Artykuł metodologiczny

Stabilne motywy DNA, nanostruktury 1D i 2D zbudowane z małych kolistych cząsteczek DNA

DOI:

10.3791/58744

⸱

12 kwietnia 2019

 ,  , 
1State Key Laboratory of Coordination Chemistry, School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół ligacji T4 i denaturacji PAGE oczyszczania małych kolistych cząsteczek DNA, wyżarzania i natywnej analizy PAGE okrągłych płytek, montażu i obrazowania AFM nanostruktur DNA 1D i 2D, a także elektroforezy w żelu agarozowym i wirowania oczyszczania skończonych nanostruktur DNA.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół syntezy małych kolistych cząsteczek DNA, wyżarzania kolistych motywów DNA oraz budowy nanostruktur DNA 1D i 2D. Na przestrzeni dziesięcioleci szybki rozwój nanotechnologii DNA przypisuje się wykorzystaniu liniowych DNA jako materiałów źródłowych. Na przykład płytka DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) jest dobrze znana jako blok konstrukcyjny do budowy sieci DNA 2D; Podstawowa struktura DAO składa się z dwóch liniowych jednoniciowych (SS) oligonukleotydów, jak dwie liny tworzące prawoskrętny węzeł babci. W tym przypadku nowy typ płytek DNA zwany cDAO (sprzężone DAO) jest zbudowany przy użyciu małego okrągłego ss-DNA c64nt lub c84nt (okrągłe 64 lub 84 nukleotydy) jako nici rusztowania i kilku liniowych ss-DNA jako nici zszywkowych. Doskonałe nanostruktury 1D i 2D są składane z płytek cDAO: nieskończonych nanodrutów, nanospiral, nanorurek, nanowstążek; i skończone nanoprostokąty. Opisano szczegółowe protokoły: 1) przygotowanie przez ligazę T4 i oczyszczanie przez denaturację PAGE (elektroforeza w żelu poliakrylamidowym) małych okrągłych oligonukleotydów, 2) wyżarzanie stabilnych okrągłych płytek, a następnie natywna analiza PAGE, 3) składanie nieskończonych nanodrutów 1D, nanopierścieni, nanospiral, nieskończonych sieci 2D nanorurek i nanowstążek oraz skończonych nanoprostokątów 2D, a następnie obrazowanie AFM (mikroskopia sił atomowych). Metoda jest prosta, solidna i przystępna cenowo dla większości laboratoriów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cząsteczki DNA były używane do budowy wielu rodzajów nanostruktur na przestrzeni dziesięcioleci. Typowe motywy to DAE (podwójne skrzyżowanie, antyrównoległe, nawet półobroty) i płytki DAO1,2,3, star tiles4,5,6,7, płytki jednożyłowe (ss)8,9,10, oraz DNA origami11,12,13. Te motywy i sieci DNA są składane z liniowych ss-DNA. Ostatnio inni i my donieśliśmy o użyciu kolistych oligonukleotydów ss jako rusztowań do budowy motywów, nanorurek 1D i sieci 2D14,15,16,17. Wstawiając skrzyżowanie Hollidaya (HJ)18,19,20,21 w środku c64nt, można utworzyć parę dwóch sprzężonych płytek DAO17. Ten nowy motyw cDAO i jego pochodne są wystarczająco stabilne i sztywne, aby tworzyć siatki DNA 2D o wielkości do 3 × 5μm2. W tym artykule używamy terminu "okrągła płytka", która jest zdefiniowana jako stabilna cząsteczka kompleksu DNA zbudowana z jednego okrągłego rusztowania i innych liniowych zszywek ss-oligonukleotydów, oraz innego terminu "płytka liniowa", która jest zbudowana z pełnego zestawu liniowych ss-oligonukleotydów.

Ten protokół pokazuje, jak skonstruować pięć rodzajów nanostruktur DNA z małymi kolistymi cząsteczkami DNA jako rusztowaniami: 1) nieskończone nanodruty 1D c64nt i c84nt, 2) nieskończone 2D cDAO-c64nt-O i cDAO-c64nt-E (-O oznacza nieparzystą liczbę 5 półobrotów, a -E reprezentuje parzystą liczbę 4 półobrotów), 3) nieskończone sieci 2D cDAO-c84nt-O i cDAO-c84nt-E, 4) skończone prostokąty 2D 5 × 6 cDAO-c64nt-O i 5 × 6 cDAO-c74&84nt-O, 5) nieskończone nanopierścienie i nanospirale 1D acDAO-c64nt-E (patrz Rysunek 3-5 dla schematycznych rysunków i obrazów powyższych pięciu rodzajów nanostruktur DNA). Nanodruty 1D c64nt i c84nt są składane z każdego rusztowania c64nt i c84nt połączonego odpowiednio z dwoma liniowymi zszywkami. Każda okrągła płytka cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c74nt lub cDAO-c84nt jest wyżarzana z odpowiadającego jej rusztowania c64nt, c74nt lub c84nt odpowiednio z czterema liniowymi zszywkami. Nieskończone siatki 2D są składane z tego samego typu dwóch okrągłych płytek o różnych sekwencjach. Dwie skończone prostokątne siatki 2D są składane z dwóch zestawów odpowiednio 32 okrągłych płytek podrzędnych. Aby zaoszczędzić pieniądze, jako odpowiednie rusztowanie stosuje się tylko jednosekwencyjne c64nt, c74nt i c84nt, podczas gdy różne zwisy są używane do wyżarzania 32 okrągłych płytek podrzędnych cDAO-c64nt, 12 cDAO-c74nt i 20 cDAO-c84nt odpowiednio w pierwszym etapie wyżarzania płytek podrzędnych, a następnie wymieszaj ze sobą odpowiednie 32 okrągłe płytki podrzędne i zastosuj drugi etap wyżarzania kratowego, aby zmontować skończone 5 × 6 krat cDAO-c64nt-O i 5 × 6 krat cDAO-c74 i 84nt-O, odpowiednio. Z pewnością okrągłe rusztowania o różnej sekwencji można zastosować do montażu różnych nanostruktur o skończonych rozmiarach, jednak będzie to kosztować więcej pieniędzy i pracy. Nieskończone nanopierścienie i nanospirale 1D acDAO-c64nt-E są wyżarzane z jednosekwencyjnych asymetrycznych płytek acDAO-c64nt z liniowymi połączeniami o parzystej liczbie 4 półobrotów. Istnieją dwa podejścia do montażu nieskończonych sieci 2D z okrągłych płytek cDAO-c64nt i cDAO-c84nt, które wyróżniają się odległościami między kafelkami odpowiednio parzystej liczby 4 i nieparzystej liczby 5 półobrotów. Pierwsza z nich wymaga, aby wszystkie płytki były identycznie wyrównane; To ostatnie wymaga naprzemienności powierzchni dwóch sąsiednich płytek wzdłuż osi śrubowych. Jeśli płytka jest sztywna i płaska, taka jak cDAO-c64nt, oba podejścia wygenerują płaskie nanowstążki; jeśli płytka jest zakrzywiona w jednym kierunku, na przykład cDAO-c84nt, połączenie międzykafelkowe o parzystej liczbie 4 połówek wygeneruje nanorurki, podczas gdy połączenie międzykafelkowe o nieparzystej liczbie 5 półzwojów wytworzy płaskie nanowstążki w wyniku eliminacji wzrostu skrzywionego przez naprzemienne wyrównanie zakrzywionych płytek. Udany montaż nanostruktur DNA 1D i 2D z okrągłych płytek wskazuje na kilka zalet tego nowego podejścia: wzmocniona stabilność i sztywność okrągłych płytek w porównaniu z płytkami liniowymi, chiralne płytki do montażu asymetrycznych nanostruktur, takich jak nanopierścienie i nanowstążki, nowe wizje zrozumienia mechaniki DNA i struktur molekularnych itp.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie kolistych DNA

  1. Korzystaj ze wszystkich liniowych DNA dostarczonych przez firmy komercyjne bezpośrednio, bez dalszego oczyszczania.
  2. Odwirować próbki DNA o masie 5 000 × g przez 5 minut, aby zebrać wszystkie granulki DNA na dnie probówek. Dodaj odpowiednią objętość buforu TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0), aby rozpuścić DNA.
  3. Zmierzyć stężenie "a" ng/μl dla każdego roztworu ss-DNA za pomocą mikrospektrometru UV przy długości fali 260 nm. Przelicz "a" ng/μL na "b" μM zgodnie z b = a × 103 / (masa cząsteczkowa nici DNA). Dostosuj ilość roztworu TE, aby uzyskać podstawowy roztwór DNA o wielkości 10 μM.
  4. Użyj ligazy DNA T4, aby połączyć końce 3' i 5' fosforylowanych 5' liniowych matryc DNA (Rysunek 1) c64nt, c74nt i c84nt dostarczonych bezpośrednio przez firmy komercyjne.
  5. Wymieszaj 5'-fosforylowaną liniową nić DNA (3,5 μM) i odpowiadającą jej szynową nić DNA (4,5 μM) w 80 μl buforze TE w probówce PCR o pojemności 200 μl15. Inkubować probówkę w otwartej butelce termicznej wypełnionej wodą o temperaturze 95 °C. Schłodzić gorącą wodę do temperatury pokojowej (25 °C) przez około 2-3 godziny w atmosferze laboratoryjnej.
  6. Dodać 10 μL 10x buforu T4 (660 mM Tris-HCl, 66 mM MgCl2, 100 mM DTT, 1 mM ATP) i 10 μL ligazy T4 (300 U/μL) do mieszaniny do końcowej objętości 100 μL. Inkubować mieszaninę w termocyklerze przez 16 godzin w temperaturze 16 °C.
    UWAGA: Powyższe stężenia DNA i objętość reakcji ~100 μL są zoptymalizowane pod kątem wysokiej wydajności ligacji i wysokiej wydajności prawidłowej cyklizacji oligomonomerów. Uruchom dwie lub więcej probówek reakcji ligacji w tym samym czasie zgodnie z projektem eksperymentalnym. Alternatywną procedurą inkubacji do podwiązania zastępującą etap 1.6 są 4 godziny w temperaturze 25 °C.
  7. Po inkubacji dezaktywować ligazę T4 w wodzie o temperaturze 95 °C przez 5 minut. Następnie przenieś probówkę do lodowatej łaźni wodnej i inkubuj przez 5 minut, aby ostygła.
  8. Dodać 10 μl 10x buforu egzonukleazy I i 10 μl egzonukleazy I (5 U/μl) do hartowanej mieszaniny i inkubować probówkę w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 30 minut, aby selektywnie trawić pozostałe liniowe DNA i pozostawić nienaruszone okrągłe DNA.
  9. Przygotuj 10% żel denaturujący PAGE.
    1. Podczas przygotowywania żelu PAGE w dygestoriach należy nosić gumowe rękawice i okulary. Dodać 6,67 ml 30% (w/v) roztworu akrylamidu/bisakryloamidu (19:1), 2 ml 10x buforu TAE·Mg (40 mM Tris, 40 mM HAc, 1 mM EDTA, pH 8,0 ,12,5 mM Mg(Ac)2), 8,4 g mocznika (7 M) i wodę dejonizowaną do końcowej objętości 20 ml w probówce wirówkowej o pojemności 40 ml.
      Uwaga: 30% (w/v) roztwór akryloamidu/bisakryloamidu (19:1) jest toksyczny.
    2. Dodać 20 μl tetrametyloetylenodiaminy (TEMED) i 100 μl nadsiarczanu amonu (APS, 10% w/v) do probówki o pojemności 40 ml przed natychmiastowym przeniesieniem roztworu żelu do systemu elektroforezy. Włóż 10-dołkowy grzebień o grubości 1,5 mm. Odczekaj co najmniej 20 minut, aż roztwór żelu stężeje.
    3. Ustaw stałe napięcie 80 V dla żelu o napięciu 85 × 80 × 1,5 mm3 (szerokość × wysokość × grubość). Dodać 1x bufor TAE·Mg do systemu elektroforezy i wstępnie uruchomić żel przez 20 minut przy 10 V/cm.
  10. Umieść probówkę PCR z kroku 1.8 w wodzie o temperaturze 95 °C na 5 minut, aby dezaktywować egzonukleazę I. Następnie przenieś probówkę do lodowatej łaźni wodnej i inkubuj przez kolejne 5 minut.
  11. Dodać 20 μl formamidu z probówki do końcowej objętości 140 μl i wymieszać roztwór. Rozprowadzić roztwór do 7-9 denaturujących studzienek żelowych PAGE równomiernie po 16-20 μl na każdą studzienkę żelową. Zmieszać 2 μl barwnika ładującego (0,05% błękitu bromofenolowego, 0,05% cyjanolu ksylenu FF, 60% glicerolu, 10 mM Tris-HCl, 60 mM EDTA, pH 7,6) z 8 μl odpowiedniego liniowego DNA prekursora (10 μM) i wstrzyknąć mieszaninę do oddzielnego dołka w celach informacyjnych.
    UWAGA: Dodanie formamidu ma na celu zwiększenie gęstości roztworu ładującego do opadania na dno żelu PAGE, a także dysocjację niektórych dwuniciowych reszt DNA.
  12. Uruchom żel przez około 2 godziny przy napięciu 10 V/cm i przestań działać, gdy ksylen cyjanol FF znajdzie się gołym okiem w pozycji 2/3 szklanej płytki.
  13. Noś gumowe rękawice i okulary, aby chronić skórę i oczy. Wyjmij żel ze szklanej płytki. Umieść żel na płytce fluorescencyjnej TLC (chromatografia cienkowarstwowa). Odetnij docelowe pasma żelu żyletką dokładnie tak, jak są zacienione przez promieniowanie UV (Rysunek 2).
    Uwaga: Światło UV jest szkodliwe dla oczu i skóry.
    UWAGA: Pod wpływem promieniowania UV o długości fali 254 nm DNA pochłonie światło i rzuci cień na płytkę TLC. Koliste DNA przebiegało nieco wolniej niż odpowiadający mu prekursor liniowy DNA. Niektóre niestrawione liniowe DNA i niechciane koliste DNA w małych ilościach, które otaczają zacienione pasmo docelowe, zanieczyszczą koliste DNA, jeśli zostaną zebrane.
  14. Przenieś opaski żelowe do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml. Wysuszyć na powietrzu lub wysuszyć żelowe paski, a następnie zetrzyj żele na pastę za pomocą szpatułki lub spłaszczonego szklanego pręta. Upewnij się, że żel został całkowicie zmiażdżony na pastę, co ma kluczowe znaczenie dla wysokiej wydajności okrągłego DNA. Dodaj dwa razy objętość żelu wody dejonizowanej do probówki i potrząśnij probówką w temperaturze pokojowej przez noc.
  15. Przefiltrować mieszaninę, aby zebrać supernatanty w probówce do mikrowirówki o pojemności 2,0 ml. Odzyskaj resztki DNA przez przepłukanie niewielką ilością wody dejonizowanej i ponownie przefiltruj w celu połączenia supernatantów.
  16. Wyekstrahować eluent równą objętością n-butanolu. Powtarzaj tę procedurę, aż objętość wody zmniejszy się do około 200 μl.
  17. Dodać 500 μl absolutnego alkoholu etylowego (−20 °C) i 20 μl 3 M NaOAc (pH 5,1) do mieszaniny w celu wytrącenia DNA. Przechowywać probówkę w temperaturze -20 °C przez 30 minut.
  18. Odwirować probówkę o stężeniu 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant. Pozostały osad DNA znajduje się w probówce około 100 μl.
  19. Dodać 600 μl 75% etanolu (−20 °C) do probówki i przechowywać w temperaturze -20 °C przez 30 min. Następnie odwirować w temperaturze 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, odrzucić supernatant. Pozostały osad DNA to ponownie około 100 μl roztworu w probówce. Powtórz procedurę dwukrotnie.
  20. Po ostatnim odwirowaniu wyrzucić supernatant w jak największym stopniu. Wysuszyć resztki koncentratorem próżniowym.
  21. Oczyszczony kolisty DNA należy przechowywać w probówce w temperaturze -20 °C.
  22. W razie potrzeby ponownie zawiesić koliste DNA w buforze TE, aby uzyskać 10 μM kolisty roztwór podstawowy DNA zgodnie z krokiem 1.3.

2. Wyżarzanie rozwiązań montażowych

  1. Przygotuj każdą płytkę lub rozwiązanie do montażu nanostrukturalnego c64bp, c84bp, HJ-c64nt, aHJ-c64nt, HJ-c84nt, tHJ-c84nt, cDAO-c64nt, acDAO-c64nt, cDAO-c84nt, c64nt, c84nt i acDAO-c64nt-E z zaprojektowanym zestawem liniowych i kołowych DNA do wyżarzania jednogarnkowego.
    1. Dla każdego roztworu montażowego zmieszać 2 μl 10x buforu TAE·Mg, 1 μl każdego roztworu podstawowego DNA z zestawu liniowych i kołowych nici w równych proporcjach molowych oraz dodatkowy bufor TE w probówce PCR o pojemności 200 μl do końcowego stężenia każdej nici przy 0,5 μM i końcowej objętości 20 μL. Wyżarz roztwór montażowy w butelce termicznej od 95 °C do 25 °C przez 48 godzin.
  2. Przygotuj każde rozwiązanie montażowe nieskończonych sieci 2D cDAO-c64nt-E, cDAO-c64nt-O, cDAO-c84nt-E i cDAO-c84nt-O z zaprojektowanym zestawem liniowych i kołowych DNA do dwuetapowego wyżarzania.
    1. Przygotować każdy roztwór do składania podpłytek prekursora, mieszając 2 μl 10x buforu TAE·Mg, 1 μl każdego roztworu podstawowego DNA z zestawu liniowych i kołowych nici w równych proporcjach molowych oraz dodatkowy bufor TE w probówce PCR o pojemności 200 μl do końcowego stężenia 0,5 μM dla każdej nici i końcowej objętości 20 μL. W pierwszym etapie wyżarzania podpłytkowego wyżarzaj każdy prekursorowy roztwór podpłytkowy w termocyklerze PCR przy użyciu szybkiej metody chłodzenia liniowego od 95 °C do 25 °C przez 2,5 godziny.
    2. Przygotować każdy roztwór montażowy powyższych czterech nieskończonych sieci, mieszając ze sobą 10 μl każdego z dwóch odpowiadających im roztworów podpłytkowych do końcowego stężenia 0,25 μM dla każdego pasma. W drugim etapie wyżarzania sieciowego wyżarzać mieszaninę 20 μl w termocyklerze PCR, stosując metodę powolnego chłodzenia, polegającą na utrzymywaniu się w temperaturze 50 °C przez 2 godziny i schładzaniu w tempie 0,1 °C na 5 minut do 20 °C, łącznie około 24 godzin.
      UWAGA: Dwa równoległe eksperymenty mogą być prowadzone jednocześnie lub później w drugim kroku wyżarzania dla każdej nieskończonej sieci 2D.
  3. Przygotuj rozwiązania montażowe dwóch skończonych prostokątnych zespołów 5 × 6 cDAO-c64nt-O i 5 × 6 cDAO-c74 i c84nt-O do wyżarzania dwuetapowego.
    1. Przygotować każdy roztwór do składania podpłytek prekursora, mieszając 1 μl 10x buforu TAE·Mg, 0,5 μl każdego roztworu podstawowego DNA z zestawu liniowych i kołowych nici w równych proporcjach molowych oraz dodatkowy bufor TE w probówce PCR o pojemności 200 μl do końcowego stężenia 0,5 μM dla każdej nici i końcowej objętości 10 μL. W pierwszym etapie wyżarzania wyżarzanie każdego prekursorowego roztworu podpłytkowego w termocyklerze PCR przy użyciu szybkiej metody chłodzenia liniowego od 95 °C do 25 °C przez 2,5 godziny.
    2. Przygotuj każdy roztwór zespołu sieci o skończonym prostokącie, mieszając 32 x (2 μl każdego roztworu podpłytki) razem w probówce PCR o pojemności 200 μl do końcowego stężenia ~ 15 nM dla każdej płytki i końcowej objętości 64 μl. W drugim etapie wyżarzania mieszaninę o objętości 64 μl należy wyżarzać w termocyklerze PCR, stosując metodę powolnego chłodzenia, polegającą na utrzymywaniu temperatury 50 °C przez 2 godziny i schładzaniu w tempie 0,1 °C na 5 minut do 20 °C, łącznie około 24 godzin.
      UWAGA: Pięć równoległych eksperymentów można przeprowadzić jednocześnie lub później w drugim etapie wyżarzania dla każdego zespołu prostokąta skończonego.

3. Natywna analiza strony

  1. Przygotuj 10% natywną STRONĘ zgodnie z krokiem 1.9, z wyjątkiem składnika mocznikowego.
  2. W przypadku próbek kontrolnych c64bp i c84bp dodać 2 μl każdego roztworu montażowego i 1 μl barwnika ładującego do 3 μl buforu TE jako kontrole oddzielnie. Dla każdego z pozostałych zestawów wymienionych w Rysunek 3, dodaj 1 μL każdego roztworu montażowego i 1 μL barwnika ładującego do 4 μL buforu TE.
  3. Wstrzyknąć każdy z powyższych roztworów do dobrze żelu. Dodaj 5 μl markera DNA (25-500 pz) do oddzielnego dołka w celach informacyjnych.
  4. Żel należy stosować przez około 4 godziny przy napięciu 10 V/cm w lodowatej kąpieli wodnej. Ksylen-cyjanol FF wyczerpie się ze szklanej płytki.
  5. Noś gumowe rękawice i okulary, aby chronić skórę i oczy. Wyjmij żel ze szklanej płytki i zanurz go w 100 ml wody dejonizowanej z 10 μl barwnika z żelu z kwasem nukleinowym na 30 min.
    Uwaga: Roztwór barwnika w żelu z kwasem nukleinowym jest toksyczny.
  6. Obserwuj żel w systemie obrazowania UV i zrób zdjęcie poplamionego żelu (Rysunek 3).

4. Oczyszczanie sieci skończonych

  1. Przygotuj natywny 2% żel agarozowy do elektroforetycznego oczyszczania skończonych sieci.
    1. Wymieszaj 1 g proszku agarozowego, 5 ml 10x buforu TBE·Mg (89 mM Tris, 89 mM kwasu borowego, 2 mM EDTA, pH 8,0, 12,5 mM Mg(Ac)2), 2 μl barwnika żelowego kwasu nukleinowego i 47,5 ml wody dejonizowanej w butelce o pojemności 250 ml. Gotuj mieszaninę, aż bąbelki staną się małe i gęste. Dodaj gorącą wodę do butelki do całkowitej objętości 50 ml i stężenia 2% agarozy.
    2. Noś grube rękawice. Wlej roztwór żelu do plastikowego pudełka żelowego o wymiarach 7 x 10 x 1 cm3 (szerokość × długość × grubość). Włóż 12-dołkowy grzebień żelowy o grubości 1,5 mm. Poczekaj, aż żel ostygnie do temperatury pokojowej. W razie potrzeby wlej żel do lodówki o temperaturze 4 °C.
      Uwaga: Należy pamiętać o oparzeniach, ponieważ roztwór jest bardzo gorący.
    3. Dodać 0,5x bufor TBE·Mg do systemu elektroforezy. Żel należy rozprowadzić pod napięciem 5 V/cm przez 20 minut w lodowatej kąpieli wodnej o stałym napięciu 50 V.
    4. Wstrzyknąć 20 μl skończonego roztworu sieciowego przygotowanego w kroku 2.3 do każdej studzienki żelu agarozowego i dodać 5 μl markera DNA (100-3 000 pz) do oddzielnego dołka. Uruchom żel przez 2 godziny przy napięciu 5 V/cm w lodowatej kąpieli wodnej.
    5. Noś gumowe rękawice i okulary, aby chronić skórę i oczy. Wytnij docelowe pasma żelu w pozycji podobnej do znacznika 1,000 pz w świetle UV i pokrój je na drobne kawałki, a następnie umieść pokruszone żele w kolumnie filtrującej8.
    6. Odwirować kolumnę przy 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ekstrahować roztwór próbki przez kolumnę. Zbierz roztwór do obrazowania AFM.
  2. Oczyść skończone sieci przez wytrącanie PEG.
    1. Zmieszać 50 μl roztworu sieci o skończonej ilości przygotowanego w kroku 2.3 z równą objętością 15% buforu PEG8000 (w/v) (20 mM Mg(Ac)2, 5 mM Tris, 1 mM EDTA i 505 mM NaCl)22. Odwirować roztwór o stężeniu 18 000 × g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    2. Usunąć supernatant i dodać 100 μl buforu PEG. Powtórzyć wirowanie.
    3. Po usunięciu supernatantu rozpuścić osad w 1x buforze TAE·Mg do obrazowania AFM.
      UWAGA: Oczyszczanie jest konieczne dla sieci o skończonej długości 5 × 6 cDAO-c64nt-O i 5 × 6 cDAO-c74 i c84nt-O do obrazowania AFM i innych zastosowań. Jeśli wydajność jest zbyt niska, zwiększ prędkość wirowania. Jeśli produkt nie jest wystarczająco czysty, powtórz krok 4.2.2.

5. Obrazowanie AFM

  1. W przypadku nanodrutu c64nt, nanodrutu c84nt, acDAO-c64nt-E, nieskończonych sieci 2D cDAO-c64nt-E(O) i cDAO-c84nt-E(O), nałóż 2 μl wyżarzonej próbki na świeżo rozszczepioną powierzchnię miki. Pozostaw na 2 minuty w celu adsorpcji sieci DNA na powierzchni miki. Umyj powierzchnię dwukrotnie 100 μl wody dejonizowanej i osusz sprężonym powietrzem.
  2. Uzyskaj obrazy AFM nieskończonych sieci DNA w powietrzu, skanując powierzchnię miki za pomocą trójkątnych sond AFM w trybie stukania. Ustaw następujące parametry skanowania: rozmiar skanowania 0,5 ~ 5 μm, rozdzielczość skanowania 512 linii i częstotliwość skanowania 3,5 Hz (Rysunek 4).
  3. W przypadku skończonych sieci DNA o długości 5 × 6 cDAO-c64nt-O i 5 × 6 cDAO-c74 i c84nt-O, należy umieścić 80 μl 1x buforu TAE·Mg na świeżo rozciętej powierzchni miki. Następnie dodać 5 μl skończonych próbek do buforu. Pozostaw na 2 minuty w celu adsorpcji sieci DNA na powierzchni miki. Dodaj kolejne 50 μl 1x buforu TAE·Mg na sondzie AFM.
  4. Uzyskaj obrazy AFM skończonych sieci DNA w płynie, skanując powierzchnię miki za pomocą trójkątnych sond AFM w trybie stukania. Ustaw następujące parametry skanowania: rozmiar skanowania 0,5-1 μm, rozdzielczość skanowania 256 linii i częstotliwość skanowania 1,5 Hz (Rysunek 5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koliste DNA porusza się nieco wolniej niż jego prekursor liniowy DNA w denaturacji PAGE (Rysunek 2), ponieważ pory wewnątrz okrągłego DNA są penetrowane i opóźniane przez włókna żelowe23,24,25. Prawidłowa wydajność reakcji ligacji dla cyklizacji oligomonomerów zależy od sekwencji i stężenia substratu, temperatury reakcji, czasu itp. Ponieważ stężenie liniowego DNA pre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoły przedstawione w tym artykule koncentrują się na syntezie małych kolistych cząsteczek DNA i składaniu nanostruktur DNA. Większość losowo sekwencjonowanych projektów DNA może być wykorzystana w tym protokole. Czystość kolistych DNA ma kluczowe znaczenie dla powodzenia zespołów DNA. Wydajność produkcji cyklizacji można poprawić poprzez obniżenie stężenia liniowego DNA fosforylowanego przez 5'; jednak zwiększy to obciążenie pracą związaną z produkcją tych samych ilości kolistych DNA. Długość nici DNA szyny wpływa r...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni za wsparcie finansowe od NSFC (granty nr 91753134 i 21571100) oraz Państwowego Kluczowego Laboratorium Bioelektroniki Uniwersytetu Południowo-Wschodniego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ligaza T4TaKaRa2011A
Bufor T4Bufor TaKaRa2011A
BuforTE SangonB548106
Butelka termicznaTermosSK-3000
TermocyklerBio GenerGE4852T
Egzonukleaza ITaKaRa2650A
Bufor egzonukleazy ITaKaRa2650A
30% (w/v) roztwór Akryl/Bis (19:1)SangonB546016
TAE premikspodwer SangonB540023
Mg(Ac)2· 4H2OOdczynnik chemiczny NanjingC0190550223
MocznikSangonA510907
TEMEDBBIA100761
Nadsiarczan amonuNanjing Odczynnik chemiczny13041920295
ZasilaczBeijing LiuyiDYY-8C
Łaźnia wodnaSumsungDK-S12
FormamidA100314BBI
(25 ~ 500 pz)B600303Sangon
(100 ~ 3000 pz)B500347Sangon
Bufor ładującySangonB548313
PAGEFiltr Beijing Liuyi24DN
ASD5010-22250,22 i mikro;
System obrazowaniaM Tanon2500R
n-butanolSangonA501800
Absolutny etanolSCR10009257
Odczynnik chemiczny NaOAcNanjing12032610459
eppendorfWirówka 5424R
Koncentrator próżniowyCHRISTRVC 2-18
Widmo ultrafioletuAllshengNano-100
barwienie kwasem nukleinowymBiotium16G1010GelRed
AgaroseBiowestG-10
System elektroforezy agarozowejPekin LiuyiDYCP-31CN
Płyta grzewczaJiangsu JintanDB-1
TBE premiks podwer KolumnaB540024
Bio-Rad7326165Freeze 'N Kolumna Squeeze
AFMBrukerDimension FastScan
PEG8000BBIA100159
MicaTed PellaTrójkątna sonda AFM BP50
w powietrzuFastScan-C
w fulidBrukerScanAsyst-fluid +
nici DNASangon
Marker DNA Marker DNA System elektroforezy UV Wirówka filtrująca Sangon Trójkątna sonda AFM Bruker

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tsu-Ju, F., Seeman, N. C. DNA double-crossover molecules. Biochemistry. 32 (13), 3211-3220 (1993).
  2. Winfree, E., Liu, F., Wenzler, L. A., Seeman, N. C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. Nature. 394 (6693), 539-544 (1998).
  3. Liu, F., Sha, R., Seeman, N. C. Modifying the surface features of two-dimensional DNA crystals. Journal of the American Chemical Society. 121 (5), 917-922 (1999).
  4. Yan, H., Park, S. H., Finkelstein, G., Reif, J. H., LaBean, T. H. DNA-templated self-assembly of protein arrays and highly conductive nanowires. Science. 301 (5641), 1882-1884 (2003).
  5. Liu, D., Wang, M., Deng, Z., Walulu, R., Mao, C. Tensegrity: Construction of rigid DNA triangles with flexible four-arm DNA junctions. Journal of the American Chemical Society. 126 (8), 2324-2325 (2004).
  6. Tian, C., Li, X., Liu, Z., Jiang, W., Wang, G., Mao, C. Directed self-assembly of DNA tiles into complex nanocages. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (31), 8041-8044 (2014).
  7. Wang, P., et al. Retrosynthetic analysis-guided breaking tile symmetry for the assembly of complex DNA nanostructures. Journal of the American Chemical Society. 138 (41), 13579-13585 (2016).
  8. Ke, Y., Ong, L. L., Shih, W. M., Yin, P. Three-dimensional structures self-assembled from DNA bricks. Science. 338 (6111), 1177-1183 (2012).
  9. Wei, B., Dai, M., Yin, P. Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles. Nature. 485 (7400), 623-626 (2012).
  10. Ke, Y., et al. DNA brick crystals with prescribed depths. Nature Chemistry. 6 (11), 994-1002 (2014).
  11. Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440 (7082), 297-302 (2006).
  12. Douglas, S. M., Dietz, H., Liedl, T., Högberg, B., Graf, F., Shih, W. M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. Nature. 459 (7245), 414-418 (2009).
  13. Dietz, H., Douglas, S. M., Shih, W. M. Folding DNA into twisted and curved nanoscale shapes. Science. 325 (5941), 725-730 (2009).
  14. Ackermann, D., Schmidt, T. L., Hannam, J. S., Purohit, C. S., Heckel, A., Famulok, M. A double-stranded DNA rotaxane. Nature Nanotechnology. 5 (6), 436-442 (2010).
  15. Zheng, H., Xiao, M., Yan, Q., Ma, Y., Xiao, S. J. Small circular DNA molecules act as rigid motifs to build DNA nanotubes. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10194-10197 (2014).
  16. Wang, M., Huang, H., Zhang, Z., Xiao, S. J. 2D DNA lattices constructed from two-tile DAE-O systems possessing circular central strands. Nanoscale. 8 (45), 18870-18875 (2016).
  17. Guo, X., Wang, X. M., Wei, S., Xiao, S. J. Construction of a holliday junction in small circular DNA molecules for stable motifs and two-dimensional lattices. ChemBioChem. 19 (13), 1379-1385 (2018).
  18. Holliday, R. A mechanism for gene conversion in fungi. Genet. Res. 5 (2), 282-304 (1964).
  19. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction. Structure and Methods, Human Genome Initiative and DNA Recombination. 1 (1), 157-181 (1990).
  20. Ariyoshi, M., Vassylyev, D. G., Iwasaki, H., Nakamura, H., Shinagawa, H., Morikawa, K. Atomic structure of the RuvC resolvase: A holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell. 78 (6), 1063-1072 (1994).
  21. Eichman, B. F., Vargason, J. M., Mooers, B. H., Ho, P. S. The Holliday junction in an inverted repeat DNA sequence: sequence effects on the structure of four-way junctions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (8), 3971-3976 (2000).
  22. Stahl, E., Martin, T. G., Praetorius, F., Dietz, H. Facile and scalable preparation of pure and dense DNA origami solutions. Angewandte Chemie: International Edition. 53 (47), 12735-12740 (2014).
  23. de Gennes, P. G. Reptation of a polymer chain in the presence of fixed obstacles. The Journal of Chemical Physics. 55 (2), 572-579 (1971).
  24. Slater, G. W., Noolandi, J. New biased reptation model for charged polymers. Physical Review Letters. 55 (15), 1579(1985).
  25. Lilley, D. M. J. Analysis of branched nucleic acid structure using comparative gel electrophoresis. Quarterly Reviews of Biophysics. 41 (1), 1-39 (2008).
  26. Pfreundschuh, M., Martinez-Martin, D., Mulvihill, E., Wegmann, S., Muller, D. J. Multiparametric high-resolution imaging of native proteins by force-distance curve-based AFM. Nature Protocols. 9 (5), 1113-1130 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Nanotechnologia DNAdenaturuj ca elektroforeza w elu poliakrylamidowym PAGEnatywna elektroforeza w elu poliakrylamidowym PAGEmikroskopia si atomowychkafelki DNAnanostruktury 1Dnanostruktury 2Doczyszczanie DNAwy arzanie DNA

Powiązane artykuły