Podczas infekcji, Listeria monocytogenes jest zdolna do przekraczania bariery krew-mózg w celu kolonizacji mózgu. W tym protokole pokazujemy, jak ocenić kolonizację bakteryjną narządów po zakażeniu myszy. Przewidziana jest procedura wykonywania perfuzji całego narządu w celu specyficznego określenia liczby bakterii w miąższu mózgu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes) Zakażenie mózgu
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Listeria monocytogenes to wewnątrzkomórkowy patogen bakteryjny, który często kojarzy się z infekcją przenoszoną przez żywność. Zdolność L. monocytogenes do przekraczania bariery krew-mózg (BBB) jest niepokojąca, ponieważ może prowadzić do zagrażającego życiu zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i mózgu. Bariera krew-mózg chroni mikrośrodowisko mózgu przed różnymi toksycznymi metabolitami i patogenami drobnoustrojowymi znajdującymi się we krwi po zakażeniu, a tym samym wspiera homeostazę mózgu. Mechanizmy, za pomocą których L. monocytogenes obecne w krwiobiegu przekraczają barierę krew-mózg, powodując infekcje mózgu, nie są w pełni poznane, brakuje również solidnego systemu modelowego do badania zakażeń mózgu przez L. monocytogenes. W tym miejscu przedstawiamy prosty model infekcji myszy, aby określić, czy bakterie przekroczyły barierę krew-mózg i określić ilościowo obciążenie bakteriami, które skolonizowały mózg in vivo. W tej metodzie zwierzęta zostały zakażone dożylnie L. monocytogenes i zostały humanitarnie poddane eutanazji poprzez narażenie na CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy. Perfuzję serca u zwierząt wykonano przed pobraniem zakażonych narządów. Krew pobrano przed perfuzją, a liczbę bakterii na narząd lub ml krwi określono poprzez rozcieńczenie homogenatów krwi lub narządów na płytkach agarowych i zliczenie liczby utworzonych kolonii. Metoda ta może być wykorzystana do badania nowych interakcji receptor-ligand, które nasilają zakażenie mózgu przez L. monocytogenes i może być łatwo zaadaptowana do badania wielu patogenów bakteryjnych.
Wprowadzenie
Gram-dodatnia bakteria Listeria monocytogenes jest fakultatywnym patogenem wewnątrzkomórkowym i jednym z najbardziej śmiertelnych patogenów przenoszonych przez żywność na świecie. Spożycie skażonej żywności L. monocytogenes może prowadzić do listeriozy u ludzi, ciężkiej choroby inwazyjnej atakującej głównie kobiety w ciąży, noworodki, osoby starsze i osoby z obniżoną odpornością1. L. monocytogenes jest jedną z głównych przyczyn zgonów z powodu patogenów przenoszonych przez żywność w USA, a wskaźniki śmiertelności z powodu listeriozy wynoszą aż 20-30%, co jest najwyższym wynikiem dla wszystkich patogenów przenoszonych ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie zwierzęta muszą być utrzymywane i traktowane z maksymalną ostrożnością, aby zminimalizować dyskomfort podczas procedury. Procedura musi być przeprowadzona zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania oraz wszystkimi przepisami federalnymi, stanowymi i lokalnymi. Należy również pamiętać, że eksperymenty laboratoryjne należy przeprowadzać zgodnie z wytycznymi dotyczącymi poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.
1. Wzrost L. monocytogenes w badaniach nad infekcjami myszy
- Umieścić w autoklawie 500 ml pożywki agarowej do naparu z mózgu i serca (BHI) w kolbie Erlenmeyera o....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Mózg jest silnie unaczyniony, a L. monocytogenes wykazuje zdolność do zakażania typów komórek obecnych we krwi3,13. Opisany protokół służy do wykazania zdolności L. monocytogenes do przekraczania bariery krew-mózg (BBB), co prowadzi do zakażenia mózgu u myszy. Aby ustalić, czy bakterie przekroczyły BBB in vivo, przed oznaczeniem miana bakterii w mózgu przeprowadza się perfuzję krwi u myszy. W przeciwnym .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
L. monocytogenes jest w stanie powodować zagrażające życiu zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych u ludzi. Wcześniejsze badania wykazały zdolność bakterii do przekraczania bariery krew-mózg (BBB) i kolonizacji mózgu. Zaproponowano trzy drogi inwazji mózgu podczas infekcji: bezpośrednią penetrację bariery krew-mózg przez bakterie, dyskretny transport przez bakterie zawarte w komórkach jednojądrzastych3 oraz migrację aksonów przez szczepy L. monocytogenes , które powodują rombencefalit.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez grant U.S. Public Health Service AI103806 z National Institutes of Health.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pożywka infuzyjna Brain Heart Becton | Dickinson | 237200 | |
| Siarczan streptomycyny | Amresco | 0382-50G | |
| Szalki Petriego | VWR | 25384-342 | |
| Glicerol | VWR | 97062-832 | |
| IKA T18 ULTRA-TURRAX Podstawowy homogenizator | IKA | 3352109 | Model: Spektrofotometr T18BS1 |
| Beckman Coulter | DU 800 seria | ||
| BALB/c myszy | Jackson Laboratory | Model #000651 | |
| Strzykawki 1 ml | Becton Dickinson | 309659 | |
| Igły 26 G | Becton Dickinson | 305115 | |
| 21 G Igły motylkowe | Becton Dickinson | 367281 | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy | Sigma-Aldrich | 60004 | |
| Probówki stożkowe 15 ml | VWR | 21008-918 | |
| Probówki okrągłodenne | VWR | 60819-546 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Corning | 46-013-CM | |
| Szpatułka ze stali nierdzewnej | VWR | 82027-520 | |
| Nożyczki ze stali nierdzewnej (6,5 cala) | VWR | 82027-592 | |
| Nożyczki ze stali nierdzewnej (4,5 cala) | VWR | 82027-578 | |
| Kleszczyki ze stali nierdzewnej (4,5 cala) | VWR | 82027-440 | |
| Kleszczyki z cienką końcówką ze stali nierdzewnej (6 cali) | VWR | 82027-406 |
Bibliografia
- Radoshevich, L., Cossart, P. Listeria monocytogenes: towards a complete picture of its physiology and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology. 16 (1), 32-46 (2018).
- de Noordhout, C. M., et al. The global burden of....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
