieszczenia (innego środowiska), zwierzęta mogą być badane za pomocą testu EPM więcej niż raz2.

EPM jest dostępny w różnych materiałach, rozmiarach (np. dla myszy lub szczura) i kolorach, co należy wziąć pod uwagę przy wyborze przedmiotów studiów. Należy pamiętać, że zapachy pozostawione przez poprzednie zwierzę na aparacie mogą zmienić zachowanie kolejnego zwierzęcia. Dlatego zalecamy stosowanie EPM wykonanego z materiału łatwego w czyszczeniu, takiego jak szkło akrylowe (nieprzezroczyste), które nie zatrzymuje zapachów po praniu. Unikaj aparatury EPM wykonanej z drewna. Najlepiej użyć koloru matowego, który różni się od koloru zwierząt testowanych na EPM (np., jeśli badane są zwierzęta białe). Im lepszy kontrast między zwierzęciem a wybiegiem, tym lepsza detekcja zwierzęcia oraz większa wiarygodność i precyzja uzyskanych wyników (pokonany dystans, prędkość, śledzenie). Aparat EPM wykonany z matowego szarego materiału jest przydatny w przypadku białych, czarnych i biało-czarnych zwierząt.

Kolejną zaletą systemu śledzenia wideo jest to, że oprócz EPM oferuje elastyczny i łatwy sposób konfiguracji z szeroką gamą testów behawioralnych, takich jak labirynt wodny, otwarte pole, labirynty z ramieniem plusowym / promieniowym / T-Y, preferencje dotyczące miejsc, wymuszone pływanie i testy zawieszenia ogona.

Podsumowując, celem tego artykułu jest opisanie testu EPM stosowanego w połączeniu z oprogramowaniem do śledzenia wideo do zbierania i analizowania zmian behawioralnych w odpowiedzi na nowatorskie terapie przeciwlękowe. Możliwe zastosowania EPM obejmują wstępne badania przesiewowe nowo opracowanych środków farmakologicznych do leczenia zaburzeń związanych z lękiem. Oprócz środków przeciwlękowych i przeciwlękowych, można również badać behawioralne działanie różnych hormonów i leków nadużywających. Można również ocenić wpływ starzenia się i narażenia na różne czynniki stresogenne. Badanie to wykazało, że gdy zostaną podjęte odpowiednie kroki, stosowanie EPM okazało się wrażliwą metodą oceny zmian behawioralnych związanych z suplementacją ketonów18,20.

Oświadczenia

D'Agostino, DP, Kesl, S., Arnold, P. Kompozycje i metody wytwarzania podwyższonej i trwałej ketozy. Patent międzynarodowy # PCT/US2014/031237. Uniwersytet Południowej Florydy.

Ari, C., D'Agostino, DP, Egzogenne suplementy ketonowe w celu zmniejszenia zachowań związanych z lękiem. Patent tymczasowy #62289749. Uniwersytet Południowej Florydy.

Dominic P. D'Agostino i Csilla Ari są współwłaścicielami firmy Ketone Technologies LLC.

Interesy te zostały zweryfikowane i zarządzane przez Uniwersytet zgodnie z jego polityką dotyczącą instytucjonalnego i indywidualnego konfliktu interesów. Wszyscy autorzy deklarują, że nie występują żadne dodatkowe konflikty interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez N000141310062 Grantu ONR oraz Grant Fundacji GLUT1D #6143113500 (dla Dominica P. D'Agostino), przez Narodową Agencję Rozwoju Węgier (w ramach Grantu No. TIOP-1.3.1.-07/2-2F-2009-2008; do Zsolt Kovács) oraz przez Departament ds. Weteranów (do Marka Kindy'ego). Autorzy pragną podziękować firmie Quest Nutrition LLC za wsparcie trwających badań na ten temat (do Csilla Ari).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Elevated Plus Maze dla myszy i szczurówCoulbourn InstrumentsH10-35-EPM
SMART Oprogramowanie do śledzenia wideoAparatura HarvardaSMART 3.0

Bibliografia

  1. Pellow, S., Chopin, P., File, S. E., Briley, M. Validation of open : closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 14 (3), 149-167 (1985).
  2. Walf, A., Frye, C. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nature Protocols. 2 (2), 322-328 (2007).
  3. Barnett, S. A. The rat: A study in behavior. , University of Chicago Press. Chicago, IL. (1975).
  4. Handley, S. L., Mithani, S. Effects of alpha-adrenoceptor agonists and antagonists in a maze-exploration model of 'fear'-motivated behaviour. Naunyn Schmiedebergs Archives. In Pharmacology. 327 (1), 1-5 (1984).
  5. Montgomery, K. C. The relation between fear induced by novel stimulation and exploratory behavior. Journal of Comparative Physiology and Psychology. 48 (4), 254-260 (1955).
  6. Sarkisova, K. Y., Midzianovskaia, I. S., Kulikov, M. A. Depressive-like behavioral alterations and c-fos expression in the dopaminergic brain regions in WAG/Rij rats with genetic absence epilepsy. Behavioral Brain Research. 144 (1-2), 211-226 (2003).
  7. Jain, N., Kemp, N., Adeyemo, O., Buchanan, P., Stone, T. W. Anxiolytic activity of adenosine receptor activation in mice. British Journal of Pharmacology. 1116 (3), 2127-2133 (1995).
  8. Paslawski, T., Treit, D., Baker, G. B., George, M., Coutts, R. T. The antidepressant drug phenelzine produces antianxiety effects in the plus-maze and increases in rat brain GABA. Psychopharmacology (Berlin). 127 (1), 19-24 (1996).
  9. Florio, C., Prezioso, A., Papaioannou, A., Vertua, R. Adenosine A1 receptors modulate anxiety in CD1 mice. Psychopharmacology (Berlin). 136 (4), 311-319 (1998).
  10. Engin, E., Treit, D. The effects of intra-cerebral drug infusions on animals' unconditioned fear reactions: a systematic review. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 32 (6), 1399-1419 (2008).
  11. Botton, P. H., et al. Aged mice receiving caffeine since adulthood show distinct patterns of anxiety-related behavior. Physiology and Behavior. 170, 47-53 (2017).
  12. Hughes, R. N., Hancock, N. J., Henwood, G. A., Rapley, S. A. Evidence for anxiolytic effects of acute caffeine on anxiety-related behavior in male and female rats tested with and without bright light. Behavioural Brain Research. 271, 7-15 (2014).
  13. Rex, A., Marsden, C. A., Fink, H. Effect of diazepam on cortical 5-HT release and behaviour in the guinea-pig on exposure to the elevated plus maze. Psychopharmacology (Berlin). 110 (4), 490-496 (1993).
  14. Almeida, S. S., Garcia, R. A., de Oliveira, L. M. Effects of early protein malnutrition and repeated testing upon locomotor and exploratory behaviors in the elevated plus-maze. Physiology of Behaviour. 54 (4), 749-752 (1993).
  15. Bertoglio, L. J., Carobrez, A. P. Behavioral profile of rats submitted to session 1-session 2 in the elevated plus-maze during diurnal/nocturnal phases and under different illumination conditions. Behavioural Brain Research. 132 (2), 135-143 (2002).
  16. Korte, S. M., De Boer, S. F. A robust animal model of state anxiety: fear-potentiated behaviour in the elevated plus-maze. European Journal of Pharmacology. 463 (1-3), 163-175 (2003).
  17. Carobrez, A. P., Bertoglio, L. J. Ethological and temporal analyses of anxiety-like behavior: the elevated plus-maze model 20 years on. Neuroscience & Biobehavioural Reviews. 29 (8), 1193-1205 (2005).
  18. Ari, C., et al. Exogenous ketone supplements reduce anxiety-related behavior in Sprague-Dawley and Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Molecular Neuroscience. 9, 137(2016).
  19. D'Agostino, D. P., et al. Therapeutic ketosis with ketone ester delays central nervous system oxygen toxicity seizures in rats. American Journal of Physiology: Regulation Integration and Comparative Physiology. 304 (10), R829-R836 (2013).
  20. Kovács, Z., D'Agostino, D. P., Ari, C. Anxiolytic effect of exogenous ketone supplementation is abolished by adenosine A1 receptor inhibition in Wistar Albino Glaxo/Rijswijk rats. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 12, 29(2018).
  21. Lynn, D. A., Brown, G. R. The ontogeny of anxiety-like behavior in rats from adolescence to adulthood. Developmental Psychobiology. 52 (8), 731-739 (2010).
  22. Ferguson, S. A., Gray, E. P. Aging effects on elevated plus maze behavior in spontaneously hypertensive, Wistar-Kyoto and Sprague-Dawley male and female rats. Physiology of Behavior. 85 (5), 621-628 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Modele gryzonitesty behawioralneegzogenne cia a ketonowesystem ledzenia SMARTramiona otwarteramiona zamkni te
Test labiryntu Elevated Plus w połączeniu z oprogramowaniem do śledzenia wideo w celu zbadania przeciwlękowego działania egzogennych suplementów ketogenicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.