Ustalenie i analiza eksplantatów plastrów guza jako warunek wstępny do badań diagnostycznych

Podsumowanie

Udostępniamy metodę generowania, hodowli i systematycznej analizy wycinków organotypowych pochodzących z mysich guzów płuc. Opisujemy również, jak zoptymalizować grubość plastra i jak dobrać stężenia leków do leczenia plastrów guza.

Streszczenie

Organotypowe pierwotne kultury eksplantatów tkankowych, które zawierają precyzyjnie wycięte plastry, reprezentują trójwymiarową (3-D) architekturę tkanki, jak również wielokomórkowe interakcje natywnej tkanki. Wycinki tkanek natychmiast wycięte ze świeżo wyciętych guzów zachowują przestrzenne aspekty niejednorodności wewnątrzguzowej (ITH), co czyni je użytecznymi substytutami biologii in vivo. Staranna optymalizacja przygotowania plastrów tkanek i warunków hodowli ma fundamentalne znaczenie dla predykcyjnego potencjału diagnostycznego eksplantatów plastrów guza. Pod tym względem modele mysie są cenne, ponieważ zapewniają stały przepływ materiału nowotworowego do przeprowadzania powtarzalnych i powtarzalnych eksperymentów. Protokół ten opisuje hodowlę wycinków tkanek pochodzących z mysiego guza płuc przy użyciu obrotowej jednostki inkubacyjnej, systemu, który umożliwia przerywaną ekspozycję tkanek na tlen i składniki odżywcze. Nasze wcześniejsze prace wykazały, że zastosowanie obrotowych jednostek inkubacyjnych poprawia żywotność tkanek w porównaniu z innymi metodami hodowli, w szczególności pływającymi plastrami i stojącymi podporami filtrów. W tym miejscu pokazujemy ponadto, że grubość plastra wpływa na żywotność plastrów hodowanych, co sugeruje, że optymalizacja grubości plastra powinna być przeprowadzona dla różnych typów tkanek. Wyraźne ITH w odpowiednich funkcjach onkogennych, takich jak aktywność sygnalizacyjna, naciekanie komórek zrębu lub ekspresja markerów różnicowania, wymaga oceny sąsiednich wycinków tkanek pod kątem ekspresji markerów zmienionych przez leczenie farmakologiczne lub samą hodowlę. Podsumowując, protokół ten opisuje wytwarzanie mysich plastrów guza płuc i ich hodowlę na obrotowej jednostce inkubacyjnej oraz pokazuje, w jaki sposób plastry powinny być systematycznie analizowane pod kątem ekspresji heterogenicznych markerów tkankowych, jako warunek wstępny przed badaniami odpowiedzi na lek.

Wprowadzenie

Tkanki guzów litych, w tym rak płuc, wykazują niejednorodność genetyczną i fenotypową oraz posiadają złożone mikrośrodowiska^1,2. Wzajemne oddziaływanie między komórkami nowotworowymi a otaczającym je mikrośrodowiskiem wpływa na mechanizmy wrażliwości i oporności na leki³. Podkreśla to zapotrzebowanie na modele przedkliniczne, które mogą dokładnie modelować złożoność biologiczną i funkcje działające w rodzimych nowotworach. Precyzyjnie pokrojone plastry pochodzące bezpośrednio ze świeżych guzów stanowią unikalny zasób, ponieważ mają główną zdolność do reprezentowania biologii in vivo, przynajmniej przez krótki okres czasu, w tym fenotypów rozmieszczonych przestrzennie w pojedynczym guzie. Wycięte guzy kliniczne są jednymi z niewielu spersonalizowanych próbek, które można uzyskać od pacjenta z rakiem, a ich zastosowanie diagnostyczne zasługuje na kontrolę.

Historia kultur organotypowych sięga początku^{XIX wieku,} kiedy to ludzkie guzy wewnątrzczaszkowe były ręcznie cięte na kawałki tkanek i hodowane przy użyciu tak zwanej metody wiszącej kropli. Fragmenty tkanek dołączono do szkiełka nakrywkowego i pozostawiono do zanurzenia w heparynizowanym ludzkim osoczu, po czym szkiełka nakrywkowe odwrócono, zapieczętowano i hodowano przez kilka tygodni⁴. Od tego czasu ręcznie wycinane kawałki guza były hodowane przy użyciu wielu innych metod, takich jak skrzepy osocza⁵, w płynnych mediach⁶, lub na filtrach o wielkości porów 0,45 μm⁶. Termin "organotypowy" został po raz pierwszy użyty w 1954 roku, w badaniu nad różnicowaniem siatkówki zarodka pisklęcia eye⁷. Następnie przeprowadzono badania, w których wykorzystano eksplantaty płuc i serca pochodzące z zarodków piskląt⁸ oraz eksplantaty mózgu od dorosłych szczurów⁹.

Opisano różne metody krojenia, a mianowicie ręczne rozdrabniacze^10,11, krajalnica do tkanek Krumdieck^12,13, oraz vibratomes^11,14,15,16. Krajalnica do tkanek Krumdieck generuje cylindryczne rdzenie tkanek, które są następnie krojone na okrągłe plastry tkanek za pomocą mikrotomu. Z drugiej strony wibratom wykorzystuje mikrotom z wibrującym ostrzem. W badaniu na wycinkach wątroby wykazano, że wibratom Leica generuje bardziej powtarzalne i spójne wycinki w porównaniu z slicerem Krumdieck¹⁵. Zastosowano grubości warstw od 250 do 500 μm, a badania wskazują na utrzymanie żywotności i cech morfologicznych nawet do 16 dni^14,10,17,18. Jednak nowotwory mają zmienne profile metaboliczne, które mogą wpływać na zapotrzebowanie na składniki odżywcze, a parametry takie jak sztywność tkanek i skład macierzy mogą wpływać na napowietrzenie i przepływ składników odżywczych. Jest zatem prawdopodobne, że każdy typ tkanki wymaga optymalizacji warunków krojenia i hodowli.

Różne metody uprawy były używane do wspierania kultur warstwowych: i) stacjonarna hodowla międzyfazowa, zwana również kulturą podporową stagnacji, w której plastry są umieszczane na półporowatej wkładce membranowej zanurzonej w pożywce. W tym przypadku górna część plastrów jest wystawiona na działanie powietrza, podczas gdy spód jest uzupełniany składnikami odżywczymi za pośrednictwem porowatej wkładki^14,19; ii) metoda kielni, pierwotnie opracowana do hodowli całych narządów lub wycinków tkanek embrionalnych. W tym przypadku plastry umieszcza się na bawełnianym arkuszu lub filtrze wspartym na metalowej siatce, a filtr moczy się w pożywce hodowlanej. Aby tkanki były wilgotne, na plastry nakłada się cienką warstwę podłoża ^20,21,22. Te dwie pierwsze są tak zwanymi kulturami interfazowymi powietrze-ciecz; iii) kultury rolkowe, w których plastry są umieszczane wewnątrz płaskiej strony plastikowej rurki zawierającej pożywkę, a powolny obrót rurki zapewnia, że tkanka jest pokryta pożywką podczas pierwszej części cyklu lub napowietrzona podczas drugiej²³; iv) obrotowe jednostki inkubacyjne, w których plastry są okresowo poddawane działaniu pożywki ze składnikami odżywczymi i napowietrzaniem. W odróżnieniu od rurek rolkowych, w tej metodzie plastry umieszcza się na porowatych siatkach tytanowych umieszczonych na 6-dołkowych płytkach z podłożem hodowlanym²⁴.

Wycinki tkanki pochodzące z wyciętych guzów litych logicznie prezentują atrakcyjny model ex vivo, w którym można przetestować odpowiedź na leczenie środkami przeciwnowotworowymi, ponieważ pozwalają na ocenę żywotności, aktywności szlaku docelowego i profili molekularnych konkretnego guza w obecności jego natywnego mikrośrodowiska guza. Jednak, aby ocenić, czy odpowiedzi na lek mierzone w wycinkach guza są predykcyjne dla odpowiedzi in situ, ważne jest, aby ocenić, w jakim stopniu wycinki tkanki zachowują specyficzne dla nowotworu funkcje biologiczne, takie jak proliferacja komórek, różnicowanie komórek specyficzne dla histopatologii lub onkogenne aktywność sygnalizacyjne. Wpływ naprężeń mechanicznych wywołanych podczas przygotowywania plastrów, obchodzenia się z nimi lub adaptacji wywołanych hodowlą na zarówno jakość, jak i funkcje biologiczne wycinków tkanek to fundamentalne pytania, ściśle związane ze zdolnością do wdrażania plastrów pochodzących z guza do diagnostyki funkcjonalnej.

Nasz projekt konsorcjum PREDECT (http://www.predect.eu, finansowany przez IMI), postanowił systematycznie odpowiedzieć na te fundamentalne pytania, badając eksplantaty krojące z różnych źródeł. Wykorzystując wycinki pochodzące z modeli raka piersi, prostaty i płuc, w ramach wspólnego wysiłku wykorzystano odczyty jakościowe, a także ilościowe odczyty oparte na hematoksylinie i eozynie (H&E), aby wykazać zapotrzebowanie na tlen atmosferyczny i stojące nośniki filtrów, aby utrzymać żywotność hodowanych plastrów do 72 godzin. Co więcej, analizy immunohistochemiczne (IHC) na hodowanych wycinkach ujawniły gradienty żywotności wewnątrz wycinków, potwierdzone gradientami martwicy w wycinkach pochodzących z mysiego niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC), gradientów receptora estrogenowego (ER), HIF1α i γH2AX w wycinkach raka piersi lub gradientów ekspresji receptora androgenowego (AR) w wycinkach raka prostaty²⁵. Co ciekawe, gradienty żywotności wewnątrz warstwy w 24-godzinnych kulturach mysiego NSCLC zostały uratowane przez hodowlę w rotacyjnej jednostce inkubacyjnej, a nasze ostatnie badanie wykazało, że żywotność została wydłużona do 72 h²⁶. Szczególnie górna strona pozostała najbardziej żywotna²⁶, co potwierdza, że analizy odpowiedzi na lek na wycinkach najlepiej przeprowadzać po tej stronie tkanki.

Chociaż pozostaje pytanie, jak daleko wycinki tkanek mogą podsumować funkcje guza in situ, były one szeroko stosowane do testowania odpowiedzi na środki przeciwnowotworowe, w tym leki celowane, przeciwciała monoklonalne i środki chemioterapeutyczne^{10,11,13,14,18,27}. Ostatnio pokazaliśmy, że mysie plastry NSCLC wykazują dynamiczne zmiany w proliferacji i aktywności sygnalizacji onkogennej po hodowli w porównaniu do świeżo ściętych plastrów 0 h²⁶. Wskazuje to, że ważne jest, aby zbadać, czy docelowe funkcje biologiczne in situ są odpowiednio zachowane podczas uprawy, przed badaniami perturbacji. Pomimo tych ustaleń wykazaliśmy, że plastry guza mogą modelować odpowiedź przestrzenną na terapie celowane, podczas gdy leczenie farmakologiczne pozostaje krótkie (24 godziny) i rozpoczyna się na początku hodowli²⁶. Poniższy protokół opisuje ważne aspekty walidacji istotne dla tworzenia i analizy kultur plastrów guza, przed ich zastosowaniem w testach farmakologicznych leków.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na myszach opisane w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Fińskiej Narodowej Rady Eksperymentów na Zwierzętach i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Zwierząt Doświadczalnych Uniwersytetu w Helsinkach oraz Państwowe Biuro Prowincji Południowej Finlandii (numer licencji ESAVI/9752/04.10.07/2015).

1. Przygotowania przed krojeniem

1. Przygotuj następujące materiały: uchwyt na próbki wibratomu, tackę buforową wibratomu, łaźnię lodową wibratomu, płytkę hodowlaną 10 cm, płytkę 24-dołkową, pipetę 10 ml, zestaw do pipet, worek na odpady, 70% EtOH w probówce o pojemności 50 ml do dezynfekcji narzędzi oraz klej do tkanek.
2. Przygotuj wibratom: przetrzyj uchwyt ostrza 70% EtOH, załóż nowe ostrze i wykonaj kontrolę wibracyjną zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji (http://photos.labwrench.com/equipmentManuals/10103-3895.pdf).
   UWAGA: Ważne jest, aby wykonać krok wibrokontroli, ponieważ minimalizuje on pionowe ugięcie ostrza i zapewnia dobrą jakość plastrów.
3. Napełnij każdą studzienkę 24-dołkowej płytki 1 ml zbilansowanego roztworu soli Hanksa (HBSS) uzupełnionego 100 j./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (HBSS + P/S); trzymaj płytkę na lodzie.
4. Przygotuj pożywkę hodowlaną F12 uzupełnioną 100 μ / ml penicyliny, 100 μg / ml streptomycyny, 2 mM glutamax, 22 mM glukozy i 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
   UWAGA: Pożywka do hodowli plastrów nowotworowych i suplementy czynnika wzrostu mogą się różnić w zależności od tkanki nowotworowej²⁵.
5. Przygotować wymaganą ilość pożywki F12 do leczenia farmakologicznego, stosując ten sam skład, jak opisano w kroku 1.4, ale z pominięciem FBS.
   UWAGA: Ponieważ czynniki wzrostu w surowicy mogą wpływać na sygnalizację onkogenną w wycinkach hodowlanych, pożywka bez surowicy jest zalecana do krótkoterminowych badań zaburzeń działania leku na wycinkach guza. Jeśli analizowane są długoterminowe hodowle plastrów, ważne jest, aby najpierw ocenić wpływ pożywki bez surowicy na żywotność tkanek i ekspresję markerów specyficznych dla nowotworu w nieleczonych kulturach plastrów.

2. Zbiór płuc zawierających nowotwory

1. Poddaj eutanazji mysz z guzem przez zwichnięcie szyjki macicy, gdy wykazuje objawy trudności w oddychaniu i utracie masy ciała.
   UWAGA: Wiadomo, że eutanazja za pośrednictwem CO₂ wywołuje warunki niedotlenienia w płucach, które może mieć wpływ na żywotność plastrów lub aktywność onkogenną poprzez wywołanie odpowiedzi niedotlenienia.
2. Rozciągnij uśpioną mysz na styropianowej pokrywie, wkładając igły 25 G we wszystkie cztery łapy, tak aby klatka piersiowa była odsłonięta. Rozpyl 70% EtOH na powierzchnię odsłoniętej skóry.
3. Rozetnij skórę od brzucha w kierunku klatki piersiowej i aż do okolicy szyi. Rozciągnij skórę po obu stronach za pomocą kleszczy i włóż igły 25 G. Rozetnij okolicę brzucha, a następnie klatkę piersiową i przeponę, aby odsłonić płuca i serce. Odsłoń tchawicę, odcinając otaczającą tkankę. Trzymaj nożyczki w pozycji pod kątem, aby uniknąć uszkodzenia tkanek.
4. Wypreparuj płuca zawierające guz razem z sercem i umieść je w probówce o pojemności 50 ml zawierającej 30 ml lodowatego HBSS + P / S; utrzymuj probówkę w lodowatym stanie i przejdź do następnego kroku tak szybko, jak to możliwe.
   UWAGA: Opóźnienia w przetwarzaniu nowotworów płuc mogą zmieniać funkcje onkogenne, na przykład aktywność szlaku sygnałowego.

3. Generowanie precyzyjnie wyciętych plastrów guza płuc

1. Przenieś płuca zawierające guz w HBSS + P/S na 10-centymetrową płytkę do hodowli tkankowej. Oddziel płaty płuc za pomocą sterylnych nożyczek i kleszczy i wybierz płaty z guzami na powierzchni do krojenia.
   UWAGA: Guzy o wielkości >3 mm nadają się do krojenia. Ponieważ normalna tkanka płucna otaczająca duży guz utrudnia krojenie z powodu różnic w sztywności tkanki, tkanka nowotworowa poddawana krojeniu powinna być oddzielona od normalnej tkanki, tak aby oczyszczony obszar guza był skierowany w stronę ostrza wibratomu.
2. Umieść wybrany płat płuca z tkanką nowotworową na kawałku bibuły filtracyjnej, aby uniknąć poślizgnięcia, i odetnij część normalnego płuca lub dodatkową tkankę nowotworową, która otacza guz, sterylnym skalpelem, aby wygenerować płaską powierzchnię kawałka tkanki.
   1. Zanurz płaską szkiełko w kropli kleju cyjanoakrylowego. Zamontuj tę stronę na uchwycie próbki wibratomu tak, aby guz był skierowany w stronę ostrza w pozycji pionowej. Pozostaw klej do wyschnięcia na 2-3 minuty
      UWAGA: Normalna tkanka płucna przyklejona do uchwytu próbki nie przeszkadza w krojeniu tkanki nowotworowej, a krojenie jest zatrzymywane przed osiągnięciem normalnej tkanki. Tkanka nowotworowa czasami wygina się z powodu gąbczastej tekstury normalnej tkanki płucnej przyklejonej do uchwytu próbki, co pogarsza jej pionową pozycję. Jeśli tak się stanie, przyklej kawałek dodatkowej normalnej tkanki podporowej płuc obok wstępnie zamontowanej normalnej tkanki płucnej, aby utrzymać guz w pozycji pionowej (Rysunek 1A iii).
3. Umieść uchwyt próbki w metalowej tacce buforowej i napełnij go zimnym HBSS + P/S, aż chusteczka zostanie zanurzona w buforze, a następnie przykryj tackę buforową pokrywką z pleksiglasu, która jest dostarczona z instrumentem. Umieść metalową tackę buforową na białej kąpieli lodowej i dodaj lód, aby chusteczka była chłodna podczas krojenia.
4. Podłącz białą kąpiel lodową do wibratomu. Wybierz odpowiednie ustawienia krojenia: amplituda w zakresie 2,5–2,8, prędkość krojenia w zakresie 0,10–0,14 ms i grubość cięcia w zakresie 160–250 μm. Ustaw ostrze wibratomu w pozycji krojenia, ustaw okno krojenia i rozpocznij krojenie.
   UWAGA: Ustawienia krojenia należy dostosować do twardości tkanki. Tkanka twarda jest łatwiejsza do krojenia niż tkanka miękka, a tkanki miękkie wymagają krojenia z mniejszą prędkością (0,1–0,12 ms) i większą amplitudą (2,6–2,8). Guz o wielkości 4-5 mm zwykle zawiera 15-20 plasterków o grubości 200 μM. W przypadku krótkotrwałej hodowli guzy mysie można kroić w warunkach półsterylnych poza kapturem laminarnym. Jednak guzy kliniczne powinny być zawsze krojone wewnątrz kaptura laminarnego klasy bezpieczeństwa biologicznego II, aby uniknąć narażenia na możliwe czynniki zakaźne w tkance ludzkiej.
5. Za pomocą sterylnych kleszczy zbierz plastry w 1 ml HBSS w oddzielnych dołkach 24-dołkowej płytki trzymanej na lodzie, ściśle śledząc kolejność, w jakiej plastry są krojone. Oznacz każdą studzienkę na 24-dołkowej płytce zgodnie z planem eksperymentalnym. Na przykład, oznacz sekwencyjne studzienki na 24-dołkowej płytce jako punkty czasowe hodowli lub jako 0 godzin, kontrola nośnika (C), leczenie lekiem (T) (Rysunek 1B ii).
   UWAGA: Nie przeszkadzaj ani nie ciągnij tkanki nowotworowej podczas pobierania plasterka, ponieważ zmieni to orientację guza w stosunku do kąta ostrza, prowadząc do niespójności w grubości kolejnych plasterków.
6. Po zebraniu wszystkich plastrów przenieś je na tytanowe kratki (2-3 plastry na siatkę) umieszczone na 6-dołkowej płytce zawierającej 2,5 ml pożywki hodowlanej na dołek. Upewnij się, że między siatką tytanową a medium nie tworzą się pęcherzyki powietrza.
   1. Aby załadować plasterek na siatkę, trzymaj płytkę 6-dołkową pod kątem, tak aby część podłoża zakrywała siatkę, i umieść plasterek w podłożu na siatce; użyj kleszczy, aby rozłożyć plasterek, jeśli się zwija. Załaduj 6-dołkowe płytki na obrotową jednostkę inkubacyjną umieszczoną w nawilżanym inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 37 °C z 95% powietrzem i 5% CO₂ i rozpocznij cykl rotacji (Rysunek 1C i-ii).
      UWAGA: Metalowe kratki i płytki 6-dołkowe muszą być dokładnie wyważone przed włączeniem jednostki obrotowej. Ważne jest, aby umieścić plastry na środku siatki tak, aby w pełni przechodziły między fazą powietrzną i ciekłą podczas cykli obrotowych. Plastry, które są umieszczone zbyt nisko lub zbyt wysoko, nie są odpowiednio narażone na działanie tlenu lub składników odżywczych (Rysunek 1C i), co może zagrozić żywotności tkanek. Ważne jest, aby podczas uprawy śledzić położenie plastra na siatce, ponieważ plaster może czasami zsunąć się w dół. Jeśli zdarzy się to w ciągu 1–2 godzin od rozpoczęcia hodowli, należy skorygować jego położenie i zanotować, że próbka może być uszkodzona. Plastry, które są nieprawidłowo ułożone przez dłuższy czas, należy wyrzucić, ponieważ na żywotność tkanek znacząco wpływa niewłaściwe natlenienie i zaopatrzenie w składniki odżywcze.
7. Zbierz wycinek tkanki przylegający do wycinków z kulturą jako odniesienie 0 h, bez hodowli. Zbierz co najmniej trzy wycinki referencyjne, które reprezentują górną, środkową i środkową tkankę, która jest krojona. Natychmiast napraw wycinki 0 h i przetwarzaj zgodnie z opisem w 5.1.
   UWAGA: Jeśli liczba wycinków jest ograniczona, np. jeśli wykonuje się wiele zabiegów złożonych lub kontrprób technicznych, porównanie każdej próbki poddanej działaniu substancji z sąsiednią próbką 0 h może być trudne. W takich przypadkach należy użyć najbliższego wycinka 0 h (w odległości co najmniej 400–600 μm od siebie), aby ocenić względną żywotność tkanek lub ekspresję odpowiednich markerów na początku hodowli.
8. W przypadku długotrwałej uprawy należy codziennie uzupełniać podłoże hodowlane. Podnieś siatkę zawierającą wycinki tkanki za pomocą sterylnych kleszczy i umieść ją w pustym dołku na płytce 6-dołkowej; Zastąp 70% pożywki świeżą pożywką hodowlaną i umieść siatkę z powrotem w pożywce. Kontynuuj cykl obracania, jak wyjaśniono w kroku 3.6.

4. Leczenie plastrów guza za pomocą inhibitorów małych cząsteczek

1. Przygotować wymagane stężenia związków w podłożu zabiegowym. Zazwyczaj 10-krotnie wyższe stężenie leku w porównaniu z IC50 mierzone w hodowlach komórkowych jest wymagane do osiągnięcia docelowego zahamowania w wycinkach tkanki. Aby uniknąć niespecyficznej cytotoksyczności, należy przeprowadzić badanie w zakresie stężeń, aby uzyskać minimalnie skuteczne stężenie dla każdego związku. W tym przypadku 0,1–1 μM inhibitora PI3K/mTOR daktolizybu i 0,05–0,5 μM inhibitora MEK selumetynibu badano na mysich plastrach NSCLC.
2. Dodać 2,5 ml pożywki z rozcieńczonym lekiem lub DMSO lub innym nośnikiem kontrolnym do płytki 6-dołkowej. Umieść tytanowe kratki w studzienkach.
3. Umieść plastry tkanki na siatkach zgodnie z opisem w kroku 3.6.
4. Przez 24 godziny należy wykonywać zabiegi z podłożem lub podawaniem leków. Przystąpić do utrwalania tkanek i przetwarzania plastrów na bloki parafinowe, jak opisano w punkcie 5.
   UWAGA: Czas trwania leczenia farmakologicznego można zoptymalizować w zależności od celu eksperymentu, biorąc pod uwagę zdolność wycinków tkanek do zachowania funkcji tkanek in situ analizowanych w okresie hodowli.

5. Utrwalanie i przetwarzanie wycinków tkanek

1. Ostrożnie podnieść niehodowany 0 h referencyjna lub hodowany plasterek na bibułę filtracyjną nasączoną PBS.
   1. Aby to zrobić, dodaj 2-3 ml PBS na bibułę filtracyjną umieszczoną na 10-centymetrowej płytce. Umieść plasterek na bibule filtracyjnej i wyjmij bibułę filtracyjną za pomocą kleszczy.
   2. Przenieś bibułę filtracyjną do histokasesty i dodaj kroplę rozcieńczonej hematoksyliny (1:1 w wodzie dejonizowanej) na wierzch wycinka tkanki, aby widocznie zaznaczyć położenie wycinka podczas kolejnych etapów przetwarzania (Rysunek 1D).
   3. Zamknij kasetę i przenieś ją do 4% neutralnego roztworu formaliny z buforem. Utrwalić tkanki przez noc w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Umieszczając plasterek na bibule filtracyjnej, upewnij się, że górna część plastra jest skierowana do góry; Jest to konieczne, aby podążać za górną, środkową i dolną sekcją wycinka podczas przekroju i analizy, jak opisano w kroku 6.3.
2. Następnego dnia przenieś kasety do 70% EtOH i natychmiast przystąp do etapu przetwarzania tkanek zatapiających parafinę.
3. Przed obróbką tkanek należy umyć histokasety w 100% EtOH 2x przez 10 minut każda. W takim przypadku użyj stacji mikrofalowej do przetwarzania tkanek. Wybierz program używany do grubości tkanki 1 mm i postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w instrukcji (https://www.totaltissuediagnostics.com/images/MM073-005_-_KOS__Operator_Manual.pdf).
   UWAGA: W przypadku korzystania z innych maszyn do przetwarzania tkanek należy używać programu odpowiedniego dla cienkich próbek tkanek.
4. W celu zatopienia w parafinie otwórz histokasę i za pomocą skalpela ostrożnie wyjmij plaster z bibuły filtracyjnej. Wyrzuć bibułę filtracyjną i przenieś plasterek do formy zawierającej ciekłą parafinę.
   1. Dociśnij chusteczkę do dna formy do zatapiania, na przykład płaskim ciężarkiem, aby zapewnić równomierne cięcie. Umieść dolną część histokasety na wierzchu formy, dodaj na nią płynną parafinę. Pozostaw formę do ostygnięcia na zimnym pasztecie przez 30 minut i oddziel formę od bloku parafinowego.
      UWAGA: Jako alternatywę dla osadzania poziomego, możliwe jest osadzenie plastra guza w pionie, ustawiając plasterek w pozycji pionowej. Sekcje pionowe z łatwością pozwalają na analizę gradientów żywotności lub wyrażenia znacznika funkcjonalnego na pojedynczej sekcji²⁵. Analiza gradientu z poziomo osadzonymi plastrami wymaga przekroju parafiny, jak opisano w kroku 6.2.

6. Przetwarzanie i analiza tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE)

1. Przygotować cienkie skrawki tkanek FFPE o grubości 4 μm za pomocą mikrotomu. Podczas cięcia wyreguluj kąt bloku tak, aby powierzchnia bloku była zorientowana poziomo w stosunku do ostrza; Jest to konieczne, aby uzyskać równe odcinki w całej tkance.
2. Aby umożliwić uchwycenie potencjalnego gradientu żywotności wywołanego hodowlą, migracji komórek przez wycinki lub gradientów ekspresji biomarkerów w wycinkach hodowlanych, należy zebrać sekcje z górnej, środkowej i dolnej warstwy każdego z wycinków tkanki na szkiełkach obiektowych, jak wyjaśniono poniżej.
3. Najpierw zbierz sekwencyjne skrawki tkanki z wycinka tkanki zatopionej w parafinie w górnej części szkiełek podstawowych. Kontynuuj zbieranie odcinków głębszych warstw tkanek do środka, a następnie dolnej części szkiełek (Rysunek 1E).
   UWAGA: Aby zmieścić trzy sekcje na szkiełku podstawowym, odetnij nadmiar parafiny otaczającej osadzony plasterek tkanki.
4. Pozostawić skrawki do wyschnięcia na noc w temperaturze 37 °C i przystąpić do barwienia H&E lub immunohistochemii, jak opisano poniżej.
   UWAGA: Utrata antygenowości może wystąpić, gdy skrawki FFPE są przechowywane w wysokich temperaturach lub przez dłuższy czas. Zaleca się przechowywanie skrawków parafiny w temperaturze 4 °C, a analizy IHC należy przeprowadzić w ciągu 6 miesięcy po pocięciu.
   1. W przypadku barwienia H&E należy odparafinować i ponownie uwodnić skrawki parafiny w następujący sposób: ksylen 3x przez 5 min, 100% EtOH 3x przez 1 min, 96% EtOH 2x przez 1 min, 70% EtOH 1 x 1min i woda dejonizowana 2x przez 1 min.
   2. Inkubować skrawki w świeżo przefiltrowanym roztworze hematoksyliny przez 10 minut i myć pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut. Zanurzyć skrawki w kwaśnym alkoholu (1% HCl w 70% EtOH) przez 2 razy i myć pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut, a następnie inkubować z 0,5% eozyną przez 2 minuty.
   3. Po etapie eozyny należy odwodnić skrawki, zanurzając szkiełka w roztworach alkoholu i ksylenu w następujący sposób: 96% EtOH 2x przez 15 s, 100% EtOH 3x przez 30 s, ksylen 3x przez 1 min. Na koniec osadź sekcje w medium montażowym na bazie ksylenu.

7. Analiza żywotności tkanek i ekspresji biomarkerów

1. Uzyskuj obrazy o wysokiej rozdzielczości, generując skany całych slajdów wybarwionych H&E za pomocą skanera. Aby ocenić żywotność tkanek, należy wykonać migawki ze skanów tkanek reprezentujących górną, środkową i dolną część plastrów.
   1. Korzystając z oprogramowania do manipulacji zdjęć, ręcznie narysuj maski na martwiczych obszarach tkanek, a następnie określ ilościowo obszary martwicze za pomocą MATLAB.
   2. Oblicz względną żywotność wycinków uprawianych w różnych punktach czasowych w porównaniu z najbliższym wycinkiem 0 h, jak to zrobiliśmy w naszym poprzednim badaniu (Närhi i in., Rysunek S2B i C)²⁶. Podobnie, oceń potencjalne gradienty żywotności wewnątrz wycinka, określając ilościowo żywotność w górnej, środkowej i dolnej części hodowanego wycinka i oblicz względną żywotność każdej sekcji do najbliższego wycinka 0 h.
      UWAGA: Podczas gdy sama hodowla mysich plastrów NSCLC indukuje martwiczą śmierć komórki, reakcje biologiczne na warunki hodowli ex vivo różnią się w zależności od tkanki nowotworowej. Na przykład gradienty w HIF1α, ER i makrofagach oznaczone przez F4/80 wykryto w kulturach warstwowych opartych na filtrach pochodzących z modelu raka piersi²⁵. W związku z tym dla każdego typu tkanki należy rozważyć analizy oparte na H&E i IHC kultur wyhodowanych.
2. Wykonać IHC na sekcjach parafinowych. Poniższy protokół IHC jest punktem wyjścia i wymaga dalszej optymalizacji dla innych przeciwciał. Krótko odparafinować i ponownie uwodnić sekcje parafiny w następujący sposób: ksylen 3x przez 5 min, 100% EtOH 3x przez 1 min, 96% EtOH 2x przez 1 min, 70% EtoH 1x przez 1 min i woda dejonizowana 2x przez 1 min.
   1. Aby odsłonić epitopy antygenowe, należy przeprowadzić pobieranie antygenu za pośrednictwem ciepła przy użyciu 10 mM kwasu cytrynowego o pH 6 w module PT, a następnie zablokować 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) i 10% normalną surowicą kozią (NGS) w 1x PBS przez 30 minut w temperaturze otoczenia (21-23 °C).
   2. Inkubować przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w 1% BSA i 5% NGS w 1x PBS, przez 1–2 godziny w temperaturze otoczenia lub przez noc w temperaturze 4 °C. Inkubować z przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikowi przez 30 minut w temperaturze otoczenia, a następnie wykrywać za pomocą 3,3′-diaminobenzydyny (DAB).
   3. Skrawki są barwione przeciwstawnie hematoksyliną (rozcieńczoną do 1:10 w wodzie dejonizowanej) przez 30 s i myte pod bieżącą wodą przez 5 minut, a następnie odwadniane przez zanurzenie szkiełek w roztworach alkoholu i ksylenu, w następujący sposób: 70% EtOH 1x, 96% EtOH 2x, 100% EtOH 3x, ksylen 3x (1 min każdy krok). Na koniec osadź sekcje w medium montażowym na bazie ksylenu.
3. Uzyskaj skany całych slajdów wybarwionych IHC, korzystając z przeglądarki obrazów, wyeksportuj je jako obrazy TIFF w powiększeniu, które obejmuje cały obszar tkanki, który ma być analizowany, i wykonaj kwantyfikacje za pomocą ImageJ.
   UWAGA: Alternatywą dla skanera jest uzyskanie obrazów mikroskopowych przy powiększeniu 20X lub 40X w celu oceny ilościowej. Powiększenie obrazu można wybrać w zależności od markera, który ma być określony ilościowo; Obrazy o dużym powiększeniu są zalecane do barwienia jądrowego, podczas gdy markery cytoplazmatyczne lub błonowe można określić ilościowo za pomocą obrazów 20X.
   1. W celu ilościowego określenia markerów jądrowych, w tym przypadku wyrażenia NKX2-1, przekonwertuj każdy obraz na obrazy 16-bitowe za pomocą Fiji-ImageJ i prześlij obrazy do analizy obrazu.
   2. Dostosuj potok analizy obrazu w zależności od analizy. W tym protokole należy użyć następującego potoku do ilościowego oznaczania jąder dodatnich NKX2-1: Zidentyfikuj obiekty podstawowe | Pomiar intensywności obiektu | Filtruj obiekty (wartość minimalna=0,0025) | Oblicz matematykę. Wyniki są przedstawiane jako procenty jąder barwionych DAB w całkowitej liczbie jąder.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia proces tworzenia, hodowli i analizy precyzyjnie wyciętych wycinków tkanek pochodzących z mysich guzów NSCLC. Do tej demonstracji wykorzystaliśmy guzy z genetycznie zmodyfikowanego modelu myszy (GEMM) zawierającego warunkową aktywację Kras^G12D wraz z utratą Lkb1 (znanego również jako kinaza serynowo-treoninowa 11), zwanego dalej KL. Hodowlę myszy i inicjację guza płuc przeprowadzono zgodnie z opisem w^26,28. Rysunek 2A pokazuje wpływ grubości warstwy tkanki na żywotność plastrów hodowanych przez 24 godziny przy użyciu obrotowej jednostki inkubacyjnej. Wyniki pokazują, że cienkie plasterki o grubości 160 μm zawierają duże nekrotyczne obszary w poprzek warstwy. Ponadto cienkie plasterki o grubości 250 μm wykazują gradient nekrozy w poprzek plasterka w porównaniu z cienkimi plasterkami o grubości 200 μm. Jest prawdopodobne, że słaba ogólna żywotność najcieńszego materiału o grubości 160 μm jest spowodowana technicznym obchodzeniem się z plastrami podczas umieszczania ich na siatkach, ponieważ są one kruche i mają tendencję do zwijania się. Z drugiej strony, gdy plastry są zbyt grube, mogą stać się podatne na niedobory tlenu lub dyfuzji składników odżywczych przez plastry, co w przypadku mysich eksplantatów NSCLC jest udowodnione jako gradient martwiczej śmierci²⁵. Należy jednak zauważyć, że plastry o różnej grubości mogą być generowane z jednego guza, pomimo zastosowania identycznych ustawień wibratomu. Dlatego zaleca się analizę wielu powtórzeń z różnych próbek guza. Co ważne, każdy rodzaj tkanki wymaga optymalizacji grubości plastrów, aby osiągnąć maksymalną żywotność, ponieważ tekstura i twardość tkanki mogą wpływać na natlenienie i przepływ składników odżywczych. Rysunek 2B-2C ilustruje ilościowe analizy IHC ekspresji NKX2-1, markera dobrze zróżnicowanego gruczolakoraka płuc (AC) w próbkach hodowanych do 72 godzin i dopasowanych do 0 godzin. Wyniki pokazują, że ekspresja NKX2-1 nie jest znacząco zmieniona w hodowanych wycinkach w porównaniu z 0 h niehodowanymi plastrami, co sugeruje, że proces hodowli nie wpływa jawnie na status różnicowania tkanki nowotworowej AC. Rysunek 2D pokazuje przydatność wycinków tkanki nowotworowej do oceny skuteczności leków celowanych. Niedawno wykazaliśmy, że mysie AC z mutacją Kras wykazują wysoką ekspresję ufosforylowanego ERK1 / 2 (co oznacza zwiększoną aktywność szlaku MAPK) w porównaniu z guzami gruczołowo-płaskonabłonkowymi (ASC), podczas gdy ekspresja fosforylowanego 4EBP1 (oznaczająca aktywność mTOR) jest podobnie wyrażona zarówno w guzach AC, jak i ASC²⁶. Aby sprawdzić, czy szlaki te mogą być skutecznie ukierunkowane na wycinki tkanki, wycinki tkanki KL AC potraktowano DMSO lub miareczkowanymi ilościami związków, a mianowicie 0,1 – 1 μM daktolizibem w celu ukierunkowania na szlak mTOR lub 0,05–0,5 μM selumetynibu w celu ukierunkowania na szlak MAPK. Wyniki pokazują, że 1 μM daktolizibu lub 0,5 μM selumetynibu są skuteczne w hamowaniu fosforylacji odpowiednio 4EBP1 lub ERK1/2. Co więcej, zależne od dawki hamowanie docelowych fosfoprotein wskazuje, że wycinki tkanek mogą być również wykorzystywane do walidacji przeciwciał specyficznych dla fosforylacji.

Rycina 1: Schematyczne przedstawienie przepływu pracy w celu ustalenia i analizy eksplantatów plastrów pochodzących z mysiego NSCLC. (A) Schemat opisujący pobieranie i przygotowanie płuc zawierających guz do krojenia. Płaty płuc są pobierane od myszy, a tkanka nowotworowa jest wycinana z normalnej tkanki. grot strzałki i gwiazdka wskazują odpowiednio około 4 mm i 1 mm guzów. Biały grot strzałki wskazuje tkankę płucną przyklejoną do powierzchni uchwytu próbki. Czerwona strzałka wskazuje dodatkowy fragment normalnej tkanki podporowej płuc, aby utrzymać guz w pozycji pionowej. (B) Krojenie wibratomem i pobieranie wycinków tkanek. Biała strzałka wskazuje kierunek krojenia. Zbieranie kolejnych plastrów do 24-dołkowej płytki zawierającej zimny HBSS + P/S. Plastry mogą być hodowane w różnych punktach czasowych (tutaj 24–72 godziny) w celu oceny ekspresji markerów specyficznych dla guza podczas uprawy (górny rząd) lub mogą być wykorzystywane do przeprowadzania leczenia farmakologicznego. C: kontrola pojazdu, T: leczenie farmakologiczne (dolny rząd). (C) Umieszczenie wycinka tkanki do hodowli za pomocą obrotowych jednostek inkubacyjnych. Przechyl płytkę 6-dołkową tak, aby część podłoża pokryła górną część siatki, umieść plasterek tkanki na środku siatki na pożywce i rozprowadź plasterek za pomocą kleszczy. Upewnij się, że płytki 6-dołkowe są wyważone wagowo, aby zapewnić płynny cykl obrotowy. X: oznacza niepoprawność, a : wskazuje prawidłowe położenie wycinka. (D) Fotografia bloku FFPE wycinka guza. strzałka wskazuje na wycinek tkanki zatopionej w parafinie barwiony hematoksyliną. (E) schematy przedstawiające porządek podziału na przekroje warstw w blokach FFPE; Skrawki te można przetworzyć w celu oceny żywotności tkanek i ekspresji biomarkerów specyficznych dla nowotworu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Ocena żywotności i ekspresji markerów specyficznych dla histotypu oraz celowane leczenie farmakologiczne wycinków tkanki niedrobnokomórkowego raka płuca. (A) Reprezentatywne obrazy H&E plasterków niedrobnokomórkowego raka płuca AC o wskazanej grubości, hodowanych przez 24 godziny. Cienkie plastry o grubości 200 μm zachowują lepszą żywotność w porównaniu z cienkimi warstwami o grubości 160 μm lub 250 μm. Ciemnoniebieski reprezentuje barwioną żywotną tkankę H&E, a różowy oznacza pseudokolorowe obszary martwicze. Jasnoniebieski oznacza obszary wyłączone z analizy, albo ze względu na złą jakość tkanki, albo obecność zrębu włóknistego. T1 i T2 reprezentują biologiczne kontrpróby pochodzące z dwóch różnych nowotworów. Podziałka = 500 μm. (B) Reprezentatywne obrazy IHC ekspresji NKX2-1 w wycinkach AC hodowanych dla wskazanych punktów czasowych. Strzałka wskazuje obszar pokazany w większym powiększeniu. Wyniki pokazują, że ekspresja NKX2-1 nie ulega zmianie w hodowanych wycinkach w porównaniu z wycinkami 0-godzinnymi. Podziałka = 500 μm i 50 μm odpowiednio dla małych i dużych powiększeń. C) Kwantyfikacja danych przedstawionych w lit. B). (D) Reprezentatywne obrazy IHC fosforylowanej ekspresji 4EBP1 lub ERK1/2 w 0-godzinnych wycinkach lub w plasterkach poddanych działaniu DMSO lub miareczkowanych ilościach daktolizybu (dakt, górny rząd) lub fosforylowanej ekspresji ERK1/2 w wycinku 0 h lub plastrach poddanych działaniu DMSO lub selumetynibu (sel, dolny rząd). Czarne kwadratowe pola oznaczają obszary pokazane w większym powiększeniu. Podziałka = 1 mm lub 50 μm odpowiednio dla małego lub dużego powiększenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opracowano różne złożone modele nowotworów in vitro, w tym hodowle 3D i organoidy, w celu podsumowania architektury i funkcji onkogennych tkanki nowotworowej in vivo ^29,30. Jednak tworzenie kultur 3D lub organoidów wiąże się z dysocjacją tkanek i selektywnym wzrostem pojedynczego typu komórek lub kokulturą kilku wybranych typów komórek w sztucznym środowisku. W konsekwencji takie modele nie oddają w pełni zawiłości heterogeniczności guza i interakcji guz-zręb. Z drugiej strony organotypowe plastry guza utrzymują architekturę tkankową i złożoność biologiczną guza in situ, bez rozległych manipulacji. Ta zdolność wycinków tkanek do modelowania komórek nowotworowych w ich naturalnym mikrośrodowisku czyni je szczególnie atrakcyjnymi dla badań przedklinicznych. Wcześniej informowaliśmy o zoptymalizowanym przepływie pracy przy tworzeniu i analizie precyzyjnie ciętych plastrów guza i wykazaliśmy, że w porównaniu z podporami filtrów, obrotowa jednostka inkubacyjna poprawia żywotność krótkoterminowych mysich kultur plastrów NSCLC^25,31. Jednak uprawa na jednostkach rotacyjnych jest trudna technicznie i wymaga stałego monitorowania. Przedstawiamy tutaj protokół generowania wycinków tkanki nowotworowej i praktycznego wykorzystania rotacyjnej jednostki inkubacyjnej do ich hodowli, a także towarzyszące metody monitorowania zdolności wycinków do wychwytywania biologii guza in situ, co jest warunkiem wstępnym przed testowaniem odpowiedzi na lek.

Kilka krytycznych etapów protokołu zapewnia integralność tkanek i żywotność wycinków guza. Jeśli normalna tkanka płucna otacza guz, wibratomizm może generować plastry o niespójnej grubości lub uszkadzać plastry z powodu różnic w teksturze i sztywności między tkankami normalnymi i nowotworowymi. Dlatego ważne jest, aby usunąć otaczającą normalną tkankę płucną przed pokrojeniem guza. Kolejnym krytycznym krokiem jest grubość krojenia, która powinna być starannie zoptymalizowana dla każdego rodzaju tkanki. Ponadto, po pokrojeniu, bardzo ważne jest, aby plasterek był umieszczony mniej więcej na środku siatki, aby zapewnić dokładne przerywane zanurzanie w pożywce hodowlanej i ekspozycję na tlen. Wreszcie, ważne jest, aby śledzić położenie plasterka podczas jego okresu rotacji, ponieważ plasterek może spaść do podłoża; W takim przypadku można podjąć dalsze działania, jak wyjaśniono w kroku 3.6 protokołu.

Oprócz obchodzenia się z tkanką w celu zapewnienia integralności, w analizie IHC istnieją również krytyczne etapy, które mają na celu zinterpretowanie, w jaki sposób plasterek przypomina tkankę natywną. Nasze poprzednie badanie wykazało, że mysie guzy NSCLC wykazują wyraźną heterogeniczność przestrzenną wewnątrz guza w onkogennych działaniach sygnalizacyjnych²⁶. Oznacza to, że użycie przestrzennie odrębnych wycinków tkanek do próbek kontrolnych lub próbek poddanych działaniu leku może wpłynąć na wiarygodną interpretację danych eksperymentalnych, a zatem ściśle przylegające wycinki powinny być używane jako próbki kontrolne i testowe. Wykazaliśmy ponadto, że podczas gdy proliferacja lub onkogenna ekspresja fosfoproteiny w świeżo pokrojonych niehodowanych wycinkach 0 h była podobna do guzów in situ , hodowane plastry wykazywały zmienioną onkogenną ekspresję fosfoproteiny, specyficznie zmienione p4EBP1 i pSRC, a także zmienioną proliferację analizowaną przez Ki67 IHC. Zmieniona ekspresja p4EBP1 została podobnie wykryta w 24-godzinnych hodowlach ludzkich NSCLC i plastrów raka prostaty (Narhi i wsp., Rysunek uzupełniający S3B-S3C, S5 i S7)²⁶. Wyniki te potwierdzają, że porównanie wycinków hodowlanych z ich najbliższym wycinkiem niehodowanym 0 h ma kluczowe znaczenie dla oceny zachowania funkcji guza in situ w wycinkach hodowanych.

Pomimo poprawy żywotności plastrów organotypowych²⁵, system rotatorów ma ograniczenia pod względem technicznym. Umieszczanie wycinków tkanek na siatkach tytanowych jest trudniejsze w porównaniu z wkładami filtracyjnymi, a obrotowa jednostka inkubacyjna może nie być dostępna. Alternatywnie można zastosować stojące wsporniki filtrów, ale w takim przypadku należy analizować tylko stronę warstw wystawioną na działanie powietrza, ponieważ gradienty żywotności i niedotlenienia powietrza do filtra mierzone ekspresją HIF1α są szybko tworzone w kulturach warstwowych opartych na filtrze (Davies i wsp., Rysunek 5 i Rysunek 7A-7B)²⁵. Ponadto wykazaliśmy, że kultury warstw guza mogą wykazywać zmienioną proliferację i aktywność sygnalizacji onkogennej w porównaniu z ich rodzimymi nowotworami²⁶, prawdopodobnie z powodu reakcji gojenia się ran lub adaptacji metabolicznej plastrów do hodowli ex vivo ³². Chociaż ogólne cechy morfologiczne mysich guzów NSCLC utrzymywały się podczas 72 godzin hodowli, zmiany proliferacyjne wywołane kulturą mogą wpływać na dokładną klasyfikację uprawianych plastrów. W związku z tym plastry tkanek powinny być wykorzystywane tylko do krótkoterminowych badań funkcjonalnych.

Zastosowanie rotacyjnej jednostki inkubacyjnej przynajmniej częściowo ratuje żywotność wewnątrz plastra lub gradienty ekspresji biomarkerów, szczególnie w ciągu pierwszych 24 godzin hodowli. Po walidacji pod kątem integralności i funkcjonalności dostarcza materiał tkankowy do badań funkcjonalnych, takich jak badania nad leczeniem farmakologicznym. Oprócz profilowania odpowiedzi na lek, zmieniona ekspresja docelowa po leczeniu farmakologicznym może również korzystnie wpłynąć na walidację przeciwciał. Jest to szczególnie istotne w przypadku wykrywania mysich epitopów z mysimi przeciwciałami monoklonalnymi, ponieważ mają one tendencję do dawania silnie barwiącego tła. Ponadto dobrze zwalidowane przeciwciała są niezbędne do uzyskania wiarygodnych i odtwarzalnych danych w warunkach diagnostycznych i klinicznych. Tak więc modulacja obfitości lub fosforylacji odpowiednich epitopów po leczeniu farmakologicznym w wycinkach tkanek zapewnia przydatne praktyczne zastosowanie w walidacji przeciwciał. Główną zaletą kultur warstw guza jest możliwość modelowania funkcji rozmieszczonych przestrzennie, w tym onkogennych działań sygnalizacyjnych lub odpowiedzi na leki w komórkach nowotworowych lub zrębowych, co czyni je atrakcyjnym modelem ex vivo . Jednak plastry obracają się podczas uprawy, a proces uprawy może jeszcze bardziej uszkodzić tkankę, szczególnie na krawędziach. W związku z tym trudno jest precyzyjnie nałożyć na siebie wybarwione biomarkerami obrazy IHC wycinków 0 h z nekrotycznymi regionami wykrytymi w hodowanych wycinkach, co utrudnia precyzyjne powiązanie aktywności biomarkerów przestrzennych z reakcją na lek. Ponadto reakcje martwicze wywołane przez nowotwór, indukowane hodowlą i lekiem są nie do odróżnienia przynajmniej w mysich wycinkach tkanek NDRP, co utrudnia dokładną ocenę ilościową przestrzennych odpowiedzi na leki. Wreszcie, zastosowanie kultur plastrów guza pozwala badaczowi na testowanie wielu związków na tym samym guzie, bez konieczności leczenia zwierząt, udoskonalając, redukując i zastępując w ten sposób eksperymenty na zwierzętach laboratoryjnych.

Jako przyszłe zastosowanie, opisany protokół może zostać zaadaptowany do klinicznych próbek guzów litych. Prawdopodobnie konieczne będą dalsze modyfikacje lub optymalizacje w zależności od typu tkanki, począwszy od dostosowania ustawień wibratomu, w tym grubości plastra i prędkości wibracji, aby zoptymalizować je pod kątem tekstury lub sztywności guza. Ponadto zapotrzebowanie na składniki odżywcze i czynniki wzrostu może się różnić w zależności od tkanki nowotworowej. Na przykład plastry raka piersi zostały wyhodowane z insuliną uzupełnioną w pożywce^13,18. Biorąc pod uwagę, że podczas operacji lub biopsji uzyskuje się ograniczoną ilość materiału tkankowego, optymalizacja kultur plastrów guza pochodzących od pacjenta może być trudna ze względu na trudności w uzyskaniu wystarczającej liczby powtórzonych próbek. Co więcej, powtarzalność danych jest również kwestionowana przez wyraźną niejednorodność próbek między pacjentami, szczególnie w odniesieniu do odsetka komórek nowotworowych w porównaniu z regionami zwłóknieniowymi lub naciekami zrębu, a także martwiczymi składnikami tkanki. Wreszcie, zastosowanie plastrów guza w warunkach diagnostycznych wymagałoby zbadania, w jakim stopniu odpowiedzi na lek w eksplantatach plastrów biopsji przed leczeniem odpowiadają odpowiedziom in vivo po leczeniu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hank' s Zrównoważony roztwór soli (HBSS)	Sigma	H6648
Penicylina Roztwór streptomycyny	Thermo Fischer Scientific	15140-122
Ham's F-12 medium	Thermo Fischer Scientific	21765-037
Glukoza	VWR	101174Y
FBS	Thermo Fischer Scientific	10270-106
Glutamina 200mM	Thermo Fischer Scientific	25030-024
Klej cyjanoakrylowy (GLUture)	Abbott	32046-90-1
Leica VT1200 S Wibrujące ostrze mikrotome	Leica Biosystems	14048142066
Nóż do krojenia	VWR	PERS60-0138
Siatki tytanowe	Albamma Research and Development	MA0036
Inkubacja plastrów jednostka	Albamma Research and Development	MD2500
10 cm płytka do hodowli	tkankowych Sarstedt	83.1802
płytka 24-dołkowa	Sarstedt	83.1836
płytka 6-dołkowa	Sarstedt	83.1839
Igły podskórne Neolus	Terumo Neolus	NN2525R
50 ml probówka sokoła	Greiner
PBS	Lonza	BE17-517Q
Formaldehyd	Fisher	F/1501/PB08
Trójdzielny papier kasetowy histo	Diagnostyka nowotworów	DX26280
Kasety Histo	VWR	720-2199
KOS Mikrofalowy wielofunkcyjny procesor tkanek	Milestone SRL	CAT307EN-003
Microtome	Thermo Fischer Scientific	HM355S Prowadnice
Superfrost Ultra plus	VWR	631-0099
BSA	Sigma	A2153
NGS	Thermo Fischer Scientific	16210-064
Kwas cytrynowy	Sigma	C1909
PT-Module	Thermo Fischer Scientific	A80400012
Hematoksylina dla H& Barwienie E	Merck	1.09249.0500
Hematoksylina do barwienia przeciwdziałającego	Dako	S3309
Eosin	Sigma	E4382
NKX2-1 przeciwciało	Abcam	ab133638	Numer serii: GR98031-12
pERK 1/2	przeciwciało Technologie sygnalizacji komórkowej	CST 4370	Numer partii: 17
p4EBP1	przeciwciało Sygnalizacja komórkowa Technologie	CST 2855	Numer serii: 20
BrightVision poly-HRP Kozie przeciwciało wtórne przeciwko królikowi	ImmunoLogic	VWRKDPVR-110HRP
Montaż medicum pertex	VWR	MEDT41-4021-00
DAB	ImmunoLogic	VWRKBSO4-110
Dactolisib (NVP BEZ-235)	Selleckchem	S1009
Selumetinib (AZD2644)	Selleckchem	S1008
Pannoramic 250	3DHISTECH
MATLAB	MathWorks		https://se.mathworks.com/ products/matlab.html
3DHISTECH PANNORAMIC VIEWER	3DHISTECH		https://www.3dhistech.com/pannoramic_viewer
Adobe Photoshop CS6	Adobe		https://www.adobe.com/products/photoshop.html?sdid=KKQIN&mv=search&s_kwcid=AL!3085!3!247821564908!e!!g!!adobe%20photoshop&ef_id=U8T1GwAABVTK3gDR:20180712103259:s
Fiji-ImageJ	ImageJ		https://imagej.net/Fiji
CellProfiler	Oprogramowanie do analizy obrazu komórkowego CellProfiler	http://cellprofiler.org/