Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie białek histonów H3 i H4 oraz oznaczanie ilościowe acetylowanych śladów histonów w komórkach i tkance mózgowej

24.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58648

⸱

30 listopada 2018

 ,  , 
1Department of Psychiatry & Behavioral Sciences, University of Miami Miller School of Medicine, 2Center for Therapeutic Innovation, University of Miami Miller School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego, systematycznego przewodnika po skutecznym oczyszczaniu histonów H3 i H4 oraz kwantyfikacji reszt acetylowanych histonów.

Streszczenie

We wszystkich organizmach eukariotycznych chromatyna, fizjologiczny szablon całej informacji genetycznej, jest niezbędna dla dziedziczności. Chromatyna podlega szeregowi różnorodnych modyfikacji potranslacyjnych (PTM), które najczęściej występują na końcach aminowych białek histonowych (tj. ogonie histonowym) i regulują dostępność i stan funkcjonalny leżącego u podstaw DNA. Ogony histonowe rozciągają się od rdzenia nukleosomu i podlegają dodawaniu grup acetylowych przez acetylotransferazy histonowe (HAT) oraz usuwaniu grup acetylowych przez deacetylazy histonowe (HDAC) podczas wzrostu i różnicowania komórek. Specyficzne wzorce acetylacji reszt lizyny (K) na ogonach histonowych określają dynamiczną homeostazę między chromatyną aktywną transkrypcyjnie lub tłumioną transkrypcyjnie poprzez (1) wpływanie na zespół histonów rdzenia i (2) rekrutację synergicznych lub antagonistycznych białek związanych z chromatyną do miejsca transkrypcji. Podstawowy mechanizm regulacyjny złożonej natury PTM ogona histonowego wpływa na większość procesów szablonowych chromatyny i powoduje zmiany w dojrzewaniu i różnicowaniu komórek zarówno w normalnym, jak i patologicznym rozwoju. Celem niniejszego raportu jest dostarczenie nowicjuszom skutecznej metody oczyszczania podstawowych białek histonowych z komórek i tkanki mózgowej oraz wiarygodne określenie ilościowe śladów acetylacji na histonach H3 i H4.

Wprowadzenie

Termin epigenetyka odnosi się do dziedzicznych zmian w aktywności genów, które zachodzą niezależnie od zmian w sekwencji DNA1,2. Transkrypcja i represja genów są determinowane przez (1) dostępność chromosomalnego DNA owiniętego wokół oktamera podstawowych białek histonowych (po dwie kopie H2A, H2B, H3 i H4) oraz przez (2) dostępność czynników transkrypcyjnych i białek rusztowania rekrutowanych do określonych miejsc promotorowych3,4. Transkrypcja genów jest regulowana przez enzymatyczne modyfikacje określonych miejsc promotora DNA i PTM ogonów histonów5,6,7. N-końce histonu H3 i H4 należą do najbardziej konserwatywnych sekwencji znanych w organizmach eukariotycznych3, a ich modyfikacje potranslacyjne zostały obszernie udokumentowane, aby odgrywać kluczową rolę w określaniu struktury i funkcji chromatyny8,9. PTM na ogonach histonów (tj. acetylacja, metylacja, fosforylacja i ubikwitynacja) zmieniają potencjał interakcji ogonów, wpływają na stan strukturalny i fałdowanie włókna chromatyny, a tym samym regulują dostępność i przetwarzanie DNA4,10,11,12. Grupy acetylowe są dodawane i usuwane z reszt K na ogonach histonowych przez zestaw specyficznych enzymów epigenetycznych oddziałujących z histonami, a mianowicie odpowiednio HAT i HDAC13. Na przykład, wcześniej wykazano, że acetylacja histonu H4 przy lizynie 12 (H4K12ac) aktywuje transkrypcję genów związanych z nabywaniem i konsolidacją pamięci14. Ponadto kilka linii dowodów sugeruje, że epigenetyczna kontrola transkrypcji genów za pośrednictwem enzymów jest kluczowym aspektem zdrowego wzrostu i różnicowania komórek6,15. Wykazano, że zmiana w epigenetycznej regulacji ekspresji genów, czy to przez epigenetyczne modyfikacje DNA, czy przez mutację samych enzymów epigenetycznych, jest rozregulowana w chorobach ludzkich, w których zmiana aktywności określonego genu jest cechą charakterystyczną patologii (np. rak)6,16,17. W związku z tym ocena zmian w rdzeniowych histonach PTM staje się cennym celem dla potencjalnych interwencji terapeutycznych. Jednak określenie obfitości, oddziałujących na siebie partnerów i konkretnych ról histonów PTM okazało się wyzwaniem18.

W bieżącym raporcie opisana jest zoptymalizowana, średnioprzepustowa strategia oczyszczania histonów rdzeniowych z komórek i tkanek mózgowych w jednej frakcji oraz kompletny protokół do kwantyfikacji histonów H3 i H4 PTM. Warto zauważyć, że chociaż obecnie publikowane techniki oczyszczania na bazie kwasów i strategie wykrywania histonów oparte na przeciwciałach są szeroko stosowane do charakteryzacji histonów, brakuje w nich opisowych szczegółów dotyczących krytycznych etapów procedury, co utrudnia szybką i powtarzalną ekstrakcję histonów i kwantyfikację. Na przykład przetwarzanie ekstraktów komórkowych i biopsji tkanek wymaga różnych narzędzi i technologii do skutecznej ekstrakcji. Co więcej, zoptymalizowany protokół przedstawiony w niniejszym manuskrypcie demonstruje praktyczne podejście o średniej przepustowości. Histony rdzeniowe są ekstrahowane jako pojedyncza, czysta frakcja, co umożliwia niezawodne wykrywanie PTM za pośrednictwem przeciwciał bez żadnych zakłóceń spowodowanych zanieczyszczeniami. Co więcej, w niniejszym manuskrypcie udało się obejść wyzwania związane z wykrywaniem histonów ze względu na ich małą masę cząsteczkową. Zazwyczaj brak zgodności między protokołami oczyszczania, kwantyfikacji i elektroforezy żelowej utrudnia naukowcom uzyskanie powtarzalnych i rozstrzygających wyników. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany przebieg pracy w celu oczyszczenia histonów rdzeniowych z komórek i tkanek oraz przygotowania ich do dalszych analiz PTM za pomocą western blot.

Obecny protokół umożliwia oczyszczanie podstawowych białek histonowych przy jednoczesnym zachowaniu ich natywnych modyfikacji potranslacyjnych (tj. acetylacji, metylacji i fosforylacji). Rysunek 1 przedstawia oś czasu protokołu oczyszczania histonów.

Protokół

Wszystkie myszy były utrzymywane w akredytowanym przez AAALAC obiekcie dla zwierząt z kontrolowaną wilgotnością i temperaturą na Uniwersytecie Miami Miller School of Medicine. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Miami Miller School of Medicine i przeprowadzone zgodnie ze specyfikacjami NIH.

1. Przygotowanie ekstraktu z próbki

  1. Komórki adherentne
    1. Wysiać komórki w naczyniach o średnicy 10 cm w odpowiedniej pożywce hodowlanej (1 x 106 do 1 x 109 liczba komórek na płytkę dla linii komórkowych, takich jak BV2, HEK-293 i SH-SY5Y, wynosi jednak ~1 x 1015 liczba komórek na płytkę dla komórek pierwotnych, takich jak pierwotne neurony korowe). Należy upewnić się, że komórki są równomiernie rozłożone na całej powierzchni płytki i pozwolić im rosnąć przez 48 h do osiągnięcia ~100% konfluencji (37 °C, 5% CO22).
    2. Po osiągnięciu przez komórki pożądanej konfluencji, delikatnie odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki dwukrotnie podwyższonej temperatury pożywką bezsurowiczą w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    3. Odssać pożywkę bezsurowiczą z naczynia i dodać 1 ml schłodzonego w lodzie buforu do ekstrakcji (0,4 M kwasu siarkowego, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl [pH 8.0] i 1x koktajl inhibitorów proteaz) do każdej szalki.
    4. Użyj plastikowego skrobaka do komórek, aby zebrać wszystkie komórki w buforze do ekstrakcji (poprzez zeskrobanie), a następnie przenieś je do oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml z 1,000 µL pipetka. Przenieś komórki pipetką w górę i w dół 3 razy, aby ułatwić homogenizację.
    5. Zamknąć wszystkie probówki i natychmiast umieścić je w lodzie.
  2. Tkanka mózgowa
    1. W przypadku użycia tkanki zamrożonej, należy umieścić ją w schłodzonej wcześniej probówce o pojemności 1,5 ml i krótko rozmrozić na lodzie. W przypadku użycia tkanki świeżej należy bezzwłocznie przejść do kroku 1.2.2.
      UWAGA: Niniejszy protokół opisuje procedury z wykorzystaniem zamrożonych próbek mózgu oraz kory przedczołowej myszy.
    2. Zhomogenizuj tkankę za pomocą ręcznego homogenizatora Dounce'a, stosując odpowiednią ilość buforu do ekstrakcji oraz zalecaną liczbę pociągnięć (Tabela 1). Aby uniknąć nadmiernego fragmentowania chromatyny, nie należy przekraczać zalecanej liczby pociągnięć.
    3. Przy użyciu pojedynczego kanału 1,000 µL za pomocą pipety przenieść homogenat do schłodzonej wcześniej probówki o pojemności 1,5 ml. Zamknąć wszystkie probówki i natychmiast umieścić je w lodzie.

2. Przygotowanie surowego ekstraktu histonowego

  1. Probówki o objętości 1,5 mL zawierające komórki lub tkankę zawieszoną w buforze do ekstrakcji należy umieścić na platformie rotacyjnej i inkubować przy 15 rpm w temperaturze 4 °C, aby umożliwić ekstrakcję surowych histonów.
    UWAGA: Czas ekstrakcji może się różnić w zależności od rodzaju komórek i tkanek i musi zostać zoptymalizowany dla każdej procedury. Niniejszy protokół przedstawia wyniki uzyskane po 15 min, 2 h i 24 h ekstrakcji (Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4 oraz Rysunek 5).
  2. Mikrowirówkę należy schłodzić do 4 °C. Po upływie pożądanego czasu ekstrakcji probówki należy wirować z maksymalną prędkością przez 10 min w temperaturze 4 °C.
  3. Nadosad zawierający surowe histony należy przenieść do nowej, schłodzonej probówki o objętości 1,5 mL. Osad należy usunąć.
  4. Nadosad należy przechowywać w temperaturze -80 °C (ekstrakcję można przerwać na tym etapie, patrz „Stop step” na Rysunku 1) lub niezwłocznie przejść do następnego kroku.
  5. Surowe histony należy zneutralizować, dodając 1/4 objętości 5x buforu neutralizującego (np. dodać 250 µL 5x buforu neutralizującego do 1 mL surowych histonów). Dobrze wymieszać, pipetując próbkę w górę i w dół 6 razy.
  6. pH mieszaniny należy sprawdzić za pomocą pasków wskaźnikowych pH. W razie potrzeby dodać więcej buforu neutralizującego, aby osiągnąć pH 7.
  7. Obecność białek histonowych i niehistonowych w surowym ekstrakcie histonowym należy ocenić w następujący sposób (Rysunek 2).
    1. Do 12,5 µL 4x buforu do próbek (Laemmli) należy dodać 37,5 µL próbki i denaturować przez 10 min w temperaturze 99 °C.
    2. Próbkę należy nałożyć na żel SDS-PAGE i prowadzić elektroforezę przez 1 h przy 100 V.
    3. Żel należy barwić przez noc w roztworze barwiącym Coomassie Brilliant Blue R-250, a następnie odbarwić w trzech kolejnych cyklach płukania (1 h/płukanie) roztworem odbarwiającym Coomassie Brilliant Blue R-250.
      UWAGA: Surowe histony (Rysunek 2) można porównać z histonami eluowanymi i oczyszczonymi (tj. materiałem naniesionym na kolumnę [Rysunek 5A]).

3. Oczyszczanie histonów rdzeniowych

  1. Równoważenie kolumny wirowej
    1. Do każdej używanej kolumny wirowej dodać 500 µL buforu równoważącego. Nie dotykać membrany kolumny.
    2. Wirować w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 800 x g. Odrzucić przelew. Powtórzyć 1x.
  2. Oczyszczanie histonów
    1. Do kolumny dodać 500 µL analizowanej próbki z kroku 2.6. Wirować w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 800 x g. Zebrać przelew.
    2. Powtarzać poprzedni krok tyle razy, ile jest konieczne, aby nałożyć całą próbkę na kolumnę. Nie przepełniać kolumny wirowej.
    3. Połączyć przelewy z każdego etapu wirowania, aby przeanalizować wydajność wiązania kolumny (Rysunek 3).
    4. Postępować zgodnie z krokiem 2.7 w celu analizy przelewu z kolumny.
  3. Płukanie kolumny
    1. Do każdej kolumny dodać 500 µL buforu do płukania. Wirować w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 800 x g. Zebrać przelew z płukania (płukanie nr 1).
    2. Powtarzać krok 3.3.1 łącznie trzy razy. Zebrać przelewy z płukania nr 2 i nr 3. Nie łączyć kolejnych przelewów z płukania kolumny.
    3. Aby dalej ocenić wydajność wiązania histonów przez kolumnę, przeanalizować trzy płukanki z kolumny zgodnie z krokiem 2.7 (Rysunek 4).
  4. Elucja histonów
    1. Przenieść kolumnę do nowej, oznakowanej probówki o pojemności 1,5 mL.
    2. Dodać 50 µL buforu do elucji histonów. Wirować w temperaturze 4 °C przez 3 min przy 800 x g. Zachować przelew zawierający białka histonowe.
    3. W celu przeprowadzenia dodatkowej elucji powtórzyć krok 3.4.2. Nie łączyć pierwszego i drugiego eluatu z przelewu, ponieważ różnią się one ilością i czystością histonów.

4. Wytrącanie histonów rdzeniowych

  1. Dodaj kwas nadchlorowy (PCA) do oczyszczonych histonów do końcowego stężenia 4% PCA (np. dodaj 3 µL 70% PCA do 50 µL oczyszczonych histonów z kroku 3.4.2.).
  2. Wiruj przez 3 s, aby zebrać cały pozostały płyn ze ścianek probówki. Wymieszaj, pipetując w górę i w dół 6 razy.
  3. Umieść probówki w statywie i inkubuj przez 24 h w temperaturze 4 °C.
  4. Następnego dnia schłodź mikrowirówkę do 4 °C i wiruj próbki przez 75 min z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C.
  5. Po zakończeniu wirowania na dnie probówki widoczny będzie mały biały osad zawierający wytrącone histony. Nie mieszaj próbki w wstrząsarzu typu vortex.
  6. Ostrożnie odessij supernatant i, nie naruszając osadu, dodaj do próbki 500 µL lodowatego 4% PCA.
  7. Wiruj w temperaturze 4 °C przez 10 min z maksymalną prędkością. Ostrożnie odessij supernatant.
  8. Powtórz krok 4.7 dwukrotnie.
  9. Nie naruszając osadu, dodaj 500 µL lodowatego acetonu. Wiruj w temperaturze 4 °C przez 10 min z maksymalną prędkością. Ostrożnie odessij supernatant.
  10. Powtórz krok 4.9 dwukrotnie.
  11. Ostrożnie odessij supernatant, pozostaw probówki niezakryte i pozwól próbce wyschnąć na lodzie przez 30 min. Sprawdź, czy cały pozostały aceton odparował.
  12. Pozostaw probówki niezakryte i pozwól próbce wyschnąć w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 min.
  13. Resuspenduj osad w 30 µL sterylnej wody. Nie pipetuj w górę i w dół. Delikatnie opukaj probówkę palcem.
  14. Zakręć wszystkie probówki i pozwól histonom zrekonstytuować na lodzie przez 30-50 min, w zależności od wielkości osadu. Sprawdź, czy osad został resuspendowany.
  15. Zakręć wszystkie probówki i pozwól osadowi dalej się resuspendować w temperaturze RT przez 5 min.
    UWAGA: Ten roztwór (pierwsza i druga elucja z kroku 3.4.3) składa się z oczyszczonych i odsolonych histonów i może być wykorzystany do dalszej kwantyfikacji oraz analizy acetylacji histonów.

5. Ilościowe oznaczenie eluowanych białek histonowych

  1. Użyj spektrofotometru zgodnie z protokołem producenta, aby określić ilość całkowitych białek histonowych uzyskanych po końcowej elucji w kroku 4.15. Zmierz absorbancję przy 230 nm. Zapisz stosunek A260/A280, który wskazuje na zanieczyszczenie próbki kwasami nukleinowymi.
  2. Użyj następującego wzoru do obliczenia stężenia histonów (x):
    figure-protocol-1
    Gdzie OD to gęstość optyczna zmierzona przy A230 nm.
  3. Stężenie histonów na poziomie ~1,5 mg/mL uznaje się za średnią wydajność dla linii komórkowych, natomiast stężenie histonów na poziomie ~5,0 mg/mL uznaje się za średnią wydajność dla 30 mg tkanki.

6. Analiza Western Blot

  1. Dostosuj ilość oczyszczonych i eluowanych histonów z kroku 4.15 do poziomu ~10 µg białka histonowego na próbkę.
  2. Dodaj odpowiednią objętość wody oraz 4x buforu do próbek Laemmli, aby dostosować objętości nakładania.
  3. Denaturuj próbki przez 10 min w temperaturze 99 °C. Schłodź je na lodzie. Wiruj przez 3 s, aby zebrać całą pozostałą ciecz i kondensację ze ścianek probówki.
  4. Nałóż próbki na żel SDS-PAGE i prowadź elektroforezę przez 1 h przy napięciu 100 V.
  5. Aby zwizualizować całkowitą zawartość białek histonowych, barwi żel przez noc w roztworze barwiącym Coomassie Brilliant Blue R-250, a następnie odbarwiaj go podczas trzech kolejnych przemywań (1 h/przemywanie) roztworem odbarwiającym Coomassie Brilliant Blue R-250.
    UWAGA: Pierwsza elucja białek histonowych zawiera histony wysokiej jakości (Rysunek 5A), podczas gdy druga elucja zawiera niskie lub zerowe poziomy histonów (Rysunek 5B).
  6. Aby ilościowo określić PTM histonów, użyj systemu transferu (patrz Tabela materiałów), aby przenieść białka histonowe z żelu SDS-PAGE (krok 6.4) na membranę PVDF.
    1. Aby złożyć kanapkę transferową, otwórz kasetę systemu transferu i umieść stos membrany PVDF (oznaczony jako Bottom+) na dnie kasety membraną skierowaną do góry. Delikatnie przeturuluj membranę wałkiem do blotingu, aby usunąć powietrze z przestrzeni między stosem a membraną.
    2. Połóż żel na membranie, delikatnie przeturuluj żel wałkiem do blotingu, aby usunąć powietrze z przestrzeni między membraną a żelem, a następnie umieść górny stos na żelu. Ponownie delikatnie przeturuluj i nałóż pokrywę kasety na górę kanapki, mocno dociśnij i przekręć pokrętło zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zablokować.
    3. Wsuń kasetę do gniazda systemu transferu. Na ekranie urządzenia wybierz Turbo Protocol. Zastosuj 3-minutowy protokół dla pojedynczego mini żelu lub 7-minutowy protokół dla więcej niż dwóch mini żeli.
    4. Zabarw membranę barwnikiem Ponceau S przez 5 min i zwizualizuj całkowitą zawartość białek histonowych.
    5. Przemyj je w 1x buforze solnym z Tris (TBS) z dodatkiem 0,1% Tween 20 przez 2 h i blokuj w 5% mleku przez 1 h. Inkubuj z przeciwciałem pierwszorzędowym i drugorzędowym (odpowiednio przez noc w 4 °C lub 1 h w temperaturze pokojowej RT) lub zgodnie z wcześniej zoptymalizowanym protokołem.
      UWAGA: W niniejszym protokole zastosowano przeciwciała przeciwko acetylowanym histonom H4K12 (Rysunek 6 i Rysunek 7) oraz H3K27 (Rysunek 8).

Wyniki

Aby zilustrować przebieg protokołu oczyszczania histonów oraz skład wszystkich analizowanych frakcji, oceniono różne ekstrakty histonowe z ludzkich komórek mikrogleju BV2. W celu zademonstrowania ilościowego oznaczenia modyfikacji potranslacyjnych (PTM) histonów H3 i H4 (t.j., acetylacji), wykorzystano lizaty tkanki mózgowej.

Komórki BV2 wysiano w gęstości 5 x 106 komórek na płytkę w 10 cm naczyniach do hodowli tkankowej i pozostawiono do wzrostu do stanu konfluencji przez 48 h. Następnie zebrano komórki, a histony uwolniono z chromatyny poprzez inkubację w buforze ekstrakcyjnym zawierającym 0,4 M kwasu siarkowego, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) oraz 1x inhibitor proteaz. Czas ekstrakcji, od 15 min do 24 h, nie wpłynął na ogólny skład surowych ekstraktów histonowych, co ustalono za pomocą barwienia Coomassie Brilliant Blue (Rysunek 2). Następnie surowe histony przepuszczono przez równoważone kolumny histonowe i przeanalizowano filtrację. Wysoka wydajność wiązania do kolumny jest określana przez brak białek histonowych w filtracie podczas analizy barwieniem Coomassie Brilliant Blue. Stwierdzono, że wydajność wiązania do kolumny wynosiła 100%, ponieważ w analizowanym filtracie nie wykryto białek histonowych (Rysunek 3). Wszystkie membrany z wiązanymi histonami przemyto następnie trzykrotnie buforem płuczącym w celu usunięcia pozostałych zanieczyszczeń, pozostawiając jedynie białka histonowe związane z żelem krzemionkowym. Ustalono, że dla wszystkich czasów ekstrakcji histonów (i.e., 15 min, 2 h i 24 h), pierwsze płukanie membrany było najważniejsze dla usunięcia zanieczyszczeń niehistonowych z kolumn, podczas gdy drugie i trzecie płukanie nie wpływało na czystość próbki. Zatem, w zależności od rodzaju próbki, dwa ostatnie płukania można pominąć. Po pierwszej elucji białka histonowego z kolumny (przy użyciu buforu elucyjnego zawierającego 1mM NaCl i EDTA), histony wytrzypiono przez noc z wykorzystaniem 4% kwasu nadchlorowego, a następnie odwirowano, przemyto i przeanalizowano pod kątem wzbogacenia w oczyszczone histony H3 i H4. Zaobserwowano, że 24 h czasu ekstrakcji zwiększa ilość histonów H3 i H4 we frakcji oczyszczonej w porównaniu do 15 min i 2 h czasu ekstrakcji (Rysunek 5A). Druga elucja z kolumny nie doprowadziła do uzyskania histonów o wysokiej jakości lub wysokiej ilości (Rysunek 5B).

Następnie wykorzystano homogenaty tkanki mózgowej do ilościowego oznaczenia PTM histonów H3 i H4, a konkretnie acetylacji. Samcom myszom typu dzikiego (C57BL6/J) podawano doustnie szeroko działający inhibitor HDAC (tributyrynę) w dawce 5 g/kg przez 3 dni. Tkankę całego mózgu pobrano w 4. dniu, a surowe histony wyekstrahowano zgodnie z opisanym protokołem. Przy użyciu nieparzystego testu t ustalono, że tributyryna zwiększa acetylację histonów w ekstrakcie surowym (t(6) = 6,184, P = 0,0004); jednak w ekstrakcie wykryto zanieczyszczenia (prążki histonowe nie są wyraźnie zdefiniowane). W związku z tym przeciwciało H4K12ac nie wykazuje wysokiej swoistości (Rycina 6). Aby dalej ocenić przydatność przedstawionego protokołu dla mniejszych fragmentów tkanek, pobrano korę przedczołową z potrójnie transgenicznych myszy z chorobą Alzheimera (3 x Tg-AD), którym codziennie przez cztery miesiące podawano 10 mg/kg M344, inhibitora HDAC klasy I i IIb. Oczyszczanie i wytrącanie histonów przeprowadzono zgodnie z opisanym tutaj protokołem. Wykorzystując oczyszczoną frakcję histonów H3 i H4, ustalono, że M344 zwiększa acetylację H4K12 2,4-krotnie (t(6) = 13,03, P < 0,0001), przy wysokiej swoistości przeciwciała H4K12ac (Rycina 7). Podobnie zaobserwowano wzrost acetylacji histonu H3 w komórkach BV2 w odpowiedzi na inny inhibitor HDAC, a mianowicie selektywny inhibitor HDAC3, RGFP-966. Stężenie 10 µM RGFP-966 powoduje około dwukrotny wzrost acetylacji histonu H3K27 po 24 h traktowania. Do porównania komórek kontrolnych versus traktowanych zastosowano nieparzysty test t Studenta.

figure-results-1
Rysunek 1: Harmonogram protokołu oczyszczania histonów. Poniżej przedstawiono wszystkie etapy analizy histonów wraz z szacowanym czasem potrzebnym na każdy z nich. W nawiasach odniesiono się do rysunków przedstawiających wyniki poszczególnych etapów, które znajdują się w manuskrypcie. Aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

figure-results-2
Rycina 2: Reprezentatywny żel barwiony Coomassie Brilliant Blue, przedstawiający surowe histony wyekstrahowane z komórek BV2. Komórki BV2 hodowano przez 48 h przed rozpoczęciem protokołu ekstrakcji histonów. Ekstrakcję histonów nieoczyszczonych prowadzono przez 15 min, 2 h i 24 h, wykonując trzy powtórzenia dla każdego punktu czasowego (dotyczy to również w Rysunek 3, Rycina 4oraz Rycina 5). W surowym ekstrakcie histonów obecne są zarówno białka niehistonowe, jak i histony. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Reprezentatywny żel barwiony Coomassie Brilliant Blue, przedstawiający przelot przez kolumnę po etapach oczyszczania histonów z komórek BV2. Po przejściu surowego ekstraktu histonowego przez kolumnę wiążącą histony, w przelocie obecne są jedynie białka niehistonowe. Białka histonowe nie występują w tej frakcji. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Reprezentatywny żel barwiony Coomassie Brilliant Blue, przedstawiający płukanie kolumny po etapie oczyszczania histonów z komórek BV2. Niezależnie od czasu ekstrakcji histonów, który wynosił (A) 15 min, (B) 2 h lub (C) 24 h, niewielkie ilości białek niehistonowych wystąpiły jedynie w pierwszym płukaniu kolumny wiążącej histony. Białka histonowe nie były obecne w żadnym z płukań. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-5
Rycina 5: Reprezentatywny żel barwiony Coomassie Brilliant Blue obrazujący elucje po etapie oczyszczania histonów z komórek BV2. (A) Wysokiej jakości oczyszczone i odsolone histony H3 oraz H4 zostały wykryte po pierwszej elucji z kolumny do oczyszczania histonów. (B) Druga elucja z kolumny do oczyszczania histonów nie dostarczyła wysokiej jakości ani ilości histonów H3 lub H4. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-6
Rycina 6: Szeroko działający inhibitor HDAC, tributryryna, zwiększa acetylację H4K12 w całym mózgu myszy typu dzikiego. (A) Ten panel przedstawia reprezentatywny western blot ukazujący wzrost acetylacji H4K12 w surowym ekstrakcie histonowym pobranym z całego mózgu myszy typu dzikiego w odpowiedzi na szeroko działający inhibitor HDAC, tributryrynę. (B) Ten panel przedstawia ilościowe oznaczenie wzrostu acetylacji H4K12 in vivo. Do porównania grup zastosowano nieparzysty test t (t(6) = 6.076, P = 0.0005). Słupki reprezentują średnią ± błąd standardowy średniej (SEM). N = 8. ***P < 0.0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-7
Rysunek 7: Inhibitor HDAC klasy I i IIb, M344, zwiększa acetylację H4K12 w korze przedczołowej potrójnie transgenicznych myszy z chorobą Alzheimera (3 x Tg-AD). (A) Ten panel przedstawia reprezentatywny western blot obrazujący wzrost acetylacji H4K12 w oczyszczonym i odsolonym ekstrakcie histonowym pobranym z kory przedczołowej myszy 3 x Tg-AD w odpowiedzi na inhibicję HDAC przez M344. (B) Ten panel przedstawia ilościowe określenie wzrostu acetylacji H4K12 w odpowiedzi na M344 podawane w codziennej dawce 10 mg/kg przez cztery miesiące. Do porównania grup zastosowano nieparowany test t (t(6) = 13,30, P < 0,0001). Słupki reprezentują średnią ± SEM. N = 8. ****P < 0,00001. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-8
Rycina 8: Selektywny inhibitor HDAC3, RGFP-966, zwiększa acetylację H3K27 w mikroglialnych komórkach BV2. (A) Ten panel przedstawia reprezentatywny western blot obrazujący wzrost acetylacji H3K27 w oczyszczonym i odsolonym ekstrakcie histonowym pobranym z komórek BV2 w odpowiedzi na inhibicję HDAC3 przez RGFP-966. (B) RGFP-966 powoduje około dwukrotny wzrost acetylacji histonu H3 w lizynie (K) 27 po 24 h traktowania. Do porównania komórek kontrolnych versus traktowanych zastosowano nieparametryczny test t (t(4) = 5.981, P = 0.002). Słupki reprezentują średnią ± SEM. N = 6. **P < 0.01. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Reprezentatywna tkanka (jedna półkula) *Średnia masa tkanki (mg)Bufor do ekstrakcji (mL)Liczba pociągnięć
Móżdżek myszy40140
Kora przedczołowa myszy300.320
Hipokamp myszy270.318
Kora entorynalna myszy190.317
* Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na dorosłych samcach myszy.
Średni wiek: 16 miesięcy. Średnia masa: 30 gramów.

Tabela 1: Zoptymalizowane warunki homogenizacji tkanki mózgowej.

Dyskusja

W obecnej pracy zademonstrowaliśmy zoptymalizowaną metodę oczyszczania podstawowych białek histonowych i ilościowego oznaczania histonów H3 i H4 PTM (np. Acetylacja). Prezentowany protokół jest kompleksowym przepływem pracy, który obejmuje zoptymalizowane procedury dotyczące przygotowania komórek i tkanek mózgowych, surowego oczyszczania histonów oraz szczegółowego wytrącania, elucji i kwantyfikacji histonów, po których następuje elektroforeza histonów i solidna kwantyfikacja histonów PTM. Duża ilość dostarczonych tutaj szczegółów pozwala na powtarzalne generowanie wysokiej jakości danych, pomimo konieczności długotrwałych manipulacji próbkami histonów.

Wiele obecnie publikowanych protokołów wymaga użycia HPLC do wyizolowania czystych frakcji histonów H3 i H419. Chociaż HPLC jest potężną techniką, jej złożoność i niska przepustowość odstraszają większość biologów molekularnych i laików od jej częstego stosowania. Rzeczywiście, HPLC nie jest dostępny dla wielu laboratoriów, a do obsługi urządzenia wymagany jest wysoko wykwalifikowany personel. HPLC jest często czasochłonna, kosztowna i potencjalnie niebezpieczna. Przedstawiono tutaj niedrogą, średnioprzepustową strategię osiągania wyników o podobnej jakości, która omija HPLC. Opisana strategia jest również bardziej praktyczna i nadaje się do stosowania w prawie każdym laboratorium, ponieważ wykorzystuje proste podejście do kolumny wirowej, które nie wymaga specjalistycznych umiejętności obsługi instrumentu. Dodatkowo tetramer histonu H3/H4 jest ekstrahowany jako pojedyncza, czysta i obfita frakcja, co umożliwia wiarygodne określenie ilościowe zachowanych PTM na każdym z białek.

PTM są niezwykle wrażliwe na zmiany stresu oksydacyjnego i zmiany pH20,21. Tak więc, w przeciwieństwie do poprzednio opublikowanych metod18, donosimy o skutecznej strategii płukania komórek w pożywkach wolnych od surowicy, aby zapewnić minimalne zaburzenia metaboliczne komórek i uniknąć interferencji natywnych PTM ze składnikami surowicy. Obecny protokół nie tylko omija tradycyjną izolację jąder, ale także zapewnia optymalne czasy lizy komórek i dokładną procedurę homogenizacji tkanek, która pozwala na zachowanie otoczki jądrowej przy jednoczesnym uniknięciu agregacji jądrowej. Chociaż czasem ekstrakcji można manipulować w zależności od liczby komórek, typu użytej komórki, wielkości tkanki itp., Przedłużona liza nie jest pożądana, ponieważ może prowadzić do lizy jąder i uwolnienia DNA, co utrudnia obróbkę próbki. Co ważne, w protokole istnieje wiele punktów kontrolnych służących do walidacji udanego oczyszczania histonów (np. kroki 2.7 i 3.2.3). Ta strategia ułatwia również rozwiązywanie problemów w trakcie całej długotrwałej procedury.

Kolejną ważną i unikalną cechą prezentowanego protokołu jest jego pełna kompatybilność z dalszymi narzędziami do analizy western blot i innymi, jeśli jest to pożądane. Białka histonowe są wykrywane na poziomie ~15 kDa 13,22,23 i, podobnie jak inne białka o małej masie cząsteczkowej, okazały się trudne do wykrycia za pomocą standardowych technik immunoblottingu. Zastosowanie wysokowydajnego i wysokoprzepustowego systemu transferu w połączeniu z żelami białkowymi o optymalnej rozdzielczości pozwala na utrzymanie potwierdzenia natywnego białka (przy braku SDS) i aktywności przy braku SDS oraz wysoką wydajność transferu białek histonowych o niskiej masie cząsteczkowej, zapewniając w ten sposób wiarygodną kwantyfikację histonów PTM.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy wyrażają swoją wdzięczność Departamentowi Zdrowia Florydy Ed and Ethel Moore's Alzheimer's Research Program (granty 6AZ08 i 7AZ26), NIH-NIAAA (grant 5R01AA023781-03) oraz American Heart Association (grant 17PRE33660831).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówki do mikrowirówekThermoFiser Scientific05-408-129lub równoważne z innych źródeł
Sterylna wodaGibco15-230-204lub równoważna z innych źródeł
70% kwas nadchlorowySigma Aldrich311421lub równoważny z innych źródeł
100% acetonSigma Aldrich270725lub równoważny z innych źródeł
Paski wskaźnika pH, niekrwawiąceMilliipore Sigma1095310001
4x bufor do próbek SDSBIO-RAD161-0747
Rotor stołowyCole-ParmerUX-04397-34lub odpowiednik z innych źródeł
Stojak na probówki 1,5 mlThermoFiser Scientific05-541lub odpowiednik z innych źródeł
Mini zestawdo oczyszczania histonówKolumny wirowe Active Motif40026zawarte w zestawie
Koktajl inhibitorów proteazyThermoFiser Scientific78430lub odpowiednik z innych źródeł
Przyrząd do nanokropliThermoFiser ScientificND-2000
Szalki do hodowli tkankowychVWR10062-880wymagane do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Pożywki tkankowesą różne w zależności od użytej linii komórkowejróżni się w zależności od użytej linii komórkowejwymaganej do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Pożywka o niskiej zawartości surowicyThermoFiser Scientific51985091wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Skrobak do komórek z tworzywa sztucznego Falcon353086wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Żel gradientowy SDS-PAGEBIO-RAD456-9035wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Coomassie Brilliant Blue R-250 Roztwór barwiącyBIO-RAD1610436wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Coomassie Brilliant Blue R-250 Roztwór odbarwiającyBIO-RAD1610438wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Zestawy transferowe Trans-Blot Turbo Mini PVDFBIO-RAD1704156wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Turbotransferu Trans-BlotRIO-RAD1704150wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Barwienie PąsemCellSignalling59803Swymagane do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Homogenizator Dounce (rozmiar/nakrętka sc 7mL) z małym luzemKimble Chase885302-0007wymagany dla histonu ekstrakcja z tkanek
100% wybielaczClorox68973wymagany do ekstrakcji histonów z tkanek Przeciwciało
H4K12acAktywny motyw39166wymagany do oznaczania ilościowego PTM za pomocą WB
Przeciwciało H3K27acAktywny motyw39134wymagany do kwantyfikacji PTM za pomocą WB
System

Bibliografia

  1. Holliday, R. Is there an Epigenetic Component in Long-term Memory? Journal of Theoretical Biology. 200, 339-341 (1999).
  2. DeWoskin, V. A., Million, R. P. The epigenetics pipeline. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 661-662 (2013).
  3. Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO Reports. 3, 224-229 (2002).
  4. Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389, 349-352 (1997).
  5. Sartor, G. C., Powell, S. K., Brothers, S. P., Wahlestedt, C. Epigenetic Readers of Lysine Acetylation Regulate Cocaine-Induced Plasticity. The Journal of Neuroscience. 35, 15062-15072 (2015).
  6. Komatsu, N., et al. SAHA, a HDAC inhibitor, has profound anti-growth activity against non-small cell lung cancer cells. Oncology Reports. 15, 187-191 (2006).
  7. Bahari-Javan, S., Sananbenesi, F., Fischer, A. Histone-acetylation: a link between Alzheimer's disease and post-traumatic stress disorder. Frontiers in Neuroscience. 8, 160(2014).
  8. Roh, T. -Y., Cuddapah, S., Zhao, K. Active chromatin domains are defined by acetylation islands revealed by genome-wide mapping. Genes & Development. 19, 542-552 (2005).
  9. Mutskov, V., Felsenfeld, G. Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9. The EMBO Journal. 23, 138-149 (2004).
  10. Howe, L., Brown, C. E., Lechner, T., Workman, J. L. Histone acetyltransferase complexes and their link to transcription. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 9, 231-243 (1999).
  11. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
  12. Bowman, G. D., Poirier, M. G. Post-Translational Modifications of Histones That Influence Nucleosome Dynamics. Chemical Reviews. 115, 2274-2295 (2015).
  13. Volmar, C. -H., Wahlestedt, C. Histone deacetylases (HDACs) and brain function. Neuroepigenetics. 1, 20-27 (2015).
  14. Plagg, B., Ehrlich, D., Kniewallner, K. M., Marksteiner, J., Humpel, C. Increased Acetylation of Histone H4 at Lysine 12 (H4K12) in Monocytes of Transgenic Alzheimer's Mice and in Human Patients. Current Alzheimer Research. 12, 752-760 (2015).
  15. Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
  16. Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone Deacetylase Inhibitors in Clinical Studies as Templates for New Anticancer Agents. Molecules. 20, 3898-3941 (2015).
  17. Ramakrishnan, S., et al. HDAC 1 and 6 modulate cell invasion and migration in clear cell renal cell carcinoma. BMC Cancer. 16, 617(2016).
  18. Wapenaar, H., Dekker, F. J. Histone acetyltransferases: challenges in targeting bi-substrate enzymes. Clinical Epigenetics. 8, 59(2016).
  19. Klinker, H., Haas, C., Harrer, N., Becker, P. B., Mueller-Planitz, F. Rapid Purification of Recombinant Histones. PLoS ONE. 9, e104029(2014).
  20. Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9, 838-848 (2018).
  21. Simithy, J., Sidoli, S., Garcia, B. A. Integrating Proteomics and Targeted Metabolomics to Understand Global Changes in Histone Modifications. Proteomics. , e1700309 (2018).
  22. Volmar, C. -H., et al. An Epigenetic Approach for the Modulation of Amyloid Precursor Protein (APP) Processing and Improvement of Memory in Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 40, S470(2015).
  23. Volmar, C. -H., et al. M344 promotes nonamyloidogenic amyloid precursor protein processing while normalizing Alzheimer’s disease genes and improving memory. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), E9135-E9144 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie histon wacetylacja histon wel SDS PAGEchromatografia kolumnowaWestern blothiston H3histon H4ekstrakt z tkanki m zgowejprzygotowanie lizatu kom rkowego

Powiązane artykuły