Artykuł metodologiczny

Mikroskopia 4D drożdży

DOI:

10.3791/58618

⸱

28 kwietnia 2019

 , 
1Department of Molecular Genetics and Cell Biology, University of Chicago

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest scharakteryzowanie, jak tworzą się i przekształcają przedziały błony w żywych komórkach pączkujących drożdży. Wiele przedziałów wewnątrzkomórkowych u drożdży jest dynamicznych, a pełne zrozumienie ich właściwości wymaga obrazowania poklatkowego. Wielokolorowa konfokalna mikroskopia fluorescencyjna 4D to potężna metoda śledzenia zachowania i składu przedziału wewnątrzkomórkowego w skali czasowej 5-15 minut. Rygorystyczna analiza dynamiki przedziałów wymaga uchwycenia tysięcy sekcji optycznych. Aby osiągnąć ten cel, fotowybielanie i fototoksyczność są minimalizowane poprzez szybkie skanowanie przy bardzo niskiej mocy lasera, a wymiary pikseli i interwały kroku Z są ustawione na największe wartości, które są kompatybilne z próbkowaniem obrazu w pełnej rozdzielczości. Wynikowe zestawy danych 4D są zaszumione, ale można je wygładzić za pomocą dekonwolucji. Nawet w przypadku danych wysokiej jakości faza analizy jest trudna, ponieważ struktury wewnątrzkomórkowe są często liczne, niejednorodne i mobilne. Aby sprostać tej potrzebie, napisano niestandardowe wtyczki ImageJ, które tablicują dane 4D na ekranie komputera, identyfikują interesujące struktury, edytują dane w celu wyizolowania poszczególnych struktur, określają ilościowo przebiegi czasu fluorescencji i tworzą filmy z projektowanych stosów Z. Filmy 4D są szczególnie przydatne do odróżniania stabilnych przedziałów od przejściowych, które przewracają się w wyniku dojrzewania. Takie filmy mogą być również wykorzystywane do charakteryzowania zdarzeń, takich jak fuzja przedziałowa, oraz do testowania skutków określonych mutacji lub innych perturbacji.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedziały systemu endomembranowego są w ciągłym ruchu, a ich pełna charakterystyka wymaga obrazowania żywych komórek. Opisano tutaj protokół, który wykorzystuje mikroskopię konfokalną 4D (time-lapse 3D) do wizualizacji fluorescencyjnie znakowanych przedziałów w pączkujących drożdżach. Metoda została opracowana w celu śledzenia dynamiki kompaktów wydzielniczych w Pichia pastoris i Saccharomyces cerevisiae1,2,3. Protokół ten skupia się na S. cerevisiae, który ma nieułożony Golgi, w którym poszczególne cisternae są optycznie rozdzielalne4. Niezwykła organizacja Golgiego u S. cerevisiae umożliwiła zademonstrowanie za pomocą mikroskopii 4D, że Golgi cisterna początkowo znakuje się rezydentnymi wczesnymi białkami Golgiego, a następnie traci te białka, nabywając rezydentne późne białka Golgiego3,5. Przejście to można zwizualizować, tworząc szczep, w którym wczesne białko Golgiego Vrg4 jest znakowane GFP, podczas gdy późne białko Golgiego Sec7 jest znakowane monomerycznym czerwonym białkiem fluorescencyjnym. Gdy śledzone są poszczególne cisternae, dojrzewanie obserwuje się jako konwersję z zielonego na czerwony3. Ten rodzaj analizy może dostarczyć cennych informacji na temat lokalizacji białek i tożsamości kompartmentów. Na przykład, dwa białka z nieznacznie przesuniętymi czasami czasami mogą wydawać się oznaczać różne przedziały na obrazach statycznych, ale można je zobaczyć w filmach 4D, aby oznaczyć ten sam przedział w różnych punktach czasowych6,7. W ten sposób mikroskopia 4D ujawnia zjawiska, które w innym przypadku nie byłyby oczywiste.

Pouczająca mikroskopia 4D komór drożdżowych może być wykonana za pomocą odpowiednich procedur i sprzętu2. O ile to możliwe, znakowanie białek fluorescencyjnych odbywa się za pomocą wymiany genów8, aby uniknąć artefaktów nadekspresji. Ponieważ struktury wewnątrzkomórkowe są często bardzo dynamiczne, obrazowanie 4D jest potrzebne, aby zapewnić niezawodne śledzenie struktury w czasie. Opisany tutaj protokół wykorzystuje laserowy skaningowy mikroskop konfokalny wyposażony w detektory o wysokiej czułości. Za pomocą tego urządzenia cała objętość komórek S. cerevisiae może być obrazowana za pomocą mikroskopii konfokalnej mniej więcej co 1-3 s, przy czym typowe są odstępy 2 s. Dane można zbierać przez okres do 5-15 minut, w zależności od gęstości znakowania fluoroforów i ich właściwości fotofizycznych. Główną przeszkodą jest zminimalizowanie fotowybielania. W tym celu intensywność lasera jest utrzymywana na jak najniższym poziomie, prędkość skanowania konfokalnego jest maksymalizowana, a parametry optyczne są skonfigurowane tak, aby obrazować na granicy Nyquista, aby uchwycić odpowiednie informacje przy jednoczesnym uniknięciu nadmiernej ekspozycji na światło. Oczekuje się również, że te ustawienia złagodzą fototoksyczność, czynnik, który jest często pomijany podczas obrazowania żywych komórek9,10,11. Uzyskane zaszumione dane są przetwarzane za pomocą algorytmów korekcji wybielacza i dekonwolucji, aby ułatwić ilościowe określenie intensywności fluorescencji.

Nawet przy wysokiej jakości filmach 4D, analiza jest trudna, ponieważ komory drożdżowe są zazwyczaj liczne, niejednorodne i mobilne. Ze względu na wewnętrzne ograniczenia mikroskopii konfokalnej i nieoptymalne ustawienia wymagane do długotrwałego obrazowania 4D, struktury fluorescencyjne, które znajdują się blisko siebie, są trudne do rozdzielenia. Problem ten można obejść, skupiając się na niewielkiej liczbie struktur fluorescencyjnych, które pozostają optycznie rozdzielalne przez cały okres znakowania, przy założeniu, że struktury te są reprezentatywne dla całej populacji znakowanych przedziałów. Przedziały fluorescencyjne, które można niezawodnie śledzić, są identyfikowane poprzez oglądanie filmów z wyświetlanymi stosami Z i tworzenie serii montaży, w których sekcje optyczne dla każdego punktu czasowego są wyświetlane na ekranie komputera. Ta analiza wykorzystuje niestandardowe wtyczki ImageJ12, które pozwalają na śledzenie pojedynczej struktury w izolacji.

Ostatnie prace dotyczące metod dotyczyły zastosowania białek fluorescencyjnych w drożdżach13, a także teorii i praktyki konfokalnego obrazowania 4D komórek drożdży2. Protokół ten koncentruje się na kluczowych praktycznych aspektach eksperymentu z obrazowaniem 4D. Zawiera on pewne ulepszenia wcześniej opisanych procedur, a także zaktualizowane wersje kodu wtyczki ImageJ i dokumentacji. Pokazany przykład koncentruje się na dynamice Golgiego, ale ten protokół jest równie odpowiedni do obrazowania innych przedziałów drożdży.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie

  1. Spraw, aby niefluorescencyjne podłoże minimalnie NSD2. Oczekuje się, że brak ryboflawiny zmniejszy wewnątrzkomórkową zieloną fluorescencję tła i związaną z nią fototoksyczność.
  2. Hodować szczep drożdży przez noc w temperaturze ~23 °C do fazy logarytmicznej w 5 ml NSD w kolbie z przegrodą o pojemności 50 ml z dobrym napowietrzeniem. Około 3-4 godziny przed analizą rozcieńczyć kulturę drożdży w świeżym NSD, tak aby końcowy OD600 wynosił 0,5-0,8 w momencie obrazowania.
  3. Przygotować roztwór 2 mg/ml konkanawaliny A (ConA). W razie potrzeby zamrozić porcje tego roztworu w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  4. Wirować roztwór ConA przez 5 minut z pełną prędkością w mikrowirówce, aby usunąć cząstki stałe, które mogą zakłócać obrazowanie. Następnie dodać 250 μl supernatantu do czystego naczynia mikroskopowego z dnem o średnicy 35 mm. Po 15 minutach przemyć 2-3 razy 2 mldH2O i pozostawić do wyschnięcia.
  5. Dodaj 250 μl kultury drożdży do naczynia pokrytego ConA, odczekaj 10 minut, aby komórki się przylgnęły, i delikatnie przemyj 2-3 razy 2 ml NSD. Przykryj komórki 2 ml świeżego NSD.

2. Obrazowanie

  1. Użyj soczewki zanurzeniowej z olejkiem 63x lub 100x. Wystarczy przysłona numeryczna (NA) 1,40, ale można również użyć obiektywu o wyższej NA.
  2. Sformatuj rozmiar ramki na 256 x 128 (szerokość x wysokość). Jeśli potrzebny jest większy rozmiar ramy, zwiększenie szerokości nie zmniejszy prędkości skanowania, o ile mikroskop konfokalny jest wyposażony w skaner rezonansowy.
  3. Dostosuj współczynnik powiększenia, aby rozmiar piksela wynosił ~80 nm.
  4. Użyj maksymalnej szybkości skanowania, która zwykle wynosi 8 kHz. Włącz dwukierunkowe skanowanie X, jeśli jest dostępne, a eksperymenty kontrolne potwierdzają, że skany z dwóch kierunków są w rejestrze.
  5. Ustaw akumulację linii na 4 lub 6. Pamiętaj, aby używać akumulacji (sumowania) zamiast uśredniania.
  6. Ustaw otworek na 1,2 jednostki Airy. Empirycznie, podczas obrazowania żywych komórek drożdży, to ustawienie przechwytuje więcej fotonów niż standardowy wybór jednostki 1.0 Airy, nie powodując przy tym znaczącej utraty rozdzielczości.
  7. Dla każdego kanału fluorescencji ustaw długość fali wzbudzenia, przypisz detektor o wysokiej czułości, ustaw zakres długości fali emisji i włącz tryb zliczania fotonów, jeśli jest dostępny. Wybór długości fali będzie zależał od fluoroforów. Na przykład wzbudzić fluorescencję GFP przy 485 nm i zebrać od 495-550 nm oraz wzbudzić fluorescencję mScarlet przy 555 nm i zebrać od 562-625 nm.
  8. Ustaw intensywność każdego lasera tak, aby była jak najniższa. To ustawienie musi być określone empirycznie. Odpowiednia intensywność spowoduje uchwycenie hałaśliwej, ale możliwej do zinterpretowania sekwencji obrazu, przy czym sygnał fluorescencji wybieli się nie więcej niż 50% pod koniec 5-minutowego filmu. W zastosowanym tutaj mikroskopie konfokalnym (patrz tabela materiałów) intensywność ta odpowiada ustawieniu mocy lasera rzędu 5%.
  9. Użyj filtrów wycinających lub bramkowania czasowego, aby uniknąć przechwytywania odbitego światła z szkiełka nakrywkowego. Jeśli bramkowanie czasowe jest dostępne, ustaw okno bramkowania na 0,6-10,0 ns.
  10. Włącz obrazowanie w jasnym polu i użyj detektora o niskiej czułości do zbierania danych. Ustaw wzmocnienie na poziomie, który sprawi, że komórki będą wyraźnie widoczne. Nie należy używać różnicowego kontrastu interferencyjnego (DIC), ponieważ pryzmat będzie zakłócał przechwytywanie wiarygodnych danych fluorescencyjnych.
  11. Ustaw interwał kroku Z na 0,25-0,35 μm. Wyobraź sobie całą objętość komórek drożdży, zbierając około 20-25 sekcji optycznych na stos Z. Określ kierunkowość obrazowania w taki sposób, aby "w dół" przesuwał się w kierunku szkiełka nakrywkowego.
  12. W przypadku typowego filmu ustaw odstęp czasu między stosami Z na 2 s i ustaw czas trwania filmu na 5 do 10 minut. W zależności od badanego przedziału zmniejsz interwał, aby uzyskać krótsze filmy o stosunkowo szybkiej dynamice, lub zwiększ interwał, aby uzyskać dłuższe filmy o stosunkowo niskiej dynamice.
  13. Zapisz film jako plik LIF z obrazami w jasnym polu w ostatnim kanale. Na tym etapie nie ma potrzeby stosowania większych głębi bitowych, a potok przetwarzania jest skonfigurowany do akceptowania 8-bitowych danych TIFF.

3. Dekonwolucja

  1. Uruchom oprogramowanie do dekonwolucji (patrz tabela materiałów), używając klasycznego algorytmu szacowania maksymalnego prawdopodobieństwa.
  2. Otwórz zestaw danych wygenerowany w kroku 2.13. Wybierz "Kreator dekonwolucji". Sprawdź wartości wyświetlane w "Kreatorze parametrów". Parametry obrazowania powinny być wykryte i poprawnie wyświetlone. W sekcji "Współczynniki załamania światła" zmień wartość "Embedding med." na 1.40, aby przybliżyć cytoplazmę drożdży. W sekcji "szkiełko nakrywkowe" wybierz "Uruchom edytor" i "Oszacuj pozycję" oraz "OK", aby ustawić pozycję szkiełka nakrywkowego. Wybierz "Ustaw wszystkie zweryfikowane" i "Akceptuj".
  3. Postępuj zgodnie z "Kreatorem dekonwolucji" dla każdego kanału fluorescencji. Wybierz "Ręczny" jako tryb szacowania tła. Sprawdź profil intensywności fluorescencji surowych danych, aby określić szacowaną wartość tła, która zwykle wynosi około 0,1.
  4. W menu ustawień dekonwolucji wprowadź wartość "Maksymalne iteracje" 40 i wyłącz korekcję wybielacza. Wprowadź szacowaną wartość SNR, która zwykle wynosi około 5,0. Kliknij "Deconvolve".
  5. W razie potrzeby wróć do oryginalnego pliku danych, dostosuj wartości tła i SNR, a następnie powtórz dekonwolucję, aż szum zostanie wystarczająco usunięty, nie eliminując prawdziwej fluorescencji ze słabych struktur.
  6. Scal kanały jasnego pola i zdekonwolucji fluorescencji. W kolejnych krokach edycji filmu w ImageJ ułóż kanały w taki sposób, aby czerwony był pierwszy, zielony (jeśli jest) jest następny, niebieski (jeśli jest) jest następny, a jasne pole jest ostatnie. Zapisz sekwencję obrazów jako 8-bitowy plik TIFF.

4. Korekcja wybielacza i generowanie filmów

  1. Zaimportuj zdekonwoluowaną sekwencję obrazów do ImageJ i przekonwertuj ją na hyperstack, wybierając pozycję Obraz > Hyperstacks > Stack do Hyperstack. Wybierz "xyzct" z menu rozwijanego i wypełnij liczbę kanałów, wycinki stosu Z i ramy czasowe (http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector).
  2. Wybierz opcję Obraz > Kolor > Podziel kanały.
  3. Popraw kanały fluorescencji do fotowybielania za pomocą wtyczki ImageJ dostępnej w http://wiki.cmci.info/downloads/bleach_corrector. Po pobraniu i zainstalowaniu tej wtyczki wybierz Wtyczki > EMBLtools > Bleach Correction. Wybierz opcję "Dopasowanie wykładnicze".
  4. Aby scalić kanały fluorescencji z korekcją jasnego pola i wybielacza w hiperstos, wybierz opcje Obraz > Kolor > Scal kanały. Zapisz wynikowy hyperstack jako 8-bitowy plik TIFF.
  5. Zainstaluj niestandardowe wtyczki ImageJ dostarczone z tym protokołem. Postępuj zgodnie z instrukcjami zawartymi w dołączonym dokumencie, aby wyświetlić, edytować i określić ilościowo sekwencję obrazów oraz utworzyć końcowy film z wyświetlanymi stosami Z.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podany tutaj przykład dokumentuje i określa ilościowo dojrzewanie dwóch drożdży Golgi cisternae, co zostało uwidocznione za pomocą dwukolorowej mikroskopii konfokalnej 4D3. Komórka drożdży zawiera około 10-15 cystern Golgi, z których każda dojrzewa w czasie około 2-4 minut. Dojrzewanie można zwizualizować, oznaczając wczesny marker Golgiego Vrg4 za pomocą GFP i oznaczając późny marker Golgiego Sec7 czerwonym białkiem fluorescencyjnym, takim jak mCherry lub mScarlet...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obrazowanie konfokalne 4D organelli drożdży wymaga starannego dostrojenia wielu parametrów. Głównym problemem jest fotowybielanie i fototoksyczność. Typowy film 4D polega na zebraniu tysięcy sekcji optycznych, dlatego oświetlenie lasera musi być utrzymywane na jak najniższym poziomie. Tandemowe fluorescencyjne znaczniki białkowe mogą być używane do wzmacniania sygnału bez zwiększania ekspresji znakowanego białka16,17. Maksymalizacja prędkości skanowania pomaga og...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez grant NIH R01 GM104010. Dziękujemy za pomoc w mikroskopii fluorescencyjnej dla Vytasa Bindokasa i Christine Labno w Integrated Microscopy Core Facility, który jest wspierany przez finansowany przez NIH grant P30 CA014599 Cancer Center Support Grant.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynia ze szklanym dnem 35 mm nr 1.5MatTekP35G-0.170-14-CNaczynia do obrazowania
Concanavalin A w proszkuSigma-AldrichC2010
TroloxVector LaboratoriesCB-1000
Leica SP8Leica Microsystems
Pakiet aplikacji Leica X Oprogramowanie mikroskopowe Leica Microsystems
Oprogramowanie Huygens Essential, wersja 17.04Oprogramowanie do dekonwolucjiobrazowania
ImageJNIHOprogramowanie do przetwarzania i analizy obrazów
Mikroskop konfokalny objętościowego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bevis, B. J., Hammond, A. T., Reinke, C. A., Glick, B. S. De novo formation of transitional ER sites and Golgi structures in Pichia pastoris. Nature Cell Biology. 4 (10), 750-756 (2002).
  2. Day, K. J., Papanikou, E., Glick, B. S. 4D confocal imaging of yeast organelles. Methods in Molecular Biology. 1496, 1-11 (2016).
  3. Losev, E., et al. Golgi maturation visualized in living yeast. Nature. 441 (22), 1002-1006 (2006).
  4. Papanikou, E., Glick, B. S. The yeast Golgi apparatus: insights and mysteries. FEBS Letters. 583 (23), 3746-3751 (2009).
  5. Matsuura-Tokita, K., Takeuchi, M., Ichihara, A., Mikuriya, K., Nakano, A. Live imaging of yeast Golgi cisternal maturation. Nature. 441 (22), 1007-1010 (2006).
  6. Day, K. J., Casler, J. C., Glick, B. S. Budding yeast has a minimal endomembrane system. Developmental Cell. 44 (1), 56-72 (2018).
  7. Papanikou, E., Day, K. J., Austin, J., Glick, B. S. COPI selectively drives maturation of the early Golgi. eLife. 4, 13232(2015).
  8. Rothstein, R. Targeting, disruption, replacement, and allele rescue: integrative DNA transformation in yeast. Methods in Enzymology. 194, 281-301 (1991).
  9. Carlton, P. M., et al. Fast live simultaneous multiwavelength four-dimensional optical microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (37), 16016-16022 (2010).
  10. Laissue, P. P., Alghamdi, R. A., Tomancak, P., Reynaud, E. G., Shroff, H. Assessing phototoxicity in live fluorescence imaging. Nature Methods. 14 (7), 657-661 (2017).
  11. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays. 39 (8), 1700003(2017).
  12. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  13. Bialecka-Fornal, M., Makushok, T., Rafelski, S. M. A review of fluorescent proteins for use in yeast. Methods in Molecular Biology. 1369, 309-346 (2016).
  14. Day, K. J., et al. Improved deconvolution of very weak confocal signals. F1000Research. 6, 787(2017).
  15. Bhave, M., et al. Golgi enlargement in Arf-depleted yeast cells is due to altered dynamics of cisternal maturation. Journal of Cell Science. 127, Pt 1 250-257 (2014).
  16. Rossanese, O. W., et al. A role for actin, Cdc1p and Myo2p in the inheritance of late Golgi elements in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Cell Biology. 153 (1), 47-61 (2001).
  17. Connerly, P. L., et al. Sec16 is a determinant of transitional ER organization. Current Biology. 15 (16), 1439-1447 (2005).
  18. Genové, G., Glick, B. S., Barth, A. L. Brighter reporter genes from multimerized fluorescent proteins. BioTechniques. 39 (6), 814-822 (2005).
  19. Pawley, J. B. Handbook of Biological Confocal Microscopy. 3rd edn. , Springer. (2006).
  20. Ishii, M., Suda, Y., Kurokawa, H., Nakano, A. COPI is essential for Golgi cisternal maturation and dynamics. Journal of Cell Science. 129 (17), 3251-3261 (2016).
  21. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740(2015).
  22. Grimm, J. B., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  23. Casler, J. C., et al. Maturation-driven transport and AP-1-dependent recycling of a secretory cargo in the Golgi. Journal of Cell Biology. , Epub ahead of print (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Mikroskopia konfokalna 4Dobrazowanie kom rek dro d ydynamika przedzia w wewn trzkom rkowychledzenie cystern aparatu Golgiegoanaliza przebiegu fluorescencji w czasieanaliza z u yciem wtyczki ImageJkorekcja bleachowania poprzez dekonwolucjoptyczne sekcjonowanie Z stackhodowla ywych kom rek dro d ylokalizacja marker w fluorescencyjnych

Powiązane artykuły