Artykuł metodologiczny

Opracowanie podwójnego humanizowanego modelu myszy TK-NOG dla patogenezy wątroby związanej z HIV

DOI:

10.3791/58645

⸱

11 września 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Experimental Neuroscience, University of Nebraska Medical Center, 2Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół zapewnia niezawodną metodę tworzenia humanizowanych myszy z ludzkim układem odpornościowym i komórkami wątroby. Podwójnie odtworzone myszy z niedoborem odporności uzyskane przez wstrzyknięcie dośledzionowe ludzkich hepatocytów i hematopoetycznych komórek macierzystych CD34 + są podatne na zakażenie ludzkim wirusem niedoboru odporności-1 i rekapitulują uszkodzenie wątroby, jak obserwowano u pacjentów zakażonych wirusem HIV.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo zwiększonej średniej długości życia pacjentów zakażonych ludzkim wirusem niedoboru odporności-1 (HIV-1), choroby wątroby stały się częstą przyczyną ich zachorowalności. Immunopatologia wątroby wywołana przez HIV-1 pozostaje nieuchwytna. Małe modele zwierzęce ksenoprzeszczepów z ludzkimi hepatocytami i ludzkim układem odpornościowym mogą podsumować ludzką biologię patogenezy choroby. W niniejszym dokumencie opisano protokół mający na celu ustanowienie podwójnego humanizowanego modelu myszy za pomocą ludzkich hepatocytów i przeszczepu hematopoetycznych komórek macierzystych / progenitorowych CD34 + (HSPC), w celu zbadania immunopatologii wątroby obserwowanej u pacjentów zakażonych wirusem HIV. Aby osiągnąć podwójną rekonstytucję, samcom myszy TK-NOG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug Tg(Alb-TK)7-2 / ShiJic) wstrzykuje się dootrzewnowo dawki gancyklowiru (GCV) w celu wyeliminowania transgenicznych komórek wątroby myszy oraz treosulfanu w celu kondycjonowania niemieloablalacyjnego, z których oba ułatwiają wszczepienie ludzkich hepatocytów (HEP) i rozwój ludzkiego układu odpornościowego (HIS). Poziomy albuminy ludzkiej (ALB) są oceniane pod kątem wszczepienia wątroby, a obecność ludzkich komórek odpornościowych we krwi wykryta za pomocą cytometrii przepływowej potwierdza powstanie ludzkiego układu odpornościowego. Model opracowany przy użyciu opisanego tutaj protokołu przypomina wiele składowych uszkodzenia wątroby w wyniku zakażenia wirusem HIV-1. Jego ustanowienie może okazać się niezbędne dla badań nad jednoczesnym zakażeniem wirusem zapalenia wątroby oraz dla oceny leków przeciwwirusowych i antyretrowirusowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Od czasu pojawienia się terapii antyretrowirusowej, nastąpił znaczny spadek liczby zgonów związanych z monoinfekcją HIV-1. Jednak choroby wątroby stały się częstą przyczyną zachorowalności u pacjentów zakażonych wirusem HIV1,2. Koinfekcje wirusami zapalenia wątroby z zakażeniem HIV-1 są bardziej powszechne i stanowią 10% - 30% osób zakażonych wirusem HIV w Stanach Zjednoczonych3,4,5.

Specyficzność wirusów HIV-1 i zapalenia wątroby ogranicza użyteczność małych modeli zwierzęcych do badania chorób zakaźnych specyficznych dla człowieka lub do badania wielu aspektów patogenezy wątroby związanej z HIV-1. Myszy z niedoborem odporności, które pozwalają na wszczepienie ludzkich komórek i/lub tkanek (określane jako humanizowane modele myszy) są dopuszczalnymi modelami zwierzęcymi do badań przedklinicznych6,7,8. Od czasu wprowadzenia humanizowanych myszy na początku 2000 roku, wiele badań przedklinicznych nad cholestatycznym ludzkim toksycznym działaniem na wątrobę, patogenami specyficznymi dla człowieka, w tym HIV-1 i zaburzeniami neurokognitywnymi związanymi z HIV, wirusem Epsteina-Barra, zapaleniem wątroby i innymi chorobami zakaźnymi, badano na tych myszach6,9,10,11. Wiele mysich modeli HSPC CD34+ i/lub przeszczepu ludzkich hepatocytów zostało opracowanych od dawna i z czasem uległo poprawie w celu zbadania patogenezy choroby wątroby związanej z wirusem zapalenia wątroby typu B (HBV)12,13,14. Kilka modeli do przeszczepu HSPC i ludzkich hepatocytów (HEP) opiera się na szczepach, znanych jako NOG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Sug/JicTac)8,13, NSG (NOD.Cg-Prkdc scid Il2rgtm1Wjl/SzJ)15, Balb/C-Rag2-/- γc-/- (Rag2tm1.1Flv Il2rgtm1.1Flv/J)12, oraz fah-/- NOD rag1-/-il2rγnull mouse16. Jednak każdy model ma swoje zalety i ograniczenia; na przykład podwójnie humanizowane myszy AFC8 dla HEP i ludzkich komórek macierzystych (HSC) na tle Balb/C-Rag2-/- γc-/- umożliwia pomyślne wszczepienie komórek odpornościowych i HSC, ale w tym modelu nie ma odpowiedzi komórek T i B specyficznej dla antygenu12. Główne problemy związane z odtworzeniem podwójnie humanizowanych myszy obejmują nieoptymalne wszczepienie, brak odpowiednich modeli do wspierania różnych tkanek, niedopasowane warunki, odrzucenie immunologiczne lub chorobę przeszczep przeciwko gospodarzowi (GVHD) oraz trudności techniczne, takie jak ryzykowne manipulacje noworodkami i wysoka śmiertelność z powodu nieprawidłowości metabolicznych13.

Chociaż humanizowane myszy są wykorzystywane do badań nad HIV od wielu lat17,18,19, wykorzystanie humanizowanych myszy do badania uszkodzeń wątroby spowodowanych przez HIV-1 zostało ograniczone20. Wcześniej informowaliśmy o stworzeniu podwójnie humanizowanego modelu myszy TK-NOG i jego zastosowaniu w chorobach wątroby związanych z HIV8. Model ten pokazuje silne wszczepienie wątroby i komórek odpornościowych oraz podsumowuje patogenezę zakażenia wirusem HIV. W tej dyskusji przedstawiono szczegółowy protokół, w tym najważniejsze etapy przeszczepiania ludzkich hepatocytów. Przedstawiono również opis HSPC wymaganych do pomyślnego wszczepienia HEP i ustanowienia funkcjonalnego układu odpornościowego u myszy TK-NOG. Szczegółowo opisano zastosowanie tych myszy do badania immunopatogenezy wątroby związanej z HIV. Wykorzystuje się samce myszy TK-NOG z transgenem kinazy tymidynowej wirusa opryszczki pospolitej typu 1 specyficznym dla wątroby (HSV-TK). Komórki wątroby myszy wykazujące ekspresję tego transgenu można łatwo usunąć po krótkiej ekspozycji na nietoksyczną dawkę GCV. Przeszczepione ludzkie komórki wątroby są stabilnie utrzymywane w wątrobie myszy bez leków egzogennych21. Myszy są również wstępnie kondycjonowane niemieloablacyjnymi dawkami treosulfanu, aby stworzyć niszę w szpiku kostnym myszy dla komórek ludzkich8. Myszom TK-NOG z niedoborem odporności wstrzykuje się doplenionowo HEP i multipotencjalne HSPC. Myszy są następnie regularnie monitorowane pod kątem rekonstytucji krwi i wątroby poprzez immunofenotypowanie krwi i pomiary poziomu albuminy ludzkiej w surowicy. Myszy, u których udało się odtworzyć więcej niż 15% zarówno ludzkich komórek odpornościowych, jak i HEP, są wstrzykiwane dootrzewnowo z HIV-1. Wpływ wirusa HIV na wątrobę można ocenić już po 4-5 tygodniach od zakażenia. Należy zauważyć, że ze względu na stosowanie wirusa HIV-1 należy podjąć wszelkie niezbędne środki ostrożności podczas obchodzenia się z wirusem i wstrzykiwania go myszom.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w Centrum Medycznym Uniwersytetu w Nebrasce.

UWAGA: Uzyskaj zgodę lokalnego IACUC przed przeprowadzeniem eksperymentów na zwierzętach.

1. Przetwarzanie krwi pępowinowej i izolacja ludzkich HSPC

  1. Wykonaj wszystkie kroki protokołu w sterylnych warunkach w komorach z przepływem laminarnym.
  2. Pobrać krew pępowinową (CB) zebraną w probówkach z heparyną i zwiększyć objętość do 35 ml, dodając sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Ułóż próbkę na pożywce do separacji limfocytów (LSM), jak pokazano na Rysunek 1 i odwiruj LSM z warstwowym CB o wymiarach 400 x g przez 35 minut w temperaturze 4 °C bez hamulców.
    UWAGA: Rozcieńczyć krew ostrożnie i delikatnie, aby uniknąć mieszania na granicy faz.
  3. Ostrożnie usuń górną warstwę LSM i plazmy i przenieś interfejs białego kożucha do nowej probówki za pomocą pipety transferowej.
  4. Zawiesić kożuchę w 30 - 40 ml lodowatego buforu (PBS + 0,5% albuminy surowicy bydlęcej [BSA] + 2 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy [EDTA]). Za pomocą pipety połączyć 20 μl zawiesiny komórek z 20 μl 0,4% błękitu trypanowego i odpipetować 10 μl mieszaniny do zewnętrznego otworu jednej z dwóch komór szkiełka liczącego i włożyć szkiełko do automatycznego licznika komórek w celu zliczenia komórek.
    nuta: Używaj lodowatego bufora na wszystkich etapach, ponieważ pomaga on utrzymać komórki przy życiu.
  5. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ostrożnie odessać supernatant. Następnie dodaj 300 μl lodowatego buforu.
  6. Dodać 100 μl ludzkiego odczynnika blokującego receptor Fc i 100 μl monoklonalnych mysich mikrogranulek sprzężonych z przeciwciałami anty-ludzkimi CD34 dla maksymalnie 1 x10 8 komórek (patrz tabela materiałów). Inkubować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, dodać 10 ml lodowatego buforu w celu przepłukania komórek i odwirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    nuta: Przeskaluj to w górę zgodnie z numerem komórki, jeśli obecnych jest więcej niż 1 x 108 komórek.
  7. Ostrożnie usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 500 μl buforu i kontynuować etap separacji magnetycznej w celu wzbogacenia HSPC.
  8. Umieść kolumnę LS o pozytywnej selekcji (patrz Tabela materiałów) w polu sortowania komórek aktywowanych magnetycznie i przepuść ją przez 3 ml buforu.
  9. Załaduj próbkę do kolumny LS, która może uwięzić mikrogranulki związane z ludzkim CD34+ w próbkach i pozwolić im przepływać pod wpływem grawitacji do probówki zbiorczej.
  10. Przemyć kolumnę 3x buforem i zebrać elucję w tej samej probówce zbiorczej frakcji CD34- komórek.
  11. Zanurz kolumnę z 5 ml buforu, aby wymyć komórki CD34 + do nowej probówki zbiorczej. Powtórz procedurę, aby uzyskać czystość >90%.
  12. Policz eluowane komórki CD34 + za pomocą barwnika błękitu trypanowego w hemocytometrze. Po zliczeniu odwirować komórki CD34+ o masie 300 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  13. Ponownie zawiesić komórki CD34+ w 25 μl PBS w celu wstrzyknięcia do natychmiastowego użycia w przeszczepie lub kriokonserwować komórki w stężeniu 1-2 milionów/ml w pożywce do zamrażania (pożywka Roswell Park Memorial Institute [pożywka RPMI 1640] + 50% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) + 10% dimetylosulfotlenku [DMSO]) do dalszego wykorzystania w transplantacji.
    nuta: Zawsze przeliczaj żywe komórki przed użyciem ich w przeszczepie.
  14. Aby sprawdzić czystość elucji CD34+, należy pobrać 50 μl zawiesiny i inkubować ją z 10 μl przeciwciała anty-ludzkiego CD34 sprzężonego z PE przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Po inkubacji przeciwciał przemyć wybarwione komórki PBS, ponownie zawiesić je w 100 μl PBS, a następnie przystąpić do wykonania cytometrii przepływowej. Dodaj dodatkową rurkę z komórkami bez przeciwciał, aby zaprojektować bramkę w cytometrze przepływowym.
  15. Po akwizycji przeanalizuj dane, wybierając obszar zainteresowania na wykresie rozproszenia do przodu (FSC) i rozrzutu bocznego (SSC), a następnie bramkowanie dla pojedynczych komórek na wykresach obszaru FSC i wysokości FSC. Bramka CD34-dodatnich komórek na pojedynczych komórkach w kanale PE i wykresie obszaru SSC.

2. Przygotowanie ludzkich hepatocytów do przeszczepu

  1. Usuń kriokonserwowane hepatocyty z ciekłego azotu, szybko zanurz fiolkę w łaźni wodnej i rozmrażaj przez około 90 - 120 s.
  2. Zdjąć nakrętkę fiolki i wlać rozmrożone hepatocyty do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z podgrzanym podłożem do rozmrażania.
  3. Zawieś komórki, kołysząc ręcznie probówką o pojemności 50 ml przez kilka sekund.
    nuta: Nie obracaj rurki.
  4. Granulować komórki w temperaturze 100 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej. Umyć granulowane komórki w PBS 0,1% BSA i połączyć je ze świeżymi lub rozmrożonymi HSPC (stosunek 10:1) w PBS w końcowej objętości 80 μl/mysz.

3. Postępowanie ze zwierzętami, badania przesiewowe, genotypowanie i leczenie przeszczepu ludzkich HSPC i hepatocytów

  1. Postępowanie ze zwierzętami
    1. W wyniku ciężkiego niedoboru odporności myszy TK-NOG należy hodować, trzymać i obchodzić się z nimi w warunkach aseptycznych.
    2. Zawsze noś fartuch laboratoryjny, rękawice, ochraniacze na buty i maskę na twarz, aby zapobiec zakażeniu potencjalnie chorobotwórczymi mikroorganizmami.
    3. Do operacji należy używać sterylnych rękawic i narzędzi oraz obchodzić się ze zwierzętami w sposób aseptyczny przez cały czas trwania zabiegu.
  2. Wybór myszy TK-NOG do eksperymentu
    1. Utrzymuj kolonię szczepu TK-NOG poprzez hodowlę samic myszy TK-NOG z samcami rodzeństwa z miotu innych niż TK-NOG i wybierz transgeniczne potomstwo przez genotypowanie.
      nuta: Przeprowadzić genotypowanie (patrz krok 3.3) w celu określenia obecności lub braku transgenu u nowonarodzonych samców i samic myszy w momencie odsadzenia.
    2. Wybieraj samców w wieku 6-8 tygodni do przeszczepu ze względu na ich wysoką wrażliwość na niedobór hepatocytów eksprymujących transgen HSV-TK za pośrednictwem GCV21.
    3. Zakolczykuj uszy myszy w momencie odsadzenia od piersi lub operacji, aby ułatwić identyfikację. Zanotuj wagę i stan zdrowia zwierząt.
  3. Genotypowanie na obecność transgenu HSV-TK przy użyciu ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym
    1. Genotypowanie należy wykonać w momencie odsadzenia (zwykle w wieku 3-4 tygodni). W celu genotypowania wytnij kawałek ucha myszy w komorze bezpieczeństwa biologicznego z przepływem laminarnym, aby zachować sterylność i wyodrębnić genomowe DNA za pomocą zestawu do izolacji genomowego DNA.
    2. Amplifikować genomowe DNA wyekstrahowane z słuchawki w mieszaninie reakcyjnej o stężeniu 20 μl w celu przeprowadzenia badania przesiewowego transgenu HSV-TK pod kontrolą ludzkiego promotora albuminy poprzez dodanie 1 μl startera do przodu 5'-CCATGCACGTCTTTATCCTGG-3', 1 μL startera odwrotnego 5'-TAAGTTGCAGCAGGGCGTC-3', 0,5 μL sondy FAM 5′-FAM-AATCGCCCGCCGGCTGC-MGB-3', i 10 μl mieszanki wzorcowej na urządzeniu do reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w czasie rzeczywistym22.
    3. Ustaw ustawienia PCR w czasie rzeczywistym w następujący sposób: 60 °C przez 30 s (etap odczytu), 95 °C przez 10 minut (etap wstrzymania), 40 cykli po 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 1 minutę (etap PCR) i 60 °C przez 30 s (etap po odczytie).
      nuta: Cykl progu (Ct) poniżej 22 jest uważany za dodatni dla transgenu HSV-TK.
  4. Leczenie z użyciem gancyklowiru i treosulfanu
    1. Za pomocą igły 27 G wstrzyknij myszom TK-NOG dootrzewnowe zastrzyki GCV (6 mg / kg) 2 razy dziennie w 7 dniu i w dniu 5 w 100 μl soli fizjologicznej przed operacją w celu wyczerpania transgenicznych komórek miąższowych myszy (jak pokazano w strategii eksperymentalnej w Rysunek 2)23.
    2. W dniach 3, 2 i 1 przed operacją należy wstępnie przygotować myszy za pomocą niemieloablacyjnych dootrzewnowych dawek treosulfanu (1,5 g / kg / dzień) w 100 μl soli fizjologicznej, używając igły 27 G.
    3. Na dzień przed zabiegiem należy pobrać dwie do trzech kropli (~100 μl) krwi z żyły podżuchwowej, nakłuwając ją lancetem o średnicy 5 mm, i wyizolować surowicę przez odwirowanie (1500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C) do testu aminotransferazy alaninowej (ALT) w celu oceny stopnia uszkodzenia wątroby.
  5. Przygotowanie do zabiegu
    1. Użyj maszynki do strzyżenia, aby ogolić sierść myszy otaczającą miejsce nacięcia (po lewej stronie ściany otrzewnej) przed zabiegiem.
    2. Dostosuj przepływ tlenu do 1 l/min, a przepływ izofluranu do 3% - 5% w komorze indukcyjnej za pomocą urządzenia do znieczulania myszy. Umieszczaj jedną mysz na raz w komorze indukcyjnej w celu znieczulenia.
    3. Podłączyć jeden koniec sterylnej probówki przedłużającej (o pojemności 550 μl zawiesiny; specyfikacje znajdują się w Tabeli Materiałów) do igły 30 G, a drugi koniec do strzykawki o pojemności 1 ml.
    4. Napełnić strzykawkę zawiesiną (80 μl/mysz) połączonych HEP i HSPC (patrz punkt 2), umieścić strzykawkę w nacięciu powtarzalnej pipety dozującej i wyregulować dozownik tak, aby dozował 10 μl w każdym naciśnięciu.
    5. Po znieczuleniu myszy (zwykle po 3 - 4 minutach) przełącz przepływ izofluranu na stożek nosowy i zmniejsz szybkość przepływu izofluranu do 2% - 3%.
  6. Przeszczepienie do śledziony ludzkich HSPC i hepatocytów u myszy
    1. Wszystkie etapy operacji należy wykonać w komorze z przepływem laminarnym w sterylnych warunkach.
    2. Umieścić czystą, sterylną serwetę na powierzchni roboczej i wyszorować lewą stronę ciała każdej myszy 10 % jodowidonu, a następnie 70 % alkoholu izopropylowego, przed wykonaniem nacięcia.
    3. Wykonaj małe nacięcie (~1 - 1,5 cm długości i 5 mm głębokości) w skórze, mięśniach i otrzewnej po lewej stronie ściany otrzewnej nożyczkami typu Vanna, aby wejść do jamy otrzewnej około 5 mm poniżej dolnej krawędzi klatki piersiowej.
    4. Zlokalizuj śledzionę, pociągnij ją lekko kleszczami do obszaru operacyjnego, aby uzyskać łatwy dostęp, i włóż igłę 30 G w dolny biegun śledziony.
    5. Odblokuj tłok pipety dozującej i dozuj jednorazowo 10 μl objętości, z ograniczeniem do 60 - 80 μl na śledzionę. Powoli cofnąć igłę i przyciąć śledzionę klipsami do podwiązywania za pomocą aplikatora do podwiązywania.
    6. Wepchnij śledzionę z powrotem do jamy ciała za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką zwilżonych sterylnym PBS.
    7. Zamknij warstwę mięśniową ściany brzucha za pomocą wchłanialnego szwu przerywanego wzoru szwów (nie ciągłego). Osiągnij zamknięcie skóry za pomocą przerwanego wzoru szwów za pomocą szwów niewchłanialnych.
    8. Używaj wkładek cyrkulacyjnych z ciepłą wodą, aby chronić myszy przed hipotermią po operacji.
    9. Niewchłanialne szwy należy usunąć 10-14 dni po zabiegu.
  7. Opieka pooperacyjna
    1. Kiedy przeszczepione zwierzę się obudzi, należy wstrzyknąć przeciwbólową buprenorfinę (0,1 mg/kg) dootrzewnowo, 2 razy dziennie przez kolejne 3 dni.
    2. Obserwuj zwierzęta co najmniej 1 raz dziennie, aż powrócą do normalnych warunków fizycznych.
      nuta: Sprawdź masę ciała każdego zwierzęcia, ponieważ niektóre myszy mogą schudnąć po operacji. Myszy zazwyczaj odzyskują swoją pierwotną wagę w ciągu 1 do 2 tygodni.

4. Walidacja wszczepienia ludzkiej wątroby za pomocą testu ELISA i ludzkiego układu odpornościowego za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Oceniaj rekonstytucję ludzkiej wątroby i układu odpornościowego co miesiąc, zaczynając 1 miesiąc po przeszczepie, odpowiednio za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) i cytometrii przepływowej.

  1. Pobrać próbki krwi z żyły podżuchwowej za pomocą lancetów w probówkach EDTA i odwirować przy 1 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Wyizolować surowicę w celu sprawdzenia poziomu albuminy ludzkiej w celu oceny skuteczności wszczepienia wątroby myszy dla przeszczepionych ludzkich hepatocytów, używając zestawu do oznaczania ilościowego ELISA albuminy ludzkiej (patrz Tabela materiałów), postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    nuta: Nie należy wyrzucać osadu i używać granulowanych komórek do analizy cytometrii przepływowej w celu oceny rekonstytucji układu odpornościowego człowieka.
  2. Zawiesić osad komórkowy bez surowicy w 35 μl buforu FACS (PBS + 2% FBS) i wybarwić 5 μl specyficznego dla myszy CD45 (stężenie 0,5 mg/ml), po 5 μl przeciwciał swoistych dla człowieka CD45 (0,1 mg/ml), CD3 (0,2 mg/ml), CD8 (0,1 mg/mL) i CD19 (0,5 mg/ml) oraz 20 μl CD4 (0,25 mg/mL) i CD14 (0,25 mg/ml) każdy przez 30 min w temperaturze 4 °C, w celu sprawdzenia rozwoju funkcjonalnego układu odpornościowego z CD34+ HSPCs.
    nuta: Rozważ dodanie jednej dodatkowej rurki z niebarwionymi komórkami, aby określić bramkowanie barwionych komórek.
  3. Po inkubacji przenieść zabarwioną zawiesinę (~100 μl) do probówki do cytometrii przepływowej z polistyrenu i użyć 2 ml 1x buforu do lizy (patrz tabela materiałów), rozcieńczając 1 część 10x buforu do lizy z 9 częściami wody destylowanej i inkubując 10 - 15 minut w celu lizy czerwonych krwinek.
    UWAGA: Obserwuj zmętnienie, aby ocenić lizę czerwonych krwinek. Gdy próbka stanie się klarowna, liza jest zakończona.
  4. Po lizie dodać 3 ml buforu FACS do probówki i odwirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut, aby uzyskać osad. Powtórzyć mycie, dodając 3 ml buforu FACS do osadu i odwirować przy 300 x g w temperaturze 4 °C przez 5 minut.
  5. Utrwal komórki w świeżo przygotowanym 1% paraformaldehydzie (PFA) i uzyskaj wybarwione komórki na cytometrze przepływowym, przeanalizowane za pomocą oprogramowania do przepływu.
  6. Do analizy wybierz limfocyty bramkujące na powierzchni FSC/SSC, a następnie bramkowanie jednokomórkowe na obszarze FSC/wysokości FSC.
  7. Ponadto bramka dla CD45 specyficznego dla człowieka (hCD45) w populacji pojedynczych komórek i uwzględnij specyficzny dla myszy CD45 (mCD45) w celu wykluczenia komórek pochodzenia mysiego. Opracuj strategię bramkowania barwionej populacji w oparciu o bramkowanie niebarwionych komórek.
  8. Bramka komórek hCD45 + w celu określenia częstotliwości limfocytów T CD3 + i limfocytów B CD19 +. Limfocyty T bramki w celu określenia podzbiorów CD4 i CD8. Aby ocenić monocyty, włącz hCD45 w celu określenia monocytów CD14 +.

5. Zakażenie wirusem HIV myszy TK-NOG i jego wpływ na ludzką wątrobę i układ odpornościowy

  1. Z wirusem HIV-1 i wszystkimi zakażonymi myszami należy obchodzić się w wyznaczonym obiekcie o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2.
    ostrożność: Autoklaw i wyrzuć wszystkie odpady zakażone wirusem HIV do podwójnych worków na zagrożenia biologiczne. Ze względów bezpieczeństwa należy nosić rękawice odporne na przecięcia podczas trzymania myszy zakażonych wirusem HIV.
  2. Podczas pracy z wirusem należy nosić środki ochrony osobistej (PPE), w tym jednorazowy fartuch na kombinezon, ochraniacze na buty, maskę na twarz i podwójne rękawice.
  3. Wybierz myszy z odtworzeniem więcej niż 15% ludzkich komórek CD45+ (testowane w kroku 4.7) i z obecnością albuminy ludzkiej w surowicy pod kątem zakażenia HIV-1 (testowane w kroku 4.1).
  4. Wstrzyknąć myszom 1 x 103 do 1 x 104 dawki zakaźne w kulturze tkankowej 50 (TCID50) HIV-1ADA w objętości 100 - 200 μl na mysz, dootrzewnowo.
  5. Myszy zakażone wirusem HIV należy poddać eutanazji 5 tygodni po zakażeniu za pomocą izofluranu (o stężeniu par izofluranu >5%).
  6. Po eutanazji myszy należy zebrać krew w probówkach EDTA przez nakłucie serca w celu wyizolowania surowicy, aby zobaczyć wpływ HIV-1 na wątrobę poprzez ocenę specyficznych dla człowieka poziomów albuminy za pomocą testu ELISA (patrz krok 4.1) i komórek krwi w celu sprawdzenia zmian w ludzkich komórkach odpornościowych za pomocą cytometrii przepływowej (patrz kroki 4.2 - 4.8).
    nuta: Oceń wiremię obwodową 5 tygodni po zakażeniu na bioanalizatorze, aby potwierdzić, czy myszy są zakażone.
  7. Po pobraniu krwi należy wyciąć wątrobę od myszy poddanych eutanazji.
  8. W celu wycięcia wątroby należy odsłonić jamę brzuszną, wykonując nacięcie o długości 1,5 - 2 cm i głębokości 0,5 cm w skórze, mięśniach i otrzewnej od ksyloidu. Wykonaj cięcie prostopadłe do kręgosłupa między wątrobą a przeponą. Podnieś wątrobę i odetnij wszelkie błony łączące ją z żołądkiem i jelitami.
  9. Zbierz i utrwal wątrobę w 4% paraformaldehydzie przez noc i postępuj zgodnie ze standardowym protokołem immunohistochemicznym, aby ocenić wpływ HIV na hepatocyty CK18 + przy użyciu swoistego dla człowieka przeciwciała CK18 8.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stworzenie podwójnie humanizowanego modelu myszy z ludzką wątrobą i komórkami odpornościowymi można łatwo monitorować na każdym etapie za pomocą bardzo prostego testu ELISA i cytometrii przepływowej. Cytometria przepływowa jest regularnie wykonywana w celu oceny rozwoju funkcjonalnego układu odpornościowego i zobaczenia wpływu zakażenia wirusem HIV na komórki odpornościowe. U podwójnie humanizowanych myszy rozwój funkcjonalnych komórek odpornościowych może wynosić od 15% do 90% bramki lim...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wątroba jest uszkodzona i uszkodzona u pacjentów zakażonych wirusem HIV24. Eksperymentalne modele na małych zwierzętach do badania chorób wątroby u ludzi w obecności HIV-1 są niezwykle ograniczone, pomimo dostępności kilku kotransplantowanych modeli zwierzęcych z HSPC CD34 + i hepatocytami 7,12,25. W eksperymentach in vitro wykazano, że hepatocyty mają niski poziom zakażenia HIV-1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez R24OD018546 grantowe Narodowego Instytutu Zdrowia (dla L.Y.P. i S.G.). Autorzy pragną podziękować dr Weizhe Li za pomoc w zabiegach chirurgicznych, Amandze Branch Woods, B.S., Yan Cheng za immunohistologię, członkom ośrodka badawczego cytometrii przepływowej UNMC dyrektorowi dr Phillipowi Hexleyowi, Victorii B. Smith i Samanthy Wall, B.S., CZŁONKOM GŁÓWNEGO OŚRODKA ZAAWANSOWANEJ MIKROSKOPII UNMC Janice A. Taylor, B.S. i Jamesowi R. Talasce, B.S., za wsparcie techniczne. Autorzy dziękują dr Mamoru Ito i Hiroshi Suemizu z CIEA za dostarczenie myszy TK-NOG oraz dr Joachimowi Baumgartowi za dostarczenie treosulfanu. Autorzy dziękują dr Adrian Koesters z UNMC za jej wkład redakcyjny w powstanie manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igły 27 G1/2"BD biosciences305109
30 igieł G1/2"BD biosciences305106
5 ml polistyrenu  probówka okrągłodenna 12 mm x 75 mm stylCorning352054
BD 1 mL strzykawka tuberkulinowa bez igłyBD biosciences309659
Bioanalizator matrycowy BD FACS BD BiosciencesDo kontroli czystości eluowanych komórek CD34+ 
Oprogramowanie macierzy BD FACSBD Biosciencesdo analizy nabytej komórki CD34+ na macierzy FACS
Roztwór lizujący BD FACS Roztwór do lizyBD Biosciences349202Do lizy czerwonych krwinek
BD LSR IIBD BiosciencesInstrument do pozyskiwania próbek cytometrii
BD  Vacutainer Plastikowa probówka do pobierania krwiBD biosciencesBD 367874Do pobierania krwi pępowinowej
Albumina surowicy bydlęcej Sigma-aldrichA9576
BuprenorfinaSubstancja kontrolowana i środek przeciwbólowy
CD14-PEBD Biosciences555398Specyficzny dla człowieka
CD19-BV605BD Biosciences562653Specyficzny dla człowieka
CD34 MicroBead Kit, ludzkiMiltenyi Biotec130-046-702Do izolacji    CD34+ HSPC
CD34-PE, ludzkiMiltenyi Biotec130-081-002Przeciwciało stosowane do kontroli czystości eluowanych komórek CD34+ 
CD3-AF700BD Biosciences557943Specyficzny dla człowieka
CD45-PerCPCy5.5BD Biosciences564105Specyficzny dla człowieka
CD4-APCBD Biosciences555349Specyficzny dla człowieka
CD8-BV421BD Biosciences562428Specyficzny dla człowieka
Szkiełka do liczenia komórekBio-rad1450015
Zestaw tkanek ChargeSwitch gDNA MiniThermofisherCS11204naukowy do ekstrakcji genomowego DNA z wkładki dousznej
System Cobas Amplicor v1.5 Roche Molecular Diagnosticsdo pomiaru wiremii
Aplikatory z bawełnianą końcówką   McKesson24-106-2S
Cytokeratin-18 (CK18)DAKOM7010Specyficzny dla człowieka
DMSO (dimetylosulfotlenek)Sigma-aldrichD2650-5X5ML
Zestaw przedłużający Microbore Slide Clamp(s) Naprawiono męski Luer Lock. L: 60 cali L: 152 cm PV: 0,55 ml Ścieżka płynu SterylneBD biosciences30914Dołączony do pipety dozującej i do załadowania z HSPC i HEP Zawiesina
FACS Diva wersja 6BD Bioscienceswymagane do  pobrania próbki
Płodowa surowica bydlęca (FBS)Gibco10438026
FLOWJO
v10.2		FLOWJO, oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej
GanciclovirAPP Pharmaceuticals, Inc.315110Lek recepturowy
Greiner MiniCollect Probówki EDTAGreiner bio-one450475
Pożywka do rozmrażania hepatocytów Laboratoria Badawcze Trójkąta MCHT50
Horizon Open Ligating Clip AppliersTeleflex537061Do trzymania klipsów ligujących
Hospira Sterylna woda do wstrzykiwańACE surgical supply co., Inc.001-1187Do rozcieńczania buprenorfiny (środka przeciwbólowego)
Zestaw do oznaczania ilościowego ELISA albuminy ludzkiejLaboratoria BethylE80-129Do oceny poziomu albuminy ludzkiej w surowicy
myszy Ludzkie hepatocytyTriangle Research Labs HUCP1  Kriokonserwowane hepatocyty ludzkie, kwalifikowane do indukcji 
Nożyczki do irysa, prosteTed Pella, Inc.13295
LancetMEDIpointNawłoć 5 mm
Kolumny LS Miltenyi Biotec130-042-401Służy do wychwytywania mikrogranulek CD34+ (selekcja pozytywna)
Pożywka do separacji limfocytów (LSM)MP Biomedicals50494Do izolacji    limfocyty z krwi obwodowej
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303zawiera separator Qudro MACS i kolumny LS
McPherson-Vannas Micro Dissecting Spring ScissorsRoboz Surgical Instrument Co.RS-5605Służy do wykonywania nacięcia na skórze w celu odsłonięcia śledziony
Mikro kleszcze preparacyjneRoboz Surgical Instrument Co.Złącze RS-5157 do trzymania i wyciągania śledziony z jamy otrzewnej
mysz CD45-FITCBD Biosciences553080
PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem)HyclonSH30256.02
Separator Qudro MACS Miltenyi Biotec130-090-976mieści cztery kolumny LS
RPMI 1640 mediumGibco11875093
StepOne Plus Real Time PCR Applied BiosystemsInstrument używany  do  genotyp
Pipeta dozująca powtarzalne z serii stepper 1mlDYMAX CORPT15469Używany do  dozowania  Wspomaganie HSPC i HEP w sposób kontrolowany
Suturevet PGA syntetyczny szew absorbaleHenry Schein Animal Health41178Szycie skóry i otrzewnej
TaqMan Gene Expression Master MixThermofisher 4369016
naukowy Automatyczny licznik komórek TC20Myszy Bio-rad1450102
TK-NOG Dostarczone przez Centralny Instytut Zwierząt Doświadczalnych (CIEA, Japonia; dr Mamoru Ito i dr Hiroshi Suemizu)
TreosulfanMedac GmbHDostarczone przez  Dr. Joachim Baumgart (medac GmbH) 
Trypan BlueBio-rad1450022
Micro Nożyczki typu Vannas, proste, 80mm LTed Pella, Inc.1346Służy do wykonywania nacięcia na skórze w celu odsłonięcia śledziony
Hemoclip Weck tradycyjne tytanowe klipsy do podwiązywaniaEsutures523700Do podwiązania śledziony po wstrzyknięciu
Oprogramowanie przepływowejBioanalizator Oprogramowanie cytometru przepływowego Oprogramowanie do analizy LLC specyficzny dla myszy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, C., et al. Factors associated with specific causes of death amongst HIV-positive individuals in the D:A:D Study. AIDS. 24 (10), 1537-1548 (2010).
  2. Puoti, M., et al. Mortality for liver disease in patients with HIV infection: a cohort study. Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes. 24 (3), 211-217 (2000).
  3. Rodriguez-Mendez, M. L., Gonzalez-Quintela, A., Aguilera, A., Barrio, E. Prevalence, patterns, and course of past hepatitis B virus infection in intravenous drug users with HIV-1 infection. The American Journal of Gastroenterology. 95 (5), 1316-1322 (2000).
  4. Scharschmidt, B. F., et al. Hepatitis B in patients with HIV infection: relationship to AIDS and patient survival. Annals of Internal Medicine. 117 (10), 837-838 (1992).
  5. Lacombe, K., Rockstroh, J. HIV and viral hepatitis coinfections: advances and challenges. Gut. 61, Suppl 1 47-58 (2012).
  6. Brehm, M. A., Jouvet, N., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Humanized mice for the study of infectious diseases. Current Opinion in Immunology. 25 (4), 428-435 (2013).
  7. Billerbeck, E., et al. Humanized mice efficiently engrafted with fetal hepatoblasts and syngeneic immune cells develop human monocytes and NK cells. The Journal of Hepatology. 65 (2), 334-343 (2016).
  8. Dagur, R. S., et al. Human hepatocyte depletion in the presence of HIV-1 infection in dual reconstituted humanized mice. Biology Open. 7 (2), (2018).
  9. Gaska, J. M., Ploss, A. Study of viral pathogenesis in humanized mice. Current Opinion in Virology. 11, 14-20 (2015).
  10. Gorantla, S., Poluektova, L., Gendelman, H. E. Rodent models for HIV-associated neurocognitive disorders. Trends in Neurosciences. 35 (3), 197-208 (2012).
  11. Xu, D., et al. Chimeric TK-NOG mice: a predictive model for cholestatic human liver toxicity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 352 (2), 274-280 (2015).
  12. Washburn, M. L., et al. A humanized mouse model to study hepatitis C virus infection, immune response, and liver disease. Gastroenterology. 140 (4), 1334-1344 (2011).
  13. Gutti, T. L., et al. Human hepatocytes and hematolymphoid dual reconstitution in treosulfan-conditioned uPA-NOG mice. The American Journal of Pathology. 184 (1), 101-109 (2014).
  14. Strick-Marchand, H., et al. A novel mouse model for stable engraftment of a human immune system and human hepatocytes. PLoS One. 10 (3), 0119820(2015).
  15. Keng, C. T., et al. Characterisation of liver pathogenesis, human immune responses and drug testing in a humanised mouse model of HCV infection. Gut. 65 (10), 1744-1753 (2016).
  16. Li, F., Nio, K., Yasui, F., Murphy, C. M., Su, L. Studying HBV Infection and Therapy in Immune-Deficient NOD-Rag1-/-IL2RgammaC-null (NRG) Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Knockout Mice Transplanted with Human Hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 1540, 267-276 (2017).
  17. Poluektova, L. Y., Garcia, J. V., Koyanagi, Y., Manz, M. G., Tager, A. M. Humanized Mice for HIV Research. , Springer-Verlag New York. New York, NY. (2014).
  18. Cheng, L., Ma, J., Li, G., Su, L. Humanized Mice Engrafted With Human HSC Only or HSC and Thymus Support Comparable HIV-1 Replication, Immunopathology, and Responses to ART and Immune Therapy. Frontiers in Immunology. 9, 817(2018).
  19. Zhang, L., Su, L. HIV-1 immunopathogenesis in humanized mouse models. Cellular & Molecular Immunology. 9 (3), 237-244 (2012).
  20. Nunoya, J., Washburn, M. L., Kovalev, G. I., Su, L. Regulatory T cells prevent liver fibrosis during HIV type 1 infection in a humanized mouse model. The Journal of Infectious Diseases. 209 (7), 1039-1044 (2014).
  21. Hasegawa, M., et al. The reconstituted 'humanized liver' in TK-NOG mice is mature and functional. Biochemical and Biophysical Research Communications. 405 (3), 405-410 (2011).
  22. Higuchi, Y., et al. The human hepatic cell line HepaRG as a possible cell source for the generation of humanized liver TK-NOG mice. Xenobiotica. 44 (2), 146-153 (2014).
  23. Kosaka, K., et al. A novel TK-NOG based humanized mouse model for the study of HBV and HCV infections. Biochemical and Biophysical Research Communications. 441 (1), 230-235 (2013).
  24. Crane, M., Iser, D., Lewin, S. R. Human immunodeficiency virus infection and the liver. World Journal of Hepatology. 4 (3), 91-98 (2012).
  25. Bility, M. T., Li, F., Cheng, L., Su, L. Liver immune-pathogenesis and therapy of human liver tropic virus infection in humanized mouse models. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 28, Suppl 1 120-124 (2013).
  26. Kong, L., et al. Low-level HIV infection of hepatocytes. Virology Journal. 9, 1-7 (2012).
  27. Dash, P. K., et al. Long-acting nanoformulated antiretroviral therapy elicits potent antiretroviral and neuroprotective responses in HIV-1-infected humanized mice. AIDS. 26 (17), 2135-2144 (2012).
  28. Sun, S., Li, J. Humanized chimeric mouse models of hepatitis B virus infection. International Journal of Infectious Diseases. 59, 131-136 (2017).
  29. Shafritz, D. A., Oertel, M. Model systems and experimental conditions that lead to effective repopulation of the liver by transplanted cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 43 (2), 198-213 (2011).
  30. Almeida-Porada, G., Porada, C. D., Chamberlain, J., Torabi, A., Zanjani, E. D. Formation of human hepatocytes by human hematopoietic stem cells in sheep. Blood. 104 (8), 2582-2590 (2004).
  31. Streetz, K. L., et al. Hepatic parenchymal replacement in mice by transplanted allogeneic hepatocytes is facilitated by bone marrow transplantation and mediated by CD4 cells. Hepatology. 47 (2), 706-718 (2008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Podw jny humanizowany model mysiengraftment ludzkich hepatocyt wtransplantacja hematopoetycznych kom rek macierzystychanaliza cytometrycznatest ELISA dla ludzkiej albuminyizolacja kom rek CD34 dodatnichrepopulacja w troby mysiejrekonstrukcja ludzkiego uk adu odporno ciowegomodel infekcji HIV 1

Powiązane artykuły