Artykuł metodologiczny

Nieinwazyjny test przeprowadzany w kojcu dla świń trzymanych w laboratorium

10.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58597

⸱

5 czerwca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Animal Sciences and Industry, Kansas State University, 2DynaSim Technical Services, INC, 3Center for Injury Biomechanics, Virginia Polytechnic Institute and State University, 4Applied Research Associates, Inc., 5Lucent Research, LLC, 6Department of Neurological Surgery, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje nowy test behawioralny - test podejścia człowieka w kojcu domowym świń - do wykrywania deficytów funkcjonalnych u świń laboratoryjnych po podwstrząsowym urazowym uszkodzeniu mózgu.

Streszczenie

Częstość występowania urazowego uszkodzenia mózgu (TBI) wzrosła zarówno w populacjach cywilnych, jak i wojskowych, a wielu badaczy przyjmuje model TBI u świń. W przeciwieństwie do modeli gryzoni dla TBI, istnieje niewiele testów behawioralnych, które zostały ustandaryzowane. Większe zwierzę wymaga bardziej inwazyjnego obchodzenia się z nim na obszarach testowych niż gryzonie, co potencjalnie zwiększa stres i zmienność reakcji zwierząt. W tym miejscu opisano test podejścia do człowieka (HAT), który został opracowany do wykonywania przed domowym kojcem świń laboratoryjnych. Jest nieinwazyjny, ale na tyle elastyczny, że pozwala na różnice w ustawieniach obudowy.

Podczas HAT opracowano trzy etogramy behawioralne, a następnie zastosowano formułę do stworzenia indeksu podejścia (AI). Wyniki wskazują, że HAT i jego indeks, AI, są wystarczająco czułe, aby wykryć łagodne i tymczasowe zmiany w zachowaniu świń po łagodnym TBI (mTBI). Ponadto, chociaż konkretne wyniki zachowań są zależne od warunków mieszkaniowych, zastosowanie sztucznej inteligencji zmniejsza zmienność i pozwala na spójne pomiary w różnych laboratoriach. Ten test jest wiarygodny i ważny; HAT może być stosowany w wielu laboratoriach i do różnych rodzajów świńskich modeli urazów, chorób i dystresu. Test ten został opracowany z myślą o zoptymalizowanej metodzie ręcznego oznaczania czasem, tak aby obserwator konsekwentnie spędzał nie więcej niż 9 minut na każdej próbce.

Wprowadzenie

Ludzkie mTBI jest często definiowane przez deficyty funkcjonalne, pomimo braku globalnych zmian strukturalnych lub znaczącego obrzęku w mózgu1,2,3. Rzeczywiście, u niektórych pacjentów z mTBI cechą charakterystyczną tego urazu jest zmiana ich stanu psychicznego przy braku jakichkolwiek zmian neuroanatomicznych4,5. Wykorzystaliśmy model świni o nazwie mTBI6, ponieważ mózgi świń są zarówno anatomicznie, jak i fizjologicznie bliższe ludziom niż gryzonie7, a odpowiednie pomiary mogą dostarczyć odpowiedniego zestawu wspólnych elementów danych z ludźmi.

W ostatnich latach model świński zyskał zainteresowanie naukowców zajmujących się neurotraumatologią i interesariuszy mTBI w badaniach przedklinicznych; jednakże, w przeciwieństwie do modeli TBI u gryzoni, opublikowano tylko kilka standardowych testów behawioralnych, które pozwalają ocenić stan afektywny świni laboratoryjnej (tj. stan psychiczny)7,8,9,10. Długoterminowym celem naszego laboratorium jest opracowanie kilku uzupełniających się zestawów narzędzi behawioralnych, które są wystarczająco czułe, aby zmierzyć, kiedy świnie doświadczają choroby subklinicznej lub kiedy zwierzęta znajdują się w stanie przedpatologicznym związanym ze stresem.

Powtarzające się testy behawioralne, które mierzą zmianę stanu afektywnego u świni laboratoryjnej, mogą być dobrymi kandydatami do odróżnienia zwierzęcia ze stanem prepatologicznym od zdrowych zwierząt. Na przykład w komercyjnej produkcji trzody chlewnej używano nakryć głowy w kojcu, aby pomóc rolnikom w wyborze zdrowych świń o dobrym temperamencie lub zmodyfikować strategie zarządzania i trzymania, które powodowały stres, urazy i choroby11,12. Testy te wykorzystano do ilościowego określenia motywacji i ogólnego stanu afektywnego jednej świni lub grupy świń13.

Nasze laboratorium i inni badacze zmierzyli motywację u świń, kwantyfikując trzy kategorie zachowań: 1) stany eksploracyjne, które są wyrażane przez nieodżywcze zachowania oralne (NNOB), gdzie świnia używa pyska, pyska lub twarzy do wąchania, lizania, żucia i ukorzeniania substratu, lub gryzie bez substratu14,15; 2) relacje przestrzenne świni z obiektem lub istotą16; 3) kierunek nosa, który jest używany zamiast kontaktu wzrokowego, ponieważ świnie mają jednooczny17, ale krótkowzroczność i przedkładają swój zmysł węchu nad wzrok18. Jeśli zdrowa świnia kojarzy ludzi z bodźcami nagradzającymi, wyraża wysoką częstotliwość NNOB, kieruje nos w stronę człowieka i stara się zbliżyć do człowieka11,16. Jednak po chorobie, urazie lub przygnębiającym doświadczeniu motywacja do poszukiwania nawet przyjemnych bodźców jest zmniejszona, a zatem te mierzalne zachowania są prawdopodobnie zmniejszone19. Badacze zachowania świń zauważyli, że anhedonia, brak motywacji do doświadczania przyjemnych bodźców, jest rozpoznawalna i mierzalna u świń w ich środowisku domowym20. W związku z tym powtarzające się HAT (przed i po leczeniu) mogą służyć jako czuła miara do odróżnienia świń laboratoryjnych leczonych podwstrząsowym mTBI od osób leczonych pozorem (tylko w znieczuleniu). Anhedonia jest jednym ze stanów afektywnych, których mogą doświadczać pacjenci z TBI21. Zastosowany tutaj HAT może pomóc w usprawnieniu przekładania wyników behawioralnych z modelu zwierzęcego na pracę kliniczną. HAT mogą być podawane codziennie w trakcie eksperymentu, co może również pomóc w standaryzacji opieki nad świniami laboratoryjnymi w celu optymalizacji dobrostanu i hodowli zwierząt22.

Tutaj, za pomocą HAT, badane są różnice behawioralne wynikające z mTBI u mini-świń. Zminimalizowanie zmienności behawioralnej osiągnięto dzięki zastosowaniu nieinwazyjnych środków HAT i umożliwieniu świniom aklimatyzacji w domowych kojcach, rutynowemu leczeniu i codziennej uczciwi Tradycyjnie, arena testowa jest używana do pomiaru zachowań (np. test na otwartym polu). Test w piórze może być pomocny w laboratoriach, które mają ograniczoną przestrzeń. Przemieszczanie i obchodzenie się ze świniami na arenie testowej może powodować reakcję stresową (dystres lub eustres) i potencjalnie zwiększać zmienność reakcji na test. Test w piórze usuwa ten komponent obsługi, a zatem prawdopodobnie zmniejsza odchylenia od handling-stress17. Z tych powodów, o których mowa powyżej, opracowaliśmy codzienną czapkę w piórze dla tego modelu mTBI.

Standaryzowane i ilościowe miary, które odpowiednio definiują stan afektywny zwierzęcia, są ważnymi aspektami w opracowywaniu nowego testu behawioralnego. Ponadto testy powinny być powtarzalne w wielu laboratoriach. Tutaj, w celu opracowania tego protokołu, HAT został przetestowany w trzech różnych systemach obudów. Stworzono trzy subetogramy, aby oznaczyć czasem określone zachowania z przykładowych filmów. Następnie stworzono ważoną formułę, która obejmowała trzy etogramy i umożliwiała stosowanie HAT w wielu laboratoriach. Chociaż test ten został opracowany i stosowany specjalnie dla świń miniaturowych leczonych mTBI podwstrząsowym, opracowane tutaj metody i protokół będą miały zastosowanie do rozróżnienia między świnią subklinicznie ranną/chorą lub zestresowaną a zdrową świnią.

Na wyniki zachowania może mieć wpływ mieszkanie pojedyncze czy grupowe, limit wolnej przestrzeni, rodzaj używanej podłogi, rodzaj użytego ogrodzenia, lokalizacja karmienia i wody, obszar defekacji i lokalizacja wzbogacenia środowiska. W związku z tym zbadano trzy typy mieszkań (ryc. 1): typ obudowy A znajdował się na Uniwersytecie Stanowym Kansas (Manhattan, KS); obudowy typu B i C znajdowały się na Virginia Tech University (Arlington, Wirginia). Indywidualny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania (IACUC) w każdej lokalizacji zatwierdził korzystanie z obiektów i procedur.

Za opracowanie etogramu pomieszczeń typu A (Rysunek 1A), mini-świnie krzyżówkowe z Minnesoty (dziki = 7, loszki = 1; Narodowe Centrum Badań nad Trzodą Chlewną, Columbia, MO; wiek = 25,6 ± 3,66 [średnia ± tygodni odchylenia standardowego (SD)]) trzymano w pomieszczeniach w pojedynczych kojcach z podłogą przyjazną dla zwierząt (IACUC #3881). Świnie użyte do tego protokołu były w dobrym zdrowiu, nie miały zastosowanych zabiegów. W celu opracowania protokołu trzymania typu B, mini-świnie z Jukatanu (wiek = 25,3 ± 2,80 tygodnia [średnia ± SD] były trzymane pojedynczo (Rysunek 1B) w obiektach Virginia Tech (IACUC #15-060). Leczenie zwierząt jest opisane gdzie indziej29 i obejmowało indukcję podwstrząsowego mTBI za pomocą nadciśnienia fali uderzeniowej lub pozorowanych kontroli (tylko znieczulenie). W celu opracowania protokołu trzymania typu C, pięć samic mini-świń z Getyngi (wiek = 23,7 ± 1,18 tygodnia [średnia ±SD]) umieszczono w parach w Virginia Tech w dużym kojcu (ryc. 1C; IACUC #15-060). Pierwsze dwa środowiska inwentarskie są typowymi pomieszczeniami laboratoryjnymi lub zawierają świnie trzymane w jednym pomieszczeniu. Pomieszczenia typu C to nietypowe warunki utrzymania, w których mogą przebywać dwie lub więcej świń i mogą być uważane za bardziej wzbogacone środowisko niż standardowe pomieszczenia laboratoryjne. Protokół ten może być używany w różnych typach obudów, jeśli przestrzegane są następujące metody.

Protokół

Indywidualne IACUC w każdej lokalizacji (Kansas State University i Virginia Tech University) zatwierdziły korzystanie z udogodnień i procedur.

1. Ustawienie kamer i długopisów oraz ustanowienie rutyny

  1. Przed umieszczeniem zwierząt w ich zagrodach należy ustawić kamery pod kątem 90° nad każdym kojcem (patrz Tabela materiałów, aby zapoznać się z sugerowanym systemem kamer).
  2. Nagrywaj zwierzęta w sposób ciągły z prędkością 30 klatek/s (kl./s), przez cały czas trwania badania lub tylko podczas sesji testowych.
  3. Przymocuj miski, poidełka, maty i zabawki za pomocą i łańcuchów.
  4. Umieść urządzenia nagłaśniające, które w sposób ciągły odtwarzają biały lub różowy szum (np. dźwięk wodospadów) w pomieszczeniu dla świń.
    nuta: Nagłe dźwięki zewnętrzne (np. otwieranie i zamykanie drzwi) mogą powodować odruch zaskoczenia podczas sesji23,24.
  5. Randomizuj lub stratyfikuj zabiegi według wstrzykiwacza w całej placówce.
  6. Ustal ustaloną rutynę hodowli zwierząt. Pomoże to świniom wiedzieć, kiedy mogą spodziewać się, że ludzie będą czyścić kojce, karmić je i obchodzić się z nimi oraz przeprowadzać test.
    1. Użyj znajomego smakołyku, aby świnie mogły skojarzyć ludzi z nagrodą.
    2. Użyj klikera podczas nagrody, aby świnie mogły skojarzyć dźwięk kliknięcia z nagrodą. Nie używaj wokalizacji i sygnałów wizualnych, aby zapoznać świnie z nagrodą (patrz Tabela Materiałów).
  7. Sesje należy przeprowadzić przed porannym posiłkiem lub przed umieszczeniem nowej paszy dla świń karmionych ad libitum.

2. Identyfikacja świń

  1. Spraw, aby obiekty były rozpoznawalne w strumieniu wideo, nawet jeśli są w jednym pomieszczeniu.
  2. Upewnij się, że obserwatorzy pozostają ślepi na zabiegi i bezstronni podczas oznaczania czasu za pomocą systemu oznaczania, który nie jest związany z zabiegami. Użyj taśmy klasy medycznej (patrz Tabela materiałów), która jest przyklejona do paska taśmy klejącej o określonym kolorze, okrągłym kształcie i wzorze.
  3. Użyj jednego okrągłego łata, aby zaznaczyć górną część świni i po jednym z każdej strony (patrz Rysunek 1, zielone i niebieskie znaczniki).
  4. Rozsmaruj cement (mniej niż 0,35 g) na rogach taśmy, aby zwiększyć trwałość przylegania.
    nuta: Zbyt dużo cementu do etykiet nie wyschnie bardzo szybko, co spowoduje przedwczesne odpadnięcie taśmy.
  5. Rozwiąż problemy i dostosuj strategię znakowania w okresie aklimatyzacji, aby oficjalne testy były przeprowadzane sprawnie i bez dodatkowego stresu dla świń.
  6. Korzystaj z arkuszy gromadzenia danych, aby śledzić oznaczenia i identyfikację obiektu (przykładowy arkusz danych znajduje się w pliku uzupełniającym 1).
    nuta: Aby usunąć taśmę, nie zrywaj taśmy, ponieważ wyrwanie włosów spowoduje ból. Może albo sam się złuszczać, lubrykant na bazie wody może pomóc go usunąć, albo można go zgolić maszynką do strzyżenia. Jeśli taśma odpadnie w niepożądanym momencie, przygotuj dodatkową taśmę do znakowania i przyklej ją ponownie, gdy świnia je posiłek, zamiast krępować świnię.

3. Sesje HAT

  1. Niech testowani ludzie noszą te same czapki, kombinezony, buty, zapachy itp. za każdym razem, gdy przeprowadzana jest sesja.
  2. Sesje należy przeprowadzać codziennie, co najmniej 3 razy, przed zabiegiem, a następnie codziennie po zabiegu.
  3. Świnia może znajdować się w dowolnym miejscu w swoim kojcu przed rozpoczęciem sesji. Aby rozpocząć sesję, poproś testowego człowieka, aby upuścił smakołyk do miski lub przed długopisem i kliknął kliker 3 razy.
  4. Badany człowiek musi umieścić ręce poza zasięgiem wzroku świni i stać nieruchomo podczas testu. Poproś innego badacza, aby zaznaczył początek sesji w arkuszu danych i uruchomił licznik czasu. Po 120 sekundach badacz cicho sygnalizuje testowanemu człowiekowi, aby przeszedł do następnego obiektu i wznowił test.

4. Ustanowienie etogramów HAT dla oprogramowania

  1. Konstruowanie etogramów (patrz rysunki 1 i 2 oraz film uzupełniający 1) w ramach jednego projektu przy użyciu specjalistycznego oprogramowania.
    UWAGA: Zachowania przestrzenne to położenie zwierzęcia względem człowieka. W etogramach relacje przestrzenne muszą być dostosowane do zagrody zwierzęcia i publikowane za każdym razem, gdy używany jest nowy zestaw kojca (Rysunek 1). W tej kategorii zachowania są uważane za wzajemnie się wykluczające. Przestrzeń podzielona jest na cztery obszary, o różnych poziomach podejścia (Rysunek 1). Obszary są ustandaryzowane we wszystkich typach mieszkań. Najbliżej lub wspinać się (Cl) oznacza, że świnie mogą wspinać się na ogrodzenie, aby uzyskać dostęp do człowieka; Dlatego wspinaczka jest uważana za zachowanie przestrzenne, które wskazuje, że świnia najaktywniej szuka kontaktu z człowiekiem. Close (Co) oznacza obszar w promieniu 61 cm od człowieka. Środek (M) to obszar w promieniu 61-122 cm od człowieka. Daleko (F) to obszar 123 cm lub więcej od człowieka.
  2. Zachowania strukturalne koncentrują się na orientacji całego ciała lub części ciała (Rysunek 2). Utwórz dwie kategorie strukturalne: 1) pozycja świni w nosie i 2) stan aktywny świni. Użyj Rysunek 2A, aby określić kierunkowość (kierunek 1 oznacza, że świnia kieruje nos w stronę człowieka; kierunek 2 oznacza, że świnia kieruje nos od człowieka).
  3. Podziel zachowania związane z aktywnością (Rysunek 2B) na trzy wzajemnie wykluczające się stany podejścia: NNOB, stanie lub chodzenie bez NNOB i odpoczynek bez NNOB (patrz kodowanie kolorami w etogramach na filmie).
    nuta: NNOB jest używany do opisania, kiedy świnia używa pyska, pyska lub twarzy do lizania, wąchania, żucia, gryzienia, pocierania lub ukorzeniania nieodżywczego obiektu w poszukiwaniu znajomości lub nowych możliwości. Dlatego, gdy znajduje się w tym stanie aktywnym, interesuje go człowiek i stan zbliżenia. Jeśli kamery górne są używane pod kątem 90°, pozycja nosa świni i ruch głowy są wskaźnikami NNOB. Od czasu do czasu świnie gryzą lub pozorują żucie; Nos jest widoczny, ale głowa porusza się w górę i w dół. Stanie lub chodzenie bez NNOB jest używane do opisu, gdy świnia jest w pozycji pionowej, głowa jest nieruchoma, a nos nie dotyka podłoża ani nie gryzie, co oznacza, że jest w mniejszym stanie podejścia. Odpoczynek bez NNOB jest używany do opisania, gdy świnia odpoczywa leżąc lub siedząc, co jest najmniej zbliżonym stanem w tej kategorii zachowań.

5. Znacznik czasu filmów dla wydajności i niezawodności

  1. Na podstawie czasów rozpoczęcia zarejestrowanych przez moduł zbierający dane edytuj materiał filmowy w dokładne, 3-minutowe sesje. Metoda oznaczania czasem zajmie 9 minut na sesję.
  2. Używaj tylko maksymalnie dwóch przeszkolonych obserwatorów do oznaczania filmów znacznikiem czasu.
    UWAGA: Jeśli używa się dwóch obserwatorów, zmienność wewnątrz obserwatora powinna zostać określona ilościowo, oceniona, dostosowana, a następnie przedstawiona jako współczynnik korelacji Pearsona po tym, jak obserwatorzy oznaczyli znacznikiem czasu ten sam przykładowy film (aby zapoznać się z metodami, zobacz Martin and Bateson25).
  3. Ustaw prędkość odtwarzania na 1x normalną prędkość (tj. 30 kl./s). Nie zatrzymuj się, nie przewijaj do tyłu ani nie oznaczaj czasem klatka po klatce.
  4. Oznacz czasowo każdą kategorię wzajemnie wykluczających się zachowań osobno.
    1. Oznaczanie przestrzennych zachowań znacznika czasu. Uruchom ponownie wideo.
    2. Zachowania strukturalne znacznika czasu. Uruchom ponownie wideo.
    3. Sygnatura czasowa dla zachowań konstrukcyjnych/pozycji nosa.
  5. Użyj czasu trwania każdego wyniku zachowania (patrz Dodatkowe filmy 2 i 3), aby podsumować dane. Pomiary czasu trwania muszą być przeliczone na procent czasu dla każdej kategorii.

6. Indeks podejścia

  1. Zastosuj formułę (Rysunek 3), aby każde zachowanie strukturalne i przestrzenne zostało połączone w celu utworzenia sztucznej inteligencji (Rysunek 3, Rysunek 4). Sztuczna inteligencja jest używana oprócz raportowania zachowań i kategorii osobno jako rysunki (Rysunek 5) lub w formie tabelarycznej.
    nuta: Szczegółowe informacje na temat oprogramowania można znaleźć w tabeli materiałów. W ramach każdej kategorii czas trwania zachowania jest najpierw przeliczany na wartości procentowe (czas trwania zachowań podzielony przez całkowity czas trwania sesji testowej). Każde zachowanie jest ważone w oparciu o poziom podejścia (Rysunek 3). Zachowania unikające (procent czasu spędzonego w dalekiej okolicy, odpoczywania, z odwróconym nosem) są mnożone przez 0. Zachowania związane z umiarkowanym podejściem (procent czasu spędzonego w środkowym obszarze, odwróconego w stronę człowieka i stojącego z nieruchomą głową) są mnożone przez 1. Największy poziom zachowań związanych z podejściem (procent czasu w bliskim i najbliższym obszarze oraz pokazujący NNOB) jest mnożony przez 2. Następnie każda kategoria jest dodatkowo ważona 3, 2 i 1 odpowiednio dla przestrzeni, orientacji nosa i aktywności. Stała (0,10) jest stosowana w celu utworzenia skali procentowej. Na przykład, jeśli świnia jest zwrócona twarzą do człowieka, znajduje się w bliskim/najbliższym obszarze i wykonuje NNOB podczas całej sesji testowej, zauważ, że sztuczna inteligencja jest w 100% (czerwona świnia w Rysunek 3). Z drugiej strony, jeśli świnia znajduje się w odległym obszarze, nie jest zwrócona twarzą do człowieka i pozostaje w pozycji spoczynkowej przez całą sesję testową, sztuczna inteligencja wynosi 0% (świnia w Rysunek 3). Świnie w bliskiej strefie mogą mieć taką samą sztuczną inteligencję jak świnia wykonująca NNOB w środkowej części, jeśli są odwrócone od człowieka i stoją z głową nieruchomo (pomarańczowe świnie w Rysunek 3).

Wyniki

Zastosowano trzy typy hodowli (A, B i C; zobacz Rysunek 1) w trzech różnych laboratoriach do testów HAT. Kategorie zachowania strukturalnego oraz orientacja głowy i ciała były wykorzystywane w testach HAT we wszystkich laboratoriach i eksperymentach, jak pokazano na Rysunku 2. Tabela 1 przedstawia dane zebrane z wszystkich trzech typów hodowli oraz statystyki opisowe wykonane na podstawie danych uzyskanych od zdrowych świń przed leczeniem podczas testu HAT. Następnie opracowano formułę do obliczania wskaźnika AI na podstawie danych uzyskanych podczas testów HAT (zobacz Rysunek 3). Wyniki wskazują, że zastosowanie wskaźnika AI zmniejszyło zmienność (Tabela 1) zebranych danych. Jest to istotne odkrycie, ponieważ dane o mniejszej zmienności pozwolą na użycie mniejszej liczby zwierząt doświadczalnych w celu wykrycia mniejszych różnic.

Dla Tabeli 1 statystyki opisowe uzyskano za pomocą procedury PROC UNIVARIATE (zobacz Tabelę materiałów w celu uzyskania szczegółowych informacji o oprogramowaniu). W celu porównania wyników zachowania związanych z typem pomieszczenia w każdej z laboratoriów zastosowano procedurę MIXED z modelem pomiarów powtarzalnych. Świnię potraktowano jako zmienną losową. Jako strukturę kowariancji wybrano typ autoregresyjny pierwszego rzędu. Średnie najmniejszych kwadratów oddzielono za pomocą metody korekty Tukeya-Kramera. Istotność określono jako P ≤ 0,05.

Następnie określono, czy w każdej sesji testowej HAT powinna uczestniczyć ta sama osoba, czy też różni eksperymentatorzy. W celu porównania reakcji na nieznajomego z reakcjami na znajomego człowieka zastosowano procedurę MIXED z modelem pomiarów powtarzalnych. Świnię potraktowano jako zmienną losową. Jako strukturę kowariancji wybrano typ autoregresyjny pierwszego rzędu. Średnie najmniejszych kwadratów porównywano za pomocą metody korekty Tukeya-Kramera. Istotność określono jako P ≤ 0,05. Stwierdzono, że nie ma różnicy w AI, gdy podczas testów uczestniczy znajomy człowiek w porównaniu z nieznajomym (zobacz dane w Tabeli 2). Jeśli świnie nigdy nie miały negatywnych doświadczeń z ludźmi, zazwyczaj uogólniają i kojarzą wszystkich ludzi pozytywnie z jedzeniem26.

Okres aklimatyzacji dla protokołu HAT został określony na podstawie indeksów podejścia u świń z typu hodowli A (336 sesji testowych). HAT został rozpoczęty w 8. dniu po przybyciu i przeprowadzony dwukrotnie przez osobę znaną (która przez poprzedni tydzień zajmowała się świniakami) oraz przez osobę nieznaną (która nie miała wcześniej żadnego kontaktu ze świniakami). Aby określić wpływ czasu na wyniki HAT, zastosowano procedurę MIXED z modelem pomiarów powtarzalnych. Świnię traktowano jako zmienną losową. Jako strukturę kowariancji wybrano typ autoregresyjny pierwszego rzędu. Średnie najmniejszych kwadratów zostały rozdzielone przy użyciu metody korekty Tukeya-Kramera. Istotność określono jako P ≤ 0,05. Jak wspomniano powyżej, dane nie wykazały różnicy między reakcjami na ekspozycję ze strony osoby znanej lub nieznanej (Tabela 2). Okres aklimatyzacji został jednak ustalony na podstawie dni 9, 11 i 13, w których zaobserwowano istotnie niższe wartości AI niż w pozostałych dniach. Wartości podstawowe powinny obejmować co najmniej trzy pomiary po aklimatyzacji, zalecamy jednak sześć sesji w celu obliczenia średniej AI jako kowariacji w modelach.

Aby określić, czy metody HAT mogą odróżnić świnki poddane lekkim urazom mózgu (mTBI) od zwierząt z grupy kontrolnej (sham), zebrano dane HAT od 12 świnek jeden dzień przed (-1) oraz trzy dni po zabiegu, do którego zastosowano jedynie znieczulenie29 (sham) lub znieczulenie oraz ekspozycję na falę uderzeniową za pomocą rury falowej29 o szczytowym ciśnieniu 47,4 ± 13,6 SD trwającym 4,7 ± 0,9 ms SD (blast). Dane analizowano za pomocą analizy wariancji z ograniczoną wiarygodnością (restricted likelihood ANOVA) przy użyciu procedury modelu mieszanego w programie statystycznym. Analiza ta określiła różnice między zabiegiem, czasem oraz ich interakcjami. Podano maksymalny błąd standardowy średniej (SEM) z modelu, a wartość P < 0,05 uznano za istotną statystycznie. Indeks aktywności (AI) obejmuje wszystkie zachowania (Rysunek 3). W dniach 1 i 2 po zabiegu pomiar AI umożliwiał odróżnienie świnek z mTBI od świnek z grupy kontrolnej (P < 0,05; Rysunek 4). Zachowania mogą być analizowane i prezentowane w ramach wzajemnie wykluczających się kategorii (Rysunek 5). Pomiar zachowania bliskiego kontaktu przestrzennego pozwalał odróżnić świnki z ekspozycją na falę uderzeniową od grupy kontrolnej w dniach 1 i 2 po zabiegu (P < 0,05; Rysunek 5A). Podobnie pomiary kierunku nosa, czasu odpoczynku oraz NNOB pozwalały odróżnić świnki z grupy kontrolnej od tych poddanych ekspozycji na falę uderzeniową w dniach 1 i 2 po zabiegu (Rysunek 5B i 5C).

Schemat układu eksperymentu z zachowaniami zwierząt pokazujący rozmieszczenie zabawek i misek w różnych strefach.
Rycina 1: Przestrzenna kategoria zachowań trzech różnych typów pomieszczeń laboratoryjnych. Etogram został ustalony w odniesieniu do człowieka (ślady stóp) oraz rozmiaru świni w stosunku do ilości wolnej przestrzeni. Najwyższy poziom zbliżenia w tej kategorii zachowań występuje, gdy świnia próbuje wspiąć się na panel najbliżej człowieka (Cl; closest lub climb). Wykwalifikowany obserwator zaznacza czasowe punkty „blisko” (Co; 0–61 cm od człowieka), „środkowo” (M; 61–122 cm od człowieka) oraz „daleko” (F; 123+ cm od człowieka), gdy uszy świni lub większa jej część znajdują się w tych strefach przestrzennych. W każdej klatce laboratoryjnej umieszczono jedną lub dwie miski do dwukrotnego dziennego karmienia, napojarkę (W) oraz zabawkę. (A) Każdą 50-kilogramową knurę trzymano osobno w klatkach o wymiarach 190 cm × 114 cm z podłogą kratownicową. (B) Każdą 50-kilogramową knurę trzymano na czarnej macie z podłogą kratownicową i odpływem z tyłu klatki. (C) Knury o masie około 10 kg trzymano parami w klatkach o wymiarach 274 × 366 cm, z podłogą betonową, matą, odpływem oraz stałymi miskami i zabawkami. Paski kolorowe (np. zielone i niebieskie) przedstawiają strategię znakowania. Wszystkie świnki na rysunku są oznaczone zielonymi lub niebieskimi plamami jako przykład znakowania i identyfikacji świń na nagraniach wideo. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Diagram zachowań, analiza ruchu zwierzęcia pokazująca postawę, orientację i stany ruchu głowy.
Rycina 2: Kategorie zachowań strukturalnych stosowane we wszystkich trzech laboratoriach i eksperymentach. (A) W kategorii orientacji głowy świń skierowany był albo w stronę człowieka lub poruszającego się obiektu, albo w przeciwną stronę. (B) W kategorii orientacji ciała głowa świni była albo opuszczona, podczas wykonywania niestronnych zachowań jamy ustnej (NNOB); albo w pozycji pionowej, podczas stania lub chodzenia, ale bez ruchu głowy lub z opuszczoną głową; albo w stanie wypoczynku, obejmującym siedzenie lub leżenie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres indeksu podejścia; ilustruje zakres zachowań zwierząt od dalekiego do bliskiego przy użyciu analizy danych równań.
Rycina 3: Wzór i schemat indeksu podejścia. Indeks podejścia został opracowany w celu umieszczenia wszystkich kombinacji zachowań na skali od 0 do 100, gdzie 0 oznacza najmniejszy stopień podejścia (świnia w dalekiej strefie, z nosem odwróconym, leżąca z nieruchomą głową), a 100 – w strefie bliskiej, z nosem skierowanym ku człowiekowi, wykonująca zachowanie NNOB. Do pomiaru zachowań użyto programu komputerowego (zobacz Tabelę materiałów, aby uzyskać więcej informacji), który zapewnił liniowe dopasowanie danych. Każdy schemat świni reprezentuje punkt danych, który liniowo odpowiada danej kategorii. W ramach każdej kategorii czas trwania zachowań najpierw przelicza się na procenty (czas trwania zachowań podzielony przez całkowity czas sesji testowej). Następnie każde zachowanie jest ważone w zależności od poziomu podejścia. Zachowania unikania (procent czasu spędzony w dalekiej strefie, odpoczywania, z nosem odwróconym) są mnożone przez 0. Zachowania umiarkowanego podejścia (procent czasu spędzony w strefie środkowej, z nosem skierowanym ku człowiekowi, stania z nieruchomą głową) są mnożone przez 1. Najwyższy poziom zachowań podejścia (procent czasu spędzony w strefach bliskiej i najbardziej zbliżonej, wykonywanie NNOB) jest mnożony przez 2. Następnie poszczególne kategorie są dodatkowo ważone współczynnikami 3, 2 i 1 odpowiednio dla lokalizacji przestrzennej, orientacji nosa i aktywności. Stała wartość (0,10) jest stosowana w celu skalowania danych w całym zakresie od 0 do 100 procent. Użyto kolorowej skali przypominającej mapę cieplną, aby przedstawić świnię w najwyższym stanie podejścia w porównaniu ze świnią w najniższym stanie podejścia (kolor czarny). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy porównujący procentowy wskaźnik podejścia w czasie po zabiegu; grupa kontrolna kontra grupa poddana ekspozycji na falę uderzeniową.
Rycina 4: Wskaźnik podejścia u świń poddanych ekspozycji na falę uderzeniową. Na rycinie przedstawiono wskaźnik podejścia u świń jeden dzień przed (-1) oraz trzy dni po poddaniu ich jedynie znieczuleniu (grupa kontrolna, n = 6) lub znieczuleniu oraz ekspozycji na falę uderzeniową o szczytowym ciśnieniu 47,4 ± 13,6 SD trwającym 4,7 ± 0,9 ms SD. Słupki błędów reprezentują SEM. Wartości P dla zabiegu wyniosły 0,032, dla czasu 0,033, a dla interakcji zabieg × czas 0,012. Dane analizowano za pomocą analizy wariancji z ograniczoną wiarygodnością (restricted likelihood ANOVA) z wykorzystaniem procedury modelu mieszanego w programie statystycznym. Analiza ta wykazała różnice między zabiegiem, czasem oraz ich interakcjami. Podano maksymalny SEM z modelu, a poziom istotności *P < 0,05 uznano za istotny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy porównujący procentową długość obserwacji w grupie placebo a ekspozycji na falę uderzeniową w przedziałach czasowych.
Rycina 5: Metoda wykresu składowego do prezentacji zachowań. Te panele przedstawiają metodę wykresu składowego do prezentacji zachowań: (A) zachowania przestrzennego, (B) kierunku nosa oraz (C) aktywności świń jeden dzień przed (-1) i trzy dni po poddaniu ich jedynie znieczuleniu (placebo, n = 6) lub znieczuleniu w połączeniu z ekspozycją na falę uderzeniową o szczytowym ciśnieniu 47,4 ± 13,6 SD trwającym 4,7 ± 0,9 ms SD. W tym eksperymencie zastosowano typ hodowli B. Wszystkie wzajemnie wykluczające się zachowania mogą być przedstawione na każdym z wykresów składowych. (A) Wartości P dla interakcji leczenie x czas dla zachowań przestrzennych wyniosły: daleko = 0,060, środek = 0,110, *blisko = 0,014, najbliżej = 0,557; (B) wartości P dla interakcji leczenie x czas dla kierunku nosa wyniosły < 0,001*; (C) wartości P dla interakcji leczenie x czas dla aktywności wyniosły > 0,10; wartości P dla efektu leczenia to odpoczynek = *0,046, stanie = 0,584 oraz *NNOB = 0,042. Uśrednione błędy standardowe średnich (SEM) wyniosły: (A) 7,5%, (B) 9,6% oraz (C) 9,7%. Każdy wynik behawioralny analizowano za pomocą analizy wariancji z ograniczoną wiarygodnością (restricted likelihood ANOVA) z zastosowaniem procedury modelu mieszanego w programie statystycznym (zobacz Tabelę materiałów dla konkretnego programu), a następnie połączono wyniki w wykresie. Analizy określiły różnice między leczeniem, czasem oraz ich interakcjami. Podano maksymalny błąd standardowy średniej (SEM) z modelu, a poziom istotności *P < 0,05 uznano za istotny statystycznie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Statystyki ANOVA dla różnych typów zamieszkaniaStatystyki opisowe dla wszystkich danych zdrowych świńLiczba jednostek eksperymentalnych
Typ hodowliP-Nie.Kwantyle, %do wykrycia Δ% w porównaniu z kontrolą1
ABCSEMwartościUwaga.μSDCV%SEMMin255075Maksymalnie255075100200
Wskaźnik podejścia, %75.469.276.65.50.3182887417231070808499184333
Czas trwania lokalizacji pióra, %
Daleko8.5a5.3a23.0b4.80.0082881020200.11.200010100--3361498421
Środkowy18.94613.7516.20.06628823291251.702103210052613158338
Zamknij72.4a43.9b62.4a12.80.0322882329123.91.7047789310050912757328
Najbliższy (wspinaczka)08.903.10.001288673247.81.904680951007419853
Zamknij + Najbliższy72.55362.314.90.311288683246.61.904678931007419853
Czas trwania aktywności, %
Leżenie/leżenie z nieruchomą głową5.6a0.0b17.0c1.80.0012881.35393.70.3013759----57932682
Stój/chodź z nieruchomo położoną głową48.3a63.6a,b83.5b100.006288524382.12.517471001002265725144
NNOB81.557.771.113.30.109288772836.41.706691981004411533
Kierunek głowy, czas trwania, %
Z dala24.7a17.4a50.7b4.50.001288262179.31.20102239922125324133
W kierunku75.3 a82.6 a49.3 b4.50.001288742127.81.28627990100266333

Tabela 1: Pomiarów HAT w stanach podstawowych poddano analizie dla wszystkich typów zamknięć, aby utworzyć ten zbiór danych. Wyniki zachowania analizowano za pomocą wariancji z ograniczoną wiarygodnością (ANOVA) przy użyciu procedury MIXED oprogramowania do analiz statystycznych. Analizy te określiły różnice w czasie trwania zachowania oraz w indeksie podejścia dla poszczególnych typów hodowli laboratoryjnych. Podano maksymalny błąd standardowy średniej (SEM) z modelu, a poziom istotności P < 0,05 uznano za istotny. Dodatkowo, do analiz opisowych wykorzystano procedurę UNIVARIATE oprogramowania statystycznego. Następnie wartość współczynnika zmienności (CV) w procentach wprowadzono do kalkulatora jednostki eksperymentalnej27 i przeanalizowano warunki oczekiwanych różnic pomiędzy dwoma zabiegami.

LeczenieWartości p
ZnaneNieznaneSEMTRTCzasTRT*Czas
Wskaźnik podejścia, %84,884,43,060,7660,0020,661
Czas trwania pobytu w miejscu, %
Daleko10,710,13,490,8440,0080,522
Środek18,717,63,380,7170,0140,918
Blisko70,472,35,250,617<0,0010,895
Czas trwania aktywności, %
Leżenie lub siedzenie, brak NNOB5,85,80,80,995<0,0010,901
Stanie lub chodzenie, brak NNOB5,55,51,40,995<0,0010,524
NNOB82,183,34,120,7220,00290,617
Kierunek głowy, czas trwania, %
Odwrócona23,9232,810,725<0,0010,329
Skierowana ku76,1772,80,725<0,0010,329

Tabela 2: Przeprowadzono eksperyment na siedmiu świniach z hodowli typu A. Każdego dnia przeprowadzano dwie sesje. W każdej sesji w testach interakcji z ludźmi (HAT) wykorzystywano jedną znaną (kobietę) lub jedną z siedmiu nieznajomych osób (trzech mężczyzn i cztery kobiety). Ta sama znana osoba występowała jako pierwsza, a następnie wykorzystano siedem nieznajomych osób. Dla analizy statystycznej zastosowano model ANOVA w celu zbadania wpływu czynnika (znajoma lub nieznajoma osoba), czasu (dzień) oraz ich wzajemnych interakcji.

Film dodatkowy 1: Konfiguracja oprogramowania Observer z napisami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film dodatkowy 2: Eksport danych z napisami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film dodatkowy 3: Analiza danych z napisami. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Przykładowy arkusz zbierania danych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Łagodne urazy mózgu, które nie powodują jawnych zmian anatomicznych i strukturalnych wykrywalnych za pomocą najnowocześniejszego obrazowania, mogą być trudne do zidentyfikowania i leczenia28. Jednak pacjenci z mTBI są szczególnie narażeni na dodatkowe urazy, które mogą spowodować znaczne uszkodzenie mózgu, dlatego ważne jest, aby zidentyfikować tę populację. Testy behawioralne opracowane w modelu mTBI u mini-świni są szczególnie istotne dla pacjentów z mTBI u ludzi, ponieważ świnie mają podobną fizjologię jak ludzie i wyrażają podobne stany afektywne, takie jak anhedonia 8,9,10,20. W tym przypadku opracowaliśmy nieinwazyjny test behawioralny w kojcu (HAT) i wykazaliśmy, że jest on wystarczająco czuły, aby odróżnić świnie mTBI od świń pozorowanych. Ponadto opracowano indeks ważony (AI) dla zachowań zaobserwowanych podczas HAT, które są wszechobecne w pomieszczeniach inwentarskich i typach świń.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów:

Metodologie HAT zostały opracowane w oparciu o wytyczne etologii25 oraz kilka strategii prób i błędów w celu poprawy wiarygodności, powtarzalności i trafności testu6. Miary niezawodności pomogły zidentyfikować mocne i słabe strony testu. Rzetelność określa stopień, w jakim pomiar jest powtarzalny i spójny oraz wolny od błędów losowych28,29. Wcześniej informowaliśmy o wiarygodności HAT w relacjach między obserwatorami i z dodatkowymi etogramami strukturalnymi, wiarygodność jest podobnie wysoka (R2 Pearsona > 0,90) dla czasutrwania 6. Pomiary częstotliwości i opóźnień wymagają przeszkolonych obserwatorów, podczas gdy miary czasu trwania są w mniejszym stopniu zależne od obserwatorów, a zatem bardziej wiarygodne we wszystkich laboratoriach30.

Niezawodność w laboratorium i powtarzalność we wszystkich laboratoriach zależy od metod. W naszym laboratorium system wideo nagrywał w sposób ciągły, pliki były początkowo przechowywane jako pliki 5-minutowe, a niektóre sesje HAT odbywały się na dwóch plikach. Mniej błędów popełniono, gdy do przycięcia i połączenia filmów użyto dokładnego czasu z arkusza danych. Przed opracowaniem etogramu obserwatorzy mogli zatrzymywać, zatrzymywać i przewijać materiał wideo, aby oznaczyć w czasie wszystkie zachowania w całym etogramie. Metoda ta nie tylko spowodowała różnice w oznaczaniu czasowym każdej próbki, w zakresie od 3 minut do 20 minut, ale także niezawodność między obserwatorami i wewnątrz nich była również słaba dla większości zachowań. W związku z tym ustawiliśmy prędkość odtwarzania i poprosiliśmy obserwatorów o oznaczanie czasowe każdej kategorii na raz. W związku z tym, gdy wiarygodność była niska tylko w jednej kategorii, obserwatorzy niezależnie od siebie oznaczali tylko kategorię, a nie cały etogram, po wspólnym zapoznaniu się z definicjami i materiałem filmowym. Metody odtwarzania zestawów i kategorii pozwoliły na spójne przewidywanie, ile czasu potrzeba na oznaczenie czasowe każdej próbki. W przypadku projektów, które trwają dłużej niż miesiąc, ważne jest, aby zmierzyć rutynowy przegląd zakodowanych filmów i wiarygodność wewnątrz obserwatora.

Kolejnym czynnikiem, który zmniejsza niezawodność i powtarzalność, jest konfiguracja wideo. Początkowo używano ręcznego aparatu fotograficznego i statywu, które przenoszono z pióra na pióro. Kiedy stosowano tę metodę, świnie musiały zostać wprowadzone do statywu i kamery przed HAT; W przeciwnym razie świnie wydawały się reagować na statyw i ruch bardziej niż na badanego człowieka. Ponadto kąty kamery inne niż górne ograniczały pole widzenia obserwatora podczas znakowania czasem, a percepcja głębi przestrzeni zwiększała zmienność wewnątrz i między obserwatorami w pomiarach zachowań przestrzennych; W związku z tym opracowaliśmy protokół z kamerami stałopozycyjnymi. W przypadku stosowania tej metody należy zachować szczególną ostrożność, aby upewnić się, że kamera jest prawidłowo umieszczona przed każdym testem, a konfiguracja jest potrzebna więcej czasu między każdą sesją świni. Dowiedzieliśmy się jednak, że system ciągłego narzutu wideo musiał rozpocząć początkowe nagrywanie o północy, co najmniej 24 godziny przed pierwszym HAT. Wyświetlanie znacznika czasu w wielu systemach wideo nie jest dokładne i zsynchronizowane z klatką; Dlatego nie polegamy już na czasach wyświetlania. Początek o północy pozwolił na dokładne przechwycenie klatki i edycję wideo, a wyświetlanie znacznika czasu nie było używane.

Ponadto aklimatyzacja świń i ustalenie rutyny były ważne podczas rozwiązywania problemów z tym testem. W nagraniach świń, które nie były dobrze zaaklimatyzowane w swoim środowisku, podczas HAT zaobserwowano stymulację. Jest to wskaźnik, że świnia może znajdować się w stanie pobudzenia31 , a nie w stanie eksploracyjnym32. Okresy aklimatyzacji trwające trzy lub więcej tygodni mogą zmniejszyć liczbę świń w doświadczeniu. Jeśli jednak tempo utrzymuje się przez wszystkie okresy pobierania próbek, może być konieczne dostosowanie tego etogramu tak, aby obejmował spacery i stanie w miejscu.

Trafność to stopień, w jakim pomiar odzwierciedla zamierzony zakres zadawanego pytania25. Podczas opracowywania HAT używaliśmy tylko etogramu przestrzennego. Definicje zachowań przestrzennych etogramu dokładnie i szczegółowo opisują bliskość ludzi i mówią bezpośrednio obserwatorowi, ile przestrzeni świnia pozostawia między sobą a człowiekiem. Jednak gdy metody te muszą zostać zastosowane w nowej konfiguracji laboratorium, uznaliśmy, że etogramy przestrzenne są specyficzne dla laboratorium. Wymiary pióra i rozmieszczenie innych obiektów wpływają na wynik etogramu przestrzennego; W związku z tym konieczne będzie opublikowanie schematu z wymiarami i specyfiką pióra, jeśli konfiguracja wstrzykiwacza nie została wcześniej zgłoszona. Oprócz raportowania na temat środowiska pióra, do etogramu dodano zachowania strukturalne. W przeciwieństwie do zachowań przestrzennych, zachowania strukturalne mogą być łatwiej oceniane w różnych laboratoriach; Te zachowania są ważne, ponieważ szczegółowo opisują poziom aktywnego stanu świni. Kiedy świnia odpoczywa, prawdopodobnie nie jest zmotywowana do podejścia i nie jest w stanie zmienić pozycji, aby podejść tak szybko, jak świnia stojąca. Podobnie, świnia wykazująca NNOB jest w stanie eksploracyjnym, ale świnia z głową nieruchomą w pozycji stojącej jest bardziej prawdopodobna w stanie katatonicznym. Orientacja nosa pomaga w trafności, ponieważ nos, uszy, a następnie oczy są tym, czego świnia używa do zbierania informacji o człowieku.

Ograniczenia techniki:

Potencjalnym problemem związanym z tą techniką jest zmienność w reakcjach świń na badanego człowieka. Ponadto świnie będą patrzeć na ręce badanego człowieka, co może spowodować niezamierzone sygnały ze strony tej osoby. Dlatego też ograniczenia te zostały wyrażone poprzez eksperymentalne testowanie 1) reakcji świń na znajomego człowieka i nieznanego człowieka oraz 2) standaryzację, że po upuszczeniu granulki badany człowiek stoi nieruchomo i kładzie ręce poza zasięgiem wzroku świni. Dane wykazały, że nie było różnic w czasie leczenia lub leczenia x czas trwania HAT (Tabela 2), co sugeruje, że HAT może być podawany zarówno przez znanych, jak i nieznanych ludzi. Inni badacze sugerują, że świnie mają tendencję do uogólniania na temat ludzi na podstawie wcześniejszych interakcji 11,12,13; Dlatego wcześniejsze doświadczenia świni z ludźmi muszą być pozytywne. Temu wyzwaniu można również zaradzić za pomocą czujnego projektu eksperymentalnego; Dla każdego bloku potrzebna jest wystarczająca liczba jednostek eksperymentalnych reprezentowanych dla każdego zabiegu będącego przedmiotem zainteresowania.

W tym badaniu, chociaż było tylko dwóch doświadczonych obserwatorów, którzy oznaczali czas wszystkich filmów dla wszystkich trzech typów mieszkań, istniały różnice między typami mieszkań dla określonych wyników zachowań (Tabela 1). Na przykład świnie w pomieszczeniach typu B częściej wchodziły na najbliższy obszar niż świnie w pomieszczeniach typu A i C. Jest to prawdopodobnie spowodowane różnicą w materiale pióra; w pomieszczeniach typu B przód kojca był bramą łańcuchową z poziomymi prętami, które umożliwiały świni wspinanie się na bramę podczas HAT. Z drugiej strony, pomieszczenia typu A i C miały pionowe pręty i mniej poziomych powierzchni, na które świnie mogły się wspinać. Zmienności tej można zaradzić, dodając czas spędzony w bliskim i najbliższym obszarze przed porównaniem ich między typami mieszkań (tabela 1; P > 0,10). Jednak świnie w pomieszczeniach typu C spędzały więcej czasu w pomieszczeniach typu odległego niż te w pomieszczeniach typu A i B (tabela 1; P < 0,05), co było prawdopodobnie spowodowane umieszczeniem poideł z tyłu pióra, a nie z przodu kojca. Jest to ograniczenie, któremu można zaradzić, jeśli laboratoria zdecydują się ustandaryzować rozmieszczenie poideł, misek i zabawek oraz upewnią się, że są one zamocowane tak, aby świnia nie przenosiła przedmiotu w inne miejsce.

Ten test jest doskonale dostępny dla laboratoriów wszystkich typów, ale, jak wspomniano wcześniej, ręcznie stemplowany etogram przestrzenny i pomiary będą się bardziej różnić w zależności od laboratorium. Niemniej jednak etogramy strukturalne ciała i głowy są wszechobecne. Laboratoria, które mają dostęp do zwalidowanego, zautomatyzowanego śledzenia świń, mogą odnieść korzyści z automatycznego śledzenia etogramu przestrzennego, a nie ręcznego, ponieważ przebyta odległość i szybkość ruchu mogą być dodatkowymi wynikami pomiarów zachowania z HAT. Ograniczeniom wynikającym z konfiguracji w piórze i tradycyjnych technologii, a nie obszarów testowych i technologii automatycznego śledzenia, można zaradzić, dostosowując formułę sztucznej inteligencji. Sztuczna inteligencja zapewnia ustandaryzowane pomiary i terminologię dotyczącą tego, w jaki sposób poszczególne świnie wykorzystują przestrzeń w kojcu i wyrażają zainteresowanie człowiekiem. Obliczenia te, wyprowadzone na podstawie powszechnych miar zachowania, są wrażliwe na modele świń subwstrząsowego mTBI i, być może, inne stany subklinicznego urazu lub choroby. Ponadto sztuczna inteligencja zmniejsza losowe zmiany podczas eksperymentów i może być łatwiej porównywana między eksperymentami i laboratoriami niż metody, które opierają się na pomiarach bardziej specyficznych dla eksperymentu. Zachowania strukturalne stanowiły podstawę tej formuły, ponieważ zachowania te są standardowymi pomiarami we wszystkich zabiegach, podczas gdy zachowania przestrzenne zależą od konfiguracji kojca, liczby świń w kojcu i systemu śledzenia. Na przykład zaobserwowaliśmy, że gdy dwie zdrowe świnie są testowane w kojcu, będą one wykonywać podobne zachowania przestrzenne, zbliżając się razem, ale świnia, która podąża za pierwszą, może skierować nos bardziej w stronę swojego kolegi z kojca niż w kierunku człowieka i wyrażać więcej NNOB, ponieważ świnia, która prowadzi, służy jako strażnik. Niemniej jednak sztuczna inteligencja pomaga w zmniejszeniu tej zmienności nawet w przypadku sparowanych zachowań.

Chociaż sztuczna inteligencja jest doskonałym zestawem narzędzi do standaryzacji testu w różnych laboratoriach, badacze mogą nadal chcieć zbadać wyniki zachowań specyficznych dla testu w laboratorium lub eksperymencie, zwłaszcza jeśli mają wystarczającą moc (tj. jednostki eksperymentalne i powtarzające się testy) w jednym eksperymencie. W związku z tym zamieszczono tutaj tabelę 1, zawierającą wszystkie wyniki zachowania, wariancję, rozkład i obliczony test liczby zwierząt dla każdego konkretnego zachowania. Na przykład, jeśli naukowcy mają środowiska zagrodowe, które pozwalają świniom konsekwentnie wspinać się podczas HAT i wiedzą, że ich leczenie powoduje ponad 75% różnicę w zachowaniach wspinaczkowych, mogą uzasadnić liczbę zwierząt na podstawie zmierzonej wariancji. Jeśli do etogramu zostaną dodane nowe zachowania, naukowcy będą musieli uzasadnić, które zachowania wskazują na zbliżanie się lub wycofanie, zanim włączą je do indeksu. Na przykład, jeśli większość zwierząt biorących udział w eksperymencie porusza się po ściankach kojca (tj. thigmotaxis)32, czas trwania tego zachowania można włączyć do kategorii etogramu strukturalno-cielesnego. Zachowanie to można przedstawić na szczegółowym skumulowanym wykresie słupkowym (tj. Rysunek 5) lub w formie tabelarycznej, a następnie można je podsumować za pomocą zatrzymania przed zastosowaniem obliczeń indeksu. Sztuczna inteligencja może zatem reprezentować zachowania, które są wszechobecne w laboratoriach, ale dodatkowe unikalne zachowania mogą być nadal reprezentowane osobno.

Znaczenie w odniesieniu do istniejących metod:

Istniejące metody HAT zostały opracowane dla świń w gospodarstwach komercyjnych w celu oceny dobrostanu zwierząt. W tym przypadku ustalono protokół dla świń laboratoryjnych, który może pomóc naukowcom w ocenie dobrostanu zwierząt i odróżnieniu świń z mTBI od świń leczonych pozorowo. Alternatywnym tradycyjnym testem może być użycie testu w otwartym polu. Test ten był wcześniej używany do oceny emocjonalności i dobrostanu świń33. Testy na otwartym polu zostały pierwotnie zaprojektowane do testowania stanów afektywnych gryzoni poprzez pomiar ich naturalnej awersji do otwartej przestrzeni i światła. W przeciwieństwie do tego, zdrowe świnie mogą postrzegać te same bodźce jako apetyt10, a po chorobie, urazie lub leczeniu stresu prawdopodobnie wyrażają strach. Ten test wymaga więcej miejsca w laboratorium i będzie wymagał od świń przyzwyczajenia się do obsługi i umieszczania na otwartym polu. Jeśli laboratoria dysponują przestrzenią i istnieją protokoły postępowania ze świniami, powtarzające się sesje HAT, oprócz jednego testu na otwartym polu, mogą pomóc w dalszym odróżnieniu zwierząt leczonych od zwierząt pozorowanych.

Kluczowe kroki w ramach protokołu:

Pierwsze trzy kroki w protokole są najbardziej krytyczne dla udanych środków HAT. Sesje na świnię trwają tylko 3 minuty; Jednak odpowiednie przygotowanie sprawi, że ten test będzie wiarygodny. Jak wspomniano powyżej, lokalizacja kamery i konfiguracja nagrywania mają kluczowe znaczenie dla przejrzystości i replikacji. Niewłaściwe kąty kamery mogą ograniczać pole widzenia obserwatora, co spowoduje błędy w pomiarach. Innym często pomijanym krokiem jest naprawianie przedmiotów w piórze. Świnia będzie przesuwać nieustalone przedmioty, a to może wpłynąć na jej motywację do zbliżenia się do człowieka. System konfiguracji i zarządzania jest ważny, ponieważ świnie muszą zaaklimatyzować się w swoim środowisku, zanim będą mogły konsekwentnie wykonywać test. Świnie, które nie są dobrze zaaklimatyzowane w swoich domowych kojcach lub rutynie lub doświadczają stresu, będą wypróżniać się w innych miejscach, a nie z tyłu kojca34. Obszar wypróżniania może wpływać na ich motywację do zbliżania się. Z perspektywy kamery obserwator powinien być w stanie zidentyfikować poszczególne świnie; Ważne jest jednak, aby schemat znakowania nie zawierał informacji na temat traktowania zwierzęcia, ponieważ będzie to zniekształcać obserwatora25.

Identyfikacja świń jest bardzo ważna dla uzyskania prawidłowych danych behawioralnych dla właściwej świni, nawet jeśli są one trzymane w jednym pomieszczeniu. Świnie są często przenoszone w celu poddania się leczeniu, a oznakowanie upewnia obserwatora, że obserwuje tę samą świnię po jej wyjęciu i umieszczeniu z powrotem w kojcu. Świnie mogą być trzymane w parach, tak jak w chlewni typu C, dlatego bardzo ważna staje się identyfikacja świń. Farby i markery do znakowania zwierząt gospodarskich wymagają codziennego stosowania; Dlatego protokół ten wymaga użycia taśmy medycznej i rozmazu z cementu do tagów. Taśma najlepiej przylega do świń o dłuższej sierści. Świnie z krótkimi włosami i suchą skórą będą złuszczać taśmę częściej niż świnie z dłuższymi włosami.

Przyszłe aplikacje:

Podsumowując, opisany tutaj nieinwazyjny test HAT w wstrzykiwaczu jest wystarczająco czuły, aby wykryć łagodne i czasowo zależne zmiany u świń po mTBI. Ponadto opracowaliśmy indeks ważony zwany sztuczną inteligencją do oceny zmian u świń trzymanych w różnych typach kojców, a także u różnych typów świń. Chociaż HAT był używany do wykrywania zmian u świń narażonych na mTBI, ten test behawioralny może być przydatny do wykrywania mierzalnych zmian behawioralnych u zwierząt doświadczających stresu lub stanów prepatologicznych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować za dofinansowanie z Biura Badań Marynarki Wojennej (Grant #12166253). Ponadto autorzy uprzejmie dziękują personelowi zajmującemu się opieką nad zwierzętami, weterynarzom i studentom z Kansas State University i Virginia Tech za ich wsparcie podczas pracy ze zwierzętami. Autorzy chcieliby również podziękować Nadège Krebs za jej pomoc techniczną oraz studentom Shelby Stair, Sarah Greenway i Mikayli Goering za pomoc techniczną i dodatkową opiekę nad zwierzętami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kamery kopułkowe 3,0 megapikseli z obiektywem 2,8-12 mm ustawionym między 2,8-3,2 mmPunkty Północny nadzór, Auburn, MECDL7233SDo długopisów niskoprofilowych potrzebne są obiektywy o niższej mm
Zestaw ramienia ciernego Manfrotto 244B& H ZdjęcieB& H # MA244; MFR # 244Do montażu i zabezpieczania kamer pod kątem 90&stopni;
nagrywania wideoPoints North Surveillance, Auburn, MENVR-RACK64NVR jest dostosowany
Kolorowa i wzorzysta taśma klejąca przymocowana do dwustronnej taśmy medycznej  MBK Tape Solutions, Chatsworth, CA3M 1522HZrównoważone znakowanie świń
Generator formuł indeksu podejściaDinasym, Manhattan, KSFirma Approach Formuladostosuje makra do konkretnych potrzeb laboratoryjnych
Oprogramowanie GeovisionPoints North Surveillance, Auburn, MEOprogramowanie Geovisiondo edycji czasu wideo w klipy 180 s
ClickerPetcoGood2Go Kliker do szkolenia psów
Smakołyk z nagrodą (granulat paszowy, chips chleba świętojańskiego, rodzynki, prawoślaz)ZmiennaNie dotyczyW zależności od wcześniejszej ekspozycji, dorosłe świnie są bardzo  neofobiczne, gdy wprowadza się nową karmę. Świnie karmione limitem mogą być karmione kilkoma granulkami paszy.
System Analizy Statystycznej (SAS)SAS Institute, Cary, Karolina PółnocnaSAS 9.0Nasze laboratoria preferują analizę modeli mieszanych i powtarzanych pomiarów
Oprogramowanie Observer 11.5Noldus Information Technology, Leesburg, VAObserver 11.5Oprogramowanie do ręcznego oznaczania czasowego klipów wideo
System

Bibliografia

  1. Iverson, G. L. Outcome from mild traumatic brain injury. Current Opinion in Psychiatry. 18 (3), 301-317 (2005).
  2. Taber, K. H., Warden, D. L., Hurley, R. A. Blast-related traumatic brain injury: what is known? The Journal of Neuropsychiatry and Clinical Neurosciences. 18 (2), 141-145 (2006).
  3. White, H., Venkatesh, B. Traumatic brain injury. Oxford Textbook of Neurocritical Care. Smith, M., Kofke, W. A., Citerio, G. 210, University Press. Oxford. (2016).
  4. Greve, K. W., et al. Personality and neurocognitive correlates of impulsive aggression in long-term survivors of severe traumatic brain injury. Brain Injury Journal. 15 (3), 255-262 (2001).
  5. Janusz, J. A., Kirkwood, M. W., Yeates, K. O., Taylor, H. G. Social Problem-Solving Skills in Children with Traumatic Brain Injury: Long-Term Outcomes and Prediction of Social Competence. Child Neuropsychology. 8 (3), 179-194 (2002).
  6. Luo, Y. Swine Applied Ethology Methods for a Model of Mild Traumatic Brain Injury (Master's Thesis). , Available from: http://hdl.handle.net/2097/35760 (2017).
  7. Kornum, B. R., Knudsen, G. M. Cognitive testing of pigs (Sus scrofa) in translational biobehavioral research. Neuroscience & Behavioral Reviews. 35 (3), 437-451 (2011).
  8. Bauman, R. A., et al. An Introductory Characterization of a Combat-Casualty-Care Relevant Swine Model of Closed Head Injury Resulting from Exposure to Explosive Blast. Journal of Neurotrauma. 26, 841-860 (2009).
  9. Friess, S., et al. Repeated traumatic brain injury affects composite cognitive function in piglets. Journal of Neurotrauma. 26, 1111-1121 (2009).
  10. Xiong, Y. A., Mahmood, A., Chopp, M. Animal models of traumatic brain injury. Nature Reviews Neuroscience. 14 (2), 128-142 (2013).
  11. Waiblinger, S., et al. Assessing the human-animal relationship in farmed species: A critical review. Applied Animal Behavior and Science. 101, 185-242 (2006).
  12. Powell, C., Hemsworth, L. M., Rice, M., Hemsworth, P. H. Comparison of methods to assess fear of humans in commercial breeding gilts and sows. Applied Animal Behavior and Science. 181, 70-75 (2016).
  13. Hemsworth, P. H., Barnett, J. L., Coleman, G. J., Hansen, C. A study of the relationships between the attitudinal and behavioural profiles of stockpersons and the level of fear of humans and reproductive performance of commercial pigs. Applied Animal Behaviour Science. 23, 301-314 (1989).
  14. Hulbert, L. E., McGlone, J. J. Evaluation of drop versus trickle-feeding systems for crated or group-penned gestating sows. Journal of Animal Science. 84 (4), 1004-1014 (2006).
  15. Mills, D. S., Marchant-Forde, J. N. The encyclopedia of applied animal behavior and welfare. , CAB International. Wallingford, UK. (2010).
  16. Backus, B. L., Sutherland, M. A., Brooks, T. A. Relationship between environmental enrichment and the response to novelty in laboratory-housed pigs. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 56 (6), 735-741 (2017).
  17. Price, E. O. Behavioral development in animals undergoing domestication. Applied Animal Behavior Science. 65 (3), 245-271 (1999).
  18. Plogmann, D., Kruska, D. Volumetric comparison of auditory structures in the brains of European wild boars (Sus scrofa) and domestic pigs (Sus scrofa f. dom.). Brain, Behavior and Evolution. 35 (3), 146-155 (1990).
  19. Horbak, K. Nosing Around: Play in Pigs. Animal Behavior and Cognition. 1 (2), 186-196 (2014).
  20. Daigle, C. Parallels between Postpartum Disorders in Humans and Preweaning Piglet Mortality in Sows. Animals. 8 (2), 22(2018).
  21. Willner, P., Muscat, R., Papp, M. Chronic mild stress-induced anhedonia: A realistic animal model of depression. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 16 (4), 525-534 (1992).
  22. Pairis, M., Young, A., Millman, S. T., Garvey, J., Johnson, A. K. Can Fear Be Effectively Assessed in Swine? A Study Measuring Fear Levels during a Human Approach Test. Animal Industry Report. , AS 655, ASL R2470 (2009).
  23. Grandin, T. Behavioral principles of livestock handling. American registry of Professional Animal Scientist. , 1-11 (2002).
  24. Weeks, C. A. A review of welfare in cattle, sheep and pig lairages, with emphasis on stocking rates, ventilation and noise. Animal Welfare. (South Mimms, England). 17, 275-284 (2008).
  25. Martin, P., Bateson, P. How Good are Your Measures. Measuring Behaviour: An Introductory Guide. Martin, P., Bateson, P. , University Press. Cambridge. 72-85 (2007).
  26. Grandin, T., Shivley, C. How Farm animals react and perceive stressful situations such as handling, restraint, and transport. Animals. 5, 1233-1251 (2015).
  27. Galyean, M. Sample size calculations I. , Available from: https://www.depts.ttu.edu/afs/home/mgalyean/ (2018).
  28. Shenton, M. E., et al. A review of magnetic resonance imaging and diffusion tensor imaging findings in mild traumatic brain injury. Brain Imaging and Behavior. 6 (2), 137-192 (2012).
  29. Walilko, T., VandeVord, P., Hulbert, L. E., Fievisohn, E., Zai, L. Establishing a neurological injury threshold using a blast overpressure model in minipigs. Military Health System Research Symposium. , (2017).
  30. Coffin, M. J., et al. Side Bias and Time of Day Influenced Cognition after Minipigs were Conditioned Using a Novel Tactile Stimulation Device. Journal of Animal Science. 96, 255-256 (2018).
  31. Dailey, J. W. Stereotypic Behavior in Pregnant Swine (Master's Thesis). , Available from: https://ttu-ir.tdl.org/ttu-ir/handle/2346/9669 (1995).
  32. Fleming, S. A., Dilger, R. N. Young pigs exhibit differential exploratory behavior during novelty preference tasks in response to age, sex and delay. Behavioural Brain Research. 321, 50-60 (2017).
  33. Ramona, D. D., Healy, S. D., Lawrence, A. B., Rutherford, K. M. D. Emotionality in growing pigs: Is the open field a valid test. Physiology & Behavior. 104, 906-913 (2011).
  34. Matthews, S. G., Miller, A. L., Clapp, J., Plötz, T., Kyriazakis, I. Early detection of health and welfare compromises through automated detection of behavioral changes in pigs. The Veterinary Journal. 217, 43-51 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Test Podejścia CzłowiekaIndeks PodejściaModel TBI u ŚwińEtogramy BehawioralneTestowanie NieinwazyjneŚwinie LaboratoryjneŁagodne Urazy Przebitego MózguRęczne Stemplowanie CzasuTestowanie w Zagrodzie DomowejOcena Behawioralna
Nieinwazyjny test przeprowadzany w kojcu dla świń trzymanych w laboratorium
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.