Artykuł metodologiczny

Oparte na morfologii rozróżnienie między zdrowymi i patologicznymi komórkami z wykorzystaniem transformaty Fouriera i samoorganizujących się map

8.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58543

⸱

28 października 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemical and Product Safety, German Federal Institute for Risk Assessment (BfR), 2Deutsches Rheuma-Forschungszentrum (DRFZ) Berlin, a Leibniz Institute, 3Charité Universitätsmedizin Berlin, 4Applied Systems Biology, Leibniz Institute for Natural Product Research and Infection Biology Hans Knöll Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj udostępniamy przepływ pracy, który pozwala na identyfikację zdrowych i patologicznych komórek na podstawie ich 3-wymiarowego kształtu. Opisujemy proces wykorzystania konturów projekcji 2D opartych na powierzchniach 3D do trenowania Mapy Samoorganizującej się, która zapewni obiektywne grupowanie badanych populacji komórek.

Streszczenie

Wygląd i ruchy komórek odpornościowych są zależne od ich środowiska. W reakcji na inwazję patogenu komórki odpornościowe są rekrutowane do miejsca zapalenia i są aktywowane, aby zapobiec dalszemu rozprzestrzenianiu się inwazji. Znajduje to również odzwierciedlenie w zmianach w zachowaniu i wyglądzie morfologicznym komórek odpornościowych. W tkance nowotworowej podobne zmiany morfokinetyczne zaobserwowano w zachowaniu komórek mikrogleju: mikroglej wewnątrznowotworowy ma mniej złożone 3-wymiarowe kształty, ma mniej rozgałęzione procesy komórkowe i porusza się szybciej niż te w zdrowej tkance. Badanie takich właściwości morfokinetycznych wymaga złożonych technik mikroskopii 3D, które mogą być niezwykle trudne, gdy są wykonywane wzdłużnie. W związku z tym rejestracja statycznego kształtu 3D komórki jest znacznie prostsza, ponieważ nie wymaga pomiarów przyżyciowych i może być wykonywana również na wyciętej tkance. Niezbędne jest jednak posiadanie narzędzi analitycznych, które pozwalają na szybki i precyzyjny opis kształtów 3D oraz umożliwiają diagnostyczną klasyfikację zdrowych i patogennych próbek tkanek wyłącznie na podstawie statycznych informacji związanych z kształtem. W tym miejscu przedstawiamy zestaw narzędzi, który analizuje dyskretne składowe Fouriera konturu zestawu projekcji 2D powierzchni komórek 3D za pomocą map samoorganizujących się. Zastosowanie metod sztucznej inteligencji pozwala naszej strukturze uczyć się o różnych kształtach komórek w miarę stosowania jej do coraz większej liczby próbek tkanek, podczas gdy przepływ pracy pozostaje prosty.

Wprowadzenie

Terminowe, proste i precyzyjne określenie stanu patologicznego tkanki biologicznej jest przedmiotem największego zainteresowania w badaniach biomedycznych. Modele mysie dostarczają środków do badania szeregu stanów patologicznych, takich jak reakcje immunologiczne lub rozwój raka, w połączeniu ze złożonymi technikami mikroskopii 3D i 4D (3 wymiary przestrzenne i czas). Badania mikroskopowe można wykonywać za pomocą mikroskopii 2-fotonowej przyżyciowej lub tkankowej z wyciętymi tkankami, mikroskopii arkuszowej światła i - do ograniczonej głębokości tkanki około 100 μm - za pomocą mikroskopii konfokalnej. Aby uzyskać informacje związane z czasem na temat zachowania komórek w warunkach fizjologicznych lub patologicznych, konieczne jest monitorowanie tkanki przez dłuższy czas, co zwykle wymaga obrazowania przyżyciowego1,2. Oczywiście zastosowanie tej techniki jest ograniczone do modeli zwierzęcych ze względu na jej inwazyjność. Dostępne są również techniki nieinwazyjne do zastosowań u ludzi, w tym różne metody tomografii (MSOT, CT itp.), ale wszystkie te metody nie mają niezbędnej rozdzielczości przestrzennej - i często czasowej - do badania zachowania na poziomie komórkowym.

Statyczne informacje dotyczące wyglądu komórek mogą być łatwiej dostępne dzięki różnym technikom obrazowania 3D wykonanym na wyciętych próbkach tkanek. W tym przypadku nie mierzy się zachowania kinetycznego komórek, dlatego konieczne jest zastosowanie nowatorskich technik analizy, które są w stanie określić stan patogenny badanych komórek wyłącznie na podstawie ich morfologii3. Takie podejście wykorzystano do powiązania kształtów komórek i tekstur tkanek z patologicznym zachowaniem4,5,6.

W nowej technice opisanej tutaj, komórki są rekonstruowane jako powierzchnie 3D, a ich kształty są charakteryzowane za pomocą projekcji 3D do 2D i kolejnej analizy kształtów peryferii opartej na Fourierze7,8. Zmniejszając wymiary z 3 do 2, problem jest uproszczony. Możliwe jest również scharakteryzowanie powierzchni komórek w 3D poprzez zastosowanie analizy harmonicznych sferycznych, tak jak to zostało zrobione w przypadku obrazów medycznych9. Jednak harmoniczne sferyczne nie radzą sobie dobrze z ostrymi i chropowatymi kształtami, co wymaga ustanowienia wieloskalowej siatki na sferze jednostkowej. Ponadto liczba niezbędnych składowych harmonicznych sferycznych może być duża (50-70), przy czym obliczenia leżące u ich podstaw są bardzo wymagające, a wyniki trudne do interpretacji10,11,12.

Dzięki naszej nowo zaproponowanej metodzie, zadanie jest zredukowane do serii opisów kształtów 2D, gdzie liczba projekcji 2D zależy od analityka i może być dostosowana do złożoności kształtu 3D. Projekcje są generowane automatycznie za pomocą skryptu Pythona, który działa w narzędziu do animacji 3D. Rzuty 2D są opisane przez dyskretne składowe transformaty Fouriera (DFT) ich peryferii, obliczone przez wtyczkę Fiji13, która jest tutaj dostarczana jako część naszego pakietu oprogramowania. DFT jest tutaj stosowany w celu rozłożenia złożonego konturu komórki na szereg funkcji grzechu i cos. W ten sposób możemy opisać konspekt za pomocą stosunkowo niewielkiej liczby składowych DFT, zmniejszając w ten sposób złożoność problemu (więcej szczegółów w sekcji Równania). Komponenty DFT są umieszczane w wytrenowanej mapie samoorganizującej się (SOM14), gdzie można obiektywnie przetestować istnienie klastrów kształtów8. SOM zapewniają konkurencyjne i nienadzorowane narzędzie uczenia się z dziedziny sztucznej inteligencji. Składają się one z połączonego układu sztucznych neuronów, które komunikują się ze sobą za pomocą ważonej funkcji odległości sąsiedztwa. Układ neuronalny reaguje na pierwszy element wejściowego zbioru danych, a neurony, których odpowiedź jest najsilniejsza, są "zgrupowane" bliżej siebie. W miarę jak układ neuronowy otrzymuje coraz więcej danych wejściowych, neurony danych, które wielokrotnie silnie reagują, zaczynają tworzyć dobrze zdefiniowane klastry w systemie. Po odpowiednim wytrenowaniu na dużym zbiorze danych, który zawiera informacje o kształcie 2D w postaci zestawu komponentów DFT, dowolne komponenty DFT pojedynczej komórki można umieścić w wytrenowanym SOM i ujawnić, czy komórka prawdopodobnie należy do zdrowej, czy patogennej grupy komórek. Oczekujemy, że takie narzędzie stanie się doskonałym uzupełnieniem metod diagnostyki naukowej i klinicznej.

Protokół

1. Wymagania dotyczące protokołu

  1. Aby uzyskać obraz o wysokiej rozdzielczości, należy uzyskać dane z mikroskopii trójwymiarowej (3D) o wysokiej rozdzielczości, zdekonwoluowane zgodnie z kryterium Nyquista, z interwałem próbkowania co najmniej dwukrotnie większym niż najwyższa częstotliwość przestrzenna próbki.
  2. Użyj oprogramowania do renderowania 3D do rekonstrukcji i eksportu powierzchni.
  3. Użyj oprogramowania do animacji 3D, które może uruchamiać skrypty Pythona (skrypt Pythona można pobrać z repozytorium github: https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis), aby tworzyć projekcje 2D.
  4. Użyj Fiji13, aby przeanalizować rzuty 2D i wyodrębnić komponenty DFT.
    1. Użyj bieżącej dystrybucji Fidżi. Jeśli istnieje już zainstalowana wersja Fidżi, upewnij się, że jest to najnowsza wersja. Można to łatwo osiągnąć, uruchamiając punkt menu Pomoc |Opcja aktualizacji.
    2. Użyj wtyczki Active Contour15, którą można pobrać z http://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?id=plugin:segmentation:active_contour:start i skopiować do folderu wtyczek.
    3. Pobierz wtyczkę SHADE Fiji z repozytorium github i skopiuj ją do folderu plugins.
  5. Korzystaj z oprogramowania do matematyki obliczeniowej, które jest w stanie obliczać samoorganizujące się mapy.

2. Zrekonstruuj obraz 3D.

UWAGA: Do celów testowych, przykładowy zestaw danych znajduje się w repozytorium github (patrz wyżej).

  1. Uruchom oprogramowanie do rekonstrukcji 3D i otwórz dane obrazu 3D.
  2. Utwórz powierzchnię 3D (wszystkich) obiektów.
    1. Wybierz opcję Widok 3D i kliknij Powierzchnie. Kliknij przycisk Dalej (niebieskie kółko z białym trójkątem), aby kontynuować pracę z kreatorem tworzenia powierzchni.
    2. Wybierz kanał obrazu do rekonstrukcji powierzchni.
    3. Zastosuj funkcję wygładzania, aby uniknąć porowatych powierzchni.
      1. Wybierz wartość wygładzenia, która nie ukrywa szczegółów powierzchni, ale unika powierzchni porowatych.
    4. Wybierz metodę progowania, aby znaleźć powierzchnie.
      1. Użyj bezwzględnego progu intensywności, gdy obiekty są dobrze oddzielone od tła i mają w przybliżeniu jednolity poziom jasności.
      2. Zastosuj próg kontrastu lokalnego, gdy obiekty różnią się intensywnością, ale nadal mogą być oddzielone od lokalnego tła i od innych otaczających je obiektów. Ustaw lokalny obszar wyszukiwania progów zgodnie z wartością oczekiwanej średnicy zrekonstruowanych obiektów.
    5. Przefiltruj zrekonstruowane powierzchnie według interesujących ich parametrów morfologicznych, np. objętości, sferyczności, stosunku powierzchni do objętości itp., a następnie zakończ rekonstrukcję powierzchni.
  3. Zapisz i wyeksportuj wygenerowane powierzchnie w formacie zgodnym z oprogramowaniem do animacji 3D, które będzie używane w następnym kroku.

3. Przekształć zrekonstruowane powierzchnie 3D w rzuty 2D

  1. Uruchom Blendera i przejdź do zakładki wyjścia w oknie po prawej stronie. Wybierz format TIFF z menu rozwijanego i ustaw głębię kolorów na 8 bitów RGBA.
  2. Przełącz się w tryb skryptowy i otwórz dostarczony plik skryptu "GUI_AutoRotate.py" z repozytorium dostarczonego z tą pracą (https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis).
  3. Kliknij Uruchom skrypt. Wybierz folder plików wrl po wyświetleniu monitu o wprowadzenie.
  4. W razie potrzeby utwórz więcej obrotów podczas pracy z bardziej złożonymi powierzchniami: przejdź do GUI i ustaw pole Rotacje na wartość powyżej 6,
    UWAGA: Obrót o 6 różnych kątów może być wystarczający do rozróżnienia różnych populacji komórek. Nie zaleca się tworzenia mniej niż sześciu obrotów na powierzchnię ze względu na potencjalną utratę informacji.
  5. Uruchom skrypt, klikając przycisk Obróć w graficznym interfejsie użytkownika. Zapisz rzuty poszczególnych powierzchni w tym samym folderze, który został użyty jako folder wejściowy (krok 2.3). Domyślnie obrazy są zapisywane w 8-bitowym formacie Tiff (patrz krok 2.1), który jest formatem wymaganym przez wtyczkę Fiji SHADE.

4. Znajdź peryferia i oblicz składowe Fouriera za pomocą Fidżi.

  1. Otwórz Fidżi i wybierz SHADE w menu Wtyczki. Zacznij od wartości domyślnych i dostosuj parametry później. Kliknij przycisk OK, gdy program będzie gotowy do uruchomienia.
    1. Wybierz wartość Próg gradientu dla progowania obrazu wejściowego.
    2. Wybierz liczbę iteracji. Im wyższa wartość Liczba iteracji, tym dokładniejsza jest rekonstrukcja peryferii. W przypadku prostszych kształtów zwykle wystarcza niższa liczba.
    3. Użyj parametru Liczba dylatacji, aby określić, o ile większa jest maska początkowa w porównaniu z rzeczywistą komórką. Zwykle bardziej złożone kształty wymagają większej liczby stopni dylatacji, aby prawidłowo znaleźć obrzeża.
    4. Zaznacz pole wyboru Ciemne tło, jeśli rzutowane kształty są jaśniejsze niż tło.
    5. Aktywuj pole wyboru Pokaż wyniki pośrednie tylko wtedy, gdy używasz małego zestawu danych testowych do określenia wydajności funkcji SHADE. Włączenie tej opcji w przypadku większych zestawów danych obniża wydajność obliczeniową i może spowodować zatrzymanie systemu z małą ilością pamięci wideo.
    6. Zaznacz pole wyboru Zapisz tabele wyników, aby użyć wyników funkcji SHADE jako danych wejściowych w kroku 5. Jeśli to pole jest zaznaczone, wszystkie wyniki są zapisywane w osobnych plikach csv. Podsumowanie danych wyjściowych jest zawsze generowane w pliku o nazwie "Result_collection_of_all_DFT_calculations.csv".
  2. Wybierz folder danych wejściowych, który zawiera pliki TIFF utworzone w kroku 3.
  3. Podaj folder danych wyjściowych.
  4. Kliknij OK, aby uruchomić wtyczkę.

5. Mapy samoorganizujące

się

UWAGA: Sieci SOM są w stanie klasyfikować dane tylko wtedy, gdy są trenowane na dużym zbiorze danych, który zawiera dane wejściowe ze wszystkich oczekiwanych typów komórek i warunków. W celach demonstracyjnych taki zestaw danych jest dostępny i można go znaleźć w naszym repozytorium ("AllCells_summary_normalised.csv" z https://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis

  1. Postępuj zgodnie z tymi wskazówkami, jeśli nie ma jeszcze dostępnego przeszkolonego SOM dla danych wejściowych; w przeciwnym razie przejdź do kroku 5.2.
    1. Uruchom oprogramowanie obliczeniowo-matematyczne zdolne do wykonywania klasyfikacji sieci neuronowych.
    2. Wybierz plik danych, który ma być używany do trenowania sieci SOM. Ten zestaw danych powinien zawierać wszystkie warunki eksperymentalne w celu wytrenowania SOM na określonych typach komórek i warunkach eksperymentalnych.
      UWAGA: Możliwe jest również użycie dostarczonego AllCells_summary_normalised.csv do testowania systemu.
    3. Rozpocznij trening i poczekaj, aż trening zostanie zakończony, zanim przejdziesz dalej. Domyślnie skrypt jest ustawiony na uruchamianie 2000 iteracji ("Epoki").
      UWAGA: Liczba iteracji zależy od szybkości uczenia się SOM. W zależności od danych wejściowych wskazane jest przetestowanie zarówno wyższej, jak i dolnej liczby epok oraz obserwacja stabilności wzorca SOM. W przypadku korzystania z dostarczonego skryptu liczbę iteracji można zmienić w wierszu 32. Rozmiar sieci można zmienić w wierszu 34 (domyślnie jest ustawiony na 12 na 12).
    4. Po zakończeniu szkolenia należy sprawdzić topologię sieci (odległości sąsiadów, płaszczyzny wejściowe, trafienia próbki itp.). Sieć jest teraz przeszkolona i można ją zapisać do wykorzystania w przyszłości.
  2. Załaduj SOM w przypadku korzystania z już wytrenowanej mapy (może to pochodzić z kroku 5.1 lub z innych źródeł) w celu klastrowania zestawu danych.
    1. Zaimportuj plik csv, który ma być testowany ze wstępnie załadowanym wytrenowanym SOM. Wybierz wyjście csv wtyczki SHADE z kroku 4 w przypadku korzystania z danych przygotowanych przez wtyczkę SHADE.
      UWAGA: Możliwe jest również użycie przykładowych plików danych "InteractingCells_summary_normalised.csv", "MobileCells_summary_normalised.csv" lub "PhagocytosingCells_summary_normalised.csv", które są dostarczane za pośrednictwem github.
    2. Po zakończeniu klasyfikacji oceń wyniki SOM jak w kroku 5.1.5.
      1. Sprawdź mapę trafień wygenerowaną na podstawie pliku csv. Każda komórka mapy pokazuje, ile razy zestaw danych "trafia" w tę konkretną komórkę wytrenowanego SOM. Gdy grupa komórek jest zgrupowana na małym obszarze tej mapy, oznacza to, że zestaw danych jest dość jednorodny. Wiele klastrów będzie oznaczać, że w zestawie danych prawdopodobnie istnieją podgrupy.
      2. Zbadaj odległości wagowe w okolicy. Obszary tej mapy, które są dobrze oddzielone, odpowiadają grupom obiektów, które zachowują się zupełnie inaczej z punktu widzenia SOM. W przypadku komponentów DFT jako danych wejściowych oznacza to, że te grupy komórek mają bardzo różne kształty odpowiadających im powierzchni 3D.
      3. Sprawdź płaszczyzny wag, aby uzyskać informacje o udziale każdego elementu w wektorze cech. W przypadku użycia 20 komponentów DFT, jak opisano wcześniej, pojawi się tutaj 19 map. W przypadku korzystania z podanego przykładowego zestawu danych pierwsze 5 lub 6 płaszczyzn wagi będzie się różnić, ale reszta z nich będzie wyglądać dość podobnie. W tym przypadku można stwierdzić, że wystarczyłoby użycie około 7 komponentów DFT.

Wyniki

Zastosowaliśmy dyskretną transformatę Fouriera (DFT) w celu obliczenia głównych składowych kształtu odpowiadających projekcjom komórek. Deskryptory Fouriera uzyskano poprzez zastosowanie algorytmu DFT do par współrzędnych xy dopasowanego obrysu projekcji komórek, otrzymanych jako wynik działania modułu AbSnake w naszym schemacie analizy. Pary współrzędnych xy te można traktować jako dwuwymiarowy wektor g o wartościach zespolonych:
Ciąg równań, notacja matematyczna g=(g₀,g₁,,...,gₘ₋₁), analiza ciągów.

Z wektora „g” wykorzystujemy DFT do obliczenia zespolonego widma Fouriera:
Wzór teorii grafów, G=(G0,G1,...,GM-1), reprezentacja sekwencyjna, równania matematyczne.
W oparciu o powszechnie znane wzory na dyskretne widmo Fouriera oraz stosując zapis liczby zespolonej dla „g” jako:
Reprezentacja liczb zespolonych; wzór gₖ=xₖ+i·yₖ; równanie matematyczne.
Otrzymujemy:
Wzór transformaty Fouriera, analiza zespolona, równanie matematyczne, koncepcja edukacyjna. (1)
Możemy obliczyć część rzeczywistą („A”) i urojoną („B”) wartości Równanie wzmocnienia zespolonego dla układów optycznych: Gm=(Am+i·Bm).:
Wzór analizy Fouriera, Σ dla dekompozycji sygnału, ilustracja matematyczna. (2)
Wzór równania równowagi statycznej, Bm równa się Im(Gm), reprezentacja szeregów Fouriera, schemat analizy matematycznej. (3)
Tutaj pierwszy składnik DFT G0 odpowiada wartości m = 0, co daje:
Równanie równowagi statycznej, wzór A0=(1/M)Σ[xk*cos(θ)+yk*sin(θ)], koncepcja matematyczna. (4)
Równanie równowagi statycznej, Σ[y*cos(0)-z*sin(0)]=ȳ, analiza wzoru matematycznego. (5)
W konsekwencji komponent ten opisuje środek geometryczny oryginalnego obiektu.
Drugi element widma DFT w kierunku prostym, G1odpowiada m = 1:
Równanie transformaty Fouriera, schemat, G_k=G_1*e^(i2πk/M), koncepcja przetwarzania sygnałów.
Równanie szeregu Fouriera z komponentami trygonometrycznymi; wizualizacja wzoru. (6)

Z równania 6 wynika, że punkty te tworzą okrąg o promieniu r₁=|G₁| równanie, wzór matematyczny, obliczanie wartości bezwzględnej, analiza, pojęcia algebraiczne oraz kąt początkowy Wzór trygonometryczny θ=tan⁻¹(B₁/A₁) do obliczania kąta w analizie matematycznej., gdzie okrąg opisuje jeden pełny obrót, podczas gdy kształt jest kreślony raz. Środek okręgu znajduje się w początku układu współrzędnych (0, 0), a promień wynosi |G1| a punktem wyjścia jest:

Równania równowagi statycznej, symbol transformaty Fouriera, schemat matematyczny analizy widmowej. równowaga statyczna; schemat ΣFx=0; bilans sił; analiza układu mechanicznego; narzędzie edukacyjne (7)

Ogólnie, dla pojedynczego współczynnika Fouriera Wzór matematyczny dla funkcji Gm jako pary Am, Bm w badaniu teoretycznym.współrzędne opisano następująco:

Równanie matematyczne, reprezentacja transformaty Fouriera, złożona funkcja wykładnicza, schemat.
Równanie transformaty Fouriera; zespolone wyrażenia wykładnicze w cosinusie i sinusie; analiza matematyczna. (8)

Podobnie jak równanie 6, równanie 8 również opisuje okrąg, lecz o promieniu Rm=|Gm|, kąt początkowy Równanie funkcji arkus tangens, tan⁻¹(Bₘ/Aₘ), w wyrażeniu matematycznym. or punkt wyjścia w Równanie: g₀^(m) = Gₘ; reprezentacja symboliczna; notacja matematyczna; zastosowanie w badaniach., gdzie kontur jest obrysowany raz, podczas gdy okrąg wykonuje „m” pełnych obrotów16,17.

Parametry kształtu jako dane wejściowe SOM
Przebieg procesu, opisany na Rysunku 1, zastosowano do zestawu danych z intravitalnej mikroskopii wielofotonowej komórek mikrogleju, poddanych dekonwolucji (z wykorzystaniem zmierzonej funkcji rozmycia punktu – Point Spread Function), aby scharakteryzować ich zmiany morfologiczne w zdrowej lub nowotworowej tkance korowej18. Dla każdej projekcji 2D zrekonstruowanych powierzchni 3D obliczono dwudziestą liczbę komponentów DFT, a wyniki posłużyły jako dane wejściowe do trenowania SOM. W warunkach fizjologicznych mikroglej wykazywał dość złożony kształt z licznymi, silnie rozgałęzionymi wypustkami (Rysunek 2a). W środowisku nowotworowym (model guza kory mózgowej) mikroglej zmienił się w prostszy kształt, bardziej przypominający wrzeciono (Rysunek 2b).

Przeszkolona SOM została przetestowana w celu oceny jej zdolności do rozróżniania komórek zdrowych od nowotworowych. Populacja komórek zdrowych została rzutowana na pojedynczy obszar SOM (Rycina 2c). SOM zareagowała na zestaw danych mikrogleju nowotworowego aktywnym obszarem w kształcie hantla (Rycina 2d). Ślepo zmieszany zestaw danych wejściowych, składający się z komponentów kształtu DFT zarówno z grupy zdrowej, jak i nowotworowej, został przez SOM rzutowany na dwie odrębne grupy, przy jednoczesnym zachowaniu kształtu ich poszczególnych konturów podobnego do tych z grup oddzielnych (Rycina 2e; porównać z 2c oraz 2d). Można wywnioskować, że zmieszany zestaw danych został pomyślnie zgrupowany przez SOM.

Wydajność SOM przetestowano, porównując jej projekcje z manualną analizą tych samych danych przeprowadzoną przez eksperta medycznego, który zaklasyfikował zbiór danych na podstawie ich zachowania czasoprzestrzennego. Ekspert zidentyfikował cztery odrębne grupy komórek (komórki spoczynkowe, komórki fagocytujące, komórki oddziałujące oraz komórki ruchome18), które zrekonstruowano i wykorzystano do wytrenowania sieci SOM o rozmiarze 12x12. Wytrenowana sieć (Rysunek 3a) wykazuje grupy sztucznych neuronów o wysokich wartościach trafień, szczególnie w dolnej lewej oraz środkowej części SOM. Odpowiedź wytrenowanej sieci przetestowano również przy użyciu czterech losowo wybranych podzbiorów obrazów (które nie stanowiły części zbioru treningowego), pochodzących z czterech różnych grup zidentyfikowanych przez eksperta18. Podzbiory te doprowadziły do uzyskania czterech dobrze zdefiniowanych odpowiedzi SOM, co przedstawiono na Rysunku 3b. Komórki spoczynkowe wykazują najbardziej złożony kształt i najwyższy poziom separacji w sieci neuronowej (Rysunek 3b, panel „resting”). Pozostałe trzy zidentyfikowane typy komórek dzieliły wspólny obszar SOM w dolnym lewym rogu, lecz w pozostałym zakresie zostały rozdzielone przez SOM. Zatem obszar SOM w dolnym lewym rogu odpowiada wartościom DFT o niższych indeksach.

Wytrzymałość podejścia SOM została przetestowana poprzez zastosowanie wytrenowanej mapy SOM do trzech losowych podzbiorów tego samego typu komórek w stanie spoczynku (które nie stanowiły części zbioru treningowego). Odpowiedź SOM na te dane wejściowe jest bardzo podobna (Rysunek 3c, podzbiory 1-3), co potwierdza odporność naszego podejścia.

Zależne od czasu zmiany kształtu komórek są precyzyjnie charakteryzowane za pomocą DFT
W celu zbadania wpływu zależnych od czasu zmian kształtu komórek na komponenty DFT, od jednej do trzech komórek z podgrupy (patrz Rycina 3b) śledzono przez 13 do 28 punktów czasowych. Rycina 4 przedstawia pierwsze dziesięć komponentów DFT komórki mobilnej (Rycina 4a) oraz komórki wchodzącej w interakcje (Rycina 4b), wykreślone jako funkcja czasu. Komórka mobilna wykazuje stale zmieniający się kształt (patrz Supplementary Video 4 w 8), co odzwierciedla bardziej chropowata powierzchnia DFT. Skoki amplitudy DFT w pierwszej jednej trzeciej przebiegu czasowego dla komórki wchodzącej w interakcje pokrywają się z szybkimi i znacznymi zmianami kształtu komórki, co pokazano w Supplementary Video 5 w 8.

Przebieg czasowy wszystkich 19 komponentów DFT został również scharakteryzowany dla tych dwóch komórek w trzech oddzielnych punktach czasowych podczas śledzenia komórki mobilnej (Rysunek 5a) oraz komórki wchodzącej w interakcje (Rysunek 5b). Osie prostopadłe reprezentują tutaj sześć kątów obrotu i wskazują, że wszystkie projekcje są równie istotne dla charakterystyki kształtu obu typów komórek.

Schemat przetwarzania danych mikroskopowych: rekonstrukcja 3D, projekcje 2D, DFT, analiza SOM, klasteryzacja.
Rysunek 1. Krok po kroku przedstawiony schemat przetwarzania danych w celu identyfikacji klastrów komórkowych na podstawie kształtu komórek. Powierzchnie zrekonstruowane w 3D posłużyły jako dane wejściowe do programu Blender w celu automatycznego wykonania projekcji 3D na 2D. Wyznaczono obrys każdej projekcji, a następnie obliczono komponenty DFT. Komponenty te stanowiły dane wejściowe dla wytrenowanej mapy samoorganizującej (SOM) w programie Matlab lub posłużyły do wytrenowania nowej mapy SOM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Zielone struktury molekularne w mikrografiach 3D wraz z diagramami do analizy kształtu w skali mikrometrycznej.
Rysunek 2. Typowy wygląd komórek mikrogleju korowego myszy w warunkach kontrolnych (a) oraz w tkance nowotworowej (b) Zrzuty ekranu zrekonstruowanych powierzchni mikrogleju. Projekcje SOM zostały stworzone z trzech grup próbek mikrogleju z kory mózgu myszy: komórek kontrolnych (nietumorowych) (c), komórek nowotworowych (d) oraz mieszanej populacji komórek (e). Rysunek został zmodyfikowany za zgodą autora.8. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Stany aktywności komórek z mapami ciepła wag; analiza klastrów i podzbiorów; schemat do celów badawczych.
Rycina 3. (a, lewa strona) Mapa Samoorganizująca (SOM) zbioru danych mikrogleju mysiego, składającego się z 768 wektorów cech wejściowych. Zbiór danych posłużył do wytrenowania sztucznej sieci neuronowej o rozmiarze 12x12, z zastosowaniem heksagonalnej geometrii sąsiedztwa, randomizacji początkowej i 200 epok. (a, prawa strona) Odpowiadające im płaszczyzny wejściowe SOM dla pierwszych 10 komponentów DFT (b) Reakcje SOM przedstawionej na (a) na jeden losowy podzbiór plików VRML dla każdego z czterech typów komórek: „mobilnych”, „oddziałujących”, „spoczynkowych” i „fagocytujących”, opisanych pierwotnie w Rycina 5 Bayerla i in.18(c) Reakcja tej samej SOM, co w (a, lewo), na trzy losowe podzbiory całego zbioru danych (które zatem nie były częścią zbioru treningowego) powierzchni 3D typu „komórki spoczywające”. Podobieństwo między tymi trzema reakcjami jest zauważalne. Rycina została zmodyfikowana za zgodą autora8. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres analizy Fouriera przedstawiający amplitudę w funkcji punktów czasowych; dane widmowe i analiza składowych DFT.
Rysunek 4. (a) Zależność od czasu pierwszych 10 składowych DFT podczas eksperymentu obrazowania intravitalnego mikrogleju mysiego. Panel ten przedstawia dane dla komórki typu „Mobile Cells”. Oś x odpowiada punktom czasowym eksperymentu z rozdzielczością czasową 60 s, oś y pokazuje amplitudę składowych DFT w jednostkach dowolnych (a.u.), natomiast oś z odpowiada składowym DFT od 1 do 10. (b) Analogicznie jak w (a), ale dla komórki typu „Interacting Cells”. Rycina została zmodyfikowana za zgodą autora.8. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskretna analiza Fouriera, amplituda a identyfikator komponentu, wykres 3D, porównanie danych widmowych.
Rysunek 5. (a) Zachowanie wszystkich 19 komponentów DFT komórki typu „Mobile Cells” na początku, w połowie i na końcu eksperymentu. Liczby na osi x odpowiadają identyfikatorom komponentów DFT od 1 do 19. Oś y przedstawia amplitudę komponentów DFT w jednostkach dowolnych (a.u.), natomiast oś z oznacza sześć losowych kątów obrotu. (b) Analogicznie jak w (a), ale dla komórki typu „Interacting Cells”. Rycina została zmodyfikowana za zgodą autora8. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Identyfikacja potencjalnie patologicznych stanów przy użyciu małych, nienaruszonych próbek tkanek ma duże znaczenie. Takie techniki zapewnią szybką reakcję na choroby zakaźne i agresywne rodzaje raka. Odpowiedzi kinetyczne i morfologiczne różnych komórek odpornościowych, np. mikrogleju i makrofagów, są charakterystyczne dla odpowiedzi immunologicznej organizmu. Chociaż w większości przypadków monitorowanie kinetycznego zachowania tych komórek nie jest praktyczne ani nawet możliwe, dość łatwo jest uzyskać trójwymiarowe obrazy w celu odzyskania ich kształtu. Zazwyczaj komórki odpornościowe przyjmują złożony kształt w zdrowej tkance i znacznie prostszą formę w stanach zapalnych lub nowotworowych18. Podczas gdy zależne od czasu cechy takiej zmiany kształtu wzbogaciłyby naszą wiedzę na temat rozwoju odpowiedzi immunologicznej, użycie tylko kształtu 3D reprezentatywnej grupy komórek może być również wystarczające do określenia zdrowej lub patologicznej natury tkanki.

Scharakteryzowanie trójwymiarowej powierzchni komórki nie jest prostym zadaniem. Zastosowanie harmonicznych sferycznych jest sposobem na przedstawienie powierzchni 3D ze stosunkowo dużą liczbą (50-70) składników11,12. Ponadto wyznaczanie harmonicznych sferycznych jest kosztowne obliczeniowo; rzutowanie bardzo skomplikowanych kształtów na sferę jednostkową jest albo niemożliwe, albo bardzo trudne ze względu na konieczność nałożenia na sferę jednostkową wielu siatek o różnym stopniu rozdrobnienia; Wreszcie, sensowna interpretacja widm składowych harmonicznych sferycznych jest daleka od trywialnej.

W naszej pracy przedstawionej tutaj zastępujemy trudne zadanie bezpośredniej analizy powierzchni 3D znacznie prostszym podejściem polegającym na wykorzystaniu rzutów 2D oryginalnej powierzchni w celu uzyskania wystarczających informacji morfologicznych do identyfikacji stanów patologicznych. Zademonstrowaliśmy każdy etap tego procesu pracy, wykorzystując dane mikroskopowe 3D z komórek szpikowych, jednocześnie wyraźnie zaznaczając, że wszystkie kroki były proste do wykonania, a uzyskane dwuwymiarowe mapy były łatwe do interpretacji.

Oczywiście projekcja 3D do 2D doprowadzi do utraty informacji o strukturze powierzchni. W naszym przykładowym zestawie danych mikrogleju w mysim modelu guza korowego wystarczyło użyć sześciu kątów podczas tworzenia projekcji 2D. Jednak bardziej złożone kształty lub mniej widoczne zmiany morfologiczne mogą wymagać utworzenia większej liczby projekcji, aby móc wiarygodnie zidentyfikować podgrupy komórek za pomocą SOM. Z tego powodu nasze podejście zostało zaprojektowane tak, aby móc generować i analizować dowolną liczbę projekcji. Po prostu wybierając większą liczbę projekcji dla bardziej złożonych kształtów, możliwe jest skalowanie utraty informacji do tolerowanego minimum. Na przykład typ współpracującej komórki na rysunkach 4a i 4b wymagałby większej liczby rzutów, aby prawidłowo odwzorować złożoną powierzchnię.

Jak każda metoda przybliżona, proponowany w niniejszym sposób pracy musiał zostać przetestowany w porównaniu z wynikami ręcznego procesu klasyfikacji mikrogleju18. Zaprezentowane wcześniej wyniki potwierdziły niezawodność zautomatyzowanego przepływu pracy. Co więcej, przepływ pracy jest bardziej efektywny czasowo w porównaniu z konwencjonalną analizą. Ekspert medyczny, który ręcznie sklasyfikował komórki mikrogleju, potrzebował około 4 tygodni na analizę zestawu danych, podczas gdy nasz przepływ pracy potrzebował tylko około 1 dnia. Solidność naszego podejścia została również wyraźnie potwierdzona przez odtwarzalność wytrenowanego SOM do podzbioru danych, które należały do tego samego typu komórki, ale nie zostały wykorzystane do trenowania SOM, jak pokazano na rysunku 3c.

Mimo że nasze podejście nie uwzględniało informacji kinetycznych, zbadaliśmy wpływ czasu na analizę kształtu opartą na DFT. Najbardziej typowy przykład zachowania zależnego od czasu znaleziono w populacji komórek mobilnych, gdzie wkład wyżej indeksowanych komponentów DFT był wyraźnie widoczny, jak na rysunku 4a. Zwraca to uwagę na znaczenie wykorzystania wystarczająco dużej liczby komponentów DFT w przypadku typów komórek, które mogą zachowywać się w sposób bardzo zależny od czasu. Ze względu na zautomatyzowany charakter i wysoką szybkość wykonywania naszych narzędzi programowych, zwiększona liczba komponentów i prognoz DFT zwiększy precyzję i wiarygodność wyników, a jednocześnie nie ograniczy znacząco wydajności obliczeniowej.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Autorzy dziękują Benjaminowi Krause za owocną dyskusję i wsparcie. Autorzy dziękują również Robertowi Güntherowi za pomoc w mikroskopii żywych komórek.

Praca była wspierana przez DFG wsparcie finansowe NI1167/3-1 (JIMI) dla R.N. i Z.C., DFG wsparcie finansowe CRC 1278 PolyTarget Project Z01 dla Z.C., C01 w TRR130 do R.N. i SFB633, TRR130, Exc257 dla A.E.H. i J.B.S. BfR zapewnił wsparcie stacjonarne SFP1322-642 dla F.L.K i A.L.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Imaris 9.1.2, oprogramowanieBitplane, Zü bogata, Szwajcariav.9.1.2Rekonstrukcja obrazu 3D i generowanie powierzchni; to było przez nas używane!
Blender 2.75a, oprogramowaniehttps://www.blender.org/v.2.75aOprogramowanie do animacji 3D i 4D o otwartym kodzie źródłowym; 2.75a to wymagana wersja dla tego Pythona
Fiji / ImageJ, oprogramowaniehttps://fiji.sc/ImageJ v.1.52bZestaw narzędzi do analizy obrazów multi-D o otwartym kodzie źródłowym
MATLABMathWorks, www.mathworks.comR2017bOgólne oprogramowanie obliczeniowe matematyczne
Maszyna MATLAB Zestaw do naukiMathWorks, www.mathworks.comR2017bMoże być używany tylko razem z
wtyczkami MATLAB Fiji: SHADEhttps://github.com/zcseresn/ShapeAnalysis v.1.0
Wtyczki Fidżi: ActiveContourhttp://imagejdocu.tudor.lu/doku.php?
id=plugin:segmentation:active_contour:start		absnake2
Komputer DowolnyNAZapoznaj się z instrukcjami Imaris, aby uzyskać informacje o minimalnych wymaganiach dotyczących komputera

Bibliografia

  1. Masedunskas, A., et al. Intravital microscopy: a practical guide on imaging intracellular structures in live animals. Bioarchitecture. 2 (5), 143-157 (2012).
  2. Niesner, R. A., Hauser, A. E. Recent advances in dynamic intravital multi-photon microscopy. Cytometry A. 79 (10), 789-798 (2011).
  3. Ho, S. Y., et al. NeurphologyJ: an automatic neuronal morphology quantification method and its application in pharmacological discovery. BMC Bioinformatics. 12, 230(2011).
  4. Yin, Z., et al. A screen for morphological complexity identifies regulators of switch-like transitions between discrete cell shapes. Nature Cell Biology. 15 (7), 860(2013).
  5. Yu, H. Y., Lim, K. P., Xiong, S. J., Tan, L. P., Shim, W. Functional Morphometric Analysis in Cellular Behaviors: Shape and Size Matter. Advanced Healthcare Materials. 2 (9), (2013).
  6. Johnson, G. R., Buck, T. E., Sullivan, D. P., Rohde, G. K., Murphy, R. F. Joint modeling of cell and nuclear shape variation. Molecular Biology of the Cell. 26 (22), 4046-4056 (2015).
  7. Wang, S. -H., Cheng, H., Phillips, P., Zhang, Y. -D. Multiple Sclerosis Identification Based on Fractional Fourier Entropy and a Modified Jaya Algorithm. Entropy. 20 (4), 254(2018).
  8. Kriegel, F. L., et al. Cell shape characterization and classification with discrete Fourier transforms and self-organizing maps. Cytometry Part A. 93 (3), 323-333 (2017).
  9. Styner, M., et al. Framework for the Statistical Shape Analysis of Brain Structures using SPHARM-PDM. Insight Journal. (1071), 242-250 (2006).
  10. El-Baz, A., et al. 3D shape analysis for early diagnosis of malignant lung nodules. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention. 14 (Pt 3), 175-182 (2011).
  11. Williams, E. L., El-Baz, A., Nitzken, M., Switala, A. E., Casanova, M. F. Spherical harmonic analysis of cortical complexity in autism and dyslexia. Translational Neuroscience. 3 (1), 36-40 (2012).
  12. Kruggel, F. Robust parametrization of brain surface meshes. Medical Image Analysis. 12 (3), 291-299 (2008).
  13. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  14. Kohonen, T. Essentials of the self-organizing map. Neural Networks. 37, 52-65 (2013).
  15. Andrey, P., Boudier, T. Adaptive Active Contours. ImageJ user and developer conference. , Luxembourg. (2006).
  16. Burger, W., Burge, M. J. Principles of Digital Image Processing. , Springer-Verlag. (2013).
  17. Lestrel, P. E. Fourier Descriptors and their Applications in Biology. , Cambridge University Press. (2008).
  18. Bayerl, S. H., et al. Time lapse in vivo microscopy reveals distinct dynamics of microglia-tumor environment interactions-a new role for the tumor perivascular space as highway for trafficking microglia. Glia. 64 (7), 1210-1226 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Morfologia kom rek 3Dstatyczna analiza kszta tu 3Ddyskretne sk adowe Fourieratrenowanie SOMklasyfikacja kszta tu kom rekmorfokinetyka mikroglejudetekcja kom rek nowotworowychanaliza kom rek odporno ciowych
Oparte na morfologii rozróżnienie między zdrowymi i patologicznymi komórkami z wykorzystaniem transformaty Fouriera i samoorganizujących się map
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.