Wykrywanie tlenku azotu we krwi na podstawie płytek krwi poprzez pomiar fosforylacji VASP

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół dotyczący potencjalnego zastosowania płytek krwi jako bardzo czułego czujnika tlenku azotu we krwi. Opisano w nim wstępne przygotowanie płytek krwi oraz zastosowanie azotynów i odtlenionych krwinek czerwonych jako generatorów tlenku azotu.

Streszczenie

Płytki krwi to składniki krwi odpowiedzialne za prawidłowe krzepnięcie krwi. Ich funkcja jest silnie regulowana przez różne szlaki. Jeden z najsilniejszych czynników wazoaktywnych, tlenek azotu (NO), może również działać jako silny inhibitor agregacji płytek krwi. Bezpośrednie wykrywanie NO we krwi jest bardzo trudne ze względu na jego wysoką reaktywność z hemoglobiną bezkomórkową, która ogranicza okres półtrwania NO do zakresu milisekund. Obecnie brak zmian po interwencjach szacuje się jedynie na podstawie zmierzonych zmian azotynów i azotanów (członków szlaku metabolicznego azotan-azotyn-NO). Jakkolwiek precyzyjne, pomiary te są raczej trudne do zinterpretowania w stosunku do rzeczywistych zmian NO, ze względu na naturalnie wysokie wyjściowe poziomy azotynów i azotanów, które są o kilka rzędów wielkości wyższe niż oczekiwane zmiany samego NO. Dlatego opracowanie bezpośrednich i prostych metod, które pozwoliłyby na bezpośrednie wykrycie NO, jest już dawno spóźnione. Protokół ten odnosi się do potencjalnego zastosowania płytek krwi jako wysoce czułego czujnika NO we krwi. Opisuje początkowe osocze bogatopłytkowe (PRP) i przemyte preparaty płytek krwi oraz zastosowanie azotynów i odtlenionych czerwonych krwinek jako generatorów NO. Fosforylacja VASP w serynie 239 (P-VASP^Ser239) służy do wykrywania obecności NO. Fakt, że białko VASP ulega silnej ekspresji w płytkach krwi i że ulega szybkiej fosforylacji, gdy obecny jest NO, prowadzi do wyjątkowej możliwości wykorzystania tego szlaku do bezpośredniego wykrywania obecności NO we krwi.

Wprowadzenie

Płytki krwi to małe fragmenty komórek w kształcie dysku, pochodzące z megakariocytów, które są kluczowe dla krzepnięcia krwi. Kaskada krzepnięcia jest inicjowana przez różne cząsteczki bioaktywne (takie jak kolagen lub ADP), uwalniane po uszkodzeniu ściany naczyniowej. Proces krzepnięcia krwi może być modyfikowany między innymi przez tlenek azotu (NO). NO, naturalnie wytwarzany przez komórki ssaków, jest jednym z najbardziej wszechstronnych sygnałów fizjologicznych. Działa jako silny środek rozszerzający naczynia krwionośne, neuroprzekaźnik i modulator immunologiczny, aby wymienić tylko kilka z wielu jego funkcji. W krwiobiegu NO pomaga również regulować stopień krzepnięcia krwi poprzez hamowanie agregacji płytek krwi. Jednym z najbardziej prawdopodobnych źródeł NO w krwiobiegu jest azotyn, jon nieorganiczny, który, jak wykazano, służy jako prekursor NO. W reakcji z czerwonymi krwinkami (RBC) azotyn jest redukowany do NO, a deoksyHb jest utleniany do methemoglobiny (metHb)¹. NO uwalniany z erytrocytów jest wazoaktywny i powoduje wazorelaksację². Ten szlak redukcji azotynów jest alternatywnym szlakiem wytwarzania NO, działającym razem i uzupełniającym klasyczną ścieżkę generowania NO przez śródbłonkową syntazę tlenku azotu w warunkach niedotlenienia.

Płytki krwi same w sobie nie są w stanie zredukować azotynu do NO, ale są bardzo wrażliwe na jego obecność. W nienaruszonych płytkach krwi NO w zakresie nanomolowym zwiększa cGMP (EC₅₀ = 10 nM) i fosforylację VASP (EC₅₀ = 0,5 nM)³. Dlatego płytki krwi mogą służyć jako doskonały czujnik redukcji azotynów przez erytrocyty i uwalniania NO do krwi. Istnieje kilka metod, które mogą bezpośrednio mierzyć stopień aktywacji płytek krwi - takich jak agregegometria i tromboelastografia (TEG)^4,5. Metody te wymagają jednak drogiego specjalistycznego oprzyrządowania i dość dużych ilości materiału. Możliwe jest również monitorowanie zdarzeń później, po uwolnieniu NO z erytrocytów, przy użyciu zmian w ekspresji białek powierzchniowych płytek krwi – takich jak P-selectin⁶. Wiadomo również, że NO zwiększa ilość cGMP w płytkach krwi⁷. Wcześniej używaliśmy cGMP do monitorowania uwalniania NO do krwi po redukcji azotynów przez odtlenione RBC⁸. Okazało się, że jest to bardzo delikatna metoda; jednak cGMP jest cząsteczką krótkotrwałą, a jej wykrycie wymaga dużego nakładu pracy. Inna możliwość, opisana w przedstawionym protokole, wykorzystuje fosforylację stymulowanego przez środek rozszerzający naczynia krwionośne białka fosfo (VASP) w celu wykrycia obecności NO we krwi. VASP jest substratem aktywacji kinazy białkowej G, która ulega fosforylacji w wyniku interakcji z NO poprzez szlak sGC / cGMP⁹. Wykrywalna fosforylacja VASP zachodzi przy bardzo niskich stężeniach NO, co może sprawić, że płytki krwi będą bardzo czułym detektorem obecności NO we krwi. VASP ulega silnej ekspresji w płytkach krwi, ale nie w innych komórkach krwi, co pozwala na selektywne śledzenie zdarzeń z udziałem płytek krwi¹⁰.

Głównym celem tego protokołu jest szczegółowe opisanie metody wykrywania uwalniania NO w pełnej krwi za pomocą jej interakcji z płytkami krwi poprzez monitorowanie fosforylacji VASP^11,12. Opisana metoda pozwala na wczesne wykrycie niskich stężeń NO - teoretycznie w zakresie nanomolowym, co sprawia, że obecny protokół jest bardziej czuły niż oznaczanie cGMP, ze względu na zastosowanie standardowych technik Western blot osiągalnych w większości warunków laboratoryjnych.

Protokół

UWAGA: Próbki krwi zostały pobrane z banku krwi NIH (protokół zatwierdzony przez IRB: 99-CC-0168).

1. Przygotowanie próbki krwi

UWAGA: Aby uniknąć aktywacji płytek krwi, powoli pobieraj krew i delikatnie mieszaj z cytrynianem, kilkakrotnie odwracając rurkę.

1. Preparat osocza bogatopłytkowego (PRP)
   1. Pobrać 30-50 ml krwi za pomocą igły o średnicy 20 g lub większej i dodać do probówki zawierającej cytrynian sodu (3,8%) w stosunku 1:9 lub kwaśną cytrynian-dekstrozę (ACD) (85 mM cytrynian trisodowy, 66,6 mM kwas cytrynowy, 111 mM glukozy, pH 4,5) w stosunku 1:6.
   2. Podwielokrotność 5 ml świeżo pobranej krwi pełnej do pustych stożkowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować krew pełną o sile 120 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Ostrożnie pobrać supernatant zawierający płytki krwi (osocze bogatopłytkowe, PRP) z górnej części za pomocą plastikowej pipety transferowej.
      UWAGA: PRP z kroku 1.1.3 jest gotowy do użycia w eksperymentach lub do dalszego przetwarzania w celu przygotowania przemytych płytek krwi. Miękki osad otrzymany po odwirowaniu (etap 1.1.2) zawiera krwinki czerwone i krwinki białe i może być dalej oczyszczany w celu uzyskania przemytych krwinek czerwonych (RBC) – patrz etap 1.3. Eksperyment musi zostać zakończony w ciągu 2 godzin od pobrania krwi. Podczas zbierania PRP (supernatantu) należy unikać gromadzenia leukocytów zawierających otoczkę kożuchową nagromadzonych na granicy faz PRP/RBC.
2. Preparat z płukanymi płytkami krwi (opcjonalnie)
   1. Odwirować zebrane PRP w temperaturze 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Odrzucić supernatant i zachować granulki płytek krwi.
   2. Delikatnie umyć granulki, dodając 5 ml buforu CGS (120 mM NaCl, 12,9 mM cytrynian trisodowy i 30 mM glukozy, pH 6,5) i odwirować przy 400 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   3. Zawiesić osady płytek krwi w 3 ml zmodyfikowanego buforu Tyrode (134 mM NaCl, 0,34 mM NaH₂PO₄, 2,9 mM KCl, 12 mM NaHCO₃, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl₂, 2 mM CaCl₂, 10 mM pH glukozy 7,4).
   4. Rozcieńczyć płytki krwi (1:100 — na przykład 10 μl płytek krwi w 990 μl roztworu Reesa-Eckera) roztworem Reesa Eckera i policzyć za pomocą hemocytometru.
   5. Dostosuj gęstość płytek krwi do 3 x 10⁸ komórek/ml, dodając bufor Tyrode.
   6. Inkubować zawiesinę płytek krwi w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę przed rozpoczęciem doświadczenia.
      UWAGA: Umyte płytki krwi są stabilne przez 5–8 godzin w temperaturze 37 °C.
3. Przygotowanie przemytych krwinek czerwonych (RBC)
   1. Po zebraniu odwirować miękki osad otrzymany w kroku 1.1.3 przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Odrzucić supernatant i przemyć osad RBC 5 ml PBS przez odwirowanie przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Powtórz ten krok 3 razy.
   3. Wyrzuć PBS i użyj umytych krwinek czerwonych do dalszych eksperymentów.

2. Odtlenienie

1. Dodać 1 ml mieszaniny PRP (przygotowanej w kroku 1.1.4 lub 1.2.4.) i erytrocytów (przygotowanych w kroku 1.3.) w żądanym hematokrycie do polipropylenowej butelki zamkniętej gumowym korkiem. Na przykład przy 20% hematokrycie dodaj 200 μl erytrocytów do 800 μl PRP.
   UWAGA: Sugerowany hematokryt wynosi od 0% do 40%. Nie należy używać szklanej butelki ani kolby, ponieważ płytki krwi przylegają do powierzchni szkła.
2. Włóż igłę podłączoną do zbiornika helu do zamkniętej butli i wykonaj wylot gazu, wkładając igłę 26 G (Rysunek 1).
3. Powoli obracaj butelką w temperaturze pokojowej.
   UWAGA: Nie pozwól, aby gaz He przedostał się przez preparat krwi. W przypadku tej procedury preferowany jest powolny przepływ gazu, a zbyt szybki przepływ gazu He prowadzi do zwiększonej hemolizy. Najbardziej efektywny przepływ gazu musi zostać określony za pomocą próby, ponieważ w dużym stopniu zależy od geometrii układu doświadczalnego.
4. Okresowo śledź proces odtleniania, mierząc ciśnienie parcjalne tlenu (pO₂) za pomocą CO-oksymetru.
   UWAGA: W naszych rękach 10 minut odtleniania zmniejsza pO₂ do 25 mmHg, co jest wymagane do redukcji azotynów przez erytrocyty. Kontynuowanie odtleniania jeszcze bardziej zmniejszyło pO₂ do 10 mmHg; jednak doprowadziło to do zwiększonej hemolizy i wzrostu hemoglobiny bezkomórkowej (Rysunek 2).

3. Redukcja azotynów w czerwonych krwinkach

1. Dodać 1 ml PBS (pH 7,4) do 0,0345 g_NaNO2, aby uzyskać 500 mM roztworu podstawowego azotynów. Rozcieńczyć 500 mM_NaNO2 do 250 μM_NaNO2 (25x) przez seryjne rozcieńczanie w PBS (pH 7,4).
2. Za pomocą mikrostrzykawki wstrzyknąć azotyny (40 μl) przez przegrodę do odtlenionej próbki PRP i RBC, aby uzyskać końcowe stężenia 10 μM w sumie 1 ml próbki.
   UWAGA: W tym eksperymencie końcowe stężenie użytego azotynu wynosi 10 μM.
3. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut lub dłużej.
   UWAGA: Dostosuj dokładny czas inkubacji RBC z azotynami potrzebnymi do maksymalnej redukcji azotynów dla różnych typów eksperymentów.
4. Usunąć korek i odpipetować 1 ml próbki do probówki do mikrowirówki.
5. Wirować przy 200 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
6. Pobrać pipetą 300 μl zawiesiny płytek krwi z górnej części supernatantu i wymieszać z ACD (pH 6,5) w stosunku 1:9. Wyrzuć osad RBC.
7. Odwirować zawiesinę płytek krwi o sile 500 x g przez 4 minuty w temperaturze pokojowej.
8. Do granulek płytek krwi dodać 80 μl lodowatego buforu do lizy (150 mM NaCl, 50 mM Tris, 0,5% NP-40, pH 7,4) zawierającego koktajl inhibitorów proteazy III (1:500).

4. Western Blotting VASP

1. Załaduj 15 μg białka z każdej próbki do 2 oddzielnych 10% żeli SDS-PAGE.
   UWAGA: Ostry bufor odpędzający, który zawiera b-merkaptoetanol, nie może usunąć P-VASP^Ser239 i przeciwciał VASP z membrany; w związku z tym P-VASP ^Ser239 i VASP powinny być uruchamiane oddzielnie.
2. Uruchom żele pod napięciem 120 V przez 1,30 godziny i przenieś do membrany nitrocelulozowej.
3. Zablokuj niespecyficzne wiązanie z 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku.
4. Inkubować błonę z P-VASP^Ser239 (1:500), VASP (1:1,000) i GAPDH (1:1,000) przez noc w temperaturze 4 °C.
5. Inkubować przeciwciało drugorzędowe peroksydazy chrzanowej (HRP) z membraną przez 45 minut w temperaturze pokojowej.
6. Wystaw membranę za pomocą imagera i określ ilościowo gęstość pasma za pomocą ImageJ.

Wyniki

Próbki krwi żylnej mają wartości pO₂ między 50-80 mmHg. Odtlenianie helem szybko obniża pO₂ do 25 mmHg w ciągu 10 minut. Wydłużony czas odtleniania nieco dalej zmniejsza pO₂ . Jednak wydłużony czas odtleniania prowadzi również do znacznie zwiększonych poziomów hemoglobiny bezkomórkowej (określonych przez CO-Oximeter, wizualnie widocznych na Rysunek 2 jako coraz bardziej czerwone zabarwienie osocza) ( Rysunek ...

Dyskusja

Ponieważ płytki krwi łatwo się aktywują, konieczne jest delikatne obchodzenie się z próbkami zawierającymi płytki krwi. Należy unikać szybkiego pipetowania i energicznego potrząsania. Inhibitory płytek krwi, takie jak prostacyklina (ChOG₂), mogą być stosowane w celu zapobiegania aktywacji płytek krwi; Może to jednak wpływać na niektóre szlaki sygnałowe wewnątrz płytek krwi. Do przygotowania granulek płytek krwi dodajemy ACD do zawiesin płytek krwi i stosujemy wirowanie z niską prędkością.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cytrynian trójsodowy	Dostawa przez bank
Kwas cytrynowy	Dostawa przez bank
Glukoza	Sigma	G7528-250G
NaCl; chlorek sodu	Sigma	S-7653 1kg
NaH2PO4; sodu fosforan jednozasadowy, monohydrat	Mallinckrodt Chemical	7892-04
KCl; chlorek potasu	Mallinckrodt Chemical	6858
NaHCO3; wodorowęglan sodu	Mallinckrodt Chemical	7412-12
HEPES; Kwas N-[2-hydroksyetylo]piperazyno-N'-[-etanosulfonowy]	Sigma	H3375-500g
MgCl2 (1 M); chlorek magnezu	Jakość Biologia	351-033-721
CaCl2; chlorek wapnia	Sigma	C5080-500G
Nalgene Butelki ekonomiczne HDPE wąskootworowe	Nalgene	2089-0001
Czerwona przegroda Korek nr 29	Fisherbrand	FB57877
NaNO2-; azotyn sodu	Sigma	S2252-500G
TRIZMA Base; Tris[hydroksymetylo]aminometan	Sigma	T8524-250G
NP-40; Glikol 4-nonylofenylo-polietylenowy	Sigma	74385-1L
Zestaw koktajlowy inhibitorów proteazy III	Calbiochem	539134
Przeciwciało Phospho-VASP (Ser239)	Technologia sygnalizacji komórkowej	3114
Przeciwciało VASP	Technologia sygnalizacji komórkowej	3112
GAPDH (14C10) Królicza mAb	Technologia sygnalizacji komórkowej	2118
2-merkaptoetanol	Sigma	M-6250-10ml
Peroksydaza AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)	Jackson Immuno Research Laboratories	111-035-003
Przejrzystość Zachodni substrat ECL	BIO-RAD	1705060-200ml
CO-oksymetr (ABL 90 flex)	Radiometr