Mikroskopia 4D drożdży

Podsumowanie

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Streszczenie

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie, jak tworzą się i przekształcają przedziały błony w żywych komórkach pączkujących drożdży. Wiele przedziałów wewnątrzkomórkowych u drożdży jest dynamicznych, a pełne zrozumienie ich właściwości wymaga obrazowania poklatkowego. Wielokolorowa konfokalna mikroskopia fluorescencyjna 4D to potężna metoda śledzenia zachowania i składu przedziału wewnątrzkomórkowego w skali czasowej 5-15 minut. Rygorystyczna analiza dynamiki przedziałów wymaga uchwycenia tysięcy sekcji optycznych. Aby osiągnąć ten cel, fotowybielanie i fototoksyczność są minimalizowane poprzez szybkie skanowanie przy bardzo niskiej mocy lasera, a wymiary pikseli i interwały kroku Z są ustawione na największe wartości, które są kompatybilne z próbkowaniem obrazu w pełnej rozdzielczości. Wynikowe zestawy danych 4D są zaszumione, ale można je wygładzić za pomocą dekonwolucji. Nawet w przypadku danych wysokiej jakości faza analizy jest trudna, ponieważ struktury wewnątrzkomórkowe są często liczne, niejednorodne i mobilne. Aby sprostać tej potrzebie, napisano niestandardowe wtyczki ImageJ, które tablicują dane 4D na ekranie komputera, identyfikują interesujące struktury, edytują dane w celu wyizolowania poszczególnych struktur, określają ilościowo przebiegi czasu fluorescencji i tworzą filmy z projektowanych stosów Z. Filmy 4D są szczególnie przydatne do odróżniania stabilnych przedziałów od przejściowych, które przewracają się w wyniku dojrzewania. Takie filmy mogą być również wykorzystywane do charakteryzowania zdarzeń, takich jak fuzja przedziałowa, oraz do testowania skutków określonych mutacji lub innych perturbacji.

Wprowadzenie

Przedziały systemu endomembranowego są w ciągłym ruchu, a ich pełna charakterystyka wymaga obrazowania żywych komórek. Opisano tutaj protokół, który wykorzystuje mikroskopię konfokalną 4D (time-lapse 3D) do wizualizacji fluorescencyjnie znakowanych przedziałów w pączkujących drożdżach. Metoda została opracowana w celu śledzenia dynamiki kompaktów wydzielniczych w Pichia pastoris i Saccharomyces cerevisiae^1,2,3. Protokół ten skupia się na S. cerevisiae, który ma nieułożony Golgi, w którym poszczególne cisternae są optycznie rozdzielalne

Protokół

1. Przygotowanie

1. Spraw, aby niefluorescencyjne podłoże minimalnie NSD². Oczekuje się, że brak ryboflawiny zmniejszy wewnątrzkomórkową zieloną fluorescencję tła i związaną z nią fototoksyczność.
2. Hodować szczep drożdży przez noc w temperaturze ~23 °C do fazy logarytmicznej w 5 ml NSD w kolbie z przegrodą o pojemności 50 ml z dobrym napowietrzeniem. Około 3-4 godziny przed analizą rozcieńczyć kulturę drożdży w świeżym NSD, tak aby końcowy OD₆₀₀ wynosił 0,5-0,8 w momencie obrazowania.
3. Przygotować roztwór 2 mg/ml konkanawaliny A (ConA). W razie potrzeby zamrozić porcje tego roztworu w ciekłym azocie i przechowywać w tem....

Wyniki

Przykład przedstawiony w niniejszym opracowaniu dokumentuje i kwantyfikuje dojrzewanie dwóch cystern aparatu Golgiego w drożdżach, wizualizowane za pomocą dwukolorowej konfokalnej mikroskopii 4D³. Komórka drożdży zawiera od 10 do 15 cystern aparatu Golgiego, z których każda dojrzewa w ciągu około 2-4 min. Dojrzewanie można wizualizować poprzez znakowanie wczesnego markera Golgiego Vrg4 białkiem GFP oraz późnego markera Golgiego Sec7 czerwonym białkiem fluorescencyj.......

Dyskusja

Obrazowanie konfokalne 4D organelli drożdży wymaga starannego dostrojenia wielu parametrów. Głównym problemem jest fotowybielanie i fototoksyczność. Typowy film 4D polega na zebraniu tysięcy sekcji optycznych, dlatego oświetlenie lasera musi być utrzymywane na jak najniższym poziomie. Tandemowe fluorescencyjne znaczniki białkowe mogą być używane do wzmacniania sygnału bez zwiększania ekspresji znakowanego białka^16,17. Maksymalizacja prędkości skanowania pomaga og.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynia ze szklanym dnem 35 mm nr 1.5	MatTek	P35G-0.170-14-C	Naczynia do obrazowania
Concanavalin A w proszku	Sigma-Aldrich	C2010
Trolox	Vector Laboratories	CB-1000
Leica SP8	Leica Microsystems
Pakiet aplikacji Leica X	Oprogramowanie mikroskopowe Leica Microsystems
Oprogramowanie Huygens Essential, wersja 17.04	Oprogramowanie do dekonwolucji	obrazowania
ImageJ	NIH		Oprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów

Mikroskop konfokalny objętościowego