Artykuł metodologiczny

Test mikroprzepływowy do oceny adhezji leukocytów do indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-EC)

9.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58678

⸱

26 listopada 2018

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2Department of Applied Stem Cell Technologies, University of Twente

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół krok po kroku zawiera szczegółowy opis konfiguracji eksperymentu i analizy danych do oceny reakcji zapalnych w hiPSC-EC oraz analizy adhezji leukocytów w przepływie fizjologicznym.

Streszczenie

Komórki śródbłonka (EC) są niezbędne do regulacji reakcji zapalnych poprzez ograniczanie lub ułatwianie rekrutacji leukocytów do dotkniętych tkanek poprzez dobrze scharakteryzowaną kaskadę receptorów proadhezyjnych, które są regulowane w górę na powierzchni komórek leukocytów po wyzwalaczu zapalnym. Reakcje zapalne różnią się między osobnikami w populacji, a podłoże genetyczne może przyczyniać się do tych różnic. Wykazano, że ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są wiarygodnym źródłem EC (hiPSC-EC), stanowiąc tym samym nieograniczone źródło komórek, które rejestrują tożsamość genetyczną i wszelkie warianty genetyczne lub mutacje dawcy. hiPSC-EC mogą być zatem wykorzystywane do modelowania reakcji zapalnych w komórkach specyficznych dla dawcy. Reakcje zapalne można modelować, określając adhezję leukocytów do hiPSC-EC pod wpływem przepływu fizjologicznego. Ten protokół krok po kroku zawiera szczegółowy opis konfiguracji eksperymentalnej i analizy danych w celu oceny odpowiedzi zapalnych w hiPSC-EC oraz analizy adhezji leukocytów w przepływie fizjologicznym.

Wprowadzenie

Stan zapalny odgrywa kluczową rolę w wielu stanach patologicznych, w tym w zaburzeniach sercowo-naczyniowych i neurodegeneracyjnych, sepsie i niepożądanych reakcjach na leki (ADR). Komórki śródbłonka (EC) odgrywają istotną rolę w regulacji reakcji zapalnych poprzez indukcję receptorów proadhezyjnych, takich jak E-selektyna, międzykomórkowa cząsteczka adhezyjna-1 (ICAM-1) i cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych-1 (VCAM-1) na ich powierzchni1,2. Wiadomo, że mikronaczyniowe EC w różnych tkankach wykazują niejednorodność w reakcjach zapalnych3,4. Ponadto podłoże genetyczne lub pewne choroby genetyczne mogą powodować różnice w reakcjach zapalnych między osobami; Dlatego ważne jest, aby mieć dostęp do EC od różnych osób. Niedawno wykazano, że ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs)5, które mogą pochodzić od praktycznie każdej osoby, służą jako niezawodne i odnawialne źródło ECs6,7,8,9. W związku z tym ocena odpowiedzi zapalnych i rekrutacji leukocytów w hiPSC-EC jest cenna nie tylko dla modelowania niektórych zaburzeń genetycznych, ale także dla dostarczenia wskazówek dotyczących zmienności międzyosobniczej i wykorzystania jako narzędzie medycyny spersonalizowanej w przyszłości.

Testy przepływu dostarczają użytecznego narzędzia do badania interakcji śródbłonka-leukocytów. Postępy w dziedzinie urządzeń mikroprzepływowych umożliwiają odtwarzanie fizjologicznych warunków przepływu płynów z precyzyjną kontrolą poziomów naprężeń ścinających specyficznych dla łożyska naczyniowego. Obrazowanie na żywo umożliwia monitorowanie kaskady zdarzeń wychwytywania, toczenia, pełzania, adhezji i transmigracji leukocytów. Opracowano kilka testów przepływu w celu zbadania interakcji śródbłonek-leukocyty, jednak wszystkie wykorzystują podstawowe ECs10,11,12,13. W tym miejscu szczegółowo opiszemy test do oceny adhezji ludzkich leukocytów do hiPSC-EC w przepływie fizjologicznym. W tej procedurze opisano zoptymalizowane warunki stymulacji hiPSC-EC bodźcami prozapalnymi, takimi jak czynnik martwicy nowotworu alfa (TNFα), dysocjacja, zasiew do chipa mikroprzepływowego z ośmioma równoległymi kanałami. Opisujemy krok po kroku protokół perfuzji hiPSC-EC z zawieszeniem leukocytów znakowanych fluorescencyjnie w chipach mikroprzepływowych, obrazowaniem żywych komórek i automatycznym zliczaniem przylegających leukocytów.

Ten protokół jest przydatny do oceny reakcji zapalnych w hiPSC-EC w badaniach przesiewowych leków, modelowaniu chorób i spersonalizowanej medycynie regeneracyjnej.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów i odczynników

  1. Przygotować kompletną pożywkę Human Endothelial-SFM (EC-SFM FULL), dodając surowicę pochodzącą z osocza ubogiego w płytki krwi (1%), podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF, 20 ng/ml) i czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF, 50 ng/ml) do ludzkiego śródbłonka-SFM (patrz tabela materiałów). Przefiltrować pożywkę przez filtr porowy 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 tygodni.
  2. Przygotować kompletną pożywkę RPMI, dodając płodową surowicę bydlęcą (10%), 2-merkaptoetanol (0,05 nM), L-glutaminę (1%), penicylinę-streptomycynę (25 U/ml) do pożywki RPMI (patrz tabela materiałów). Przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 tygodni.

2. Powlekanie chipów mikroprzepływowych

  1. Umieść sterylny biochip na sterylnej szalce Petriego o średnicy 10 cm.
  2. Przygotować roztwór roboczy fibronektyny, rozpuszczając roztwór podstawowy w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) bez Ca2+/Mg2+ do końcowego stężenia 50 μg/ml. Oszacuj 80 μl roztworu roboczego na biochip.
  3. Wstrzyknąć 10 μl roztworu roboczego fibronektyny do każdego kanału biochipa. Użyj pipety z małymi końcówkami o pojemności 10 μl i upewnij się, że wlot kanału a końcówka pipety zapewniają ścisły kontakt (Rysunek 1C, po lewej).
  4. Zamknij pokrywę szalki Petriego zawierającej biochip i umieść ją w wilgotnej komorze (Rysunek 2B). Przechowywać komorę w temperaturze 4 °C przez noc. Aby nawilżyć komorę, umieść czystą bibułkę na dnie nawilżonej komory i dodaj 5 ml sterylnego H2O.
  5. Następnego dnia, przed badaniem, należy wstępnie podgrzać biochip w temperaturze 37 °C w inkubatorze.

3. Przygotowanie hiPSC-EC

UWAGA: W opisanym tutaj protokole, hiPSC-EC zostały zróżnicowane, oczyszczone, kriokonserwowane i rozmrożone, jak opisano wcześniej8.

  1. Rozmrozić i nanieść hiPSC-EC w kompletnym EC-SFM FULL w jednej 0,1% pokrytej żelatyną kolbie T75, trzy do czterech dni przed badaniem.
  2. W noc poprzedzającą test stymuluj hiPSC-EC za pomocą TNFα, dodając EC-SFM FULL uzupełniony 10 ng/ml TNFα i inkubuj przez noc (~12 godzin) w temperaturze 37 °C, jak opisano wcześniej 7.

4. Dysocjacja hiPSC-EC i zasiewanie do mikroprzepływowego chipa

  1. W dniu testu należy pobrać z inkubatora kolbę z hiPSC-EC i zbadać komórki pod mikroskopem. Upewnij się, że hiPSC-EC są zlewane w 80–100% i mają typową morfologię podobną do EC.
  2. Przenieść kolbę do okapu do hodowli komórkowych.
  3. Odessać pożywkę z kolby hiPSC-EC.
  4. Krótko przemyć kulturę komórkową, dodając 10 ml PBS bez Ca2+ / Mg2+. Zassać PBS.
  5. Dodać 4 ml na kolbę 1x enzymu dysocjacyjnego. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) (Rysunek 1B).
  6. Zatrzymać reakcję dysocjacji, dodając 8 ml pożywki Human Endothelial-SFM na kolbę. Delikatnie odłączyć zawiesinę hiPSC-EC i zebrać ją w stożkowej probówce o pojemności 15 ml za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
  7. Policz całkowitą liczbę komórek w zawiesinie.
  8. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej.
  9. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w EC-SFM FULL do końcowego stężenia 1,5 x 107 komórek/ml.
  10. Wyjąć szalkę Petriego z biochipem z inkubatora i przenieść ją do kaptura do hodowli komórkowych.
  11. Odessać roztwór fibronektyny ze wszystkich kanałów chipa mikroprzepływowego.
  12. Wstrzyknąć 6 μl zawiesiny komórek do każdego kanału za pomocą pipety z małą końcówką o pojemności 10 μl (Rysunek 1C, środek). Należy upewnić się, że zawiesina komórek jest dobrze wymieszana przed wstrzyknięciem i unikać wytrącania się komórek.
  13. Zbadaj biochip pod mikroskopem i upewnij się, że komórki są równomiernie rozmieszczone, a gęstość komórek jest wysoka (Rysunek 2C).
  14. Inkubować biochip przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  15. Dodaj 40 μl EC-SFM FULL do zbiorników pożywki z obu stron każdego kanału.
  16. Inkubować biochip przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C (Rysunek 1C, po prawej).
  17. Dodaj kolejne 50 μl EC-SFM FULL do zbiorników z obu stron każdego kanału.

5. Przygotowanie ludzkich leukocytów

UWAGA: W opisanym tutaj protokole użyto dostępnej na rynku linii komórek monocytowych (THP-1). Alternatywnie można użyć komórek jednojądrzastych krwi obwodowej lub neutrofili. Izolację monocytów krwi obwodowej i neutrofili można przeprowadzić przy użyciu standardowej procedury11. Wykonaj wszystkie czynności opisane w tym paragrafie w kapturze do hodowli komórkowych.

  1. Zebrać leukocyty w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
  2. Przemyć leukocyty 10 ml PBS bez Ca2+/Mg2+. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej (Rysunek 1D).
  3. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml PBS za pomocą barwnika DiOC6 (λex = 485 nm, λem = 501 nm) (1:5 000). Inkubować komórki w ciemności przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Przemyć leukocyty 10 ml PBS bez Ca2+/Mg2+. Odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. Powtórzyć etap mycia jeszcze raz.
  5. Policz całkowitą liczbę komórek w zawiesinie.
  6. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w kompletnym podłożu RPMI do końcowego stężenia 2,5 x 106 komórek/ml.

6. Przygotowanie pompy mikroprzepływowej

  1. Zamontuj pompę mikroprzepływową z kolektorem 8-kanałowym.
  2. Podłącz pompę do komputera z zainstalowanym oprogramowaniem operacyjnym.
  3. Uruchom oprogramowanie mikroprzepływowe i załaduj protokół, klikając Otwórz protokół i przejdź na komputerze, aby wybrać protokół mikroprzepływowy.
  4. Połącz oprogramowanie z pompą, wybierając folder Setup (Konfiguracja) i klikając przycisk Run Assay Step (Uruchom krok testu).
  5. Zdefiniuj geometrię kanałów w celu prawidłowego sterowania natężeniem przepływu: wybierz opcję Aktualizuj geometrię w folderze Ustawienia geometrii i kliknij przycisk Uruchom krok testu.
    nuta: Upewnij się, że szczegóły geometrii są zgodne ze strzykawką i kanałami, które mają być użyte (ID geometrii = 1, Liczba kanałów = 8, Szerokość kanału = 800,0 μm, Głębokość kanału = 120,0 μm, Objętość strzykawki = 250 μL) oraz lepkość próbki (Lepkość cieczy = 1,0).
  6. Umyj pompę, umieszczając dopływowy (pomarańczowy) w stożkowej rurce o pojemności 50 ml zawierającej 80% etanolu. Umieść wyjściowy (zielony) w stożkowej pustej probówce (pojemniku na odpady) o pojemności 50 ml.
  7. Wybierz folder Wypłukiwania/Wymywania pompą i kliknij przycisk Uruchom krok oznaczania (Objętość prania = 2000 μL, Krok objętości prania = 250 μL, Kierunek wymywania = Wyjście). Powtórz krok prania jeszcze raz.
  8. Powtórz kroki płukania pompy (kroki 6.6–6.7) wodą klasy do hodowli komórkowych i pożywką do hodowli śródbłonka ludzkiego.
  9. Kontynuuj etap mycia kolektora.
  10. Ręcznie otwórz zawór między strzykawką a kolektorem, umieszczając adapter 3-drożny we właściwej pozycji (wskaźnik OFF jest przekręcony w lewo).
  11. Wybierz Set Current Channel/Open step w folderze Washout/Manifold Wash i kliknij Uruchom krok testu, aby otworzyć wszystkie zawory kolektora.
  12. Umyj kolektor ręcznie, wypychając 5 ml 80% etanolu ze strzykawki, a następnie 5 ml wody klasy do hodowli komórkowych.
  13. Umyć kolektor, wypychając ze strzykawki 5 ml pożywki hodowlanej Human Endothelial-SFM.
  14. Usuń wszystkie duże pęcherzyki powietrza, które są uwięzione w kolektorze. W tym celu należy umieścić 8-dołkowy adapter szpilkowy w 10-centymetrowej szalce Petriego z pożywką i wykonuj pchanie/ciągnięcie strzykawką, aż wszystkie duże pęcherzyki powietrza znikną (małe pęcherzyki nie stanowią problemu).
  15. Wybierz Set Current Channel/Close step (Ustaw krok Current Channel/Close) w folderze Washout/Manifold Wash (Mycie kolektora) i kliknij przycisk Run Assay Step (Uruchom krok testu), aby zamknąć wszystkie zawory kolektora.
  16. Podłącz zielony wylotowy od pompy do adaptera kolektora.
  17. Przestaw zawór 3-drogowy z powrotem do pozycji OFF, aby zamknąć strzykawkę.
  18. Wybierz folder Washout/Cable Washout i kliknij Uruchom krok testowania, aby umyć każdy port pożywką RPMI indywidualnie, upewniając się, że wszystkie pęcherzyki zostały usunięte z każdego (objętość dozowania = 100 μl).
    nuta: Każdy zawór kolektora jest otwierany jeden po drugim, od 1 do 8, a 100 μl medium jest dozowane przez każdy pojedynczy kanał, pozostawiając pozostałe kanały zamknięte. Upewnij się, że płyn spływa z każdego kołka. Jeśli nie wypływa płyn, oznacza to pęcherzyk powietrza lub zatkanie.

7. Przygotowanie chipa mikroprzepływowego do obrazowania na żywo

  1. Upewnij się, że zestawy mikroprzepływowe są gotowe, a komora obrazowania na żywo jest wstępnie zrównoważona do 37 °C, a poziom CO2 osiąga 5% (Rysunek 3A, B).
  2. Wyjmij biochip z inkubatora i umieść go w uchwycie na chip mikroskopu. Zamontuj uchwyt chipa na stoliku do obrazowania mikroskopu (Rysunek 3C).
  3. W celu podłączenia biochipa do pompy za pośrednictwem kolektora, należy umieścić adapter 8-pinowy w pobliżu zbiorników wylotowych chipa i pogłębić wszystkie piny w medium (ale nie podłączać całkowicie).
  4. Wybierz punkt menu Washout | Połącz się z folderem Chip i kliknij Uruchom krok testu, aby dozować pożywkę RPMI przed podłączeniem chipa (objętość dozowania = 30 ml). Po dozowaniu pożywki włóż 8-pinowy adapter do gniazda biochipa.
    nuta: Na tym etapie wszystkie kanały są ustawiane w pozycji Włączone (otwarte) i przez każdy kanał dozowane jest 30 μl pożywki, a następnie kanały są ustawiane w pozycji Wyłączone (zamknięte). Gwarantuje to, że żadne pęcherzyki powietrza nie zostaną wprowadzone do kanałów chipa mikroprzepływowego.
  5. Ręcznie odessać pożywkę ze wszystkich zbiorników wlotowych biochipa za pomocą pipety.
  6. Wybierz punkt menu Washout | Chip Washout folder i kliknij Uruchom krok testu, aby przepuścić 40 μl pożywki EC-SFM FULL przez każdy z kanałów jeden po drugim, aby pozbyć się martwych komórek/zanieczyszczeń z kanału (objętość wymywania = 40 μl, maksymalne ścinanie wymywania = 40 dyn/ cm 2).

8. Test przyczepności przepływowej i akwizycja obrazu

  1. Ręcznie zassać pożywkę ze zbiornika wlotowego kanału będącego przedmiotem zainteresowania za pomocą pipety.
  2. Dodać 100 μl leukocytów z kroku 5.6 do zbiornika wlotowego kanału będącego przedmiotem zainteresowania.
    nuta: Delikatnie wymieszaj komórki, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
  3. w teście komórkowym | Opis kroku, wybierz opcję Ustaw bieżący kanał/Opis kroku i na liście kanałów wybierz tylko bieżący kanał, który Cię interesuje, ustaw na Włączony (otwarty), a wszystkie pozostałe siedem kanałów ustaw na Wyłączone (zamknięte).
  4. Wybierz test komórkowy | Krok Opis folderu i kliknij Uruchom test Step.
    nuta: Upewnij się, że dozowanie o zmiennym natężeniu przepływu stosuje stałe podciśnienie, aby wyciągnąć zawiesinę leukocytów ze zbiornika wlotowego przez kanał przez 5 minut (zestaw ścinania = stały, naprężenie ścinające = -0,5 dyn / cm2, czas trwania = 00:05:00, opóźnienie skanowania = 00:00:00). Ujemna wartość naprężenia ścinającego zapewnia prawidłowy kierunek przepływu.
  5. Odessać pozostałe leukocyty ze zbiornika wlotowego.
  6. Dodać 100 μl kompletnego podłoża RPMI do zbiornika wlotowego. Wybierz folder Cell Assay/Step description i kliknij Run Assay Step, aby perfuzjować kanał przez 5 minut pożywką RPMI w celu wypłukania wszystkich nieprzylegających leukocytów (zestaw ścinania = stały, naprężenie ścinające = -0,5 dyn/cm2, czas trwania = 00:05:00, opóźnienie skanowania = 00:00:00).
  7. Uzyskaj obrazy z co najmniej trzech do czterech różnych pozycji kanału, aby zobrazować przylegające leukocyty (aby upewnić się, że uchwycone są reprezentatywne obszary).
  8. Powtórz kroki 8.1–8.7, aby ocenić działanie wszystkich pozostałych kanałów.
    UWAGA: Możliwe jest uruchomienie wielu kanałów jednocześnie. Aby to zrobić, otwórz wszystkie interesujące Cię kanały w kroku 8.3. i wykonaj wszystkie wyżej wymienione kroki 8.4–8.7 dla wielu kanałów zainteresowania.

9. Zakończenie testu i czyszczenie pompy mikroprzepływowej

  1. Po zakończeniu eksperymentu wyeksportuj i zapisz wszystkie obrazy w formacie RAW.
  2. Zapisując wyniki, uruchom pompę mikroprzepływową i protokół czyszczenia kolektora.
  3. W przypadku pompy mikroprzepływowej należy najpierw uruchomić folder Washout/Pump Washout, przetapiając 4 ml wody klasy do hodowli komórkowych, a następnie 4 ml 80% etanolu, jak opisano w krokach 6.6–6.7 Osusz pompę, przepuszczając powietrze przez kilka minut.
  4. W celu wyczyszczenia kolektora należy uruchomić etap Mycie/Mycie Kolektora za pomocą strzykawki. Postępuj zgodnie z instrukcjami, aby otworzyć strzykawkę i zawory kolektora, jak opisano w krokach 6.10–6.11: Najpierw umyj 80% etanolem, a następnie wodą klasy do hodowli komórkowych. Osuszyć kolektor, przepychając powietrze przez strzykawkę. Zamknąć zawór strzykawkowy i zawory kolektora zgodnie z opisem w krokach 6.10 i 6.15.

10. Liczenie przylegających leukocytów

  1. Pobierz i zainstaluj oprogramowanie do przetwarzania obrazów14 z http://cellprofiler.org.
    nuta: Przetwarzanie obrazu w tym badaniu przeprowadzono przy użyciu oprogramowania w wersji 2.1.1. W przypadku korzystania z nowszej wersji potok może wymagać niewielkiej adaptacji.
  2. Pobierz potok Count_leukocytes.cpipe. Kliknij pozycję Plik | Import | Potok z pliku i przejdź na komputerze, aby wybrać potok Count_leukocytes.cpipe.
  3. Przeciągnij i upuść folder z uzyskanymi obrazami RAW przylegających leukocytów do okna Lista plików w Modułach wejściowych | Sekcja obrazów do analizy.
  4. Określ typowy rozmiar leukocytów za pomocą modułów analizy | IdentifyPrimaryObjects. Określ minimalną i maksymalną średnicę przylegających leukocytów w pikselach.
  5. Wybierz kryteria filtrowania za pomocą punktu menu Moduły zestawienia | FilterObjects. Określ minimalnie akceptowany obszar obiektów w pikselach.
  6. Rozpocznij analizę, naciskając przycisk Analizuj obrazy.
    nuta: Wszystkie obrazy RAW zostaną przetworzone, a wyniki zostaną zapisane w domyślnym folderze wyjściowym. Plik wyjściowy Image.txt zawiera liczbę przylegających leukocytów w każdym przetwarzanym obrazie (każda liczba odpowiada jednemu obrazowi, tj. każdemu uzyskanemu polu widzenia).

Wyniki

W pierwszej kolejności należy zbadać odpowiedź hiPSC-ECs na stymulację prozapalnym czynnikiem TNFα, zgodnie z wcześniejszym opisem7. Leczenie TNFα przez 12 h wywołuje nadekspresję E-selectiny, z osiągnięciem szczytu w 6 h po rozpoczęciu terapii. Dodatkowo, ICAM-1 ulega nadekspresji w 6 – 12 h po podaniu preparatu. Chociaż nie zaobserwowano oczekiwanej nadekspresji VCAM-1, jest ona zazwyczaj widoczna w pierwotnych ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej (HUVECs). Stwierdzono, że nocna (12 h) inkubacja z TNFα jest najwygodniejsza dla testu adhezji leukocytów.

Optymalna dysocjacja hiPSC-EC powinna skutkować uzyskaniem zawiesiny pojedynczych komórek wolnej od skupisk komórkowych. Rysunek 2C przedstawia optymalną gęstość hiPSC-EC bezpośrednio po wstrzyknięciu. Zazwyczaj 15 min po wstrzyknięciu hiPSC-EC przylegają do dna kanału i zaczynają się rozpływać (Rysunek 2D). Po 1 h od wstrzyknięcia hiPSC-EC tworzą dobrze rozpłyniętą monowarstwę wzdłuż kanału i będą gotowe do rozpoczęcia testu przepływowego (Rysunek 2E).

Znakowanie leukocytów fluorescencyjnym znacznikiem jest korzystne dla obrazowania w kontraście fazowym podczas zautomatyzowanej kwantyfikacji obrazów, ponieważ ułatwia etap identyfikacji komórek, szczególnie że leukocyty przylegają do monowarstwy EC i oprogramowaniu często trudno jest rozróżnić poszczególne typy komórek.

Bezpłatne otwartoźródłowe oprogramowanie do przetwarzania obrazów jest bardzo przydatne do zautomatyzowanej kwantyfikacji adherentnych leukocytów. Procedura opisana w niniejszym protokole opiera się na pierwotnej identyfikacji obiektów z wykorzystaniem adaptacyjnego progowania obrazów fluorescencyjnych leukocytów (Rysunek 4A). Filtrowanie zidentyfikowanych obiektów na podstawie minimalnej powierzchni pozwala dodatkowo usunąć błędnie zidentyfikowane elementy, takie jak debris komórkowy, autofluorescencja lub jakikolwiek inny nieswoisty sygnał fluorescencyjny (Rysunek 4C, D).

Jeden chip mikroprzepływowy z ośmioma równoległymi kanałami umożliwia porównanie dwóch niezależnych grup, na przykład komórek śródbłonka (EC) zróżnicowanych z niezależnych hiPSC, takich jak od zdrowych dawców lub pacjentów z zaburzeniami genetycznymi. Można również uwzględnić dodatkowe kontrole, takie jak nieleczone EC lub wstępna obróbka przeciwciałem blokującym ICAM-110,1. Jednorazowo można przetwarzać od dwóch do trzech chipów mikroprzepływowych. Dla zapewnienia wiarygodności wniosków zaleca się przeprowadzenie minimum trzech niezależnych eksperymentów biologicznych w różne dni.

Schemat przygotowania hiPSC-EC; stymulacja komórek, przemycia enzymatyczne, etapy wirowania, inkubacja w chipie.
Rysunek 1Przygotowanie hiPSC-EC i leukocytów do analizy przepływowej. (A) Obróbka wstępna hiPSC-EC bodźcem prozapalnym (TNFα). (BSchematyczne przedstawienie enzymatycznej dysocjacji, wirowania i resuspensji hiPSC-ECs.C) Schematyczna reprezentacja powlekania kanałów (C, lewo), wstrzykiwania zawiesiny hiPSC-EC (C, środek) oraz dodawania pożywki do hodowli komórkowej po adhezji hiPSC-EC w chipie mikroprzepływowym. (D) Schematyczny przebieg etapu płukania leukocytów, znakowania barwnikiem fluorescencyjnym DiOC6 oraz resuspensji. Aby wyświetlić większą wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Konfiguracja komory do hodowli komórkowej z urządzeniem mikrofluidycznym oraz obrazy mikroskopowe przedstawiające etapy wzrostu komórek.
Rycina 2Chip mikrofluidyczny z hiPSC-EC. (A) Chip mikroprzepływowy w 10-centymetrowej płytce Petriego. (B) Komora nawilżana używana do inkubacji. (C, D, E) Reprezentatywne obrazy hiPSC-ECs w kanale mikroprzepływowym w 0 min (C), 15 min (D), 1 h (E) po iniekcji. Pasek skali = 200 µm. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Układ mikroskopii perfuzyjnej leukocytów; komora przepływowa, obrazowanie w kontraście fazowym, analiza fluorescencyjna.
Rycina 3Układ doświadczalny obrazowania żywych komórek oraz testu perfuzji leukocytów. (A, B) Zdjęcie (A) i schematyczne przedstawienie (B) układu eksperymentalnego do obrazowania żywych komórek i analizy przepływowej: (1) - odwrócony mikroskop fluorescencyjny z zamontowaną komorą do obrazowania żywych komórek (5% CO2, 37 °C, nawilżone), (2) – pompa mikroprzepływowa, (3) – kolektor 8-kanałowy, (4) – komputer do sterowania mikroskopem i akwizycji obrazu, (5) – komputer do sterowania pompą mikroprzepływową. (C) Chip mikrofluidyczny z włożonymi przewodami 8-kanałowego rozdzielacza, zamocowany w uchwycie na płytki i umieszczony na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu. (D) Schematyczne przedstawienie głównych etapów analizy przepływowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza segmentacji komórek; konfiguracja interfejsu oprogramowania i wyniki filtrowania danych; dostosowanie rozmiaru obiektów.
Rycina 4Analiza obrazu i zautomatyzowana detekcja leukocytów adherentnych. (A) Okno dialogowe oprogramowania do przetwarzania obrazów z określonymi ustawieniami służącymi do identyfikacji leukocytów. (B) Okno dialogowe oprogramowania do przetwarzania obrazów z określonymi kryteriami filtrowania zidentyfikowanych obiektów na podstawie minimalnie akceptowalnej powierzchni (SAmin = 70 px). (C) Przykład poprawnej identyfikacji leukocytów i filtrowania obiektów niespecyficznych o małej powierzchni (SA) (typowy średnica w pikselach (Min, Max) = (9, 15); kryteria filtrowania SA)min = 70 px). Obiekty zaakceptowane są przedstawione w kolorze zielonym, a obiekty odrzucone w kolorze fioletowym. (D) Przykład błędnej identyfikacji leukocytów ze względu na nieprawidłowy zakres typowej średnicy (Typowa średnica w pikselach (Min, Max) = (3, 15); Kryteria filtrowania SAmin = 70 px). Obiekty zaakceptowane są przedstawione w kolorze zielonym, a obiekty odrzucone w kolorze fioletowym. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Protokół ten opisuje charakterystykę leczenia hiPSC-EC bodźcami prozapalnymi, takimi jak TNFα, funkcjonalną ocenę adhezji leukocytów do hiPSC-EC w teście przepływowym z wykorzystaniem obrazowania na żywo i automatycznego zliczania przylegających leukocytów.

Nocna stymulacja hiPSC-EC za pomocą TNFα powoduje wydłużony wygląd, który zazwyczaj wskazuje na aktywowany fenotyp prozapalny w EC. Na etapie optymalizacji poziomy ekspresji E-selektyny, ICAM-1, VCAM-1 powinny być weryfikowane za pomocą FAC 7,8, a pierwotne EC ludzkiej żyły pępowinowej (HUVEC) zaleca się włączenie jako kontroli dodatniej.

Należy osiągnąć optymalną dysocjację hiPSC-EC i gęstość wysiewu, aby uzyskać zlewającą się monowarstwę bez tworzenia grudek komórkowych i zatorów kanałów. Bardzo ważne jest, aby ponownie zawiesić leukocyty tuż przed perfuzją, aby uniknąć wytrącania się komórek i utrzymać stałe stężenie podczas oznaczania każdego kanału. Można użyć ludzkich leukocytów krwi obwodowej, takich jak monocyty i neutrofile, lub jako alternatywę można zastosować ustalone monocytowe linie komórkowe, takie jak THP-1 lub HL-60.

Podczas montażu zestawu mikroprzepływowego i podczas testu przepływu bardzo ważne jest, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza w rurkach i kanałach mikroprzepływowych, ponieważ mogą one spowodować oderwanie się hiPSC-EC i/lub przylegających leukocytów. Interfejs płyn-ciecz lub włączenie dodatkowych etapów mycia podczas przygotowywania zestawu mikroprzepływowego może pomóc w zapobieganiu powstawaniu pęcherzyków powietrza.

Wskazane jest, aby protokół był uruchamiany przez dwóch operatorów, z których jeden przygotowuje komórki, a drugi przygotowuje system mikroprzepływowy i test przepływu. Gwarantuje to, że EC są powlekane w mikroprzepływowych chipach w stałym oknie czasowym przed przetwarzaniem oraz poprawia dokładność i odtwarzalność wyników. Ponadto umożliwia to również ustawienie ślepych eksperymentów, aby uniknąć stronniczości wyników.

Aby skutecznie wykrywać komórki za pomocą zautomatyzowanego potoku przetwarzania obrazu, ważne jest, aby uzyskiwać obrazy w ostrości z wysokim stosunkiem sygnału do szumu i unikać autofluorescencji niespecyficznych obiektów, takich jak grudki komórek. Kluczowe znaczenie ma prawidłowe określenie minimalnych i maksymalnych granic typowej wielkości przylegających leukocytów, które należy zidentyfikować. Typową wielkość leukocytów można oszacować za pomocą narzędzia do pomiaru linii w ImageJ. Na przykład w naszej analizie użyliśmy zakresu 9–15 pikseli, co odpowiada fizycznemu rozmiarowi 10,3–17,1 μm (rysunek 4C). W przypadku użycia niewłaściwego zakresu, np. 3–15 pikseli (3,4–17,1 μm), pojedynczy leukocyt jest identyfikowany nie jako jedna komórka, ale raczej jego podczęści są identyfikowane jako oddzielne obiekty (ryc. 4D). Prowadzi to do fałszywej liczby obiektów, które należy zidentyfikować.

Wiele obiektów o niskiej intensywności i mniejszej powierzchni niż leukocyty można wykryć za pomocą dostarczonej metody progowania adaptacyjnego. Może się to zdarzyć z powodu autofluorescencji lub innych niespecyficznych sygnałów fluorescencyjnych. Niemniej jednak te niespecyficzne obiekty, jeśli ich obszar jest mniejszy niż typowy obszar pojedynczego leukocytu, można filtrować, definiując minimalnie akceptowaną powierzchnię (Figura 4C).

Opisany tutaj test przepływu pozwala na bezpośrednią ocenę adhezji leukocytów do monowarstwy EC, wyjaśniając interakcję tych dwóch typów komórek, ale nie uwzględnia innych typów komórek, takich jak perycyty, które są obecne w ścianie naczyniowej i mogą również uczestniczyć w regulacji wynaczynienia leukocytów15. Zintegrowanie mikrośrodowiska hodowli 3D z innymi typami komórek może poprawić fizjologiczne znaczenie systemu. Pomimo tych ograniczeń, opisany tutaj test przepływu do oceny reakcji zapalnych stanowi cenne narzędzie do podstawowej charakterystyki i zastosowań modelowania choroby hiPSC-EC.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy pragną podziękować następującym grantom: Europejska Rada ds. Badań Naukowych (ERCAdG 323182 STEMCARDIOVASC); Netherlands Organ-on-Chip Initiative, projekt NWO Gravitation finansowany przez Ministerstwo Edukacji, Kultury i Nauki rządu Holandii (024.003.001).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Vena8 Endothelial+ biochipCellix LtdV8EP-800-120-02P10
Mirus Evo NanopumpCellix LtdMIRUS-EVO-PUMP1 x pompa strzykawkowa;
1 x oprogramowanie do testów VenaFluxAssay;
1 x zestaw przewodów; Zasilacz i
.
8-kanałowa płyta wielokanałowa MultiFlow8Cellix LtdMIRUS-MULTIFLOW8
Skrzynka nawilżanaCellix LtdHUMID-BOX
System obrazowania fluorescencyjnego Leica AF6000Leica Microsystems
HamamatsuC9100
Szafa bezpieczeństwa biologicznego/okap z przepływem laminarnymCleanair
CO2 inkubator kultur komórkowychPanasonicMCO-170AICUV
WirówkaHitachihimac-CT6EL
Ręczny pipetownik (P-10 (10 mL), P-200 (200 µ L), P-1000 (1,000 &mikro; L)Gilson międzynarodowy4807 (10&mikro; L), 4810 (200&mikro; L), 4809 (1000&mikro; l)
Sterylna pipeta plastikowaGreiner Bio-One606180 (5 ml), 607180 (10 ml)
szalka PetriegoVWR/ Duran Group391-0860
Kolby hodowlane (75 cm2)CELLSTAR658,170
Probówka wirówkowa (15 mL)CELLSTAR188271
Nazwa FirmaNumer katalogowyUwagi
Żelatyna ze skóry wieprzowej, typ ASigma-AldrichG1890
Fibronektyna (osocze bydlęce)Sigma-AldrichF1141
DPBS, bez wapnia, bez magnezuLife Technologies14190-169
Ludzki śródbłonek-SFMŻycie Technologie11111-044
Ludzki VEGF 165 IS, klasa premiumMiltenyi Biotec130-109-386
Ludzki FGF-2, premium klasaMiltenyi Biotec130-093-842
Surowica uboga w płytki krwi, bydlęcaTechnologie biomedyczneBT-214
Rekombinowany ludzki TNF-αTebu-bio300-01A-A
TrypLE SelectLife Technologies12563029
DiOC6(3)Sigma-Aldrich318426
RPMI 1640Medium Life Technologies21875-034
2-merkaptoetanol (50 mM)Life Technologies31350010
FBSLife Technologies10270-106
L-glutaminaLife Technologies25030-024
Penicylina-Streptomycyna (5,000 U/mL)Life Technologies15070-063
Woda destylowanaLife Technologies15230-089
Absolut etanoluMerck1.00983.2500
VCAM-1R& Systemy DFAB5649P
E-SelectinR& Systemy DBBA21
ICAM-1R& D systemsBBA20
NazwaCompanyWersja oprogramowaniaKomentarze
CellrofilerCellProfiler2.1.1
VenaFluxAssay SoftwareCellix Ltd2.3.a
Aparat fotograficzny ze sprzężeniem ładunku zwielokrotniającego elektrony

Bibliografia

  1. Vestweber, D. How leukocytes cross the vascular endothelium. Nature Reviews Immunology. 15 (11), 692-704 (2015).
  2. Hajishengallis, G., Chavakis, T. Endogenous modulators of inflammatory cell recruitment. Trends in Immunology. 34 (1), 1-6 (2013).
  3. Molema, G. Heterogeneity in endothelial responsiveness to cytokines, molecular causes, and pharmacological consequences. Seminars in thrombosis and hemostasis. 36 (3), 246-264 (2010).
  4. Aird, W. C. Endothelial Cell Heterogeneity. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (1), a006429(2012).
  5. Shi, Y., Inoue, H., Wu, J. C., Yamanaka, S. Induced pluripotent stem cell technology: a decade of progress. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (2), 1-16 (2016).
  6. Lin, Y., Gil, C. H., Yoder, M. C. Differentiation, Evaluation, and Application of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endothelial Cells. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (11), 2014-2025 (2017).
  7. Halaidych, O. V., Freund, C., et al. Inflammatory Responses and Barrier Function of Endothelial Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. , (2018).
  8. Orlova, V. V., vanden Hil, F. E., Petrus-Reurer, S., Drabsch, Y., ten Dijke, P., Mummery, C. L. Generation, expansion and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  9. Orlova, V. V., Drabsch, Y., et al. Functionality of endothelial cells and pericytes from human pluripotent stem cells demonstrated in cultured vascular plexus and zebrafish xenografts. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (1), 177-186 (2014).
  10. Shetty, S., Weston, C. J., Adams, D. H., Lalor, P. F. A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress. Journal of Visualized Experiments. (85), 1-6 (2014).
  11. Muller, W. A., Luscinskas, F. W. Assays of transendothelial migration in vitro. Methods in enzymology. 443, 155-176 (2008).
  12. Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), 1-5 (2012).
  13. Vajen, T., Heinzmann, A. C. A., et al. Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets. Journal of Visualized Experiments. (134), (2018).
  14. Carpenter, A. E., Jones, T. R., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100(2006).
  15. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte Migration into Inflamed Tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

kom rki r db onka pochodz ce z hiPSCcytometria przep yewowaizolacja kom rekpowlekanie fibronektynobrazowanie ywych kom rekanaliza w programie CellProfilercytokiny prozapalnemonowarstwa kom rek r db onka
Test mikroprzepływowy do oceny adhezji leukocytów do indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych (hiPSC-EC)
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.