Artykuł metodologiczny

Oczyszczanie białek histonów H3 i H4 oraz oznaczanie ilościowe acetylowanych śladów histonów w komórkach i tkance mózgowej

DOI:

10.3791/58648

⸱

30 listopada 2018

 ,  , 
1Department of Psychiatry & Behavioral Sciences, University of Miami Miller School of Medicine, 2Center for Therapeutic Innovation, University of Miami Miller School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego artykułu jest dostarczenie wyczerpującego, systematycznego przewodnika po skutecznym oczyszczaniu histonów H3 i H4 oraz kwantyfikacji reszt acetylowanych histonów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We wszystkich organizmach eukariotycznych chromatyna, fizjologiczny szablon całej informacji genetycznej, jest niezbędna dla dziedziczności. Chromatyna podlega szeregowi różnorodnych modyfikacji potranslacyjnych (PTM), które najczęściej występują na końcach aminowych białek histonowych (tj. ogonie histonowym) i regulują dostępność i stan funkcjonalny leżącego u podstaw DNA. Ogony histonowe rozciągają się od rdzenia nukleosomu i podlegają dodawaniu grup acetylowych przez acetylotransferazy histonowe (HAT) oraz usuwaniu grup acetylowych przez deacetylazy histonowe (HDAC) podczas wzrostu i różnicowania komórek. Specyficzne wzorce acetylacji reszt lizyny (K) na ogonach histonowych określają dynamiczną homeostazę między chromatyną aktywną transkrypcyjnie lub tłumioną transkrypcyjnie poprzez (1) wpływanie na zespół histonów rdzenia i (2) rekrutację synergicznych lub antagonistycznych białek związanych z chromatyną do miejsca transkrypcji. Podstawowy mechanizm regulacyjny złożonej natury PTM ogona histonowego wpływa na większość procesów szablonowych chromatyny i powoduje zmiany w dojrzewaniu i różnicowaniu komórek zarówno w normalnym, jak i patologicznym rozwoju. Celem niniejszego raportu jest dostarczenie nowicjuszom skutecznej metody oczyszczania podstawowych białek histonowych z komórek i tkanki mózgowej oraz wiarygodne określenie ilościowe śladów acetylacji na histonach H3 i H4.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Termin epigenetyka odnosi się do dziedzicznych zmian w aktywności genów, które zachodzą niezależnie od zmian w sekwencji DNA1,2. Transkrypcja i represja genów są determinowane przez (1) dostępność chromosomalnego DNA owiniętego wokół oktamera podstawowych białek histonowych (po dwie kopie H2A, H2B, H3 i H4) oraz przez (2) dostępność czynników transkrypcyjnych i białek rusztowania rekrutowanych do określonych miejsc promotorowych3,4. Transkrypcja genów jest regulowana przez enzymatyczne modyfikacje określonych miejsc promotora DNA i PTM ogonów histonów5,6,7. N-końce histonu H3 i H4 należą do najbardziej konserwatywnych sekwencji znanych w organizmach eukariotycznych3, a ich modyfikacje potranslacyjne zostały obszernie udokumentowane, aby odgrywać kluczową rolę w określaniu struktury i funkcji chromatyny8,9. PTM na ogonach histonów (tj. acetylacja, metylacja, fosforylacja i ubikwitynacja) zmieniają potencjał interakcji ogonów, wpływają na stan strukturalny i fałdowanie włókna chromatyny, a tym samym regulują dostępność i przetwarzanie DNA4,10,11,12. Grupy acetylowe są dodawane i usuwane z reszt K na ogonach histonowych przez zestaw specyficznych enzymów epigenetycznych oddziałujących z histonami, a mianowicie odpowiednio HAT i HDAC13. Na przykład, wcześniej wykazano, że acetylacja histonu H4 przy lizynie 12 (H4K12ac) aktywuje transkrypcję genów związanych z nabywaniem i konsolidacją pamięci14. Ponadto kilka linii dowodów sugeruje, że epigenetyczna kontrola transkrypcji genów za pośrednictwem enzymów jest kluczowym aspektem zdrowego wzrostu i różnicowania komórek6,15. Wykazano, że zmiana w epigenetycznej regulacji ekspresji genów, czy to przez epigenetyczne modyfikacje DNA, czy przez mutację samych enzymów epigenetycznych, jest rozregulowana w chorobach ludzkich, w których zmiana aktywności określonego genu jest cechą charakterystyczną patologii (np. rak)6,16,17. W związku z tym ocena zmian w rdzeniowych histonach PTM staje się cennym celem dla potencjalnych interwencji terapeutycznych. Jednak określenie obfitości, oddziałujących na siebie partnerów i konkretnych ról histonów PTM okazało się wyzwaniem18.

W bieżącym raporcie opisana jest zoptymalizowana, średnioprzepustowa strategia oczyszczania histonów rdzeniowych z komórek i tkanek mózgowych w jednej frakcji oraz kompletny protokół do kwantyfikacji histonów H3 i H4 PTM. Warto zauważyć, że chociaż obecnie publikowane techniki oczyszczania na bazie kwasów i strategie wykrywania histonów oparte na przeciwciałach są szeroko stosowane do charakteryzacji histonów, brakuje w nich opisowych szczegółów dotyczących krytycznych etapów procedury, co utrudnia szybką i powtarzalną ekstrakcję histonów i kwantyfikację. Na przykład przetwarzanie ekstraktów komórkowych i biopsji tkanek wymaga różnych narzędzi i technologii do skutecznej ekstrakcji. Co więcej, zoptymalizowany protokół przedstawiony w niniejszym manuskrypcie demonstruje praktyczne podejście o średniej przepustowości. Histony rdzeniowe są ekstrahowane jako pojedyncza, czysta frakcja, co umożliwia niezawodne wykrywanie PTM za pośrednictwem przeciwciał bez żadnych zakłóceń spowodowanych zanieczyszczeniami. Co więcej, w niniejszym manuskrypcie udało się obejść wyzwania związane z wykrywaniem histonów ze względu na ich małą masę cząsteczkową. Zazwyczaj brak zgodności między protokołami oczyszczania, kwantyfikacji i elektroforezy żelowej utrudnia naukowcom uzyskanie powtarzalnych i rozstrzygających wyników. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowany przebieg pracy w celu oczyszczenia histonów rdzeniowych z komórek i tkanek oraz przygotowania ich do dalszych analiz PTM za pomocą western blot.

Obecny protokół umożliwia oczyszczanie podstawowych białek histonowych przy jednoczesnym zachowaniu ich natywnych modyfikacji potranslacyjnych (tj. acetylacji, metylacji i fosforylacji). Rysunek 1 przedstawia oś czasu protokołu oczyszczania histonów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie myszy były trzymane w obiekcie dla zwierząt o kontrolowanej wilgotności i temperaturze, akredytowanym przez AAALAC w University of Miami Miller School of Medicine. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez University of Miami Miller School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i przeprowadzone zgodnie ze specyfikacjami NIH.

1. Przygotowanie ekstraktu próbki

  1. Komórki adherentne
    1. Umieść komórki w 10-centymetrowych szalkach w odpowiednich pożywkach hodowlanych (1 x 106 do 1 x 109 komórek na szalkę dla linii komórkowych, takich jak BV2, HEK-293 i SH-SY5Y, ale ~1 x 1015 komórek na szalkę dla komórek pierwotnych, takich jak pierwotne neurony korowe). Upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone na całej powierzchni płytki i pozwól komórkom rosnąć przez 48 godzin, aby osiągnąć ~100% konfluencji (37 °C, 5% CO2 ).
    2. Gdy komórki osiągną pożądane zbieganie, delikatnie zaaspiruj pożywkę hodowlaną i umyj komórki 2x wstępnie podgrzaną pożywką bez surowicy pod kapturem do hodowli tkankowej.
    3. Odessać pożywkę bez surowicy z naczynia i dodać 1 ml lodowatego buforu ekstrakcyjnego (0,4 M kwasu siarkowego, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl [pH 8,0] i 1x koktajl inhibitorów proteazy) do każdego naczynia.
    4. Użyj plastikowego skrobaka do komórek, aby zebrać wszystkie komórki w buforze ekstrakcyjnym (przez skrobanie) i przenieść je do oznaczonej probówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety o pojemności 1,000 μl. Pipetuj komórki w górę iw dół 3x, aby ułatwić homogenizację.
    5. Zamknij wszystkie probówki i natychmiast połóż je na lodzie.
  2. Tkanka mózgowa
    1. Jeśli używana jest zamrożona chusteczka, umieść ją w schłodzonej probówce o pojemności 1,5 ml i krótko rozmroź na lodzie. Jeśli używana jest świeża tkanka, należy natychmiast przejść do kroku 1.2.2.
      UWAGA: Obecny protokół opisuje procedury z wykorzystaniem próbek zamrożonego mózgu myszy i kory przedczołowej myszy.
    2. Homogenizować tkankę za pomocą ręcznego homogenizatora Dounce, używając odpowiedniej ilości buforu ekstrakcyjnego i zalecanej liczby uderzeń (Tabela 1). Aby uniknąć nadmiernego rozdrobnienia chromatyny, nie przekraczaj zalecanej liczby uderzeń.
    3. Za pomocą jednokanałowej pipety o pojemności 1 000 μl przenieś homogenat do wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. Zamknij wszystkie probówki i natychmiast połóż je na lodzie.

2. Przygotowanie surowego ekstraktu z histonów

  1. Umieścić probówki o pojemności 1,5 ml zawierające komórki lub tkanki zawieszone w buforze ekstrakcyjnym na obrotowej platformie i obracać z prędkością 15 obr./min w temperaturze 4 °C, aby umożliwić ekstrakcję surowych histonów.
    UWAGA: Czas ekstrakcji może się różnić w zależności od typu komórek i tkanek i musi być zoptymalizowany dla każdej procedury. Obecny protokół przedstawia wyniki uzyskane po 15 minutach, 2 godzinach i 24 godzinach ekstrakcji (Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4 i Rysunek 5).
  2. Schłodzić mikrowirówkę do temperatury 4 °C. Po upływie żądanego czasu ekstrakcji należy odwirować probówki z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Przenieść supernatant wraz z surowymi histonami do nowej, wstępnie schłodzonej probówki o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć granulkę.
  4. Przechowywać supernatant w temperaturze -80 °C (ekstrakcję można zatrzymać na tym etapie, patrz "Etap zatrzymania" w Rysunek 1) lub natychmiast przejść do następnego kroku.
  5. Zneutralizować surowe histony za pomocą 1/4 objętości 5-krotnego buforu neutralizacyjnego (np. dodać 250 μl 5-krotnego buforu neutralizacyjnego do 1 ml surowych histonów). Dobrze wymieszaj, pipetując w górę i w dół 6 razy.
  6. Sprawdź pH mieszaniny za pomocą pasków pH. Dostosuj odpowiednio, dodając więcej buforu neutralizującego, aby osiągnąć pH 7.
  7. Oceń obecność białka histonowego i niehistonowego w surowym ekstrakcie histonowym w następujący sposób (Rysunek 2).
    1. Dodać 37,5 μl próbki do 12,5 μl 4x (Laemmli) buforu próbki i denaturować przez 10 minut w temperaturze 99 °C.
    2. Załaduj próbkę do żelu SDS-PAGE i uruchom żel przez 1 godzinę pod napięciem 100 V.
    3. Zabarwić żel przez noc roztworem barwiącym Coomassie Brilliant Blue R-250 i odbarwić podczas trzech kolejnych prań (1 h/pranie) roztworem odbarwiającym Coomassie Brilliant Blue R-250.
      UWAGA: Surowe histony (Rysunek 2) mogą być porównane z histonami wymytymi i oczyszczonymi (tj. wejście kolumnowe [Rysunek 5A]).

3. Oczyszczanie histonów rdzeniowych

  1. Równoważenie kolumny wirowania
    1. Dodać 500 μl buforu równowagi do każdej używanej kolumny wirowej. Nie dotykaj membrany kolumny.
    2. Wirować w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 800 x g. Odrzuć przepływ. Powtórz 1x.
  2. Oczyszczanie histonów
    1. Dodać do kolumny 500 μl próbki będącej przedmiotem zainteresowania z kroku 2.6. Wirować w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 800 x g. Zbierz przepływ.
    2. Powtórz poprzedni krok tyle razy, ile to konieczne, aby załadować całą próbkę do kolumny. Nie przepełniaj kolumny wirowania.
    3. Połącz przepływ z każdego etapu wirowania, aby przeanalizować skuteczność wiązania kolumn (Rysunek 3).
    4. Wykonaj krok 2.7, aby przeanalizować przepływ kolumny.
  3. Mycie kolumny
    1. Dodać 500 μl buforu do przemywania do każdej kolumny. Wirować w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 800 x g. Zbierz płyn przepływowy (pranie #1).
    2. Powtórz krok 3.3.1, co daje w sumie trzy prania. Zebrać płyny przepływowe #2 i #3. Nie należy łączyć kolejnych myć przepływowych kolumny.
    3. Aby dokładniej ocenić skuteczność wiązania histonów przez kolumnę, przeanalizuj mycie trzech kolumn, wykonując krok 2.7 (Rysunek 4).
  4. Elucja histonów
    1. Przenieść kolumnę do nowej oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać 50 μl buforu elucyjnego histonów. Wirować w temperaturze 4 °C przez 3 minuty przy 800 x g. Zachowaj przepływ zawierający białka histonowe.
    3. Aby uzyskać dodatkową elucję, powtórz krok 3.4.2. Nie należy łączyć pierwszego i drugiego przepływu eluatów, ponieważ różnią się one ilością histonów i czystością.

4. Wytrącanie się histonów rdzeniowych

  1. Dodać kwas nadchlorowy (PCA) do oczyszczonych histonów do końcowego stężenia 4% PCA (np. dodać 3 μl 70% PCA do 50 μl oczyszczonych histonów z kroku 3.4.2.
  2. Wirować przez 3 sekundy, aby zebrać wszystkie pozostałe płyny ze ścianki probówki. Mieszać pipetując w górę i w dół 6 razy.
  3. Umieścić probówki w stojaku i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
  4. Następnego dnia schłodzić mikrowirówkę do temperatury 4 °C i odwirować próbki przez 75 minut z maksymalną prędkością w temperaturze 4 °C.
  5. Po zakończeniu wirowania na dnie probówki będzie widoczna mała biała osadka zawierająca wytrącone histony. Nie należy wirować próbki.
  6. Ostrożnie odessać supernatant i, nie naruszając osadu, dodać do próbki 500 μl lodowatego 4% PCA.
  7. Wirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut z maksymalną prędkością. Ostrożnie zassać supernatant.
  8. Powtórz krok 4.7 2x.
  9. Nie naruszając osadu, dodaj 500 μl lodowatego acetonu. Wirować w temperaturze 4 °C przez 10 minut z maksymalną prędkością. Ostrożnie zassać supernatant.
  10. Powtórz krok 4.9 2x.
  11. Ostrożnie odessać supernatant, pozostawić probówki niezamknięte i pozostawić próbkę do wyschnięcia na lodzie przez 30 minut. Sprawdzić, czy wszystkie pozostałości acetonu wyparowały.
  12. Pozostawić probówki bez korka i pozostawić próbkę do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut.
  13. Zawiesić osad w 30 μl sterylnej wody. Nie pipetować w górę i w dół. Delikatnie przesuń rurkę palcem.
  14. Zakryj wszystkie probówki i pozwól histonom rozpuścić się na lodzie przez 30 - 50 minut, w zależności od wielkości granulki. Sprawdź, czy granulat jest ponownie zawieszony.
  15. Zakryj wszystkie probówki i pozwól granulce na dalsze zawieszenie w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    UWAGA: Roztwór ten (pierwsza i druga elucja z kroku 3.4.3) składa się z oczyszczonych i odsolonych histonów i może być stosowany do dalszej analizy ilościowej i acetylacji histonów.

5. Kwantyfikacja elutowanych białek histonów

  1. Użyć spektrofotometru zgodnie z protokołem producenta, aby określić ilościowo całkowitą zawartość białek histonowych otrzymanych po końcowej elucji w kroku 4.15. Zmierzyć absorbancję przy 230 nm. Zapisać stosunek A260/A280 wskazujący na zanieczyszczenie próbki kwasem nukleinowym.
  2. Użyj następującego wzoru, aby obliczyć stężenie histonów (x):
    figure-protocol-1
    Tutaj OD to gęstość optyczna mierzona przy A230 nm.
  3. Stężenie histonów ~1,5 mg/ml jest uważane za średnią wydajność dla linii komórkowych, podczas gdy stężenie histonów ~5,0 mg/ml jest uważane za średnią wydajność dla 30 mg tkanki.

6. Analiza Western Blot

  1. Dostosuj oczyszczony i eluowany histon od kroku 4.15 do ~10 μg białka histonowego/próbki.
  2. Dodać odpowiednią objętość wody i 4x bufor próbki Laemmli, aby dostosować objętość ładowania.
  3. Denaturacja próbek przez 10 minut w temperaturze 99 °C. Schłodzić je na lodzie. Wirować przez 3 sekundy, aby zebrać wszystkie resztki cieczy i kondensatu ze ścianki probówki.
  4. Załaduj próbki do żelu SDS-PAGE i uruchom żel przez 1 godzinę pod napięciem 100 V.
  5. Aby uwidocznić całkowite białko histonowe, zabarwić żel przez noc roztworem barwiącym Coomassie Brilliant Blue R-250 i odbarwić podczas trzech kolejnych prań (1 godzina/pranie) roztworem odbarwiającym Coomassie Brilliant Blue R-250.
    UWAGA: Pierwsza elucja białek histonowych zawiera wysokiej jakości histony (Rysunek 5A), podczas gdy druga elucja zawiera niski lub żaden poziom histonów ( Figura 5B).
  6. Aby określić ilościowo histonowe PTM, należy użyć systemu transferowego (patrz tabela materiałów) w celu przeniesienia białka histonowego z żelu SDS-PAGE (krok 6.4) na membranę PVDF.
    1. Aby zmontować kanapkę transferową, otwórz kasetę systemu transferowego i umieść stos membran PVDF (oznaczony jako Bottom+) na spodzie kasety z membraną skierowaną do góry. Delikatnie zwiń membranę za pomocą wałka do biksów, aby usunąć powietrze spomiędzy stosu a membrany.
    2. Połóż żel na wierzchu membrany, delikatnie zwiń żel za pomocą wałka do bibuły, aby usunąć powietrze spomiędzy membrany a żelu, a następnie umieść górny stos na żelu. Ponownie delikatnie zwiń i umieść pokrywę kasety na kanapce, mocno dociśnij i obróć nob zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zablokować.
    3. Włóż kasetę do gniazda systemu transferowego. Na ekranie aparatu wybierz Turbo Protocol (Protokół turbo). Użyj 3-minutowego protokołu dla pojedynczego mini żelu lub 7-minutowego protokołu dla więcej niż dwóch mini żeli.
    4. Wybarwić błonę barwnikiem Ponceau S przez 5 minut i uwidocznić całkowitą zawartość białek histonowych.
    5. Umyj je w 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris (TBS) z 0,1% Tween 20 przez 2 godziny i zablokuj je w 5% mleku na 1 godzinę. Inkubuj z przeciwciałem pierwszorzędowym i wtórnym (odpowiednio przez noc w temperaturze 4 °C lub 1 godzinę w temperaturze pokojowej) lub zgodnie z wcześniej zoptymalizowanym protokołem.
      UWAGA: W obecnym protokole zastosowano przeciwciała przeciwko acetylowanym histonom H4K12 (Rysunek 6 i Figura 7) i H3K27 (Figura 8).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zilustrować postęp protokołu oczyszczania histonów i skład wszystkich analizowanych frakcji, oceniliśmy różne ekstrakty histonowe z ludzkich mikroglejowych komórek BV2. Aby zademonstrować kwantyfikację histonów H3 i H4 PTM (tj. acetylacji), użyliśmy lizatów tkanki mózgowej.

Komórki BV2 zostały posiane w proporcji 5 x 106 komórek na talerz w 10 cm naczyniach poddanych kulturze tkankowej i pozostawione do wzrostu do zbiegu przez 48 godzin. Następnie zebrano komórki, a histony uwolniono z chromatyny przez inkubację w buforze ekstrakcyjnym zawierającym 0,4 M kwasu siarkowego, 1 mM KCl, 1 mM MgCl2, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) i 1x inhibitor proteazy. Czas ekstrakcji, od 15 minut do 24 godzin, nie wpłynął na ogólny skład surowych ekstraktów histonowych, określony za pomocą barwienia Coomassie Brilliant Blue (Rysunek 2). Następnie surowe histony przepuszczono przez zrównoważone kolumny histonowe i przeanalizowano ich przepływ. Wysoka skuteczność wiązania kolumn jest określana przez brak białka histonowego w przepływie podczas analizy za pomocą barwienia Coomassie Brilliant Blue. Określiliśmy skuteczność wiązania kolumn na 100%, ponieważ w analizowanym przepływie nie było wykrywalnych białek histonowych (Rysunek 3). Wszystkie błony ze związanymi histonami zostały następnie trzykrotnie przemyte buforem do płukania, aby usunąć wszelkie pozostałe zanieczyszczenia, pozostawiając tylko białka histonowe związane z żelem krzemionkowym. Ustaliliśmy, że dla wszystkich czasów ekstrakcji histonów (tj. 15 min, 2 h i 24 h) pierwsze płukanie membrany było najważniejsze w celu usunięcia zanieczyszczeń niehistonowych z kolumn, podczas gdy drugie i trzecie płukanie nie wpłynęło na czystość próbki. W związku z tym, w zależności od rodzaju próbki, dwa ostatnie prania mogą zostać pominięte. Po pierwszej elucji białka histonowego z kolumny (przy użyciu buforu elucyjnego zawierającego 1mM NaCl i EDTA), histony wytrącono przez noc 4% kwasem nadchlorowym, a następnie granulowano, przemywano i analizowano w celu wzbogacenia oczyszczonych histonów H3 i H4. Zaobserwowaliśmy, że 24 godziny czasu ekstrakcji zwiększają ilość histonów H3 i H4 w oczyszczonej frakcji w porównaniu do 15 minut i 2 godzin czasu ekstrakcji (Rysunek 5A). Druga elucja z kolumny nie spowodowała powstania histonów wysokiej jakości lub dużej ilości (Rysunek 5B).

Następnie użyliśmy homogenatów tkanki mózgowej do ilościowego określenia histonów H3 i H4 PTM, czyli acetylacji. Samcom myszy typu dzikiego (C57BL6/J) podawano szeroko działający inhibitor HDAC (tributyrynę) w dawce 5 g/kg doustnie przez 3 dni. Cała tkanka mózgowa została pobrana w 4 dniu i surowych histonów została wyekstrahowana zgodnie z opisanym protokołem. Korzystając z niesparowanego testu t, ustaliliśmy, że tributyryna zwiększa acetylację histonów w surowym ekstrakcie (t(6) = 6,184, P = 0,0004); W ekstrakcie wykrywane są jednak zanieczyszczenia (prążki histonowe nie są jasno określone). W związku z tym przeciwciało H4K12ac nie ma wysokiej swoistości (Rysunek 6). Aby dalej ocenić możliwość zastosowania przedstawionego protokołu do mniejszych odcinków tkanki, pobraliśmy korę przedczołową od myszy z potrójną transgeniczną chorobą Alzheimera (3 x Tg-AD) leczonych codziennie 10 mg / kg M344, inhibitorem HDAC klasy I i IIb, przez cztery miesiące. Oczyszczanie i wytrącanie histonów przeprowadzono zgodnie z opisanym tu protokołem. Używając oczyszczonej frakcji histonu H3 i H4, ustaliliśmy, że M344 zwiększa acetylację H4K12 2,4-krotnie (t(6) = 13,03, P < 0,0001), z wysoką specyficznością przeciwciała H4K12ac (Rysunek 7). Podobnie zaobserwowaliśmy wzrost acetylacji histonów H3 w komórkach BV2 w odpowiedzi na inny inhibitor HDAC, a mianowicie selektywny inhibitor HDAC3, RGFP-966. 10 μM RGFP-966 powoduje około dwukrotny wzrost acetylacji histonu H3K27 po 24 godzinach leczenia. Niesparowany test t Studenta został wykorzystany do porównania komórek kontrolnych i leczonych.

figure-results-1
Rysunek 1: Kalendarium protokołu oczyszczania histonów. Wszystkie kroki analizy histonów są pokazane poniżej wraz z szacowanym czasem potrzebnym na każdy krok. W nawiasach wymieniono ryciny przedstawiające wynik poszczególnych etapów i przedstawione w manuskrypcie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rycina 2: Reprezentatywny żel barwiony na niebiesko Coomassie Brilliant przedstawiający surowe histony wyekstrahowane z komórek BV2. Komórki BV2 hodowano przez 48 godzin przed rozpoczęciem protokołu ekstrakcji histonów. Surowe histony były ekstrahowane przez 15 minut, 2 godziny i 24 godziny, z trzema powtórzeniami dla każdego punktu czasowego (tak jest również w przypadku Rysunek 3, Rysunek 4 i Rysunek 5). W surowym ekstrakcie histonowym obecne są zarówno białka niehistonowe, jak i histonowe. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Reprezentatywny żel barwiony na niebiesko Coomassie Brilliant demonstrujący przepływ kolumny po etapach oczyszczania histonów z komórek BV2. Po przejściu surowego histonu przez kolumnę wiążącą histony, w przepływie obecne są tylko białka niehistonowe. W tej frakcji nie ma białek histonowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Ryc. 4: Reprezentatywny żel barwiony na niebiesko Coomassie Brilliant demonstrujący płukanie kolumny po etapie oczyszczania histonów z komórek BV2. Niezależnie od czasów ekstrakcji histonów, które wynosiły (A) 15 minut, (B) 2 godziny lub (C) 24 godziny, niewielkie ilości białek niehistonowych były obecne tylko w kolumnie wiążącej histony podczas pierwszego płukania. Białka histonów były nieobecne we wszystkich płukaniach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rycina 5: Reprezentatywny żel barwiony na niebiesko Coomassie Brilliant wykazujący eluacje po etapie oczyszczania histonów z komórek BV2. (A) Wysokiej jakości oczyszczone i odsolone histony H3 i H4 wykryto po pierwszej elucji z kolumny oczyszczającej histony. (B) Druga elucja z kolumny oczyszczającej histony nie dała wysokiej jakości ani ilości histonów H3 lub H4. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Szeroko działający inhibitor HDAC, tributyryna, zwiększa acetylację H4K12 w całym mózgu myszy typu dzikiego. (A) Ten panel pokazuje reprezentatywną plamę western blot obrazującą wzrost acetylacji H4K12 w surowym ekstrakcie histonowym pobranym z całego mózgu myszy typu dzikiego w odpowiedzi na szeroko działający inhibitor HDAC, tributyrynę. (B) Panel ten pokazuje ilościowe określenie wzrostu acetylacji H4K12 in vivo. Do porównania grup użyto niesparowanego testu t (t(6) = 6,076, P = 0,0005). Słupki reprezentują średnią ± błędem standardowym średniej (SEM). N = 8. P < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rycina 7: Inhibitor HDAC klasy I i IIb, M344, zwiększa acetylację H4K12 w korze przedczołowej myszy z potrójną transgeniczną chorobą Alzheimera (3 x Tg-AD). (A) Ten panel pokazuje reprezentatywną plamę zachodnią przedstawiającą wzrost acetylacji H4K12 w oczyszczonym i odsolonym ekstrakcie histonowym pobranym z kory przedczołowej myszy 3 x Tg-AD w odpowiedzi na hamowanie HDAC przez M344. (B) Panel ten pokazuje ilościowe określenie wzrostu acetylacji H4K12 w odpowiedzi na M344 podawany w dawce 10 mg/kg dziennie przez cztery miesiące. Do porównania grup użyto niesparowanego testu t (t(6) = 13,30, P < 0,0001). Słupki reprezentują średnią ± SEM. N = 8. P < 0,00001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-8
Ryc. 8: Selektywny inhibitor HDAC3, RGFP-966, zwiększa acetylację H3K27 w komórkach mikrogleju BV2. (A) Ten panel pokazuje reprezentatywną western blot obrazującą wzrost acetylacji H3K27 w oczyszczonym i odsolonym ekstrakcie histonowym pobranym z komórek BV2 w odpowiedzi na hamowanie HDAC3 przez RGFP-966. (B) RGFP-966 powoduje około dwukrotny wzrost acetylacji histonu H3 i lizyny (K) 27 po 24 godzinach leczenia. Niesparowany test t zastosowano do porównania komórek kontrolnych i leczonych (t(4) = 5,981, P = 0,002). Słupki reprezentują średnią ± SEM. N = 6. **P < 0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Reprezentatywna tkanka (jedna półkula) *Średnia masa tkanki (mg)Bufor ekstrakcyjny (ml)Liczba uderzeń
Móżdżek myszyRozdział 401Rozdział 40
Kora czołowa myszyRozdział 300,320
Hipokamp myszy27 Rozdział 270,3Rozdział 18
Kora śródwęchowa myszyRozdział 190,317
* Wszystkie eksperymenty przeprowadzono na dorosłych samcach myszy.
Średni wiek: 16 miesięcy. Średnia waga: 30 gramów.

Tabela 1: Zoptymalizowane warunki homogenizacji tkanki mózgowej.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W obecnej pracy zademonstrowaliśmy zoptymalizowaną metodę oczyszczania podstawowych białek histonowych i ilościowego oznaczania histonów H3 i H4 PTM (np. Acetylacja). Prezentowany protokół jest kompleksowym przepływem pracy, który obejmuje zoptymalizowane procedury dotyczące przygotowania komórek i tkanek mózgowych, surowego oczyszczania histonów oraz szczegółowego wytrącania, elucji i kwantyfikacji histonów, po których następuje elektroforeza histonów i solidna kwantyfikacja histonów PTM. Duża ilość dostarczonych tutaj szczegółów pozwala na powtarzalne generowanie wysokiej jakości danych, pomimo konieczności długotrwałych manipulacji próbkami histonów.

Wiele obecnie publikowanych protokołów wymaga użycia HPLC do wyizolowania czystych frakcji histonów H3 i H419. Chociaż HPLC jest potężną techniką, jej złożoność i niska przepustowość odstraszają większość biologów molekularnych i laików od jej częstego stosowania. Rzeczywiście, HPLC nie jest dostępny dla wielu laboratoriów, a do obsługi urządzenia wymagany jest wysoko wykwalifikowany personel. HPLC jest często czasochłonna, kosztowna i potencjalnie niebezpieczna. Przedstawiono tutaj niedrogą, średnioprzepustową strategię osiągania wyników o podobnej jakości, która omija HPLC. Opisana strategia jest również bardziej praktyczna i nadaje się do stosowania w prawie każdym laboratorium, ponieważ wykorzystuje proste podejście do kolumny wirowej, które nie wymaga specjalistycznych umiejętności obsługi instrumentu. Dodatkowo tetramer histonu H3/H4 jest ekstrahowany jako pojedyncza, czysta i obfita frakcja, co umożliwia wiarygodne określenie ilościowe zachowanych PTM na każdym z białek.

PTM są niezwykle wrażliwe na zmiany stresu oksydacyjnego i zmiany pH20,21. Tak więc, w przeciwieństwie do poprzednio opublikowanych metod18, donosimy o skutecznej strategii płukania komórek w pożywkach wolnych od surowicy, aby zapewnić minimalne zaburzenia metaboliczne komórek i uniknąć interferencji natywnych PTM ze składnikami surowicy. Obecny protokół nie tylko omija tradycyjną izolację jąder, ale także zapewnia optymalne czasy lizy komórek i dokładną procedurę homogenizacji tkanek, która pozwala na zachowanie otoczki jądrowej przy jednoczesnym uniknięciu agregacji jądrowej. Chociaż czasem ekstrakcji można manipulować w zależności od liczby komórek, typu użytej komórki, wielkości tkanki itp., Przedłużona liza nie jest pożądana, ponieważ może prowadzić do lizy jąder i uwolnienia DNA, co utrudnia obróbkę próbki. Co ważne, w protokole istnieje wiele punktów kontrolnych służących do walidacji udanego oczyszczania histonów (np. kroki 2.7 i 3.2.3). Ta strategia ułatwia również rozwiązywanie problemów w trakcie całej długotrwałej procedury.

Kolejną ważną i unikalną cechą prezentowanego protokołu jest jego pełna kompatybilność z dalszymi narzędziami do analizy western blot i innymi, jeśli jest to pożądane. Białka histonowe są wykrywane na poziomie ~15 kDa 13,22,23 i, podobnie jak inne białka o małej masie cząsteczkowej, okazały się trudne do wykrycia za pomocą standardowych technik immunoblottingu. Zastosowanie wysokowydajnego i wysokoprzepustowego systemu transferu w połączeniu z żelami białkowymi o optymalnej rozdzielczości pozwala na utrzymanie potwierdzenia natywnego białka (przy braku SDS) i aktywności przy braku SDS oraz wysoką wydajność transferu białek histonowych o niskiej masie cząsteczkowej, zapewniając w ten sposób wiarygodną kwantyfikację histonów PTM.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy wyrażają swoją wdzięczność Departamentowi Zdrowia Florydy Ed and Ethel Moore's Alzheimer's Research Program (granty 6AZ08 i 7AZ26), NIH-NIAAA (grant 5R01AA023781-03) oraz American Heart Association (grant 17PRE33660831).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,5 ml probówki do mikrowirówekThermoFiser Scientific05-408-129lub równoważne z innych źródeł
Sterylna wodaGibco15-230-204lub równoważna z innych źródeł
70% kwas nadchlorowySigma Aldrich311421lub równoważny z innych źródeł
100% acetonSigma Aldrich270725lub równoważny z innych źródeł
Paski wskaźnika pH, niekrwawiąceMilliipore Sigma1095310001
4x bufor do próbek SDSBIO-RAD161-0747
Rotor stołowyCole-ParmerUX-04397-34lub odpowiednik z innych źródeł
Stojak na probówki 1,5 mlThermoFiser Scientific05-541lub odpowiednik z innych źródeł
Mini zestawdo oczyszczania histonówKolumny wirowe Active Motif40026zawarte w zestawie
Koktajl inhibitorów proteazyThermoFiser Scientific78430lub odpowiednik z innych źródeł
Przyrząd do nanokropliThermoFiser ScientificND-2000
Szalki do hodowli tkankowychVWR10062-880wymagane do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Pożywki tkankowesą różne w zależności od użytej linii komórkowejróżni się w zależności od użytej linii komórkowejwymaganej do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Pożywka o niskiej zawartości surowicyThermoFiser Scientific51985091wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Skrobak do komórek z tworzywa sztucznego Falcon353086wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Żel gradientowy SDS-PAGEBIO-RAD456-9035wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Coomassie Brilliant Blue R-250 Roztwór barwiącyBIO-RAD1610436wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Coomassie Brilliant Blue R-250 Roztwór odbarwiającyBIO-RAD1610438wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Zestawy transferowe Trans-Blot Turbo Mini PVDFBIO-RAD1704156wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Turbotransferu Trans-BlotRIO-RAD1704150wymagany do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Barwienie PąsemCellSignalling59803Swymagane do ekstrakcji histonów z hodowanych komórek
Homogenizator Dounce (rozmiar/nakrętka sc 7mL) z małym luzemKimble Chase885302-0007wymagany dla histonu ekstrakcja z tkanek
100% wybielaczClorox68973wymagany do ekstrakcji histonów z tkanek Przeciwciało
H4K12acAktywny motyw39166wymagany do oznaczania ilościowego PTM za pomocą WB
Przeciwciało H3K27acAktywny motyw39134wymagany do kwantyfikacji PTM za pomocą WB
System

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Holliday, R. Is there an Epigenetic Component in Long-term Memory? Journal of Theoretical Biology. 200, 339-341 (1999).
  2. DeWoskin, V. A., Million, R. P. The epigenetics pipeline. Nature Reviews Drug Discovery. 12, 661-662 (2013).
  3. Eberharter, A., Becker, P. B. Histone acetylation: a switch between repressive and permissive chromatin. EMBO Reports. 3, 224-229 (2002).
  4. Grunstein, M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. Nature. 389, 349-352 (1997).
  5. Sartor, G. C., Powell, S. K., Brothers, S. P., Wahlestedt, C. Epigenetic Readers of Lysine Acetylation Regulate Cocaine-Induced Plasticity. The Journal of Neuroscience. 35, 15062-15072 (2015).
  6. Komatsu, N., et al. SAHA, a HDAC inhibitor, has profound anti-growth activity against non-small cell lung cancer cells. Oncology Reports. 15, 187-191 (2006).
  7. Bahari-Javan, S., Sananbenesi, F., Fischer, A. Histone-acetylation: a link between Alzheimer's disease and post-traumatic stress disorder. Frontiers in Neuroscience. 8, 160(2014).
  8. Roh, T. -Y., Cuddapah, S., Zhao, K. Active chromatin domains are defined by acetylation islands revealed by genome-wide mapping. Genes & Development. 19, 542-552 (2005).
  9. Mutskov, V., Felsenfeld, G. Silencing of transgene transcription precedes methylation of promoter DNA and histone H3 lysine 9. The EMBO Journal. 23, 138-149 (2004).
  10. Howe, L., Brown, C. E., Lechner, T., Workman, J. L. Histone acetyltransferase complexes and their link to transcription. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 9, 231-243 (1999).
  11. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293, 1074-1080 (2001).
  12. Bowman, G. D., Poirier, M. G. Post-Translational Modifications of Histones That Influence Nucleosome Dynamics. Chemical Reviews. 115, 2274-2295 (2015).
  13. Volmar, C. -H., Wahlestedt, C. Histone deacetylases (HDACs) and brain function. Neuroepigenetics. 1, 20-27 (2015).
  14. Plagg, B., Ehrlich, D., Kniewallner, K. M., Marksteiner, J., Humpel, C. Increased Acetylation of Histone H4 at Lysine 12 (H4K12) in Monocytes of Transgenic Alzheimer's Mice and in Human Patients. Current Alzheimer Research. 12, 752-760 (2015).
  15. Bhaskara, S., et al. Hdac3 is essential for the maintenance of chromatin structure and genome stability. Cancer Cell. 18, 436-447 (2010).
  16. Mottamal, M., Zheng, S., Huang, T. L., Wang, G. Histone Deacetylase Inhibitors in Clinical Studies as Templates for New Anticancer Agents. Molecules. 20, 3898-3941 (2015).
  17. Ramakrishnan, S., et al. HDAC 1 and 6 modulate cell invasion and migration in clear cell renal cell carcinoma. BMC Cancer. 16, 617(2016).
  18. Wapenaar, H., Dekker, F. J. Histone acetyltransferases: challenges in targeting bi-substrate enzymes. Clinical Epigenetics. 8, 59(2016).
  19. Klinker, H., Haas, C., Harrer, N., Becker, P. B., Mueller-Planitz, F. Rapid Purification of Recombinant Histones. PLoS ONE. 9, e104029(2014).
  20. Chen, K., et al. Neurodegenerative Disease Proteinopathies Are Connected to Distinct Histone Post-translational Modification Landscapes. ACS Chemical Neuroscience. 9, 838-848 (2018).
  21. Simithy, J., Sidoli, S., Garcia, B. A. Integrating Proteomics and Targeted Metabolomics to Understand Global Changes in Histone Modifications. Proteomics. , e1700309 (2018).
  22. Volmar, C. -H., et al. An Epigenetic Approach for the Modulation of Amyloid Precursor Protein (APP) Processing and Improvement of Memory in Alzheimer's Disease. Neuropsychopharmacology: official publication of the American College of Neuropsychopharmacology. 40, S470(2015).
  23. Volmar, C. -H., et al. M344 promotes nonamyloidogenic amyloid precursor protein processing while normalizing Alzheimer’s disease genes and improving memory. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), E9135-E9144 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oczyszczanie histon wacetylacja histon wel SDS PAGEchromatografia kolumnowaWestern blothiston H3histon H4ekstrakt z tkanki m zgowejprzygotowanie lizatu kom rkowego

Powiązane artykuły