Listeria monocytogenes (Listeria monocytogenes) Zakażenie mózgu

Gram-dodatnia bakteria Listeria monocytogenes jest fakultatywnym patogenem wewnątrzkomórkowym i jednym z najbardziej śmiertelnych patogenów przenoszonych przez żywność na świecie. Spożycie skażonej żywności L. monocytogenes może prowadzić do listeriozy u ludzi, ciężkiej choroby inwazyjnej atakującej głównie kobiety w ciąży, noworodki, osoby starsze i osoby z obniżoną odpornością¹. L. monocytogenes jest jedną z głównych przyczyn zgonów z powodu patogenów przenoszonych przez żywność w USA, a wskaźniki śmiertelności z powodu listeriozy wynoszą aż 20-30%, co jest najwyższym wynikiem dla wszystkich patogenów przenoszonych przez żywność². Obecnie nie istnieje szczepionka przeciwko L. monocytogenes, a zdolność bakterii do skutecznego rozprzestrzeniania się na dystalne narządy i mózg poprzez przekraczanie bariery krew-mózg (BBB) może prowadzić do zagrażającego życiu zapalenia opon mózgowych i kolonizacji mózgu^3,4,5,6. Bakteryjne zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych jest zazwyczaj ciężkie; Podczas gdy większość osób otrzymujących leczenie wraca do zdrowia, infekcje mogą powodować poważne powikłania, np. uszkodzenie mózgu, utratę słuchu lub trudności w uczeniu się u dzieci. Przewiduje się, że L. monocytogenes odpowiada za co najmniej 10% wszystkich nabytych w społeczności zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych w USA.⁷.

Główną drogą rozprzestrzeniania się bakterii do mózgu i opon mózgowych jest krwiobieg. Bakterie krążące w naczyniach krwionośnych w mózgu są w stanie przekroczyć barierę krew-mózg, powodując infekcję mózgu. Bariera krew-mózg to silnie unaczyniony system barierowy, który chroni mózg przed obcymi cząsteczkami krążącymi we krwi. Komórki śródbłonka stanowią warstwę, która wyściela wewnętrzną powierzchnię naczyń krwionośnych^8,9. Oprócz L. monocytogenes, wiele patogenów bakteryjnych, takich jak Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli i Haemophilus influenzae typu b (Hib) jest zdolnych do kolonizacji mózgu poprzez krzyżowanie BBB^3,4,5,6. Jednak podczas badania obciążeń bakteryjnych w mózgu zakażonych myszy ważne jest ustalenie, czy bakterie przekroczyły barierę krew-mózg, w przeciwnym razie obciążenie bakteryjne w mózgu może reprezentować bakterie, które nadal znajdują się w naczyniach krwionośnych mózgu. W związku z tym konieczne jest perfuzja myszy z całej krwi przed określeniem jednostek tworzących kolonie (CFU) homogenatów mózgu.

W tym badaniu opisujemy metody in vivo do badania infekcji mózgu L. monocytogenes. Do opisanych tutaj metod użyliśmy L. monocytogenes szczep 10403S. L. monocytogenes 10403S jest jednym z najczęściej stosowanych szczepów laboratoryjnych do badania listeriozy układowej w mysim modelu infekcji¹⁰. Protokół ten opiera się na standardowym dożylnym wstrzyknięciu L. monocytogenes, a następnie perfuzji myszy. Schematyczny zarys protokołu infekcji u myszy pokazano na rysunku 1. Pobrano mózgi i inne narządy zakażone L. monocytogenes od myszy nieperfundowanych lub perfundowanych i określono obciążenie narządami bakteryjnymi. Metody te są przydatne nie tylko do określenia całkowitej kolonizacji bakteryjnej mózgu u zakażonych zwierząt, ale są również korzystne dla określenia, czy bakterie przeniknęły do BBB in vivo, aby pośredniczyć w inwazji mózgu. Należy podkreślić, że ten protokół laboratoryjny powinien zostać przeprowadzony po konsultacji z odpowiednim instytucjonalnym komitetem ds. bezpieczeństwa biologicznego i kierownictwem obiektu dla zwierząt.

Wszystkie zwierzęta muszą być utrzymywane i traktowane z maksymalną ostrożnością, aby zminimalizować dyskomfort podczas procedury. Procedura musi być przeprowadzona zgodnie z Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Użytkowania oraz wszystkimi przepisami federalnymi, stanowymi i lokalnymi. Należy również pamiętać, że eksperymenty laboratoryjne należy przeprowadzać zgodnie z wytycznymi dotyczącymi poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2.

1. Wzrost L. monocytogenes w badaniach nad infekcjami myszy

1. Umieścić w autoklawie 500 ml pożywki agarowej do naparu z mózgu i serca (BHI) w kolbie Erlenmeyera o pojemności 1 l, aby przygotować płytki z pożywką stałą. Pozostawić podłoże do ostygnięcia w łaźni wodnej o temperaturze 56 °C, a następnie dodać streptomycynę w końcowym stężeniu 100 μg/ml.
   1. Wlać 25 ml podłoża/szalki Petriego do szalek Petriego. Pozostawić płytki do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (22 ^oC-25 °C). W razie potrzeby płytki można suszyć w temperaturze 37 °C aż do całkowitego wyschnięcia.
2. Używając sterylnej pętli inokulacyjnej i techniki aseptycznej, uzyskaj pętlę pełną zamrożonego szczepu L. monocytogenes 10403S^11,12 z kultury podstawowej zamrożonej w pożywce BHI plus 30% glicerolu i utrzymuj w zamrażarce -80 °C.
   1. Umieść L. monocytogenes na płytce z agarem BHI / streptomycyną w taki sposób, aby można było wyizolować pojedyncze kolonie bakterii. Umieścić płytki w inkubatorze o temperaturze 37 °C na noc (od 18 godzin do 24 godzin) w celu wyhodowania kolonii L. monocytogenes.
   2. Za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej pobrać pojedynczą kolonię L. monocytogenes z płytki agarowej BHI i zaszczepić kolonię w sterylnej probówce zawierającej 5 ml bulionu BHI zawierającego 100 μg/ml streptomycyny.
3. Inkubować probówkę hodowlaną L. monocytogenes lekko przechyloną pod kątem 30° przez noc w inkubatorze statycznym.
   1. Następnego dnia należy przeprowadzić oględziny pod kątem wzrostu kultury L. monocytogenes (pożywka BHI będzie mętna) i krótko przetrząsnąć, aby zapewnić równomierne zawieszenie hodowli.
   2. Usunąć w asepcie 1 ml podwielokrotność kultury bakteryjnej i zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD₆₀₀) za pomocą spektrofotometru.
      UWAGA: Sterylny bulion BHI jest używany jako ślepa próba do odczytu spektrofotometru przed pomiarem gęstości optycznej kultury L. monocytogenes. Kulturę L. monocytogenes można również rozcieńczyć (od dwóch do pięciu razy) w BHI przed odczytaniem gęstości optycznej.
   3. Oznaczyć liczbę jednostek tworzących kolonie L. monocytogenes (CFU) na ml kultury BHI, posiewając 10-krotne seryjne rozcieńczenia kultury. Jest to przydatne do ustalenia związku między gęstością optyczną kultury L. monocytogenes a liczbą bakterii na ml hodowli. Ogólnie rzecz biorąc, OD₆₀₀ wynoszące 1,0 dla kultury L. monocytogenes równa się około 1 x 10⁹ CFU bakterii na ml.

2. Przygotowanie L. monocytogenes do zakażenia myszy

1. Osiemnaście do dwudziestu czterech godzin przed zakażeniem zwierząt hodować kultury L. monocytogenes w bulionie BHI zawierającym 100 μg/ml streptomycyny i oznaczyć OD₆₀₀/~CFU na ml, jak wskazano w kroku 1.
   UWAGA: Myszy są zazwyczaj zamawiane na tydzień przed zakażeniem i są aklimatyzowane w obiekcie dla zwierząt przed przeprowadzeniem badań nad infekcją. W tym badaniu 6-8 tygodniowe samice myszy BALB/c (5 myszy na grupę) były trzymane w środowisku barierowym w obiekcie przechowawczym dla zwierząt na poziomie BSL2 Harvard Medical School i dostarczały im żywność i wodę ad libitum.
2. Określ ilość kultury L. monocytogenes wymaganą do zakażenia każdej myszy na podstawie ~CFU na ml kultury bakteryjnej. Rozcieńczyć kulturę L. monocytogenes w sterylnym, buforowanym fosforanami roztworze soli fizjologicznej o pH 7,2 (PBS) do odpowiedniego stężenia bakterii. Myszy są zwykle zakażane dożylnie 200 μl PBS zawierającego 1-2 × 10⁴ CFU bakterii / zwierzę.
3. Sprawdzić liczbę L. monocytogenes w inokulum, posiewając 10-krotne seryjne rozcieńczenia na płytkach agarowych BHI zawierających 100 μg/ml streptomycyny. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc w celu określenia liczby L. monocytogenes zaszczepionych na mysz w następujący sposób:
   Inokulum (CFU) = (liczba kolonii x współczynnik rozcieńczenia) / ml posiane x objętość (ml) wstrzyknięte

3. Zakażenie myszy L. monocytogenes poprzez dożylne wstrzyknięcie do żyły ogonowej

1. Zdejmij pokrywę i pojemniki na żywność z klatki zawierającej myszy i umieść klatkę pod lampą grzewczą na podczerwień o mocy 250 W na 5 minut.
   UWAGA: Ta metoda pozwala na rozszerzenie żył ogonowych, dzięki czemu wstrzyknięcia są łatwiejsze do wykonania.
   1. Ostrożnie umieść zwierzę w urządzeniu krępującym mysz o odpowiedniej wielkości, aby bezpiecznie przytrzymać zwierzę podczas wstrzykiwania żyły ogonowej.
2. Wymieszać inokulum L. monocytogenes (krok 2.2) i umieścić inokulum w strzykawce o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę o pojemności 26 G.
3. Zlokalizuj boczną żyłę ogonową myszy i oczyść miejsce wstrzyknięcia za pomocą wacika nasączonego alkoholem lub sprayu z 75% etanolem.
4. Delikatnie wstrzyknąć myszowi 200 μl zawiesiny L. monocytogenes do bocznej żyły ogonowej za pomocą strzykawki z igłą 26 G.
   1. Za pomocą bawełnianej gazy na krótko uciskać miejsce wstrzyknięcia, aby zatamować krwawienie, a następnie umieścić zwierzę w nowej klatce.
      UWAGA: Wykonaj ten proces dla wszystkich myszy, które mają zostać wstrzyknięte i oznacz klatkę odpowiednimi etykietami. Aby określić stężenie inokulum L. monocytogenes po wstrzyknięciu, powtórzyć krok 2.3, używając pozostałej ilości inokulum. Dożylna inokulum zakażenia L. monocytogenes na mysz jest podawana jako średnia CFU mierzona na podstawie próbek inokulum przed i po wstrzyknięciu.
5. Codziennie monitoruj zakażone zwierzęta i odnotowuj wszelkie widoczne oznaki choroby (np. potargana sierść, zgarbiona postawa, powolne ruchy, utrata masy ciała). Należy usunąć z badania zwierzęta, które wydają się być w znacznym stanie agonalnym przed 72 godzinami po zakażeniu (np. 24, 48 godzin po zakażeniu) i humanitarnie uśmiercić. Kontynuuj codzienne monitorowanie, aż wszystkie pozostałe zwierzęta zostaną uśmiercone po 72 godzinach od zakażenia.
   UWAGA: 50% dawka śmiertelna (LD₅₀) dla L. monocytogenes szczep 10403S u myszy BALB/c wynosi ~1–2 x 10⁴ CFU/zwierzę. Myszy zakażone dawkami LD₅₀ L. monocytogenes przy użyciu tego protokołu mogą wykazywać oznaki choroby, jak wskazano powyżej, a badacze mogą oczekiwać, że myszy zaczną ulegać infekcji po 72 godzinach od zakażenia.

4. Rozwarstwienie i perfuzja serca myszy zakażonych L. monocytogenes

1. Po 72 godzinach od zakażenia (lub we wcześniejszym pożądanym momencie) należy poddać zakażone myszy eutanazji przy użyciu protokołu zatwierdzonego przez instytucjonalną Komisję Etyki Zwierząt, takiego jak uduszenie CO₂ , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.
   UWAGA: Jeśli ma być wykonane pobranie krwi, należy zminimalizować rozerwanie naczyń krwionośnych podczas wykonywania zwichnięcia szyjki macicy.
   1. Potwierdź, że myszy zostały poddane eutanazji z powodu braku reakcji drgania łapy.
      UWAGA: Jeśli ma być wykonana perfuzja serca, należy skonfigurować automatyczną pompę/system perfuzyjny o natężeniu przepływu 4 ml objętości/min.
2. Umieść zwierzę na grzbiecie w misce sekcyjnej i nałóż 75% etanolu na powierzchnię sierści/skóry na brzuchu.
3. Za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie w ścianie brzucha i rozszerz nacięcie tuż poniżej klatki piersiowej.
4. Odsłoń przeponę i narządy trzewne.
   UWAGA: Uważaj, aby nie zranić żadnych narządów trzewnych.
5. Otwórz klatkę piersiową, przecinając przeponę i przeciąć klatkę piersiową obustronnie, aby odsłonić lewą komorę serca.
6. Za pomocą kleszczy delikatnie chwyć serce i włóż igłę motylkową 21 G podłączoną do systemu perfuzyjnego do lewej komory, a następnie ostrożnie przeciąć prawy przedsionek, aby zebrać krew (~0,2 ml) do probówki o pojemności 2 ml zawierającej 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), aby zapobiec krzepnięciu. Schemat ideowy perfuzji serca u myszy jest pokazany w Rysunek 2.
   UWAGA: Jeśli perfuzja nie ma być wykonana, krew może zostać pobrana przez nakłucie serca za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i szybko przeniesiona do probówki o pojemności 2 ml zawierającej 10 mM EDTA, aby zapobiec krzepnięciu. Narządy zakażone L. monocytogenes są następnie pobierane zgodnie z opisem (krok 5.1).
7. Rozpocznij perfuzję i perfuzję zwierzęcia przez 4 minuty z 15–20 ml PBS zawierającego 10 mM EDTA.
   UWAGA: Oceń perfuzję, obserwując krew i roztwór PBS-EDTA przepływający przez prawe przedsionek do szalki sekcyjnej. Mózg i wątroba będą wyglądały na zbledzone po całkowitej perfuzji, zapewniając, że pozostałe bakterie pochodzą z pobranych narządów, a nie z krążącej krwi.

5. Grabież organów i określanie obciążenia bakteryjnego

1. Po perfuzji należy pobrać narządy (np. wątrobę, śledzionę), ostrożnie usuwając wszelkie przyczepione naczynia krwionośne i więzadła, a następnie umieścić narządy oddzielnie w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml sterylnego zimnego (4 °C) PBS. Próbki należy przechowywać na lodzie do czasu dalszego przetwarzania.
2. Aby zebrać mózg, odetnij głowę za uszami za pomocą nożyczek i przetnij skórę głowy między oczami zwierzęcia wzdłuż linii środkowej. W razie potrzeby odetnij nadmiar tkanki, trzymając nożyczki przyciśnięte do czaszki.
   1. Delikatnie włóż jedną końcówkę nożyczek do otworu wielkiego (otworu w podstawie czaszki, przez który przechodzi rdzeń kręgowy) i naciąć bocznie w czaszce po obu stronach.
   2. Delikatnie przeciąć czaszkę między oczami gryzonia wzdłuż linii środkowej, upewniając się, że wywierasz boczny nacisk. Unikaj zaburzeń mózgu i utrzymuj minimalny kontakt między tkanką mózgową a nożyczkami.
   3. Za pomocą kleszczy z cienką końcówką otwórz czaszkę, aby odsłonić mózg i umieść szpatułkę między spodem mózgu a podstawą czaszki, aby usunąć mózg.
      UWAGA: Powoduje to rozerwanie włókien nerwowych mózgu.
   4. Ostrożnie przenieś mózg do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml sterylnego zimnego PBS.
   5. Wyrzuć tuszę myszy i powtórz te czynności dla pozostałych zwierząt.
      UWAGA: Po pobraniu wszystkich narządów należy oczyścić obszar zabiegu i przygotować się do homogenizacji narządów w celu określenia obciążenia bakteryjnego.
3. Oczyść i wysterylizuj końcówkę homogenizatora tkankowego umieszczonego w komorze bezpieczeństwa biologicznego, wkładając końcówkę i uruchamiając homogenizator przez 10 sekund sekwencyjnie w 5% wybielaczu, sterylnej wodzie, 75% etanolu, sterylnej wodzie, z których każdy znajduje się w oddzielnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
4. Homogenizuj zainfekowany mózg (~20 s przy ustawieniu 6, maksymalna prędkość obrotowa) w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, aż nie pozostaną żadne widoczne fragmenty tkanki.
   1. Wyczyść homogenizator zgodnie z opisem w kroku 5.3, aby zapobiec przenoszeniu się bakterii na następną próbkę narządu.
   2. Przeprowadź proces homogenizacji dla wszystkich innych narządów (np. wątroby, śledziony).
   3. Po zakończeniu procesu homogenizacji wyczyść homogenizator zgodnie z opisem w kroku 5.3 i przechowuj do dalszego użycia.
5. Przygotować 10-krotne seryjne rozcieńczenia homogenatów narządowych w sterylnym PBS i umieścić rozcieńczenia na płytkach z agarem BHI / streptomycyną w celu oznaczenia jtk na narząd.
   UWAGA: Podobną metodę stosuje się w celu oznaczenia jtk na ml krwi.
   1. Po nasianiu wszystkich rozcieńczeń należy przenieść płytki na noc do inkubatora o temperaturze 37 °C.
   2. Następnego dnia policz liczbę kolonii na każdej szalce, aby określić całkowitą liczbę bakterii w narządzie lub ml krwi w następujący sposób:
      CFU/organ = (liczba kolonii x współczynnik rozcieńczenia) / ml homogenatu posianego x 5
      CFU/ml krwi = (liczba kolonii x współczynnik rozcieńczenia) / ml krwi posianej

Mózg jest wysoce unaczyniony, a L. monocytogenes jest znany z infekowania typów komórek obecnych we krwi3,13. Opisany protokół służy do wykazania zdolności L. monocytogenes do przekraczania bariery krew-mózg (BBB) prowadzącej do zakażenia mózgu u myszy. Aby ustalić, czy bakterie przekroczyły barierę krew-mózg in vivo, perfuzja krwi u myszy jest wykonywana przed określeniem obciążenia bakteryjnego w mózgu. W przeciwnym razie uzyskany CFU może zawierać bakterie obecne w naczyniach krwionośnych mózgu. L. monocytogenes zakażone mózgi (Rysunek 3A) i wątroby (Rysunek 3B) przed lub po perfuzji w 72 godziny po zakażeniu. Rysunek 4 pokazuje obciążenia bakteryjne w narządach myszy zakażonych L. monocytogenes i ilustruje liczbę bakterii obecnych w mózgu, krwi, wątrobie i śledzionie każdej myszy. Dane te sugerują, że perfuzja zwierząt nie wpłynęła znacząco na obciążenie bakteryjne w narządach myszy badanych w tym badaniu (Rysunek 4).

Rysunek 1: Schematyczny zarys protokołu infekcji L. monocytogenes in vivo. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Schemat ideowy procedury perfuzji serca. Perfuzja przez serce myszy pokazująca wprowadzenie igły perfuzyjnej do lewej komory (krok 4.6). Po wkłuciu igły wykonuje się natychmiastowe nacięcie prawego przedsionka, aby rozpocząć procedurę perfuzji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Pobrane organy myszy po zakażeniu L. monocytogenes. Myszy BALB/c zakażono dożylnie poprzez wstrzyknięcie do żyły ogonowej bocznej L. monocytogenes 10403S typu dzikiego (1-2 x 104 bakterie / zwierzę). Po 72 godzinach od zakażenia myszy poddano eutanazji i pobrano narządy myszy lub uśpione myszy poddano perfuzji przez serce za pomocą 15-20 ml PBS zawierającego 10 mM EDTA przed pobraniem narządów. Reprezentatywne mózgi (A) i wątroby (B) pokazano u myszy nieperfundowanych lub perfronowanych. Należy pamiętać, że narządy myszy będą białe/blade (zblanszowane) po perfuzji, co zapewnia, że bakteryjna CFU pochodzi z pobranej tkanki narządu, a nie z krwi krążącej w tkance. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Ghosh et al., 201814. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Obciążenia bakteryjne w zakażonych narządach myszy.Myszy BALB/c zostały zakażone dożylnie L. monocytogenes 10403S typu dzikiego, zgodnie z opisem w Rysunek 3. Po 72 godzinach od zakażenia pobrano mózg, krew, wątrobę i śledzionę każdej myszy i określono obciążenie bakteryjne. W oddzielnych eksperymentach przeprowadzono perfuzję całego ciała myszy i określono obciążenie bakteryjne w każdym narządzie. Linie poziome wskazują wartości mediany. * W tej grupie krew pobrano bezpośrednio przed rozpoczęciem perfuzji serca. Ten rysunek został zmodyfikowany na podstawie Ghosh et al., 201814. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.