Test mikroprzepływowy do oceny adhezji leukocytów do indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-EC)

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w wielu stanach patologicznych, w tym w zaburzeniach sercowo-naczyniowych i neurodegeneracyjnych, sepsie i niepożądanych reakcjach na leki (ADR). Komórki śródbłonka (EC) odgrywają istotną rolę w regulacji reakcji zapalnych poprzez indukcję receptorów proadhezyjnych, takich jak E-selektyna, międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna-1 (ICAM-1) i cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych-1 (VCAM-1) na ich powierzchni^1,2. Wiadomo, że mikronaczyniowe EC w różnych tkankach wykazują niejednorodność w reakcjach zapalnych^3,4. Ponadto podłoże genetyczne lub pewne choroby genetyczne mogą powodować różnice w reakcjach zapalnych między osobami; Dlatego ważne jest, aby mieć dostęp do EC od różnych osób. Niedawno wykazano, że ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs)⁵, które mogą pochodzić od praktycznie każdej osoby, służą jako niezawodne i odnawialne źródło ECs^6,7,8,9. W związku z tym ocena odpowiedzi zapalnych i rekrutacji leukocytów w hiPSC-EC jest cenna nie tylko dla modelowania niektórych zaburzeń genetycznych, ale także dla dostarczenia wskazówek dotyczących zmienności międzyosobniczej i wykorzystania jako narzędzie medycyny spersonalizowanej w przyszłości.

Testy przepływu dostarczają użytecznego narzędzia do badania interakcji śródbłonka-leukocytów. Postępy w dziedzinie urządzeń mikroprzepływowych umożliwiają odtwarzanie fizjologicznych warunków przepływu płynów z precyzyjną kontrolą poziomów naprężeń ścinających specyficznych dla łożyska naczyniowego. Obrazowanie na żywo umożliwia monitorowanie kaskady zdarzeń wychwytywania, toczenia, pełzania, adhezji i transmigracji leukocytów. Opracowano kilka testów przepływu w celu zbadania interakcji śródbłonek-leukocyty, jednak wszystkie wykorzystują podstawowe ECs^10,11,12,13. W tym miejscu szczegółowo opiszemy test do oceny adhezji ludzkich leukocytów do hiPSC-EC w przepływie fizjologicznym. W tej procedurze opisano zoptymalizowane warunki stymulacji hiPSC-EC bodźcami prozapalnymi, takimi jak czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα), dysocjacja, zasiew do chipa mikroprzepływowego z ośmioma równoległymi kanałami. Opisujemy krok po kroku protokół perfuzji hiPSC-EC z zawieszeniem leukocytów znakowanych fluorescencyjnie w chipach mikroprzepływowych, obrazowaniem żywych komórek i automatycznym zliczaniem przylegających leukocytów.

Ten protokół jest przydatny do oceny reakcji zapalnych w hiPSC-EC w badaniach przesiewowych leków, modelowaniu chorób i spersonalizowanej medycynie regeneracyjnej.

1. Przygotowanie roztworów i odczynników

1. Przygotować kompletną pożywkę Human Endothelial-SFM (EC-SFM FULL), dodając surowicę pochodzącą z osocza ubogiego w płytki krwi (1%), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF, 20 ng/ml) i czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF, 50 ng/ml) do ludzkiego śródbłonka-SFM (patrz tabela materiałów). Przefiltrować pożywkę przez filtr porowy 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
2. Przygotować kompletną pożywkę RPMI, dodając płodową surowicę bydlęcą (10%), 2-merkaptoetanol (0,05 nM), L-glutaminę (1%), penicylinę-streptomycynę (25 U/ml) do pożywki RPMI (patrz tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 tygodni.

2. Powlekanie chipów mikroprzepływowych

1. Umieść sterylny biochip na sterylnej szalce Petriego o średnicy 10 cm.
2. Przygotować roztwór roboczy fibronektyny, rozpuszczając roztwór podstawowy w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) bez Ca²⁺/Mg²⁺ do końcowego stężenia 50 μg/ml. Oszacuj 80 μl roztworu roboczego na biochip.
3. Wstrzyknąć 10 μl roztworu roboczego fibronektyny do każdego kanału biochipa. Użyj pipety z małymi końcówkami o pojemności 10 μl i upewnij się, że wlot kanału a końcówka pipety zapewniają ścisły kontakt (Rysunek 1C, po lewej).
4. Zamknij pokrywę szalki Petriego zawierającej biochip i umieść ją w wilgotnej komorze (Rysunek 2B). Przechowywać komorę w temperaturze 4 °C przez noc. Aby nawilżyć komorę, umieść czystą bibułkę na dnie nawilżonej komory i dodaj 5 ml sterylnego H₂O.
5. Następnego dnia, przed badaniem, należy wstępnie podgrzać biochip w temperaturze 37 °C w inkubatorze.

3. Przygotowanie hiPSC-EC

UWAGA: W opisanym tutaj protokole, hiPSC-EC zostały zróżnicowane, oczyszczone, kriokonserwowane i rozmrożone, jak opisano wcześniej⁸.

1. Rozmrozić i nanieść hiPSC-EC w kompletnym EC-SFM FULL w jednej 0,1% pokrytej żelatyną kolbie T75, trzy do czterech dni przed badaniem.
2. W noc poprzedzającą test stymuluj hiPSC-EC za pomocą TNFα, dodając EC-SFM FULL uzupełniony 10 ng/ml TNFα i inkubuj przez noc (~12 godzin) w temperaturze 37 °C, jak opisano wcześniej ⁷.

4. Dysocjacja hiPSC-EC i zasiewanie do mikroprzepływowego chipa

1. W dniu testu należy pobrać z inkubatora kolbę z hiPSC-EC i zbadać komórki pod mikroskopem. Upewnij się, że hiPSC-EC są zlewane w 80–100% i mają typową morfologię podobną do EC.
2. Przenieść kolbę do okapu do hodowli komórkowych.
3. Odessać pożywkę z kolby hiPSC-EC.
4. Krótko przemyć kulturę komórkową, dodając 10 ml PBS bez Ca²⁺ / Mg²⁺. Zassać PBS.
5. Dodać 4 ml na kolbę 1x enzymu dysocjacyjnego. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) (Rysunek 1B).
6. Zatrzymać reakcję dysocjacji, dodając 8 ml pożywki Human Endothelial-SFM na kolbę. Delikatnie odłączyć zawiesinę hiPSC-EC i zebrać ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
7. Policz całkowitą liczbę komórek w zawiesinie.
8. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w EC-SFM FULL do końcowego stężenia 1,5 x 10⁷ komórek/ml.
10. Wyjąć szalkę Petriego z biochipem z inkubatora i przenieść ją do kaptura do hodowli komórkowych.
11. Odessać roztwór fibronektyny ze wszystkich kanałów chipa mikroprzepływowego.
12. Wstrzyknąć 6 μl zawiesiny komórek do każdego kanału za pomocą pipety z małą końcówką o pojemności 10 μl (Rysunek 1C, środek). Należy upewnić się, że zawiesina komórek jest dobrze wymieszana przed wstrzyknięciem i unikać wytrącania się komórek.
13. Zbadaj biochip pod mikroskopem i upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone, a gęstość komórek jest wysoka (Rysunek 2C).
14. Inkubować biochip przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
15. Dodaj 40 μl EC-SFM FULL do zbiorników pożywki z obu stron każdego kanału.
16. Inkubować biochip przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (Rysunek 1C, po prawej).
17. Dodaj kolejne 50 μl EC-SFM FULL do zbiorników z obu stron każdego kanału.

5. Przygotowanie ludzkich leukocytów

UWAGA: W opisanym tutaj protokole użyto dostępnej na rynku linii komórek monocytowych (THP-1). Alternatywnie można użyć komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub neutrofili. Izolację monocytów krwi obwodowej i neutrofili można przeprowadzić przy użyciu standardowej procedury¹¹. Wykonaj wszystkie czynności opisane w tym paragrafie w kapturze do hodowli komórkowych.

1. Zebrać leukocyty w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
2. Przemyć leukocyty 10 ml PBS bez Ca²⁺/Mg²⁺. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (Rysunek 1D).
3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS za pomocą barwnika DiOC6 (λ_ex = 485 nm, λ_em = 501 nm) (1:5 000). Inkubować komórki w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
4. Przemyć leukocyty 10 ml PBS bez Ca²⁺/Mg²⁺. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórzyć etap mycia jeszcze raz.
5. Policz całkowitą liczbę komórek w zawiesinie.
6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnym podłożu RPMI do końcowego stężenia 2,5 x 10⁶ komórek/ml.

6. Przygotowanie pompy mikroprzepływowej

1. Zamontuj pompę mikroprzepływową z kolektorem 8-kanałowym.
2. Podłącz pompę do komputera z zainstalowanym oprogramowaniem operacyjnym.
3. Uruchom oprogramowanie mikroprzepływowe i załaduj protokół, klikając Otwórz protokół i przejdź na komputerze, aby wybrać protokół mikroprzepływowy.
4. Połącz oprogramowanie z pompą, wybierając folder Setup (Konfiguracja) i klikając przycisk Run Assay Step (Uruchom krok testu).
5. Zdefiniuj geometrię kanałów w celu prawidłowego sterowania natężeniem przepływu: wybierz opcję Aktualizuj geometrię w folderze Ustawienia geometrii i kliknij przycisk Uruchom krok testu.
   nuta: Upewnij się, że szczegóły geometrii są zgodne ze strzykawką i kanałami, które mają być użyte (ID geometrii = 1, Liczba kanałów = 8, Szerokość kanału = 800,0 μm, Głębokość kanału = 120,0 μm, Objętość strzykawki = 250 μL) oraz lepkość próbki (Lepkość cieczy = 1,0).
6. Umyj pompę, umieszczając dopływowy (pomarańczowy) w stożkowej rurce o pojemności 50 ml zawierającej 80% etanolu. Umieść wyjściowy (zielony) w stożkowej pustej probówce (pojemniku na odpady) o pojemności 50 ml.
7. Wybierz folder Wypłukiwania/Wymywania pompą i kliknij przycisk Uruchom krok oznaczania (Objętość prania = 2000 μL, Krok objętości prania = 250 μL, Kierunek wymywania = Wyjście). Powtórz krok prania jeszcze raz.
8. Powtórz kroki płukania pompy (kroki 6.6–6.7) wodą klasy do hodowli komórkowych i pożywką do hodowli śródbłonka ludzkiego.
9. Kontynuuj etap mycia kolektora.
10. Ręcznie otwórz zawór między strzykawką a kolektorem, umieszczając adapter 3-drożny we właściwej pozycji (wskaźnik OFF jest przekręcony w lewo).
11. Wybierz Set Current Channel/Open step w folderze Washout/Manifold Wash i kliknij Uruchom krok testu, aby otworzyć wszystkie zawory kolektora.
12. Umyj kolektor ręcznie, wypychając 5 ml 80% etanolu ze strzykawki, a następnie 5 ml wody klasy do hodowli komórkowych.
13. Umyć kolektor, wypychając ze strzykawki 5 ml pożywki hodowlanej Human Endothelial-SFM.
14. Usuń wszystkie duże pęcherzyki powietrza, które są uwięzione w kolektorze. W tym celu należy umieścić 8-dołkowy adapter szpilkowy w 10-centymetrowej szalce Petriego z pożywką i wykonuj pchanie/ciągnięcie strzykawką, aż wszystkie duże pęcherzyki powietrza znikną (małe pęcherzyki nie stanowią problemu).
15. Wybierz Set Current Channel/Close step (Ustaw krok Current Channel/Close) w folderze Washout/Manifold Wash (Mycie kolektora) i kliknij przycisk Run Assay Step (Uruchom krok testu), aby zamknąć wszystkie zawory kolektora.
16. Podłącz zielony wylotowy od pompy do adaptera kolektora.
17. Przestaw zawór 3-drogowy z powrotem do pozycji OFF, aby zamknąć strzykawkę.
18. Wybierz folder Washout/Cable Washout i kliknij Uruchom krok testowania, aby umyć każdy port pożywką RPMI indywidualnie, upewniając się, że wszystkie pęcherzyki zostały usunięte z każdego (objętość dozowania = 100 μl).
    nuta: Każdy zawór kolektora jest otwierany jeden po drugim, od 1 do 8, a 100 μl medium jest dozowane przez każdy pojedynczy kanał, pozostawiając pozostałe kanały zamknięte. Upewnij się, że płyn spływa z każdego kołka. Jeśli nie wypływa płyn, oznacza to pęcherzyk powietrza lub zatkanie.

7. Przygotowanie chipa mikroprzepływowego do obrazowania na żywo

1. Upewnij się, że zestawy mikroprzepływowe są gotowe, a komora obrazowania na żywo jest wstępnie zrównoważona do 37 °C, a poziom CO₂ osiąga 5% (Rysunek 3A, B).
2. Wyjmij biochip z inkubatora i umieść go w uchwycie na chip mikroskopu. Zamontuj uchwyt chipa na stoliku do obrazowania mikroskopu (Rysunek 3C).
3. W celu podłączenia biochipa do pompy za pośrednictwem kolektora, należy umieścić adapter 8-pinowy w pobliżu zbiorników wylotowych chipa i pogłębić wszystkie piny w medium (ale nie podłączać całkowicie).
4. Wybierz punkt menu Washout | Połącz się z folderem Chip i kliknij Uruchom krok testu, aby dozować pożywkę RPMI przed podłączeniem chipa (objętość dozowania = 30 ml). Po dozowaniu pożywki włóż 8-pinowy adapter do gniazda biochipa.
   nuta: Na tym etapie wszystkie kanały są ustawiane w pozycji Włączone (otwarte) i przez każdy kanał dozowane jest 30 μl pożywki, a następnie kanały są ustawiane w pozycji Wyłączone (zamknięte). Gwarantuje to, że żadne pęcherzyki powietrza nie zostaną wprowadzone do kanałów chipa mikroprzepływowego.
5. Ręcznie odessać pożywkę ze wszystkich zbiorników wlotowych biochipa za pomocą pipety.
6. Wybierz punkt menu Washout | Chip Washout folder i kliknij Uruchom krok testu, aby przepuścić 40 μl pożywki EC-SFM FULL przez każdy z kanałów jeden po drugim, aby pozbyć się martwych komórek/zanieczyszczeń z kanału (objętość wymywania = 40 μl, maksymalne ścinanie wymywania = 40 dyn^{/ cm 2}).

8. Test przyczepności przepływowej i akwizycja obrazu

1. Ręcznie zassać pożywkę ze zbiornika wlotowego kanału będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą pipety.
2. Dodać 100 μl leukocytów z kroku 5.6 do zbiornika wlotowego kanału będącego przedmiotem zainteresowania.
   nuta: Delikatnie wymieszaj komórki, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
3. w teście komórkowym | Opis kroku, wybierz opcję Ustaw bieżący kanał/Opis kroku i na liście kanałów wybierz tylko bieżący kanał, który Cię interesuje, ustaw na Włączony (otwarty), a wszystkie pozostałe siedem kanałów ustaw na Wyłączone (zamknięte).
4. Wybierz test komórkowy | Krok Opis folderu i kliknij Uruchom test Step.
   nuta: Upewnij się, że dozowanie o zmiennym natężeniu przepływu stosuje stałe podciśnienie, aby wyciągnąć zawiesinę leukocytów ze zbiornika wlotowego przez kanał przez 5 minut (zestaw ścinania = stały, naprężenie ścinające = -0,5 dyn / cm², czas trwania = 00:05:00, opóźnienie skanowania = 00:00:00). Ujemna wartość naprężenia ścinającego zapewnia prawidłowy kierunek przepływu.
5. Odessać pozostałe leukocyty ze zbiornika wlotowego.
6. Dodać 100 μl kompletnego podłoża RPMI do zbiornika wlotowego. Wybierz folder Cell Assay/Step description i kliknij Run Assay Step, aby perfuzjować kanał przez 5 minut pożywką RPMI w celu wypłukania wszystkich nieprzylegających leukocytów (zestaw ścinania = stały, naprężenie ścinające = -0,5 dyn/cm², czas trwania = 00:05:00, opóźnienie skanowania = 00:00:00).
7. Uzyskaj obrazy z co najmniej trzech do czterech różnych pozycji kanału, aby zobrazować przylegające leukocyty (aby upewnić się, że uchwycone są reprezentatywne obszary).
8. Powtórz kroki 8.1–8.7, aby ocenić działanie wszystkich pozostałych kanałów.
   UWAGA: Możliwe jest uruchomienie wielu kanałów jednocześnie. Aby to zrobić, otwórz wszystkie interesujące Cię kanały w kroku 8.3. i wykonaj wszystkie wyżej wymienione kroki 8.4–8.7 dla wielu kanałów zainteresowania.

9. Zakończenie testu i czyszczenie pompy mikroprzepływowej

1. Po zakończeniu eksperymentu wyeksportuj i zapisz wszystkie obrazy w formacie RAW.
2. Zapisując wyniki, uruchom pompę mikroprzepływową i protokół czyszczenia kolektora.
3. W przypadku pompy mikroprzepływowej należy najpierw uruchomić folder Washout/Pump Washout, przetapiając 4 ml wody klasy do hodowli komórkowych, a następnie 4 ml 80% etanolu, jak opisano w krokach 6.6–6.7 Osusz pompę, przepuszczając powietrze przez kilka minut.
4. W celu wyczyszczenia kolektora należy uruchomić etap Mycie/Mycie Kolektora za pomocą strzykawki. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby otworzyć strzykawkę i zawory kolektora, jak opisano w krokach 6.10–6.11: Najpierw umyj 80% etanolem, a następnie wodą klasy do hodowli komórkowych. Osuszyć kolektor, przepychając powietrze przez strzykawkę. Zamknąć zawór strzykawkowy i zawory kolektora zgodnie z opisem w krokach 6.10 i 6.15.

10. Liczenie przylegających leukocytów

1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie do przetwarzania obrazów¹⁴ z http://cellprofiler.org.
   nuta: Przetwarzanie obrazu w tym badaniu przeprowadzono przy użyciu oprogramowania w wersji 2.1.1. W przypadku korzystania z nowszej wersji potok może wymagać niewielkiej adaptacji.
2. Pobierz potok Count_leukocytes.cpipe. Kliknij pozycję Plik | Import | Potok z pliku i przejdź na komputerze, aby wybrać potok Count_leukocytes.cpipe.
3. Przeciągnij i upuść folder z uzyskanymi obrazami RAW przylegających leukocytów do okna Lista plików w Modułach wejściowych | Sekcja obrazów do analizy.
4. Określ typowy rozmiar leukocytów za pomocą modułów analizy | IdentifyPrimaryObjects. Określ minimalną i maksymalną średnicę przylegających leukocytów w pikselach.
5. Wybierz kryteria filtrowania za pomocą punktu menu Moduły zestawienia | FilterObjects. Określ minimalnie akceptowany obszar obiektów w pikselach.
6. Rozpocznij analizę, naciskając przycisk Analizuj obrazy.
   nuta: Wszystkie obrazy RAW zostaną przetworzone, a wyniki zostaną zapisane w domyślnym folderze wyjściowym. Plik wyjściowy Image.txt zawiera liczbę przylegających leukocytów w każdym przetwarzanym obrazie (każda liczba odpowiada jednemu obrazowi, tj. każdemu uzyskanemu polu widzenia).

Po pierwsze, należy zbadać reakcję hiPSC-EC na stymulację środkiem prozapalnym TNFα, jak opisano wcześniej7. Leczenie TNFα przez 12 godzin wyzwala regulację w górę selektyny E, ze szczytem po 6 godzinach od rozpoczęcia leczenia. Dodatkowo ICAM-1 jest regulowany w górę 6 - 12 godzin po zabiegu. Chociaż nie zaobserwowaliśmy oczekiwanej regulacji w górę VCAM-1, jest ona zwykle obserwowana w pierwotnych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC). Stwierdziliśmy, że leczenie TNFα przez noc (12 godzin) jest najwygodniejsze w teście adhezji leukocytów.

Optymalna dysocjacja hiPSC-EC powinna doprowadzić do powstania zawiesiny pojedynczej komórki wolnej od grudek komórkowych. Rysunek 2C ilustruje optymalną gęstość hiPSC-EC zaraz po wstrzyknięciu. Zazwyczaj, 15 minut po wstrzyknięciu, hiPSC-EC przyczepiają się do dna kanału i zaczynają się rozprzestrzeniać (Rysunek 2D). 1 godzinę po wstrzyknięciu, hiPSC-EC tworzą dobrze rozłożoną monowarstwę wzdłuż kanału i będą gotowe do rozpoczęcia testu przepływu (Rysunek 2E).

Znakowanie leukocytów znacznikiem fluorescencyjnym jest korzystne dla obrazów kontrastu fazowego w automatycznej kwantyfikacji obrazu, ponieważ ułatwia identyfikację komórek, zwłaszcza że leukocyty przylegają do monowarstwy EC i często oprogramowanie ma trudności z rozróżnieniem różnych typów komórek.

Darmowe oprogramowanie do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym jest bardzo przydatne do automatycznego oznaczania ilościowego przylegających leukocytów. Potok opisany w niniejszym protokole opiera się na identyfikacji obiektów pierwotnych przy użyciu adaptacyjnego progowania obrazów fluorescencyjnych leukocytów (Rysunek 4A). Filtrowanie zidentyfikowanych obiektów na podstawie minimalnego obszaru dodatkowo odfiltrowuje fałszywie zidentyfikowane obiekty, takie jak szczątki komórek, autofluorescencja lub jakikolwiek inny niespecyficzny sygnał fluorescencyjny (Rysunek 4C, D).

Jeden mikroprzepływowy chip z ośmioma równoległymi kanałami pozwala na porównanie dwóch niezależnych grup, na przykład EC różniących się od niezależnych hiPSC, takich jak zdrowi dawcy lub pacjenci z zaburzeniami genetycznymi. Można również uwzględnić dodatkowe kontrole, takie jak nieleczone EC lub wstępne leczenie przeciwciałem blokującym ICAM-110,11. Jednorazowo można przetwarzać od dwóch do trzech chipów mikroprzepływowych. W celu zapewnienia wiarygodności wniosków zaleca się przeprowadzenie co najmniej trzech niezależnych eksperymentów biologicznych w niezależnych dniach.

Rysunek 1: Przygotowanie hiPSC-EC i leukocytów do testu przepływowego. (A) Wstępne leczenie hiPSC-EC bodźcem prozapalnym (TNFα). (B) Schematyczne przedstawienie dysocjacji, wirowania i ponownego zawieszania hiPSC-EC. (C) Schematyczne przedstawienie powlekania kanałów (C, po lewej), wstrzykiwania zawiesiny hiPSC-EC (C, środek) i dodawania pożywki do hodowli komórkowych po przyłączeniu hiPSC-EC do chipa mikroprzepływowego. (D) Schematyczne przedstawienie etapu płukania leukocytów, znakowania barwnikiem fluorescencyjnym DiOC6 i ponownego zawieszenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Mikroprzepływowy chip z hiPSC-ECs. (A) Chip mikroprzepływowy na 10 cm szalce Petriego. (B) Wilgotna komora używana do inkubacji. (C, D, E) Reprezentatywne obrazy hiPSC-EC w kanale mikroprzepływowym 0 min (C), 15 min (D), 1 h (E) po wstrzyknięciu. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Eksperymentalna konfiguracja obrazowania żywych komórek i testu perfuzji leukocytów.(A, B) Zdjęcie (A) i schematyczne przedstawienie (B) układu doświadczalnego obrazowania żywych komórek i testu przepływu: (1) - odwrócony mikroskop fluorescencyjny z zamontowaną komorą do obrazowania na żywo (5% CO2, 37 °C, nawilżany), (2) - pompa mikroprzepływowa, (3) - kolektor 8-kanałowy, (4) - komputer do sterowania mikroskopem i akwizycji obrazu, (5) - komputer do sterowania pompą mikroprzepływową. (C) Chip mikroprzepływowy z włożoną rurką kolektora 8-kanałowego zamocowaną w uchwycie płytki i zamontowaną w zmotoryzowanym stopniu mikroskopu. (D) Schematyczne przedstawienie głównych etapów testu przepływu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analiza obrazu i automatyczne wykrywanie przylegających leukocytów.(A) Okno dialogowe oprogramowania do przetwarzania obrazu z określonymi ustawieniami identyfikacji leukocytów. (B) Okno dialogowe oprogramowania do przetwarzania obrazu z określonymi kryteriami filtrowania zidentyfikowanych obiektów na podstawie minimalnie przyjętej powierzchni (SAmin = 70 px). (C) Przykład poprawnej identyfikacji leukocytów i filtrowania niespecyficznych obiektów o małej powierzchni (SA) (typowa średnica w pikselach (Min, Max) = (9, 15); Kryteria filtrowania SAmin = 70 px). Zaakceptowane obiekty są oznaczone kolorem zielonym, a odrzucone obiekty są oznaczone kolorem fioletowym. (D) Przykład nieprawidłowej identyfikacji leukocytów ze względu na nieprawidłowy zakres typowej średnicy (Typowa średnica w pikselach (Min, Max) = (3, 15); Kryteria filtrowania SAmin = 70 px). Zaakceptowane obiekty są oznaczone kolorem zielonym, a odrzucone obiekty są oznaczone kolorem fioletowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.