Artykuł metodologiczny

qKAT: Ilościowe półautomatyczne typowanie genów receptorów podobnych do immunoglobulin komórek zabójczych

DOI:

10.3791/58646

⸱

6 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, University of Cambridge, 2Department of Physiology, Development and Neuroscience, University of Cambridge, 3Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Cambridge School of Medicine, NIHR Cambridge Biomedical Research Centre, 4Centre for Trophoblast Research, University of Cambridge, 5Department of Genetics & Evolution, University of Geneva, 6Royal Papworth Hospital, 7Department of Plant Sciences, University of Cambridge

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ilościowe półautomatyczne typowanie immunoglobuliny z komórek zabójczych (KIR) (qKAT) to prosta, wysokoprzepustowa i opłacalna metoda kopiowania genów KIR typu liczbowego do ich zastosowania w badaniach populacyjnych i asocjacyjnych chorób.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Receptory immunoglobulinowe komórek zabójczych (KIRs) to zestaw hamujących i aktywujących receptorów immunologicznych na limfocytach NK i T, kodowanych przez polimorficzny klaster genów na chromosomie 19. Ich najlepiej scharakteryzowanymi ligandami są cząsteczki ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA), które są kodowane w locus głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) na chromosomie 6. Istnieje wiele dowodów na to, że odgrywają one znaczącą rolę w odporności, reprodukcji i transplantacji, co sprawia, że tak ważne jest posiadanie technik, które mogą je dokładnie genotypować. Jednak homologia o wysokiej sekwencji, a także zmienność alleli i liczby kopii utrudniają zaprojektowanie metod, które mogą dokładnie i skutecznie genotypować wszystkie geny KIR. Tradycyjne metody są zwykle ograniczone pod względem rozdzielczości uzyskanych danych, przepustowości, opłacalności oraz czasu potrzebnego na przygotowanie i przeprowadzenie eksperymentów. Opisujemy metodę zwaną ilościowym półautomatycznym typowaniem KIR (qKAT), która jest wysokoprzepustową metodą wielopoziomowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym, która może określić liczbę kopii genów dla wszystkich genów w locus KIR. qKAT to prosta metoda o wysokiej przepustowości, która może dostarczyć danych o liczbie kopii KIR o wysokiej rozdzielczości, które można dalej wykorzystać do wnioskowania o różnicach w strukturalnie polimorficznych haplotypach, które je obejmują. Te dane dotyczące liczby kopii i haplotypów mogą być korzystne dla badań nad powiązaniami chorób na dużą skalę, genetyką populacyjnej, a także badaniami nad ekspresją i funkcjonalnymi interakcjami między KIR i HLA.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

U ludzi, locus receptora immunoglobulinowego (KIR) jest odwzorowany na długim ramieniu chromosomu 19 w kompleksie receptorów leukocytów (LRC). Locus ten ma około 150 kb długości i zawiera 15 genów KIR ułożonych od głowy do ogona. Obecnie znane loci KIR to KIR2DL1, KIR2DL2/KIR2DL3, KIR2DL4, KIR2DL5A, KIR2DL5B, KIR2DS1-5, KIR3DL1/KIR3DS1, KIR3DL2-3 oraz dwa pseudogeny, KIR2DP1 i KIR3DP1. Geny KIR kodują dwuwymiarowe (2D) i trójwymiarowe (3D) immunoglobulinopodobne receptory domenowe z krótkimi (S; aktywującymi) lub długimi (L; hamującymi) ogonami cytoplazmatycznymi, które ulegają ekspresji przez komórki NK i podzbiory limfocytów T. Zmienność liczby kopii wykazywana w locus KIR tworzy różnorodne haplotypy o zmiennej zawartości genów1. Niealleliczną rekombinacją homologiczną (NAHR), ułatwioną przez bliski układ genów od głowy do ogona i homologię o wysokiej sekwencji, jest mechanizmem, który uważa się za odpowiedzialny za zmienność haplotypową. W populacjach na całym świecie zgłoszono ponad 100 różnych haplotypów1,2,3,4. Wszystkie te haplotypy można podzielić na dwie główne grupy: haplotypy A i B. Haplotyp A zawiera 7 genów KIR: KIR3DL3, KIR2DL1, KIR2DL3, KIR2DL4, KIR3DL1 i KIR3DL2, które są genami hamującymi KIR, oraz aktywujący gen KIR KIR2DS4. Jednak nawet 70% osób pochodzenia europejskiego, które są homozygotyczne pod względem haplotypu A KIR, ma wyłącznie niefunkcjonalną formę "delecji" KIR2DS45,6. Wszystkie inne kombinacje genów KIR tworzą haplotypy grupy B, w tym co najmniej jeden ze specyficznych genów KIR KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS3, KIR2DS5, KIR3DS1, KIR2DL2 i KIR2DL5 i zazwyczaj zawierają dwa lub więcej aktywujących genów KIR.

Cząsteczki HLA klasy I zostały zidentyfikowane jako ligandy dla pewnych receptorów hamujących (KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3 i KIR3DL1), receptorów aktywujących (KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DS4, KIR2DS5 i KIR3DS1), oraz dla KIR2DL4, które jest unikalnym KIR który zawiera długie ogony cytoplazmatyczne, podobnie jak inne hamujące receptory KIR, ale ma również dodatnio naładowaną resztę w pobliżu domeny zewnątrzkomórkowej, co jest wspólną cechą innych aktywujących receptorów KIR. Połączenie wariantów w obrębie genów KIR i genów HLA wpływa na interakcję liganda receptora, która kształtuje potencjalną odpowiedź komórek NK na poziomie indywidualnym7,8. Dowody z badań asocjacji genetycznych wskazują, że KIR odgrywa rolę w oporności wirusów (np. ludzki wirus niedoboru odporności [HIV]9 i wirus zapalenia wątroby typu C [HCV]10), powodzenie transplantacji11, ryzyko zaburzeń ciąży i sukces reprodukcyjny12,13, ochrona przed nawrotem choroby po allogenicznym przeszczepieniu krwiotwórczych komórek macierzystych (HSCT)14,15,16, oraz ryzyko zachorowania na nowotwory17.

Połączenie homologii o wysokiej sekwencji oraz różnorodności allelicznej i haplotypowej stanowi wyzwanie w zadaniu dokładnego genotypowania genów KIR. Konwencjonalne metody typowania genów KIR obejmują specyficzną dla sekwencji starter (SSP), reakcję łańcuchową polimerazy (PCR)18,19,20, specyficzna dla sekwencji sonda oligonukleotydowa (SSOP) PCR21 oraz desorpcja laserowa wspomagana matrycą-jonizacja czasu lotu spektrometria mas (MALDI-TOF MS)22. Wadą tych technik jest to, że zapewniają one tylko częściowy wgląd w genotyp osobnika, a jednocześnie są pracochłonne w wykonaniu. Ostatnio sekwencjonowanie nowej generacji (NGS) zostało zastosowane do typowania locus KIR. Chociaż ta metoda jest bardzo wydajna, może być kosztowna w uruchomieniu, a przeprowadzanie dogłębnych analiz i sprawdzania danych jest czasochłonne.

qKAT to wysokoprzepustowa ilościowa metoda PCR. Podczas gdy konwencjonalne metody są pracochłonne i czasochłonne, ta metoda umożliwia przeprowadzenie prawie 1000 próbek genomowego DNA (gDNA) w ciągu pięciu dni i daje genotyp KIR, a także liczbę kopii genu. qKAT składa się z dziesięciu reakcji multipleksowych, z których każda jest ukierunkowana na dwa loci KIR i jeden gen referencyjny o ustalonej liczbie kopii w genomie (STAT6) używany do względnej kwantyfikacji liczby kopii genu KIR23. Test ten został z powodzeniem wykorzystany w badaniach obejmujących duże panele populacyjne i kohorty chorób zakaźnych, takich jak HCV, choroby autoimmunologiczne, takie jak cukrzyca typu 1 i zaburzenia ciąży, takie jak stan przedrzucawkowy, a także stanowi genetyczne podstawy dla badań mających na celu zrozumienie funkcji komórek NK1,4,24,25,26.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i posiewanie z DNA

  1. Dokładne określenie ilościowe stężenia gDNA za pomocą przyrządu spektrofotometrycznego lub fluorometrycznego.
  2. Rozcieńczyć DNA do 4 ng/μl na 96-dołkowej płytce głębinowej. Dołącz co najmniej jedną kontrolną próbkę gDNA o znanej liczbie kopii i jedną kontrolę bez matrycy.
  3. Odwirować 96-dołkowe płytki o masie 450 x g przez 2 minuty.
  4. Za pomocą przyrządu do obchodzenia się z cieczami dozuj każdą próbkę w poczwórnym duplikacji na 384-dołkowe płytki qPCR, tak aby każda studzienka zawierała 10 ng DNA (2,5 μl / dołek). Przygotuj co najmniej dziesięć płytek 384-dołkowych, po jednej na każdą reakcję qKAT.
  5. Jeśli gDNA jest dozowane z więcej niż jednej 96-dołkowej płytki, wykonaj pełne mycie 2% wybielaczem i ultraczystą wodą, aby wyczyścić igły systemu obsługi płynów między każdą 96-dołkową płytką próbek gDNA.
  6. Wysuszyć DNA na powietrzu, inkubując 384-dołkowe płytki w czystym miejscu w temperaturze pokojowej przez co najmniej 24 godziny.

2. Przygotowanie starterów i sond

UWAGA: qKAT składa się z dziesięciu reakcji multipleksowych. Każda reakcja obejmuje trzy pary starterów i trzy sondy znakowane fluorescencyjnie, które specyficznie amplifikują dwa geny KIR i jeden gen referencyjny. Sondy, które zostały opublikowane w Jiang et al.27 zostały zmodyfikowane tak, że oligonukleotydy są teraz znakowane barwnikami ATTO, ponieważ oferują lepszą fotostabilność i długą żywotność sygnału. Wstępnie podymimulowane kombinacje podkładów są dostępne w handlu (patrz Tabela materiałów).

  1. Przygotować kombinacje starterów dla każdej reakcji zgodnie z rozcieńczeniami podanymi w tabeli 1.
  2. Przygotować kombinacje sond dla każdej reakcji zgodnie z tabelą 1. Przetestuj każdą pojedynczą sondę przed wykonaniem kombinacji.

3. Przygotowanie Master Mixu

UWAGA Objętości wymienione poniżej służą do przeprowadzenia jednej reakcji qKAT na zestawie 10 płytek 384-dołkowych.

  1. Upewnij się, że próbki gDNA posiane na płytkach 384-dołkowych są całkowicie suche. Wykonuj wszystkie kroki na lodzie i utrzymuj odczynniki przykryte przed ekspozycją na światło tak bardzo, jak to możliwe, ponieważ sondy znakowane fluorescencyjnie są światło- i termoczułe.
  2. Rozmrozić podwielokrotności buforu qPCR, startera i sondy w temperaturze 4 °C.
  3. Na lodzie przygotuj mieszankę wzorcową dla 10 płytek 384-dołkowych, dodając 18,86 ml ultraczystej wody, 20 ml buforu qPCR, 1 000 μl wstępnie przygotowanej kombinacji starterów i 180 μl wstępnie przygotowanej kombinacji sond (Tabela 2).
  4. Rozprowadzić mieszankę wzorcową równomiernie na płytce dołka o głębokości 96 za pomocą pipety wielokanałowej, pipetując 415 μl do każdego dołka. Przechowuj ten talerz w pojemniku na lód przykrytym przed światłem.
  5. Za pomocą przyrządu do obchodzenia się z cieczami dozować 9,5 μl mieszanki głównej do każdego dołka płytki 384-dołkowej z wysuszonym gDNA. Uszczelnić płytkę folią i natychmiast umieścić ją w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten proces dla pozostałych płytek, upewniając się, że igły systemu obchodzenia się z cieczami zostały umyte wodą między każdą płytką.
  6. Odwirować 384-dołkowe płytki o sile 450 x g przez 3 minuty i inkubować je w temperaturze 4 °C przez noc lub między 6-12 godzinami w celu ponownego zawieszenia DNA i rozproszenia pęcherzyków powietrza.

4. Test qPCR

  1. Po całonocnej inkubacji odwirować przy 450 x g przez 3 minuty, aby rozproszyć pozostałe pęcherzyki powietrza.
  2. W celu automatyzacji należy podłączyć maszynę qPCR (np. LightCycler 480) do urządzenia do obsługi mikropłytek (patrz Tabela materiałów). Zaprogramować manipulator mikropłytek tak, aby umieszczał płytki w maszynie qPCR z chłodzonej stacji dokującej, która jest chroniona przed światłem.
    UWAGA Testy powinny teoretycznie działać na innych maszynach qPCR z kompatybilnymi ustawieniami optycznymi.
  3. Stosować następujące warunki cyklu: 95 °C przez 5 minut, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 s i 66 °C przez 50 s, z gromadzeniem danych w temperaturze 66 °C.
  4. Po zakończeniu biegu poproś robota, aby zebrał płytkę z maszyny qPCR i umieścił ją w doku do odrzutów.

5. Analiza po uruchomieniu

  1. Po amplifikacji oblicz wartości cyklu kwantyfikacji (Cq) przy użyciu metody maksimum drugiej pochodnej lub metody Fit Points za pomocą oprogramowania maszyny qPCR (patrz Tabela materiałów), wykonując poniższe czynności.
  2. Otwórz oprogramowanie qPCR i w zakładce Navigator otwórz zapisany plik eksperymentu reakcyjnego dla jednej płytki.
  3. W przypadku analizy przy użyciu metody maksimum drugiej pochodnej wybierz zakładkę Analiza i utwórz nową analizę przy użyciu metody Abs Quant/Second Derived Max.
    1. W oknie Utwórz nową analizę należy wybrać typ analizy: Abs Quant/Second Derivative Max method, podzbiór: All Samples, program: Amplifikacja, nazwa: Rx-DFO (gdzie x to numer reakcji).
    2. Wybierz Filter Comb i wybierz VIC/HEX/Yellow555 (533-580). Gwarantuje to, że dane zebrane dla STAT6 zostaną wybrane.
    3. Wybierz Kompensacja kolorów dla VIC/HEX/Yellow555(533-580). Kliknij przycisk Oblicz. Powtórz to dla Fam (465-510) i Cy5/Cy5.5(618-660). Kliknij Zapisz plik.
  4. W przypadku analizy przy użyciu metody Fit Points wybierz opcję Abs Quant/Fit Points na karcie Analysis.
    1. W oknie Utwórz nową analizę należy wybrać typ analizy: metoda Abs Quant/Fit Points, podzbiór: Wszystkie próbki, program: Amplifikacja, nazwa: RxF-DFO (gdzie x to numer reakcji).
    2. Wybierz odpowiednie filtry i kompensacje kolorów dla STAT6 i każdego z genów KIR (Fam/Cy5). Na karcie Pasmo szumów ustaw pasmo szumów, aby wykluczyć szum tła.
    3. Na karcie Analiza ustaw punkty dopasowania na 3 i wybierz opcję Pokaż punkty dopasowania. Kliknij przycisk Oblicz. Kliknij Zapisz plik.

6. Eksport wyników

  1. W oprogramowaniu qPCR otwórz zakładkę Navigator (Nawigator). Wybierz opcję Results Batch Export (Eksport wsadowy wyników).
  2. Otwórz folder, w którym są zapisane pliki eksperymentu, i przenieś je do prawej części okna. Kliknij Dalej. Wybierz nazwę i lokalizację eksportowanego pliku.
  3. Wybierz Typ analizy Abs Quant/Second Derivative Max method lub Abs Quant/Fit Points. Kliknij Dalej. Sprawdź, czy nazwa pliku, folder eksportu i typ analizy są poprawne, a następnie kliknij przycisk Dalej, aby rozpocząć proces eksportu.
  4. Poczekaj, aż stan eksportu zmieni się na Ok. Ekran automatycznie przejdzie do następnego kroku. Sprawdź, czy wszystkie wybrane pliki zostały pomyślnie wyeksportowane, aby liczba plików, które zakończyły się niepowodzeniem = 0. Kliknij Gotowe.
  5. Użyj skryptów split_file.pl i roche2sds.pl, aby podzielić wyeksportowane płytki na indywidualne reakcje dla każdej płyty.
    UWAGA Skrypty są dostarczane na żądanie/GitHub.

7. Kopiuj obliczenia liczbowe

  1. Otwórz oprogramowanie do analizy numerów kopii (np. CopyCaller). Wybierz opcję Importuj plik z wynikami PCR w czasie rzeczywistym i załaduj pliki tekstowe utworzone przez roche2sds.pl.
  2. Wybierz opcję Analizuj i przeprowadź analizę, wybierając kalibrator próbki ze znanym numerem kopii lub wybierając najczęstszy numer kopii. W Tabeli 5 przedstawiono najczęstszą liczbę kopii genów KIR zwykle obserwowaną w populacjach pochodzenia europejskiego.

8. Kontrole jakości danych

  1. Użyj skryptu języka R KIR_CNVdata_analysis_for_Excel_ver020215. R, aby połączyć dane kopii numerów ze wszystkich tablic w arkuszu kalkulacyjnym.
    UWAGA Skrypty są dostarczane na żądanie/GitHub.
  2. Ponownie sprawdź surowe dane w oprogramowaniu do analizy liczby kopii dla próbek, które nie są zgodne ze znaną nierównowagą sprzężeń (LD) dla genów KIR (Tabela 6).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analizę liczby kopii można przeprowadzić, eksportując pliki do oprogramowania do analizy liczby kopii, które dostarcza przewidywaną i szacowaną liczbę kopii w oparciu o metodę ΔΔCq.

Liczba kopii może być przewidziana albo na podstawie znanej liczby kopii kontrolnych próbek DNA na płytce, albo poprzez wprowadzenie najczęstszej liczby kopii genu (Tabela 5). Rysunek 1 pokazuje wyniki płytki dla reakcji ukierunkowanej na KIR2DL4 i KIR3DS1, a także gen referencyjny STAT6. Najczęstszą liczbą kopii dla KIR2DL4, genu ramowego w locus KIR, są dwie kopie, podczas gdy najczęstszą liczbą kopii dla KIR3DS1, genu aktywującego, jest jedna kopia. Wyniki na rysunku pokazują wykresy amplifikacji PCR obserwowane w oprogramowaniu qPCR oraz dane dotyczące liczby kopii wygenerowane na podstawie danych qPCR. Jak pokazano, test jest w stanie rozróżnić numery kopii genów KIR 0, 1, 2, 3 i 4. Oprogramowanie do analizy liczby kopii umożliwia również przeglądanie rozkładu numeru kopii na płycie w postaci wykresu kołowego lub wykresu słupkowego. Skuteczność przewidywania liczby kopii jest mniejsza w przypadku próbek o wyższej liczbie kopii.

Jakość wszystkich materiałów użytych w reakcjach, gDNA,, starterów i sond, może mieć wpływ na dokładność uzyskanych wyników. Jednak niezgodność w wynikach jest najprawdopodobniej spowodowana różnicą w stężeniu DNA na płytce. Czystość wyekstrahowanego gDNA, którą można zmierzyć za pomocą proporcji 260/280 i 260/230, może również mieć wpływ na jakość. Pożądane jest przełożenie 260/280 1,8 - 2 i 260/230 2 - 2,2. Nierówny zakres stężeń DNA na płytce może prowadzić do dużej zmienności cyklu progowego (Ct) między próbkami i niezgodności w zakresie szacowanej liczby kopii. Wyniki w Rysunek 2 pokazują wpływ, jaki rozbieżność między wartościami Ct na płycie może mieć na dokładność przewidywania liczby kopii. Czerwona linia wskazuje zakres szacowanej liczby kopii dla próbki i najlepiej, aby była jak najbardziej zbliżona do liczby całkowitej.

Dane z kopii numeru, po przeanalizowaniu, mogą być wyeksportowane jako plik arkusza kalkulacyjnego w formacie 96-dołkowym. Użyliśmy skryptu R (dostępnego na życzenie), aby połączyć dane o numerach kopii wszystkich 10 tablic, które są uruchamiane jako zestaw w jednym arkuszu kalkulacyjnym. Opublikowane dane o KIR z populacji pochodzących głównie z Europy umożliwiają przewidywanie reguł LD, które istnieją między różnymi genami w kompleksie KIR 1. Prognozy te są wykorzystywane do przeprowadzania dalszych kontroli uzyskanych wyników dotyczących liczby kopii (tabela 6). Próbki, które nie są zgodne z przewidywanym LD między genami, mogą zawierać nietypowy polimorfizm lub haplotypowe zmiany strukturalne. Schemat blokowy opisujący protokół jest pokazany w Rysunek 3.

Narzędzie o nazwie KIR Haplotype Identifier (http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/) zostało opracowane w celu ułatwienia imputacji haplotypów ze zbioru danych. Imputacja działa na podstawie listy haplotypów referencyjnych zaobserwowanych w populacji pochodzenia europejskiego1. Jednak narzędzie pozwala również na użycie niestandardowego zestawu haplotypów referencyjnych. Generowane są trzy oddzielne pliki; Pierwszy plik zawiera listę wszystkich kombinacji haplotypów dla próbki, drugi plik zawiera przyciętą listę kombinacji haplotypów, które mają najwyższą łączną częstość, a trzeci plik zawiera listę próbek, do których nie można przypisać haplotypów. Brak przypisania haplotypów może być wykorzystany jako wskaźnik nowych haplotypów.

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywne wyniki płytki dla reakcji nr 5. (A) Ten panel pokazuje wykresy wzmocnienia. (B) Ten panel pokazuje wykresy liczb kopii. (C) Ten panel pokazuje rozkład numerów kopii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki płytki o zmiennym stężeniu DNA dla reakcji numer 5. (A) Ten panel pokazuje wykresy wzmocnienia. (B) Ten panel pokazuje wykresy liczb kopii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Schemat blokowy protokołu qKAT. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

szt. szt. szt. TGL szt. szt. ) szt. szt. szt. powiedział: szt. powiedział: szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. powiedział: szt. szt. szt. szt. szt. powiedział: szt. ) szt. szt. szt. powiedział: szt. powiedział: szt. Rozdział szt. powiedział: ) szt. powiedział: szt. szt. szt. szt. powiedział: szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. szt. powiedział: szt. TGL szt. Rozdział szt. szt. szt. szt. szt. szt. powiedział: szt. powiedział: szt. ) szt. szt. TGL ) szt. szt. szt. szt. szt. powiedział: szt. powiedział: szt. ) szt. szt. powiedział: ) szt. Rozdział szt. szt. szt. powiedział: szt. powiedział: szt. szt. szt. szt. powiedział: szt. ) szt. szt. szt. powiedział: szt. TGL szt. szt. szt. powiedział: szt. szt. ) szt. szt. szt. powiedział: szt.
TestGenówPodkłady do przoduStężenie (nM)Podkłady odwrotneStężenie (nM)SondyStężenie (nM)
Nie 1Zobacz materiał 3DP1A4FZ kolei 250A5RZ kolei 250Zobacz materiał P4a150
Zobacz materiał 2DL2Zobacz materiał 2DL2F4400C3R2600P5b (Biblioteka P5b150
STATYSTYKA 6STAT6F200STAT6R200Kontroler PSTAT6150
Nie 22DS2A4F400A6R400Zobacz materiał P4a200
Zobacz materiał 2DL3D1F400D1R400Zobacz materiał P9150
STATYSTYKA 6STAT6F200STAT6R200Kontroler PSTAT6150
Nie 3Zobacz materiał 3DL3A8F500A8R500Zobacz materiał P4a150
2DS4Del2DS4DelZ kolei 2502DS4R2Z kolei 250P5b (Biblioteka P5b150
STATYSTYKA 6STAT6F200STAT6R200Kontroler PSTAT6150
Nie 43DL1e4B1FZ kolei 250B1R125Zobacz materiał P4b150
3DL1e9D4F (Klasa D4FZ kolei 250D4R2500Zobacz materiał P9150
STATYSTYKA 6STAT6F200STAT6R200Kontroler PSTAT6150
Nie 53DS1Sieć B2FZ kolei 250B1RZ kolei 250Zobacz materiał P4b150
Zobacz materiał 2DL4Zobacz materiał C1F200Zobacz materiał C1R200Zobacz materiał P5B-2DL4150
STATYSTYKA 6STAT6F200STAT6R200Kontroler PSTAT6150
Nie 6Zobacz materiał 2DL1B3F500B3R125Zobacz materiał P4b150
Zobacz materiał 2DP1D3FZ kolei 250D3R500Zobacz materiał P9150
STATYSTYKA 6STAT6F200STAT6R200Kontroler PSTAT6150
Nie 72DS1B4F500B4R (Klasa B4RZ kolei 250Zobacz materiał P4b150
Zobacz materiał 2DL5D2F (Strefa D2F500D2R (Język w języku angielskim)500Zobacz materiał P9150
STATYSTYKA 6STAT6F200STAT6R200Kontroler PSTAT6150
Nie 82DS3B5FZ kolei 250B5R (Klasa B5RZ kolei 250Zobacz materiał P4b150
3DL2e9D4F (Klasa D4FZ kolei 250D5R125Zobacz materiał P9150
STATYSTYKA 6STAT6F200STAT6R200Kontroler PSTAT6150
Nie 93DL2e4A1F200A1R200Zobacz materiał P4a150
2DS4FL2DS4FLZ kolei 2502DS4R2500P5b (Biblioteka P5b150
STATYSTYKA 6STAT6F200STAT6R200Kontroler PSTAT6150
Nie 10Zobacz materiał 2DS5Zobacz materiał B6F2200Zobacz materiał B6R3200Zobacz materiał P4b150
2DS4Zobacz materiał C5FZ kolei 250C5RZ kolei 250P5b (Biblioteka P5b150
STATYSTYKA 6STAT6F200STAT6R200Kontroler PSTAT6150

Tabela 1: Kombinacja i stężenie starterów i sond używanych w każdej reakcji qKAT27.

powiedział: TGL szt. szt. szt. szt. szt. Rozdział Rozdział Rozdział powiedział: powiedział: szt. szt. szt. szt. szt. Rozdział Rozdział powiedział: powiedział: szt. szt. szt. szt. Rozdział Rozdział Rozdział TGL ) powiedział: powiedział: TGL szt. Rozdział szt. szt. szt. Rozdział Rozdział Rozdział powiedział: szt. szt. szt. Rozdział Rozdział Rozdział TGL powiedział: szt. Rozdział szt. szt. szt. Rozdział Rozdział Rozdział powiedział: ) ) powiedział: TGL szt. szt. szt. szt. szt. Rozdział Rozdział Rozdział powiedział: ) ) powiedział: TGL szt. szt. szt. Rozdział szt. Rozdział Rozdział Rozdział TGL powiedział: powiedział: powiedział: szt. szt. szt. Rozdział Rozdział Rozdział TGL powiedział: szt. szt. szt. Rozdział Rozdział Rozdział
Reakcja Podwielokrotności startera (μL)Porcje sondy (μL)
Czynnik R1Zobacz materiał 3DP1A4FA5RZobacz materiał 2DL2F4C3R2WodaSTAT6FSTAT6RP4AZobacz materiał P5BKontroler PSTAT6
Zobacz materiał 2DL2100100160240200Rozdział 80Rozdział 80606060
Czynnik R22DS2A2FA6RD1FD1RWodaSTAT6FSTAT6RP4AZobacz materiał P9Kontroler PSTAT6
Zobacz materiał 2DL3160160160160160Rozdział 80Rozdział 80Rozdział 806060
Uwaga: potrzebujesz 20 μL mniej wody w MasterMix
Czynnik R3Zobacz materiał 3DL3A8F A8FBA8R2DS4DELF2DS4R2WodaSTAT6FSTAT6RP4AZobacz materiał P5BKontroler PSTAT6
2DS4DEL100 100200100100200Rozdział 80Rozdział 80606060
Czynnik R4Zobacz materiał 3DL1E4B1FB1RD4F (Klasa D4FD4R2WodaSTAT6FSTAT6RKlasa P4BZobacz materiał P9Kontroler PSTAT6
Zobacz materiał 3DL1E910050100200350Rozdział 80Rozdział 80606060
Czynnik R53DS1Sieć B2FB1RZobacz materiał C1FZobacz materiał C1RWodaSTAT6FSTAT6RKlasa P4BZobacz materiał P5B-2L4Kontroler PSTAT6
Zobacz materiał 2DL4100100Rozdział 80Rozdział 80440Rozdział 80Rozdział 80606060
Czynnik R6Zobacz materiał 2DL1B3FB3RD3FD3RWodaSTAT6FSTAT6RKlasa P4BZobacz materiał P9Kontroler PSTAT6
Zobacz materiał 2DP120050100200Z kolei 250Rozdział 80Rozdział 80606060
Czynnik R72DS1B4FB4R (Klasa B4RD2F (Strefa D2FD2R (Język w języku angielskim)WodaSTAT6FSTAT6RKlasa P4BZobacz materiał P9Kontroler PSTAT6
Zobacz materiał 2DL5200100200200100Rozdział 80Rozdział 80606060
Zobacz materiał R82DS3B5FB5R (Klasa B5RD4F (Klasa D4FD5RWodaSTAT6FSTAT6RKlasa P4BZobacz materiał P9Kontroler PSTAT6
Zobacz materiał 3DL2E910010010050450Rozdział 80Rozdział 80606060
Zobacz materiał R9Zobacz materiał 3DL2E4A1FA1R2DS4WTF2DS4R2WodaSTAT6FSTAT6RP4AZobacz materiał P5BKontroler PSTAT6
2DS4WTRozdział 80Rozdział 80100200340Rozdział 80Rozdział 80606060
Czynnik R10Zobacz materiał 2DS5Zobacz materiał B6F2Zobacz materiał B6R3Zobacz materiał C5FC5RWodaSTAT6FSTAT6RKlasa P4BZobacz materiał P5BKontroler PSTAT6
2DS4OGÓŁEMRozdział 80Rozdział 80100100440Rozdział 80Rozdział 80606060

Tabela 2: Objętości (μL) roztworów podstawowych 100 μM starter/sonda do wykonania kombinacji startera i sondy.

powiedział: Rozdział pkt. powiedział: TGLI Rozdział ) powiedział: Rozdział powiedział: szt. powiedział: ) Rozdział pkt. powiedział: powiedział: TGLI Rozdział
nazwakierunekModyfikacja 5'Modyfikacja 3'Sekwencja (5'→3')długośćTmGC%Eksoniepozycja
Zobacz materiał P4azmysłFamBHQ-1TCATCCTGC
AATGTTGGT
CAGATGTCA (Język angielski)		27 Rozdział 276044,44Księga 425-451
Zobacz materiał P4bAntysensFamBHQ-1AACAGAACC
GTAGCATCT
GTAGGTCCC
T		2862504576-603
P5b (Biblioteka P5bzmysłATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TTCCTCTG (Protokół TTCCTCTG)		2560Rozdział 525828-852
Zobacz materiał P5B-2DL4zmysłATTO647NBHQ-2AACATTCCA
GGCCGACT
TCCCTCTG (Biblioteka TCCCTCTG)		256156 Rozdział 565828-852
Zobacz materiał P9zmysłATTO647NBHQ-2CCCTTCTCA
GAGGCCCA
AGACACC (AGACACC		246062,59Lata 1246-1269
Kontroler PSTAT6 ATTO550BHQ-2CTGATTCCT
CCATGAGCA
TGCAGCTT powiedział:		266250

Tabela 3: Lista sond używanych w qKAT1,27. Barwniki fluorescencyjne użyte na końcu 5' sond oligo P5b, P5b-2DL4, P9 i PSTAT6 zostały zmodyfikowane do barwników ATTO.

powiedział: ) pkt. pkt. pkt. pkt. powiedział: pkt. pkt. ) powiedział: Rozdział pkt. Rozdział pkt. pkt. powiedział: ) pkt. Rozdział pkt. Rozdział TGL Rozdział powiedział: Rozdział pkt. powiedział: pkt. ) pkt. TGL powiedział: pkt. ) pkt. TGL ) Rozdział pkt. pkt. ) pkt. powiedział: pkt. TGL pkt. szt. ) powiedział: pkt. szt. pkt. TGL pkt. powiedział: Rozdział SZT. pkt. powiedział: Rozdział SZT. pkt. Rozdział TGL ) Rozdział szt. pkt. powiedział: Rozdział Rozdział powiedział: ) pkt. powiedział: pkt. powiedział: ) pkt. pkt. Rozdział powiedział: Rozdział
genPodkładykierunekSekwencja (5'-3')długośćTm GC%Eksoniepozycja Amplikon (bp)Allele mogą zostać pominięte
3DL2e4A1FnaprzódGCCCCTGCTGAA
ATCAGG (Biblioteka ATCAGG		Rozdział 18Rozdział 5261,14399-416Rozdział 1793DL2*008, *021, *027, *038.
A1RrewersCTGCAAGGACAG
GCATCAA powiedział:		Rozdział 1953 Rozdział 5352,6559-5773DL2*048
Zobacz materiał 3DP1A4FnaprzódGTCCCCTGGTGA
AATCAGA (angielski)		Rozdział 19Rozdział 4952,64Nr kat. 398-416Rozdział 112Brak
A5RrewersGTGAGGCGCAAA
Ogólne Warunki Handlowe (GTCA)		Rozdział 18Rozdział 5255,6Nr tel. 492-509Brak
2DS2A2FnaprzódGTCGCCTGGTGA
AATCAGA (angielski)		Rozdział 19Rozdział 4952,64Nr kat. 398-416Rozdział 111Brak
A6RrewersTGAGGTGCAAAG
TGTCCTTAT (TGTCCTTAT)		2151 Rozdział 5142,9tel. 488-508Brak
Zobacz materiał 3DL3 A8Fa (A8FanaprzódGTGAAATCGGGA
GAGACG		Rozdział 185055,64406-423Rozdział 139Brak
A8FbnaprzódGGTGAAATCAGG
AGAGACG		Rozdział 195052,6405-4233DL3*054, 3DL3*00905.
A8RrewersAGTTGACCTGGG
AACCCG (Kontroler AACCCG)		Rozdział 1851 Rozdział 5161,1526-543Brak
3DL1e4B1FnaprzódCATCGGTCCCAT
GATGCT (Biblioteka GATGCT		Rozdział 1851 Rozdział 5155,64549-566Rozdział 853DL1*00505, 3DL1*006, 3DL1*054, 3DL1*086, 3DL1*089
B1RrewersGGGAGCTGACAA
CTGATAGG powiedział:		20Rozdział 5255614-6333DL1*00502
3DS1Sieć B2FnaprzódCATCGGTTCCAT
GATGCG powiedział:		Rozdział 1851 Rozdział 5155,64549-566Rozdział 853DS1*047; może odebrać 3DL1*054.
B1RrewersGGGAGCTGACAA
CTGATAGG powiedział:		20Rozdział 5255614-633Brak
Zobacz materiał 2DL1B3FnaprzódTTCTCCATCAGT
CGCATGAC powiedział:		20Rozdział 52504544-56396 Rozdział 962DL1*020, 2DL1*028
B3RrewersGTCACTGGGAGC
TGACAC		Rozdział 185061,1622-6392DL1*023, 2DL1*029, 2DL1*030
2DS1B4FnaprzódTCTCCATCAGTC
GCATGAA (Organizacja Współpracy Gospodarczej)		Rozdział 1951 Rozdział 5147,44545-56396 Rozdział 962DS1*001
B4R (Klasa B4RrewersGGTCACTGGGAG
Konwencja CTGAC (Międzynarodowa Organizacja		17Rozdział 4964,7624-640Brak
2DS3B5FnaprzódCTCCATCGGTCG
KNEBEL KOTA		Rozdział 1853 Rozdział 5361,14546-56396 Rozdział 96Brak
B5R (Klasa B5RrewersGGGTCACTGGGA
GCTGAA (Organizacja Współpracy Gospodarczej)		Rozdział 1851 Rozdział 5161,1624-641Brak
Zobacz materiał 2DS5Zobacz materiał B6F2naprzódAGAGAGGGGACG
Specyfikacja TTTAACC (TTTAACC		Rozdział 195052,64Księga 475-493Rozdział 173Brak
Zobacz materiał B6R3rewersTCCAGAGGGTCA
Certyfikat CTGGGC (Biblioteka CTGGGC		Rozdział 1853 Rozdział 5366,7630-6472DS5*003
Zobacz materiał 2DL4Zobacz materiał C1FnaprzódGCAGTGCCCAGC
ATCAAT (Kontroler		Rozdział 18Rozdział 5255,65808-825Rozdział 83Brak
Zobacz materiał C1RrewersCCGAAGCATCTG
TAGGTCT		Rozdział 19Rozdział 5252,6872-8902DL4*018, 2DL4*019
Zobacz materiał 2DL2Zobacz materiał 2DL2F4naprzódGAGGTGGAGGCC
CATGAAT (KOT)		Rozdział 19Rozdział 5257,95Tel. 778-7961512DL2*009; 782G zmieniono na A.
C3R2rewersTCGAGTTTGACC
ACTCGTAT (Biblioteka Medyczna		2051 Rozdział 51Rozdział 45909-928Brak
2DS4Zobacz materiał C5FnaprzódTCCCTGCAGTGC
GCAGC (Biblioteka Główna Policji		175770,65803-819120Brak
C5RrewersTTGACCACTCGT
AGGGAGC powiedział:		Rozdział 19Rozdział 5257,9Zobacz materiał 904-9222DS4*013
2DS4Del2DS4DelnaprzódCCTTGTCCTGCA
GCTCCAT (Biblioteka GCTCCAT)		Rozdział 1954 Rozdział 5457,95Nr kat. 750-768Rozdział 203Brak
2DS4R2rewersTGACGGAAACAA
GCAGTGGA (Biblioteka Główna)		2053 Rozdział 5350933-952Brak
2DS4FL2DS4FLnaprzódCCGGAGCTCCTA
TGACATG powiedział:		Rozdział 1953 Rozdział 5357,95Tel. 744-762Rozdział 209Brak
2DS4R2rewersTGACGGAAACAA
GCAGTGGA (Biblioteka Główna)		2053 Rozdział 5350933-952Brak
Zobacz materiał 2DL3D1FnaprzódAGACCCTCAGGA
GGTGA (Liga Przemysłowa)		17Rozdział 4858,89Lata 1180-1196Rozdział 156Brak
D1RrewersCAGGAGACAACT
TTGGATCA (Język angielski)		2050Rozdział 45Lata 1316-13352DL3*010, 2DL3*017, 2DL3*01801 oraz 2DL3*01802
Zobacz materiał 2DL5D2F (Strefa D2FnaprzódCACTGCGTTTTC
AKAKARAK		20Rozdział 52509Lata 1214-12331202DL5B*011 oraz 2DL5B*020
D2R (Język w języku angielskim)rewersGGCAGGAGACAA
TGATCTT TGATCTT (Protokół TGATCT		Rozdział 19Rozdział 4947,4Lata 1315-1333Brak
Zobacz materiał 2DP1D3FnaprzódCCTCAGGAGGTG
ACATACGT		2053 Rozdział 53559Lata 1184-1203Rozdział 121Brak
D3RrewersTTGGAAGTTCCG
TGTACACT (Protokół TGTACACT)		2050Rozdział 45Lata 1285-1304Brak
3DL1e9D4F (Klasa D4FnaprzódCACAGTTGGATC
ACTGCGT		Rozdział 19Rozdział 5252,691203-122193 Rozdział 933DL1*061, 3DL1*068
D4R2rewersCCGTGTACAAGA
TGGTATCTGTA powiedział:		2353 Rozdział 5343,5Lata 1273-12953DL1*05901, 3DL1*05902, 3DL1*060, 3DL1*061, 3DL1*064, 3DL1*065, 3DL1*094N, 3DL1*098
3DL2e9D4F (Klasa D4FnaprzódCACAGTTGGATC
ACTGCGT		Rozdział 19Rozdział 5252,691203-1221Rozdział 156Brak
D5RrewersGACCTGACTGTG
GTGCTCG powiedział:		Rozdział 1954 Rozdział 5463,2Lata 1340-1358Brak
STATYSTYKA 6STAT6FnaprzódCCAGATGCCTAC
CATGGTGC powiedział:		2054 Rozdział 5460129 Rozdział 129
STAT6RrewersCCATCTGCACAG
ACCACTCC		2054 Rozdział 5460

Tabela 4: Sekwencje starterów używanych w qKAT1,27.

powiedział: TGL TGL powiedział: powiedział: TGL powiedział: TGL powiedział: powiedział: powiedział:
Gen KIR Zobacz materiał 3DL32DS2Zobacz materiał 2DL2Zobacz materiał 2DL3Zobacz materiał 2DP1Zobacz materiał 2DL1Zobacz materiał 3DP1Zobacz materiał 2DL43DL1
EX9		3DL1
EX9		3DS1Zobacz materiał 2DL52DS3Zobacz materiał 2DS52DS12DS4
Łączny		2DS4
Fl		2DS4
Del		3DL2
ex4		3DL2
EX9
Najczęściej kopiowany numercyfra arabska11cyfra arabskacyfra arabskacyfra arabskacyfra arabskacyfra arabskacyfra arabskacyfra arabska11111cyfra arabska11cyfra arabskacyfra arabska

Tabela 5: Najczęstsza liczba kopii genów KIR powszechnie obserwowana w próbkach pochodzenia europejskiego.

Reguły nierównowagi powiązań dla qKAT oparte na populacjach europejskichSprawdzanie numeru kopii
1KIR3DL3, KIR3DP1,KIR2DL4 i KIR3DL2 są genami ramowymi obecnymi w obu haplotypach.KIR3DL3, KIR3DP1,KIR2DL4 i KIR3DL2 = 2
cyfra arabskaKIR2DS2 i KIR2DL2 są ze sobą w LD2DS2=2DL2
3KIR2DL2 i KIR2DL3 są allelami tego samego genu2DL2+2DL3=2
4KIR2DP1 i KIR2DL1 są ze sobą w LD2DP1=2DL1
5Ekson 4 z KIR3DL1 i KIR3DL2 jest równy eksonowi 9 odpowiednio z KIR3DL1 i KIR3DL2.3DL1ex4=3DL1ex9 ORAZ 3DL2ex4=3DL2ex9
6KIR3DL1 i KIR3DS1 są allelami3DL1+3DS1=2
7KIR2DS3 i KIR2DS5 są w LD z KIR2DL52DS3+2DS5=2DL5
8KIR3DS1 i KIR2DS1 są w LD3DS1=2DS1
9Obecność KIR2DS1 i KIR2DS4Total wzajemnie się wykluczają w haplotypie2DS1+2DS4TOTAL=2
10KIR2DS4FL i KIR2DS4del są wariantami KIR2DS4TOTAL2DS4FL+2DS4DEL=2DS4TOTAL

Tabela 6: Nierównowaga powiązań między genami KIR powszechnie obserwowana w populacjach pochodzenia europejskiego może być wykorzystana do sprawdzenia danych o liczbie kopii1,27.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisaliśmy nowatorską, półautomatyczną, wysokoprzepustową metodę o nazwie qKAT, która ułatwia typowanie liczby kopii genów KIR. Metoda ta stanowi postęp w stosunku do konwencjonalnych metod, takich jak SSP-PCR, które są niskoprzepustowe i mogą jedynie wskazywać na obecność lub brak tych wysoce polimorficznych genów.

Dokładność uzyskanych danych dotyczących liczby kopii zależy od wielu czynników, w tym od jakości i jednorodności stężenia próbek gDNA oraz jakości odczynników. Jakość i dokładność próbek gDNA na płytce są niezwykle ważne, ponieważ różnice w stężeniu na płytce mogą powodować błędy w obliczeniach liczby kopii. Ponieważ testy zostały zwalidowane przy użyciu zestawów próbek pochodzenia europejskiego, dane z kohort z innych części świata wymagają dokładniejszych kontroli. Ma to na celu zapewnienie, że przypadki zaniku alleli lub niespecyficznego wiązania starter/sonda nie zostaną błędnie zinterpretowane jako zmiana liczby kopii.

Chociaż testy zostały zaprojektowane i zoptymalizowane pod kątem wysokiej przepustowości, można je modyfikować w celu badania mniejszej liczby próbek. Metryka ufności w oprogramowaniu do analizy liczby kopii ulega pogorszeniu w przypadku analizy mniejszej liczby próbek, ale można ją poprawić, jeśli na płytce zostaną uwzględnione kontrolne próbki genomowego DNA o znanym numerze kopii genu KIR i uwzględnione zostaną dodatkowe powtórzenia próbek.

W przypadku laboratoriów bez robotów do obsługi cieczy/płytek, mieszanka wzorcowa może być dozowana za pomocą pipet wielokanałowych, a płytki można ręcznie ładować do urządzenia qPCR.

Głównym celem stojącym za opracowaniem qKAT było stworzenie prostej, wysokoprzepustowej, wysokorozdzielczej i opłacalnej metody genotypowania KIR do badań asocjacyjnych chorób. Udało się to osiągnąć, ponieważ qKAT został wykorzystany do zbadania roli KIR w kilku dużych badaniach asocjacji chorób, w tym w szeregu chorób zakaźnych, chorób autoimmunologicznych i zaburzeń ciąży 4,24,25,26.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt otrzymał finansowanie od Rady ds. Badań Medycznych (MRC), Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej Horyzont 2020 w zakresie badań i innowacji (umowa o grant nr 695551) oraz od National Institute of Health (NIH) Cambridge Biomedical Research Centre i NIH Research Blood and Transplant Research Unit (NIHR BTRU) w zakresie dawstwa i transplantacji narządów na Uniwersytecie Cambridge oraz we współpracy z NHS Blood and Transplant (NHSBT). Wyrażone poglądy są poglądami autorów, a niekoniecznie poglądami NHS, NIHR, Departamentu Zdrowia lub NHSBT.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
ODCZYNNIKI
OligonukleotydySigmaZamówienie niestandardoweSEKWENCJE: Wymienione w Tabeli 4
Sondy oznaczone barwnikami ATTOSigmaZamówienie niestandardoweSEKWENCJE: Wymienione w Tabeli 3
Sonda SensiFAST No-ROX KitBiolineBIO-86020−
MiliQ woda−−−
NazwaFirmaNumer katalogowyUwagi
>EQUIPMENT
Wirówka z obrotowym wirnikiem kubełkowymEppendorf (lub odpowiednik)Eppendorf 5810R lub równoważny system
NanoDropThermo NaukowyND-2000
OR
QuBit FluorometrLife TechnologiesQ33216
Matrix HydraThermo Scientific109611
LightCycler 480 II Instrument 384-dołkowyRoche05015243001
Twister II Mikropłytka z Mé Termiczny układarka płytowa Cour (Mé Cour)Caliper Life Sciences204135
Mieszalnik VortexBiosanBS-010201-AAA
Pipety jednokanałowe (zakres objętości: 0,5– 10 &mikro; L, 2– 20 &mikro; L, 20– 200 i mikro; L, 200– 1 000 i mikro; L; 1-10 mL)Gilson (lub odpowiednik)F144801, F123600, F123615, F123602, F161201
końcówki do pipet bez RNaz i DNaz filtrowane (10 &mikro; L, 20 i mikro; L, 200 i mikro; L, 1,000 i mikro; L, 10 mL)Starlab (lub odpowiednik)S1111-3810, S1120-1810, S1120-8810, S1111-6810, I1054-0001
Zbiornik odczynnika StarTub PS, 55 mlProbówkaE2310-1010
50 mlSTARLABE1450-0200
96-dołkowa płytka głębinowaFisher Scientific12194162
LC480 384 Płytki wielodołkoweRoche04729749001
Folia uszczelniająca LightCycler 480Roche04729757001
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
SOFTWARE
Roche LightCycler 480 Software v1.5
Oprogramowanie Applied Biosystems CopyCaller v2.1https://www.thermofisher.com/uk/en/home/technical-resources/software-downloads/copycaller-software.html
haplotypu KIR
wirówkowa STARLAB identyfikator http://www.bioinformatics.cimr.cam.ac.uk/haplotypes/

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, W., et al. Copy number variation leads to considerable diversity for B but not A haplotypes of the human KIR genes encoding NK cell receptors. Genome Research. 22, 1845-1854 (2012).
  2. Nemat-Gorgani, N., et al. Different Selected Mechanisms Attenuated the Inhibitory Interaction of KIR2DL1 with C2 + HLA-C in Two Indigenous Human Populations in Southern Africa. The Journal of Immunology. 200, 2640-2655 (2018).
  3. Norman, P. J., et al. Co-evolution of human leukocyte antigen (HLA) class I ligands with killer-cell immunoglobulin-like receptors (KIR) in a genetically diverse population of sub-Saharan Africans. PLoS Genetics. 9, e1003938(2013).
  4. Nakimuli, A., et al. Killer cell immunoglobulin-like receptor (KIR) genes and their HLA-C ligands in a Ugandan population. Immunogenetics. 65, 765-775 (2013).
  5. Bontadini, A., et al. Distribution of killer cell immunoglobin-like receptors genes in the Italian Caucasian population. Journal of Translational Medicine. 4, 1-9 (2006).
  6. Graef, T., et al. KIR2DS4 is a product of gene conversion with KIR3DL2 that introduced specificity for HLA-A*11 while diminishing avidity for HLA-C. The Journal of Experimental Medicine. 206, 2557-2572 (2009).
  7. Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150, 248-264 (2017).
  8. Blokhuis, J. H., et al. KIR2DS5 allotypes that recognize the C2 epitope of HLA-C are common among Africans and absent from Europeans. Immunity, Inflammation and Disease. 5, 461-468 (2017).
  9. Martin, M. P., et al. Epistatic interaction between KIR3DS1 and HLA-B delays the progression to AIDS. Nature Genetics. 31, 429-434 (2002).
  10. Khakoo, S. I., et al. HLA and NK cell inhibitory receptor genes in resolving hepatitis C virus infection. Science. 305, 872-874 (2004).
  11. van Bergen, J., et al. KIR-ligand mismatches are associated with reduced long-term graft survival in HLA-compatible kidney transplantation. American Journal of Transplantation. 11, 1959-1964 (2011).
  12. Hiby, S. E., et al. Association of maternal killer - cell immunoglobulin-like receptors and parental HLA - C genotypes with recurrent miscarriage. Human Reproduction. 23, 972-976 (2008).
  13. Nakimuli, A., et al. A KIR B centromeric region present in Africans but not Europeans protects pregnant women from pre-eclampsia. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, 845-850 (2015).
  14. van Bergen, J., et al. HLA reduces killer cell Ig-like receptor expression level and frequency in a humanized mouse model. The Journal of Immunology. 190, 2880-2885 (2013).
  15. Bachanova, V., et al. Donor KIR B Genotype Improves Progression-Free Survival of Non-Hodgkin Lymphoma Patients Receiving Unrelated Donor Transplantation. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 22, 1602-1607 (2016).
  16. Cooley, S., et al. Donor selection for natural killer cell receptor genes leads to superior survival after unrelated transplantation for acute myelogenous leukemia. Blood. 116, 2411-2419 (2010).
  17. Barani, S., Khademi, B., Ashouri, E., Ghaderi, A. KIR2DS1, 2DS5, 3DS1 and KIR2DL5 are associated with the risk of head and neck squamous cell carcinoma in Iranians. Human Immunology. 79, 218-223 (2018).
  18. Vilches, C., Castaño, J., Gómez-Lozano, N., Estefanía, E. Facilitation of KIR genotyping by a PCR-SSP method that amplifies short DNA fragments. Tissue Antigens. 70, 415-422 (2007).
  19. Ashouri, E., Ghaderi, A., Reed, E. F., Rajalingam, R. A novel duplex SSP-PCR typing method for KIR gene profiling. Tissue Antigens. 74, 62-67 (2009).
  20. Martin, M. P., Carrington, M. KIR locus polymorphisms: genotyping and disease association analysis. Methods in Molecular Biology. , 49-64 (2008).
  21. Crum, K. A., Logue, S. E., Curran, M. D., Middleton, D. Development of a PCR-SSOP approach capable of defining the natural killer cell inhibitory receptor (KIR) gene sequence repertoires. Tissue Antigens. 56, 313-326 (2000).
  22. Houtchens, K. A., et al. High-throughput killer cell immunoglobulin-like receptor genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry with discovery of novel alleles. Immunogenetics. 59, 525-537 (2007).
  23. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  24. Traherne, J. A., et al. KIR haplotypes are associated with late-onset type 1 diabetes in European-American families. Genes and Immunity. 17, 8-12 (2016).
  25. Hydes, T. J., et al. The interaction of genetic determinants in the outcome of HCV infection: Evidence for discrete immunological pathways. Tissue Antigens. 86, 267-275 (2015).
  26. Dunphy, S. E., et al. 2DL1, 2DL2 and 2DL3 all contribute to KIR phenotype variability on human NK cells. Genes and Immunity. 16, 301-310 (2015).
  27. Jiang, W., et al. qKAT: A high-throughput qPCR method for KIR gene copy number and haplotype determination. Genome Medicine. 8, 1-11 (2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Typowanie gen w KIRmetoda qKATPCR w czasie rzeczywistymanaliza liczby kopiireakcje multipleksoweinterakcje HLAreceptory kom rek NKgenetyka populacyjnapowi zania z chorobami

Powiązane artykuły