Artykuł metodologiczny

Syngeniczny model chłoniaka z komórek B myszy do przedklinicznej oceny limfocytów T CD19 CAR

16.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58492

⸱

16 października 2018

 ,  ,  ,  , 
1Manchester Cancer Research Centre Building, Department Cancer Sciences, University of Manchester, 2Celyad

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół produkcji i testów przedklinicznych mysich limfocytów T CD19 CAR metodą transdukcji retrowirusowej i wykorzystania jako terapii przeciwko ustalonemu syngenicznemu chłoniakowi B-komórkowemu A20 u myszy BALB/c z lub bez kondycjonowania wstępnego limfodepletingu.

Streszczenie

Zdumiewający sukces kliniczny terapii limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) CD19 doprowadził do zatwierdzenia dwóch chimerycznych receptorów antygenowych drugiej generacji (CAR) dla ostrej białaczki limfoblastycznej (ALL) i chłoniaka nieziarniczego (NHL). Naukowcy koncentrują się obecnie na naśladowaniu tych sukcesów w innych nowotworach hematologicznych, w których obserwuje się mniej imponujące wskaźniki całkowitej odpowiedzi. Dalsza inżynieria limfocytów CAR T lub jednoczesne stosowanie innych metod leczenia może skutecznie przezwyciężyć przeszkody na drodze do skutecznej terapii w innych stanach nowotworowych.

Dlatego prezentujemy model, w którym inni mogą przeprowadzać testy przedkliniczne limfocytów T CD19 CAR. Wyniki tego dobrze przetestowanego modelu chłoniaka z komórek B mogą być ogólnie pouczającą terapią komórkami T CAR.

Ten protokół pozwala na powtarzalne wytwarzanie mysich komórek CAR T poprzez transfekcję fosforanu wapnia komórek produkcyjnych Plat-E z retrowirusowymi konstruktami MP71 i plazmidem pakującym pCL-Eco, a następnie zbieranie wydzielanych cząstek retrowirusowych i transdukcję za pomocą rekombinowanego fragmentu ludzkiej fibronektyny oraz wirowanie. Opisano również walidację transdukcji retrowirusowej i potwierdzenie zdolności limfocytów CAR T do zabijania docelowych komórek chłoniaka ex vivo, poprzez zastosowanie cytometrii przepływowej, luminometrii i testu immunoenzymatycznego (ELISA).

Opisano protokoły testowania limfocytów T CAR in vivo u myszy syngenicznych limforepletowych i limfodepletowych, z ustalonym, układowym chłoniakiem. Aktywność przeciwnowotworowa jest monitorowana przez bioluminescencję in vivo i progresję choroby. Pokazujemy typowe wyniki eradykacji ustalonego chłoniaka z komórek B przy użyciu CAR 1 lub 2generacji w połączeniu ze wstępnym kondycjonowaniem limfodepletingu oraz mniejszości myszy osiągających długoterminową remisję przy użyciu limfocytów T CAR eksprymujących IL-12 u myszy z pulą limforudyczną.

Te protokoły mogą być używane do oceny limfocytów T CD19 CAR z różnymi dodatkowymi modyfikacjami, kombinacjami limfocytów CAR T i innymi środkami terapeutycznymi lub przystosowane do użycia limfocytów CAR T przeciwko różnym antygenom docelowym.

Wprowadzenie

Terapia limfocytami T z chimerycznym receptorem antygenu antygenowego (CAR) wykazała zdumiewający sukces kliniczny w leczeniu nowotworów złośliwych CD19+, co doprowadziło do zatwierdzenia tisagenlecleucel w nawrotowej ostrej białaczce limfoblastycznej 1 i axicabtagene ciloleucel dla postępującego chłoniaka nieziarniczego z dużych komórek B2 w 2017 roku.

Coraz bardziej doceniane jest znaczenie interakcji między rakiem a układem odpornościowym zarówno w postępie choroby, jak i mechanizmach terapeutycznych3,4,5. Na przykład jest dobrze udokumentowane, że mikrośrodowisko guza (TME) jest zalane czynnikami, które mogą tłumić funkcje efektorowe komórek odpornościowych6,7,8. Alternatywnie, pobudzanie endogennych komórek odpornościowych i rozprzestrzenianie się epitopów może być kluczem do eradykacji guza i długoterminowej odporności na prowokację nowotworową9,10. Oba te zjawiska nie mogą być oceniane w modelach ksenogenicznych, które nie mają układu odpornościowego. Podobnie, systemy wykorzystujące białka transgeniczne nie odzwierciedlają dokładnie wyzwania, jakim jest przełamanie tolerancji immunologicznej, która jest wymagana do rozprzestrzeniania się epitopów11,12. Model syngeniczny z w pełni funkcjonalnym układem odpornościowym ma zatem zasadnicze znaczenie dla modelowania tych ważnych aspektów progresji choroby nowotworowej i terapii immunologicznej.

Ważnym zastrzeżeniem terapii limfocytami T CAR jest to, że do osiągnięcia sukcesu terapeutycznego wymagane jest wstępne kondycjonowanie limfodeplecyjne13,14. Zazwyczaj osiąga się to u pacjentów poprzez podanie chemioterapii przed infuzją limfocytów CAR T15,16. Jako standardową metodę, w celu naśladowania limfodeplecji stosowanej w warunkach pacjenta, podajemy napromienianie całego ciała 5 Gy (TBI) w celu uzyskania limfodeplecji przed podaniem terapeutycznych komórek CAR T myszom z układowym chłoniakiem z komórek B A20.

Podczas gdy wstępne kondycjonowanie limfodeplecji limfologicznej nie stanowi problemu dla większości pacjentów, toksyczność związana z chemioterapeutykami oznacza, że pacjenci o niskim stanie sprawności nie kwalifikują się do terapii limfocytami T CAR. Aby stworzyć system testowy, który reprezentuje pacjentów niekwalifikujących się do limfodeplecji, ustaliliśmy syngeniczny model myszy limforepletowej, w którym modelujemy terapię chłoniaka limfocytami T CAR. W tym modelu wykazaliśmy, że wydzielanie IL-12 z limfocytów CAR T może prowadzić do eradykacji utrwalonego chłoniaka ze wskaźnikiem sukcesu ~ 25%17. Ponadto wykazaliśmy, że endogenne komórki odpornościowe są zaangażowane w eradykację raka.

Tutaj szczegółowo opisujemy protokół produkcji mysich komórek CAR T, tworzenia chłoniaka u myszy syngenicznych oraz leczenia chłoniaka limfocytami CAR T z użyciem lub bez użycia kondycjonowania wstępnego limfodepletingu. Można to wykorzystać do badań skojarzonych limfocytów CAR T z innymi lekami, testowania limfocytów CAR T z innymi transgenami lub do stosowania innych strategii adoptywnej terapii komórkowej lub immunoterapii przeciwko chłoniakowi.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach były prowadzone pod auspicjami Ustawy o Zwierzętach (Procedurach Naukowych) z 1986 roku oraz zgodnie z wytycznymi brytyjskiego Komitetu Koordynacyjnego ds. Badań nad Rakiem. Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone w instytucie CRUK-Manchester i zatwierdzone przez lokalny organ ds. dobrostanu zwierząt i oceny etycznej (CRUK-MI AWERB).

1. Przygotowania

  1. Maxiprep pMP71 retrowirusowy konstrukt plazmidowy i plazmidy pakujące retrowirusa pCL-Eco 18.
    UWAGA: pMP71 koduje mCherry i CAR oddzielone sekwencją FMDV2A. Jest to wymienne z innymi konstruktami retrowirusowymi. pCL-Eco koduje białka gag, pol i ekotropowe białka otoczki.
  2. Przygotuj kompletną pożywkę z limfocytów T (TCM) do hodowli mysich limfocytów T przy użyciu pożywki RPMI 1640, 10% FCS, 1% 100x penicylina-streptomycyna-glutamina (PSG).
    nuta: Roztwór zawiera 100 μM/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 2 mM L-glutaminy), 50 μM β-merkaptoetanolu i 25 mM kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES).
  3. Hodowla komórek A20 w RPMI 1640, 10% FCS i 0,05 mM β-merkaptoetanolu w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  4. Hodować komórki Platinum-E (Plat-E) w kompletnym zmodyfikowanym pożywce orła (DMEM) firmy Dulbecco (DMEM z 10% płodową surowicą cielęcą (FCS), 2 mM L-glutaminy, 1 μg/ml puromycyny i 10 μg/ml blasticydyny) w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    nuta: Komórki Plat-E pochodzą z komórek 293T i wyrażają białka retrowirusowe gag, pol i ekotropowe otoczki.
  5. Przygotować roztwory pożywek do transfekcji 1 i 2 bezpośrednio przed transfekcją. Przygotować roztwór 1 (pH 7,9) zawierający DMEM + 10% FCS + 25 mM HEPES, roztwór 2 (pH 7,1) zawierający DMEM + 25 mM HEPES.
  6. Przygotować 10 μg/ml rekombinowanego roztworu fragmentu ludzkiej fibronektyny, rozcieńczając sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu użycia.
  7. Przed użyciem sterylnie przefiltruj wszystkie media przez filtry 0,2 μm (z wyłączeniem rekombinowanego fragmentu ludzkiej fibronektyny).

2. Transdukcja retrowirusowa limfocytów T

  1. Dzień 1: Przygotowanie do transfekcji
    1. Wysiew 7,5 x 106 komórek Platinum-E (Plat-E) w 15 cm2 szalkach do hodowli tkankowych w 18 ml kompletnego DMEM i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  2. Dzień 2: Transfekcja retrowirusowej linii komórkowej Plat-E
    1. Przygotować 20,4 μg DNA wektora opakowaniowego pcl-Eco, 39,6 μg plazmidowego DNA kodującego retrowirusowy konstrukt CAR i 150 μl 1 M CaCl2 do końcowej objętości 3 ml roztworu do transfekcji 2 na 15 cm2 naczynia do transfekcji. Wiruj przez 10 s i odpoczywaj przez 5 minut
    2. Usuń pożywkę DMEM z szalek o długości 15 cm2 i zastąp ją 12 ml roztworu do transfekcji 1,
      ostrożność Podczas zmiany nośnika naczynia o średnicy 15 cm2 mogą wyschnąć na środku. Może to spowodować znaczną śmierć transfekowanych komórek Plat-E. Pracuj szybko i usuwaj nośniki z zaledwie 1-2 płyt jednocześnie.
    3. Dodać 3 ml roztworu do transfekcji 2 zawierającego DNA i CaCl2 do każdej 15 cm2 szalki kroplami, równomiernie na każdej płytce. Delikatnie kołysz płytkami ruchami z boku na bok przez 10 s. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  3. Dzień 3: Przygotowanie supernatantu zawierającego wirusa do transdukcji
    1. Zastąp pożywkę transfekowanych komórek Plate-E 18 ml kompletnym TCM i wróć do inkubatora.
      ostrożność Podczas zmiany nośnika 15 cm2 naczynia mogą wyschnąć na środku. Może to spowodować znaczną śmierć transfekowanych komórek Plat-E. Pracuj szybko i usuwaj nośniki z zaledwie 1-2 płyt jednocześnie.
  4. Dzień 3: Izolacja i aktywacja in vitro mysich limfocytów T śledziony
    1. Usuń śledziony od 6-8-tygodniowych myszy BALB / c, jak wcześniej opisali Parkinson i wsp.19 i zanurz je w sterylnym, lodowatym PBS w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    2. Za pomocą pęsety przenieś śledzionę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i homogenizuj za pomocą tłuczka z minimalną siłą.
    3. Użyj pipety 1000 μl i ~ 800 μl PBS, aby przenieść homogenat do sitka do komórek porowych 100 μm przymocowanego do 50 ml probówki zawierającej 5 ml PBS, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Powtórz krok 2.4.2 dla dodatkowych śledzion. Nie przekraczać 3 śledziony na tubę.
      ostrożność Splenocyty przepuszczone przez filtr mogą tworzyć grudki, jeśli zostaną pozostawione. Ręcznie obracaj rurki z przerwami podczas przetwarzania kilku śledzion, aby uniknąć zlepiania się komórek. Pozostałe fragmenty na sitku do komórek można dalej rozgniatać za pomocą tłoka ze strzykawki o pojemności 5 ml przy użyciu minimalnej siły.
    4. Uzupełnić do 20 ml PBS. Delikatnie ułóż zawiesinę komórek o objętości 20 ml na 20 ml pożywki o gradiencie gęstości (tabela materiałów) w probówce o pojemności 50 ml. Odwirować powstałą zawiesinę o sile 800 x g przez 20 minut bez użycia hamulca.
    5. Pobrać komórki z warstwy granicznej za pomocą sterylnej pipety Pasteura i przenieść do probówki o pojemności 50 ml. Uzupełnić do 50 ml PBS i odwirować przy 800 x g przez 10 minut w celu umycia. Odrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w pełnym TCM.
    6. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru.
    7. Hodowla komórek o gęstości 5 x 106 komórek/ml w kompletnym TCM z 30 ng/ml przeciwciałem anty-CD3ε (klon 145-2C11), przeciwciałem anty-CD28 o stężeniu 30 ng/ml (klon 37,51), rekombinowaną ludzką IL-2 o stężeniu 100 U/ml i rekombinowaną mysią IL-7 o stężeniu 2 ng/mL. Należy użyć kolby do hodowli tkankowych o odpowiedniej wielkości w stosunku do objętości pobranych komórek.
      nuta: Komórki prezentujące antygen są wymagane do aktywacji limfocytów T przez przeciwciała CD3 i CD28, w przypadku pracy z oczyszczonymi limfocytami T konieczne jest pokrycie płytek przeciwciałami lub użycie kulek magnetycznych (tabela materiałów)
    8. Inkubować mysie splenocyty w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  5. Dzień 3: Przygotowanie płytek do transdukcji
    1. Pokryć 6-dołkowe płytki niepochodzące z hodowli tkankowej 2 ml rekombinowanego fragmentu ludzkiej fibronektyny o stężeniu 10 μg/ml i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Dzień 4: Transdukcja mysich limfocytów T
    1. Przenieś rekombinowany fragment ludzkiej fibronektyny z powlekanych płytek na świeże płytki 6-dołkowe bez hodowli tkankowych. Inkubować te płytki przez noc w temperaturze 4 °C przez 2 rundę transdukcji.
    2. Dodaj 2 ml TCM do każdej studzienki oryginalnych rekombinowanych płytek pokrytych fragmentem ludzkiej fibronektyny i pozostaw na 30 minut w temperaturze pokojowej, aby zablokować niespecyficzne wiązanie.
    3. Zebrać supernatant zawierający retrowirusa z transfekowanych komórek Plat-E w 15 cm szalkach do hodowli tkankowych i zastąpić 18 ml kompletnego TCM.
      ostrożność Pracuj szybko, aby uniknąć wysuszenia ogniw Plat-E.
      nuta: Powodzenie transfekcji można sprawdzić na tym etapie za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jeśli wykorzystuje się gen markera fluorescencyjnego, taki jak mCherry (Rysunek 1).
    4. Przefiltruj supernatant zawierający retrowirusa przez filtr 0,45 μm, aby usunąć resztki komórek. Usunąć TCM z rekombinowanych 6-dołkowych płytek pokrytych fragmentem ludzkiej fibronektyny i dodać 2,5 ml przefiltrowanego supernatantu zawierającego retrowirusa lub do każdej studzienki (użyć pełnego TCM do pozorowanej transfekcji). Oznacz każdy dobrze, a także do dodania retrowirusa lub pożywki próbnej.
    5. Odwirować płytki o sile 1200 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Podczas obracania się płytek zbierz aktywowane limfocyty T i policz za pomocą hemocytometru.
      1. Transdukcję przeprowadza się za pomocą 5 x 106 aktywowanych splenocytów w sumie 5 ml / studzienkę. Zebrać wymaganą liczbę splenocytów do próby/transdukcji w oddzielnych probówkach przez odwirowanie przy 500 x g przez 5 min.
      2. Ponownie zawiesić splenocyty o gęstości 5 x 106 komórek na 2,5 ml przefiltrowanego supernatantu zawierającego retrowirusa z kroku 2.6.4 lub TCM jako kontrolę ujemną. Dodać rekombinowaną ludzką IL-2 (hIL-2) i rekombinowaną myszą IL-7 (mIL-7) do końcowego stężenia odpowiednio 200 j.m./ml i 4 ng/ml.
    7. Zebrać 6-dołkowe płytki z wirówki po zakończeniu etapu 2.6.5 i dodać 2,5 ml / dołek ponownie zawieszonych splenocytów do odpowiednich studzienek, aby uzyskać końcową objętość 5 ml / dołek i końcowe stężenie 100 U / ml hIL-2 i 2 ng / ml mIL-7.
    8. Odwirować płytki o sile 1200 x g przez 90 minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu inkubować płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez noc.
  7. Dzień 5: Runda 2 transdukcji
    1. Zbierz rekombinowany fragment ludzkiej fibronektyny z płytek, ponieważ można go ponownie wykorzystać. Powtórz kroki 2.6.2 - 2.6.5.
    2. Podczas obracania się płytek zbierz komórki z 1. rundy transdukcji za pomocą pipety Pasteura. Przepłukać każdą studzienkę 2 ml PBS, zawirować i zebrać pozostałe komórki w każdym dołku.
      nuta: Pipetuj w górę i w dół, aby ponownie zawiesić osadzone komórki. Zebrać każdą grupę kontrolną/transdukcyjną w oddzielnych probówkach.
    3. Probówki wirówkowe o sile 500 x g przez 5 minut. Ponownie zawiesić komórki w 2,5 ml na studzienkę transdukcji z 200 IU / ml IL-2 i 4 ng / ml IL-7. Powtórz kroki 2.6.7 - 2.6.8.
    4. Usunąć komórki z wirówki i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 4 godziny. Zebrać transdukowane komórki jak w krokach 2.7.2-2.7.3.
    5. Policz komórki, odwiruj przy 500 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić w pełnym TCM o gęstości 1 x 106 komórek/ml ze 100 U/ml hIL-2 i 2ng/ml mIL-7. Przenieść do kolby hodowlanej o odpowiedniej wielkości i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    6. Dodawaj świeże pożywki TCM zawierające 100U/ml hIL-2 i 2ng/ml mIL-7 co 2 dni, utrzymując gęstość komórek 1 x 106 komórek/ml.
      nuta: Zebrane splenocyty zawierają różne typy komórek. W tych warunkach hodowli limfocyty inne niż T obumierają w ciągu 2-3 dni. Po ~ 4 dniach w hodowli komórkowej liczba limfocytów T jest zwykle równoważna całkowitej liczbie zebranych splenocytów w dniu 0.

3. Pomiar efektywności transdukcji

  1. W 4 dniu po transdukcji zbierz próbkę transdukowanych lub nietransdukowanych limfocytów T (około 3 x 105 komórek). Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 500 x g przez 5 minut, wyrzucić supernatant, jednokrotnie przemyć granulowane komórki PBS i ponownie odwirować.
  2. Odrzucić sklarowany nad osadem i dodać 100 μl PBS zawierającego odpowiedni barwnik reaktywny z aminami (np. żywą/martwą plamę, rozcieńczenie 1 do 100) do studzienki. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
  3. Przemyć dwukrotnie PBS i odwirować przy 500 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i inkubować z 50 μl buforu FACS zawierającego przeciwciała anty-mysie CD16/CD32 do blokowania receptora Fc (rozcieńczenie 1 do 100). Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Bezpośrednio dodać 50 μl głównej mieszanki barwiącej przeciwciała zawierającej przeciwciała anty-mysie CD4-BV786 i CD8-BV711 (końcowe stężenie 1 μL/basenik w buforze FACS). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C w ciemności. Powtórz krok prania 3.3. Ponownie zawiesić komórki w 1% buforze PFA i utrzymywać je w ciemności w temperaturze 4 °C do czasu analizy metodą cytometrii przepływowej.
  5. Analizuj komórki za pomocą równoważnego odpowiedniego cytometru przy użyciu BV711, BV785 i fluorescencji mCherry jako markerów podzbioru CD4 i CD8 oraz ekspresji CAR odpowiednio bramkującej jak w (Rysunek 2).

4. Walidacja in vitro aktywności limfocytów CAR T

  1. Nasiona syngenicznych docelowych komórek nowotworowych CD19 + z ekspresją lucyferazy lub bez niej o gęstości 1 x 104 komórek w 100 μl TCM / basenie w 96-dołkowej płytce do hodowli tkankowej z dnem U.
  2. Dodać 1 x 104 limfocyty T CAR CD19 / studzienkę w objętości 100 μl / studzienkę, aby uzyskać stosunek efektora do celu (E:T) 1:1,
    nuta: Współczynniki E:T należy ustalić dla każdego konstruktu CAR i docelowej linii komórkowej.
  3. Stosować same limfocyty T i same komórki nowotworowe jako kontrole ujemne oraz limfocyty T stymulowane octanem forbolu (PMA) (50 ng / ml) i jonomycyną (1 μg / ml) jako kontrolę pozytywną dla uwalniania interferonu gamma (IFNγ). Komórki do kohodowli w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 16–24 h.
  4. Po kohodowli odwirować płytki o masie 500 x g przez 5 minut i zebrać supernatant do dalszej analizy ELISA IFNγ i IL-12p70.
    nuta: Można go przechowywać w temperaturze -80 °C.
  5. Ponownie zawiesić granulki komórkowe w 100 μl PBS zawierającego lucyferynę (końcowe stężenie 1,5 mg/ml). Inkubować płytki przez 10 minut w temperaturze 37 °C. Następnie zmierz luminescencję z każdej studzienki za pomocą odpowiedniego luminometru.
    nuta: Czasy ekspozycji muszą być zoptymalizowane pod kątem linii komórkowych i gęstości. Reprezentatywne wyniki są pokazane w Rysunek 3a. Cytotoksyczność ex vivo limfocytów CAR T może być modyfikowana w celu ekspresji lucyferyny przez wspólną hodowlę z liniami komórkowymi eksprymującymi docelowy antygen. Gdy limfocyty CAR T zabijają komórki docelowe, uwalniana jest lucyferyna, dlatego zmniejszenie sygnału luminometrycznego jest skorelowane z zabiciem komórki. Komórki nietransdukowane mogą często mieć wpływ na żywotność komórek docelowych, szczególnie w długich okresach inkubacji. Zmierz stężenie mysich IFNγ i IL-12p70 w supernatancie zgodnie z protokołami ELISA producenta. Reprezentatywne wyniki są pokazane w (Rysunek 3b i 3c). Aktywację ex-vivo limfocytów CAR T przez kohodowlę z liniami komórkowymi wykazującymi ekspresję antygenu docelowego można oznaczyć, analizując zawartość supernatantu za pomocą testu ELISA. Stosunek komórek CAR T do komórek docelowych i długość okresu kohodowli muszą być zoptymalizowane dla każdego konstruktu CAR, docelowej linii komórkowej i analitu. Leczenie PMA i jonomycyną może być stosowane jako kontrola pozytywna w celu potwierdzenia jakości limfocytów T i ich zdolności do reagowania.

5. Oceń aktywność przeciwnowotworową u myszy

  1. Protokół 1
    1. Wykonać dożylne (IV) podanie 100 mg/kg cyklofosfamidu myszom z BALB/c w wieku od 6 do 8 tygodni. Pozwala to na wszczepienie guza bez znaczącej limfodeplecji17 (Ryc. 4).
      nuta: Ustalenie chłoniaka A20 może zająć ponad 2 miesiące przy nieoptymalnym wskaźniku przyjmowania. Można to poprawić, stosując cyklofosfamid na 1 dzień przed dostarczeniem komórek chłoniaka. W celu zbadania myszy z pęcherzykami limforudycznymi zidentyfikowaliśmy dawkę cyklofosfamidu, która może zwiększyć skuteczność chłoniaka bez powodowania limfodeplecji.
    2. Następnego dnia wstrzyknij 100 μl 5 x 105 syngenicznych komórek chłoniaka A20 z komórek B zmodyfikowanych do ekspresji lucyferazy i białka zielonej fluorescencji (GFP) myszom przez wstrzyknięcie dożylne (IV).
    3. Pozwól myszom rozwinąć chłoniaka układowego przez ~ 17 dni.
    4. Potwierdź obecność chłoniaka układowego przez dootrzewnowe (IP) wstrzyknięcie 100 μL 30 mg/ml lucyferyny i obrazowanie za pomocą systemu obrazowania bioluminescencji in vivo.
      1. Użyj separatorów, aby uniknąć rozlania się sygnału na sąsiednie myszy. Wystaw myszy na 1 minutę po stronie brzusznej z obszarem zainteresowania o stałej wielkości.
      2. Wyświetlanie względnych jednostek światła (RLU) jako fotonów na sekundę (p/s). Ustawienia muszą być zoptymalizowane dla każdego modelu guza; Użyj ekspozycji, która może wykryć wczesne wykrycie guzów, ale nie prowadzi do saturacji, gdy guzy osiągają punkty końcowe.
      3. Rejestruj łączną wartość RLU dla każdej myszy ze stałym rozmiarem obszaru zainteresowania. (Rysunek 5a i b).
    5. Wstrzyknąć pojedynczą dawkę 1 x 106 limfocytów T CAR przez wstrzyknięcie dożylne myszom limforepletym z ustalonym chłoniakiem.
      UWAGA: (Ważne) Poziomy dawkowania muszą być ustalone dla każdego konstruktu CAR przy użyciu schematu zwiększania dawki, aby zapewnić, że wszelkie możliwe objawy toksyczności wynikające z limfocytów CAR T zostały scharakteryzowane i mogą być wyeliminowane. Chociaż limfocyty T CAR anty-mysie CD19 nie wykazują toksyczności, limfocyty CAR T mogą powodować nieoczekiwane toksyczności. W przypadku gdy wiele konstruktów CAR i skuteczność transdukcji nie są identyczne, całkowita liczba podanych limfocytów T powinna być utrzymywana na tym samym poziomie poprzez dodanie nietransdukowanych limfocytów T do preparatów komórkowych.
    6. Monitoruj postęp choroby co tydzień poprzez wstrzyknięcie IP 100 μl 30 mg / ml lucyferyny i obrazowanie za pomocą systemu obrazowania bioluminescencji in vivo (Rysunek 5c).
    7. Ściśle monitoruj myszy pod kątem oznak toksyczności i poddaj eutanazji wszystkie myszy, które wykazują wczesne oznaki paraliżu kończyn tylnych (HLP) lub patologicznego obciążenia nowotworem, zanim pojawi się jakiekolwiek cierpienie.
      nuta: Toksyczność chłoniaka A20 może obejmować paraliż kończyn tylnych spowodowany inwazją guza na opony mózgowe. Regularnie sprawdzaj, czy nie ma wczesnych oznak zmienionego chodu. Podobnie, mogą pojawić się duże guzy IP, które mogą prowadzić do dyskomfortu objawiającego się zmienionym zachowaniem.
    8. Monitoruj przeżywalność myszy przez 60 - 100 dni (Rysunek 5d). Przeprowadzić eutanazję metodą Schedule-1 po zakończeniu eksperymentu.
  2. Protokół 2
    1. Dostarczyć 200 mg/kg cyklofosfamidu 6 do 8-tygodniowym myszom BALB/c przez wstrzyknięcie do żyły ogonowej w 100 μl PBS na mysz.
    2. Następnego dnia wstrzyknąć 5 x 105 syngenicznych komórek chłoniaka A20 z komórek B wykazujących ekspresję lucyferazy i GFP w 100 μl PBS poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej.
    3. Pozwól myszom rozwinąć chłoniaki układowe przez ~ 7-14 dni
    4. Potwierdź chłoniaka układowego przez wstrzyknięcie IP 100 μL 30 mg / ml lucyferyny i obrazowanie za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo.
    5. Wykonać napromienianie całego ciała 5 Gy (TBI) przy 0,02 Gy/min dla limfodeplecji.
      nuta: Pacjenci poddawani leczeniu limfocytami T CAR są poddawani szeregowi schematów w celu uzyskania limfodeplecji przed podaniem limfocytów T, co znacznie zwiększa wszczepianie adoptyjnie przenoszonych komórek CAR T. Można to powtórzyć u myszy za pomocą napromieniania całego ciała (TBI) (Ryc. 6).
    6. Następnego dnia wstrzyknij 1 x 106 limfocytów T CAR w 100 μl PBS poprzez wstrzyknięcie żyły ogonowej myszom z ustalonymi guzami.
    7. Próbki krwi należy pobrać przez krwawienie z żyły ogonowej po 7 dniach.
    8. Dodać bufor do lizy krwinek czerwonych do każdej próbki krwi, a następnie przygotować się do cytometrii przepływowej, jak opisano w sekcji 3. Analiza trwałości limfocytów CAR T w krążeniu za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 2).
      nuta: Dodanie kulek zliczających bezpośrednio przed cytometrią pozwala na określenie liczby limfocytów CAR T na mililitr krwi.
    9. Monitoruj postęp choroby zgodnie z opisem w krokach 5.1.5 - 5.1.8 (Rysunek 7).

Wyniki

Aby zapewnić wysoką wydajność transdukcji limfocytów T, konieczne jest uzyskanie świeżych cząsteczek retrowirusowych. Transfekcja linii komórkowej Plat-E plazmidem producentem pCL-Eco oraz plazmidem retrowirusowym pMP71 prowadzi do wydzielania cząsteczek retrowirusowych do supernatantu komórkowego. W przypadku kodowania w retrowirusie genu markera fluorescencyjnego, takiego jak mCherry, pomyślną transfekcję można potwierdzić za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 1). Do transdukcji limfocytów T wykorzystuje się supernatant zawierający wirusy z przetransfekowanych komórek Plat-E poprzez 2 rundy spinfekcji na płytkach pokrytych fragmentem fibronektyny. Wydajność transdukcji można określić 4 dni po transdukcji. poprzez cytometria przepływowa. Pomyślnie transdukowane komórki wykazują ekspresję genu markera zakodowanego w retrowirusie (Rysunek 2). Wydajność transdukcji wynosi od ok. 50% do 90% w przypadku receptorów pierwszej generacji oraz od ok. 10% do 40% w przypadku konstruktów CAR zbliżonych do maksymalnej pojemności pakowania retrowirusowego. Choć ekspresja genu markerowego świadczy o pomyślnej transdukcji retrowirusowej, kluczowe jest wykazanie funkcjonalności komórek CAR-T po wejściu w interakcję z komórkami wykazującymi ekspresję antygenu docelowego na powierzchni. Linie komórek docelowych zmodyfikowane w celu ekspresji lucyferazy mogą być wykorzystywane w testach lucyferazowych do bezpośredniego badania stopnia cytotoksyczności komórek CAR-T (Rysunek 3A). Uwalnianie cytokin efektorowych z komórek CAR-T podczas kokultury z komórkami docelowymi, określone za pomocą testu ELISA, może być również wykorzystane jako pośrednia miara cytotoksyczności komórek CAR-T (Rysunek 3B i 3C).

Komórki CAR-T otrzymane zgodnie z niniejszym protokołem można ocenić u myszy z zachowaną populacją limfocytów poprzez wywołanie systemowego chłoniaka A20 za pomocą dawki 10 mg/kg cyklofosfamidu (podanego dożylnie) na 1 dzień przed dożylną iniekcją 5 x 105 komórki A20 (Rysunek 4). Iniekcja domięśniowa lucyferyny i rejestracja obrazu za pomocą in vivo obrazownik bioluminescencyjny może być wykorzystywany do monitorowania masy guza przy zastosowaniu stałej ROI i czasu ekspozycji przez cały okres (Rycina 5A-C). Komórki CAR-T zmodyfikowane w celu ekspresji IL-12 są zdolne do eradykacji chłoniaka systemowego przy zastosowaniu limfodeplecyjnego przygotowania, co skutkuje przeżyciem bez choroby u około 25% myszy (Rysunek 5D). Kondycjonowanie limfodeplecyjne, przeprowadzone poprzez całkowite naświetlanie ciała (TBI) w dawce 5 Gy na 1 dzień przed dożylną administracją komórek CAR-T, znacząco poprawia przeżywalność i zagnieżdżenie przeszczepu (Rycina 6). W tym modelu CAR-T komórki pierwszej generacji są zdolne do eliminacji systemowego chłoniaka A20, zazwyczaj indukując przeżycie wolne od choroby u 10% myszy (Rysunek 7).

Porównanie mikroskopowe; fluorescencja vs pole jasne; analiza rozkładu komórkowego; skala 300µm.
Rysunek 1. Potwierdzenie pomyślnej transfekcji komórek Plat E. Komórki Plat-E transfekowane retroviralnym konstruktem CAR oraz plazmidowym DNA wektora pakującego pMP71 i pcl-Eco. Pomyślną transfekcję wykazuje ekspresja genu markera fluorescencyjnego mCherry. A) mikroskopia w polu jasnym, B) mikroskopia fluorescencyjna i C) Przedstawiono nałożone obrazy. Powiększenie = 50X. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cytometryczna, różnicowanie podzbiorów limfocytów T CD4/CD8, wykresy A-C przedstawiające bramkowanie singletów oraz żywych/martwych komórek.
Rycina 2. Oznaczanie wydajności transdukcji za pomocą cytometrii przepływowej. Cytometrię przepływową wykorzystano do oznaczenia wydajności transdukcji limfocytów T myszy w 4. dniu po transdukcji, stosując Zombie UV live/dead, mCherry, BV71 i BV785 odpowiednio do detekcji komórek żywych, konstruktu CAR, CD4 oraz CD8. Reprezentatywne wyniki A) Nietransdukowane, B) mCherry.αmCD19.mCD3z oraz C) mCherry.αmCD19.mCD3z.mIL12 przedstawiono wraz z bramowaniem dla: 1) singletów, 2) żywych komórek, 3) CD4 i CD8, oraz 4) i 5) oceny komórek mCherry-dodatnich wykazujących ekspresję CAR. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy i punktowy przedstawiający dane dotyczące odpowiedzi immunologicznej. Pomiary obejmują poziomy RLU, IFN-γ oraz IL12.
Rycina 3. Walidacja aktywności limfocytów CAR-T. Komórki CAR T αmCD19 współhodowano z komórkami chłoniaka A20 zmodyfikowanymi w celu ekspresji lucyferazy (1 x 1041 x 104) przez 16 h na płytce 96-dołkowej z dnem w kształcie litery U. Po kokulturze komórki odwirowano, a nadeświetle zebrano. A) Komórki resuspendowano w PBS, a do oceny żywotności komórek docelowych wykorzystano luminometrię. W supernatantach z kokultury oceniano obecność IFNγ (B) oraz IL-12 (C). Stosunek komórek CAR-T do komórek docelowych oraz czas trwania kokultywacji muszą zostać zoptymalizowane dla każdego konstruktu CAR i linii komórek docelowych. Jako kontrolę pozytywną w celu potwierdzenia jakości limfocytów T oraz ich zdolności do odpowiedzi można zastosować inkubację z PMA i jonomycyną. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe (SD). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). *** p < 0,01). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie17. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza graficzna liczby, przepływu i przeżywalności WBC w czasie w badaniu nad cyklofosfamidą.
Rycina 4. Ustanowienie chłoniaka A20 bez limfodeplecji. Cyklofosfamid może zwiększyć efektywność indukcji chłoniaka, nie powodując jednocześnie limfodeplecji. A) Morfologia krwi myszy BALB/c w wieku 6–8 tygodni po dożylnym podaniu cyklofosfamidu w dawce 100 mg/kg. Słupki błędu przedstawiają SD B) Obciążenie chłoniakiem u myszy BALB/c w wieku 6–8 tygodni po dożylnym podaniu 10 mg/kg cyklofosfamidy lub soli fizjologicznej w dniu -1 oraz dożylnym podaniu 5 x 105 Komórki A20 w dniu 0 zmierzone przy użyciu luminometru. C) Przeżywalność myszy w B)Słupki błędów przedstawiają SD. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu dwuczynnikowej analizy wariancji (2-way ANOVA). ** p < 0.01, *** p < 0,01). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie pracy Kueberuwy it al.17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Obrazowanie bioluminescencyjne myszy, efekty terapii limfocytami T; wykres wzrostu guza; wykres analizy przeżywalności.
Rycina 5. Monitorowanie obciążenia chłoniakiem i przeżywalności. Myszy z chłoniakiem A20 wykazującym ekspresję lucyferazy otrzymują 100 µL dożylne (IP) iniekcje lucyferyny w stężeniu 30 mg/mL, a obrazowanie wykonano za pomocą in vivo system obrazowania bioluminescencyjnego A) Myszy eksponowano przez 1 min stronę brzuszną, a następnie niezwłocznie obrócono, aby obrazować stronę grzbietową w celu wykrycia mas guzów po obu stronach ciała. (B). C) Reprezentatywne wyniki obciążenia chłoniakiem u myszy BALB/c otrzymujących różne dawki komórek αmCD19 CAR T bez limfodeplecji. Słupki błędów przedstawiają błąd standardowy średniej (SEM). D) Wskaźnik przeżywalności tych samych myszy. Rysunek zmodyfikowany na podstawie opracowania Kueberuwy i inni17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki terapii komórkami CAR-T; trendy dla WBC, limfocytów i monocytów; wykres CD4/CD8; dane eksperymentalne.
Rycina 6. Efekty limfodeplecji. A) Morfologia krwi myszy BALB/c w wieku 6–8 tygodni po otrzymaniu dawki 5 Gy TBI przy mocy dawki 0,02 Gy/min; słupki błędów przedstawiają SD. Analiza statystyczna przeprowadzona za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA). * p < 0.05, ** p <0.01, *** p < 0.001. B) Monitorowanie CD4+ oraz CD8+ Analiza komórek CAR-T we krwi obwodowej myszy za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem markerowego genu mCherry 7 dni po podaniu. Słupki błędów przedstawiają SD. Rysunek zmodyfikowano na podstawie publikacji Kueberuwa it al.17. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wpływ terapii komórkami CAR-T na myszy: A) Wyniki obrazowania, B) Wykres bioluminescencji, C) Wykres przeżywalności.
Rysunek 7. Aktywność komórek CAR-T przy limfodeplecyjnym przygotowaniu wstępnym. Typowe wyniki pokazujące efekt TBI w dawce 5 Gy w dniu poprzedzającym podanie limfocytów CAR-T. A) Obrazowanie i (B) wyświetlacze graficzne obrazowania myszy po 100 µL do brzuszne (IP) wstrzyknięcia lucyferyny w stężeniu 30 mg/ml przy użyciu in vivo system obrazowania bioluminescencyjnego. Słupki błędów przedstawiają SEM. C) Przeżywalność tych samych myszy. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Kueberuwa i inni17. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

Mysie modele syngeniczne umożliwiają testowanie progresji choroby i terapii przy jednoczesnym utrzymaniu nienaruszonego układu odpornościowego. Ma to zasadnicze znaczenie, jeśli chodzi o terapie, które oddziałują na układ odpornościowy, a w szczególności w przypadku leków immunoterapeutycznych.

Opisany tutaj protokół ma dwa krytyczne strumienie pracy, z których pierwszym jest genetyczna modyfikacja mysich limfocytów T w celu ekspresji CAR. Wymaga to 7 dni od rozpoczęcia do walidacji transdukcji. Równolegle z wytwarzaniem limfocytów CAR T dochodzi do powstania chłoniaka układowego u myszy. Jeśli produkcja komórek CAR T nie powiedzie się lub jakość jest niewystarczająca, zazwyczaj nie ma wystarczająco dużo czasu na wyprodukowanie komórek zastępczych, zanim myszy ulegną chłoniakowi. Dlatego tak ważne jest, aby naukowcy korzystający z tych modeli dokładnie przeprowadzili badania nad dawkowaniem guza i progresją choroby, aby skutecznie określić czas produkcji limfocytów CAR T do podawania terapeutycznego.

Typowe przyczyny niskiej wydajności transdukcji limfocytów T obejmują słabą wydajność transfekcji komórek produkcyjnych, zwykle spowodowaną niską czystością plazmidu lub niedokładnym określeniem pH pożywki transfekcyjnej. Zaleca się sprawdzenie skuteczności transfekcji komórek producenta przed przystąpieniem do pełnego protokołu, ponieważ słaba transfekcja ograniczy skuteczność transdukcji komórek T. Rekombinowane fragmenty ludzkiej fibronektyny mogą być zbierane i przechowywane w temperaturze -20 °C w celu ponownego wykorzystania, jednak wielokrotne zamrażanie i rozmrażanie powoduje zmniejszenie wydajności transdukcji. Szybkie przetwarzanie śledziony myszy po pobraniu jest również ważne dla uzyskania wysokiej wydajności żywotnych limfocytów T.

Należy zauważyć, że opisany tutaj protokół wykorzystuje komórki A20 eksprymujące lucyferazy. Jest to preferowane, ponieważ zapewnia możliwość pomiaru ogólnoustrojowego obciążenia guzem za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Jednak w obecności funkcjonalnego układu odpornościowego odpowiedzi na lucyferazy mogą zniekształcić wyniki. Wcześniej testowaliśmy reakcje immunologiczne myszy, które przeżyły, na transgeny markerowe17. Kluczowe jest powtórzenie kluczowych eksperymentów z wykorzystaniem komórek A20 wolnych od transgenów, aby potwierdzić, że nie odgrywają one znaczącej roli w eradykacji guza przez komórki odpornościowe.

Podczas gdy środki kliniczne mogą być stosowane tylko in vivo u myszy z niedoborem odporności, zastosowanie mysich komórek CAR T przeciwko mysim komórkom rakowym pozwala nam ocenić wkład układu odpornościowego w skuteczność terapeutyczną lub postęp choroby. Protokół ten może być wykorzystany do przedklinicznej oceny CAR ukierunkowanych na chłoniaka z komórek B lub inne CAR z dodatkowymi modyfikacjami, takimi jak wydzielanie IL-12, jak opisano tutaj. Należy zauważyć, że chociaż wzajemne oddziaływanie między komórkami odpornościowymi można ocenić w syngenicznych modelach myszy, mogą one nie odzwierciedlać dokładnie interakcji u ludzi in vivo. Na szczególną uwagę zasługuje fakt, że ludzkie i mysie CAR będą różnić się strukturą, co może mieć dalsze konsekwencje; optymalna aktywacja i warunki hodowli komórkowej dla wzrostu limfocytów T są różne20, rozkład tkankowy ekspresji docelowego antygenu może się różnić między ludźmi i myszami, a doświadczane toksyczności mogą być radykalnie różne. Dlatego konieczne jest wykorzystanie modeli ex vivo i ksenogenicznych w celu potwierdzenia wyników.

Podsumowując, syngeniczny model chłoniaka limfodepletowanego i limforedowego podsumowuje pacjentów z wcześniejszą chemioterapią / radioterapią i bez niej. Zapewnia to modelowy system, w którym można naśladować warunki kliniczne, aby umożliwić testowanie szeregu strategii terapeutycznych, które będą ważne w przypadku nadchodzącej fali nowych środków terapii immunologicznej.

Dzięki zastosowaniu kondycjonowania wstępnego można zauważyć, że wszystkie myszy zazwyczaj usuwają chłoniaka. Przy wskaźnikach całkowitej odpowiedzi u ludzi do 90% jest to reprezentatywne. Jednak wyzwania związane z terapią limfocytami T CD19 CAR będą zależeć od zapobiegania wysokiej częstotliwości obserwowanych nawrotów, które często są CD19. W tym modelu nie obserwowano nawrotów do 100 dni, a często nawet dłużej. Modyfikacje naśladujące nawroty obserwowane w klinice mogą pomóc w sprostaniu przyszłym wyzwaniom związanym z terapią komórkami T CD19 CAR.

Oświadczenia

David Gilham pracuje dla firmy Celyad, która jest zaangażowana w produkcję limfocytów CAR T. Reszta autorów nie ma nic do ujawnienia.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować Bloodwise za finansowanie tych badań (grant 13031) oraz jednostce zasobów biologicznych CRUK Manchester, ośrodku obrazowania i cytometrii oraz biologii molekularnej za wsparcie tych prac.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2 &mikro; m filtr strzykawkowyAppleton WoodsFC121
0,45 &mikro; m filtr strzykawkowyAppleton WoodsFC122
1,5 ml tłuczek i mikroprobówkaVWR431-0098
100X penicylina-streptomycyna-glutamina (PSG)Gibco10378016
2-merkaptoetanol (50 mM)Gibco31350-010
Chlorowodorek blastycydynyS Sigma- Aldrich15205
Filtr górny do butelek (0,2 i mikro; m)Laboratorium Naukowe dostarczaFIL8192
Brilliant Violet 711 przeciwciało anty-mysie CD8aBioLegend100759rozcieńczeniu barwienia 1 na 100. Clone 53-6,7
Brilliant Violet 785 anty-mysie przeciwciało CD4BioLegend100552rozcieńczeniu barwienia 1 na 100. Klon RM4-5
Chlorek wapnia dwuwodnySigma- AldrichC7902
Koraliki do liczenia komórek – CountBright absolutne koraliki do liczeniaSondy molekularneC36950
Sitko do komórek 100μ mVWR734-0004
Monohydrat cyklofosfamiduMerck239785-1GM
Dulbecco' s Zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) - Wysoka glukozaSigma AldrichD6546
DynabeadsGibco11131D
Ficoll Paque PlusGE HealthcareGE17-1440-03Sprzedawane przez Sigma- Aldrich
Cytometr przepływowy - LSR Fortessa x20BD Biosciences658222R1
płodowo-bydlęcyGibco10270
Appleton WoodsHC001
Roztwór HEPESSigma- AldrichH0887 
IL-12 p70 Mysz niepowlekany zestaw ELISAInvitrogen88-7121-76
IL2, ProleukinNovartisPL 00101/0936<
em>in vivo system obrazowania bioluminescencji – system obrazowania in vivo xtreme IIBrukerT149094
Jonomycyna Sól wapniowaSigma- AldrichI0634
Żywa/martwa plama - Zombie Violet Fixable Viability KitBioLegend423114do barwienia 1 na 100
- Lumistart OmegaBMG Labtech415-301
Mysi IFN-γ Zestaw ELISADiaklon861.050.010
ParaformaldehydSigma- Aldrich16005
pCL-EcoNovus BiologicalsNBP229540
12-mirystynian 13-octanu (PMA) Phorbol 12-mirystynian 13 octanu (PMA)Sigma- AldrichP8139
Platinum E cellBiolabsRV-101(RRID:CVCL_B488)
Oczyszczony klon NA/LE Chomik przeciw myszom CD28BD Bioscience553294  37.51
Oczyszczony NA/LE Chomik Anti-Mouse CD3εBD Biosciences553057klon   145-2C11 
Oczyszczony szczurzy anty-mysi CD16 / CD32 (mysi blok BD Fc)BD Biosciences553142rozcieńczeniu barwienia 1 na 100. Klon 2.4G2
Dichlorowodorek puromycynySigma- AldrichP8833
Rekombinowany fragment ludzkiej fibronektyny - Odczynnik retronektynyTaKaRaT100B
Rekombinowana mysz IL-7 (bez nośnika)BioLegend577806
Bufor do lizy czerwonych krwinekeBioscience004-4333-57
RPMI 1640 MediumLonzaBE12-167F
Trypsyna - roztwór EDTASigma- AldrichT3924 
XenoLight D-LucyferinPerkin Elmer122799
Hemacytometr Luminometr s

Bibliografia

  1. Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/BiologicsBloodVaccines/CellularGeneTherapyProducts/ApprovedProducts/UCM574106.pdf (2017).
  2. Malarkey, M., Brian, W. Food and Drugs Administration Biologics Licence Application Approval letter. , Available from: https://www.fda.gov/downloads/biologicsbloodvaccines/cellulargenetherapyproducts/approvedproducts/ucm581259.pdf (2017).
  3. Liu, Y., Zeng, G. Cancer and Innate Immune System Interactions: Translational Potentials for Cancer Immunotherapy. Journal of Immunotherapy. 35 (4), Hagerstown, Md. 299-308 (2012).
  4. Janssen, L. M. E., Ramsay, E. E., Logsdon, C. D., Overwijk, W. W. The immune system in cancer metastasis: friend or foe. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 5 (1), 79(2017).
  5. Pandya, P. H., Murray, M. E., Pollok, K. E., Renbarger, J. L. The Immune System in Cancer Pathogenesis: Potential Therapeutic Approaches. Journal of Immunology Research. 2016, 13(2016).
  6. Vinay, D. S., et al. Immune evasion in cancer: Mechanistic basis and therapeutic strategies. Seminars in Cancer Biology. 35, S185-S198 (2015).
  7. Gajewski, T. F., Meng, Y., Harlin, H. Immune Suppression in the Tumor Microenvironment. Journal of Immunotherapy. 29 (3), 233-240 (2006).
  8. Munn, D. H., Bronte, V. Immune suppressive mechanisms in the tumor microenvironment. Current opinion in immunology. 39, 1-6 (2016).
  9. Vanderlugt, C. L., Miller, S. D. Epitope spreading in immune-mediated diseases: implications for immunotherapy. Nature Reviews Immunology. 2, 85(2002).
  10. Hardwick, N., Chain, B. Epitope spreading contributes to effective immunotherapy in metastatic melanoma patients. Immunotherapy. 3 (6), 731-733 (2011).
  11. Makkouk, A., Weiner, G. Cancer Immunotherapy and Breaking Immune Tolerance-New Approaches to an Old Challenge. Cancer research. 75 (1), 5-10 (2015).
  12. Jackson, S. R., Yuan, J., Teague, R. M. Targeting CD8(+) T-cell tolerance for cancer immunotherapy. Immunotherapy. 6 (7), 833-852 (2014).
  13. Brentjens, R. J., et al. Lymphodepletion and tumor burden govern clinical responses in patients with B-cell malignancies treated with autologous, CD19-targeted T cells. Journal of Clinical Oncology. 29 (15_suppl), 2534(2011).
  14. Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817(2011).
  15. Hay, K. A., et al. Kinetics and Biomarkers of Severe Cytokine Release Syndrome after CD19 Chimeric Antigen Receptor-modified T Cell Therapy. Blood. 130, 2295-2306 (2017).
  16. Zhang, T., et al. Efficiency of CD19 chimeric antigen receptor-modified T cells for treatment of B cell malignancies in phase I clinical trials: a meta-analysis. Oncotarget. 6 (32), 33961-33971 (2015).
  17. Kueberuwa, G., Kalaitsidou, M., Cheadle, E., Hawkins, R. E., Gilham, D. E. CD19 CAR T Cells Expressing IL-12 Eradicate Lymphoma in Fully Lymphoreplete Mice through Induction of Host Immunity. Molecular Therapy - Oncolytics. 8, 41-51 (2018).
  18. Engels, B., et al. Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes. Human Gene Therapy. 14 (12), 1155-1168 (2003).
  19. Parkinson, C. M., et al. Diagnostic Necropsy and Selected Tissue and Sample Collection in Rats and Mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e2966(2011).
  20. Kueberuwa, G., et al. CCR7(+) selected gene-modified T cells maintain a central memory phenotype and display enhanced persistence in peripheral blood in vivo. Journal for Immunotherapy of Cancer. 5, 14(2017).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Syngeniczny model mysitransdukcja retrowirusowacytometria przep ywowaobrazowanie bioluminescencyjnekondycjonowanie poprzez limfodeplecjekspresja IL 12kom rki producenta Plat Erekombinowana fibronektyna
Syngeniczny model chłoniaka z komórek B myszy do przedklinicznej oceny limfocytów T CD19 CAR
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.