Zwężenie lewego przedsionka wywołane tętnicą żylną płuc i nadciśnienie płucne grupy 2 u szczura

Podsumowanie

Zwężenie lewego przedsionka (LAS) jest nowatorską techniką chirurgiczną używaną do badania nadciśnienia płucnego grupy 2 (PH) i mechanizmów leżących u podstaw tętnicy żylnej płucnej. Tutaj przedstawiamy protokół zwężania lewego przedsionka za pomocą tytanowego klipsa w celu spowodowania tętnicy żylnej płuc i umiarkowanego PH u szczura.

Streszczenie

Mechanizm indukowanej zwężeniem zastawki mitralnej tętnicy żylnej płucnej i nadciśnienia płucnego grupy 2 (PH) jest niejasny. Nie ma modelu PH grupy 2 u gryzoni ze względu na zwężenie zastawki mitralnej (SM), co ułatwiłoby badanie mechanizmów chorobowych i potencjalnych strategii terapeutycznych. Przedstawiamy nowy szczurzy model tętnicy żylnej płuc wywołanej przekrwieniem żylnym płuc i PH grupy 2 spowodowanej zwężeniem lewego przedsionka (LAS). LAS uzyskuje się poprzez zwężenie lewego przedsionka za pomocą półzamkniętego tytanowego klipsa. Po operacji LAS model szczura z prędkością napływu strumieniowego większą lub równą 2,0 m/s w badaniu echokardiograficznym stopniowo rozwija tętnicę żylną płuc i PH grupy 2 w okresie od 8 do 10 tygodni. W tym protokole przedstawiamy krok po kroku procedurę, jak wykonać operację LAS. Prezentowany model szczurzy LAS naśladuje stwardnienie rozsiane u ludzi i jest przydatny do badania mechanizmu molekularnego leżącego u podstaw tętnic żylnych płuc oraz do przedklinicznej oceny terapii PH grupy 2.

Wprowadzenie

Celem tego artykułu jest pokazanie krok po kroku, jak przeprowadzić operację LAS u szczurów. Chirurgicznie indukowany LAS ściśle naśladuje stwardnienie rozsiane i triatriatum u ludzi, co wiąże się z powstaniem mechanicznej przeszkody w lewym przedsionku¹. Niedrożność dopływu do lewej komory (LV) często powoduje przekrwienie krążenia żylnego w płucach, a u pacjentów stopniowo rozwija się PH. Światowa Organizacja Zdrowia klasyfikuje PH spowodowane chorobami lewego serca jako grupę 2, która jest najbardziej rozpowszechnioną grupą PH^2,3,4. Rozpoznanie PH u pacjentów z chorobami lewego serca wiąże się z ponad siedmiokrotnym wzrostem standaryzowanej śmiertelności w ciągu 1 roku⁴. Obecnie nie ma zatwierdzonej terapii PH grupy 2 poza leczeniem podstawowych chorób lewego serca (np. chirurgiczna wymiana zwężonej zastawki mitralnej). Jednak nawet skuteczna wymiana zastawki mitralnej nie rozwiązuje w pełni pH nawet u połowy pacjentów z MS⁵. To utrzymujące się pH jest spowodowane niekorzystną przebudową naczyń płucnych, która jest słabo poznana. W związku z tym modele zwierzęce są ważne dla lepszego zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw niekorzystnej przebudowy naczyń płucnych w PH grupy 2.

Istnieje kilka modeli zwierzęcych grupy 2 PH. Podwiązanie tętnic wieńcowych^6,7 i poprzeczne pasmo aorty^8,9,10 u gryzoni są najczęściej używanymi modelami zwierzęcymi PH grupy 2. Główną wadą tych modeli jest udział LV, co sprawia, że wynik badań PH grupy 2 jest trudny do interpretacji. Natomiast LV pozostaje nienaruszony w modelu LAS. Co więcej, model LAS jest klinicznie istotny, ponieważ powoduje powolny i postępujący rozwój PH w okresie 10 tygodni¹¹. U ludzi stwardnienie rozsiane jest uważane za znaczące, jeśli prędkość przepływu dopplerowskiego jest większa niż 2,0 m/s¹¹, a także używamy tej liczby jako punktu odcięcia w celu określenia, czy operacja LAS spowodowała znaczne zwężenie. Ponadto, mimo że model LAS generuje łagodne lub umiarkowane PH, wykazuje charakterystyczne zmiany histologiczne, podobne do tych u ludzi, a mianowicie rozwój tętnicy żylnej wewnątrzpłucnej¹¹. Model szczura LAS jest nowatorskim i klinicznie istotnym modelem PH grupy 2 z zachowaną funkcją lewej komory. Nadaje się do badania patofizjologii trwałej przebudowy naczyń płucnych, identyfikacji celów molekularnych i testowania nowych terapii PH grupy 2.

Protokół

Protokół eksperymentalny LAS został zatwierdzony przez Komitet Opieki nad Zwierzętami Jikei University School of Medicine oraz Uniwersytecki Komitet ds. Badań i Etyki (protokół #2015-118).

1. Przygotowanie przedoperacyjne

1. Po przybyciu do obiektu dla zwierząt należy zapewnić 5-tygodniowym samcom szczurów Sprague Dawley o wadze od 150 do 200 g z 1 tygodniem na aklimatyzację w nowym domu przed operacją.
2. Przed zabiegiem należy przygotować następujący sprzęt przez autoklawowanie: 1) respirator dla małych zwierząt, 2) urządzenie do znieczulenia, 3) zestaw do intubacji (składający się z pary kleszczy hemostatycznych, depresora języka i angiocewnika 18 G), 4) narzędzia chirurgiczne (w tym para zakrzywionych kleszczy, para kleszczy prostych, wkrętak igły, zwijacz klatki piersiowej, para nożyczek, szew monofilamentowy 5-0, aplikator z klipsem, średnio-duże klipsy i rurka na klatkę piersiową 23 G).
3. Przygotuj sterylne patyczki higieniczne i gazę, aby poradzić sobie z krwawieniem.
4. Użyj poduszki grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia około 37 °C podczas zabiegu.

2. Anestezjologia i intubacja dotchawicza

1. Znieczulić szczura w komorze indukcyjnej z 5% izofluranem zmieszanym z 2 l/min powietrza w pomieszczeniu
.
2. Przed intubacją zgol włosy na klatce piersiowej szczura za pomocą golarki do włosów i nałóż krem do depilacji, aby usunąć cienkie włosy.
3. Sprawdź odruch pedałowania, aby potwierdzić skuteczne znieczulenie przed intubacją.
4. Zaczep przednie zęby sznurkiem i zabezpiecz sznurek dwoma kołkami.
5. Otwórz usta szczura za pomocą kleszczy hemostatu i włóż depresor języka do ust.
6. Podnieś depresor języka, aby uwidocznić strunę głosową.
   UWAGA: Pomocne jest świecenie silnym światłem na obszar głowy szczura, aby pomóc w wizualizacji strun głosowych.
7. Wprowadzić cewnik naczyniochłonny 18 G jako rurkę dotchawiczą do tchawicy, a następnie szybko podłączyć cewnik do respiratora.
8. Ustaw objętość oddechową na 10 μl na gram przy częstości oddechów 100 oddechów/minutę.
9. Utrzymać znieczulenie za pomocą 2% izofluranu zmieszanego z 2 l/min powietrza w pomieszczeniu
.

3. Przygotowanie pola operacyjnego

1. Przygotować miejsce operacji za pomocą naprzemiennych peelingów z chlorheksydyny i alkoholu x3.
2. Buprenorfinę podawać podskórnie w dawce 0,01 mg/kg.
3. Przykryj szczura sterylną zasłoną.
4. Sprawdź odruch pedałowania, aby potwierdzić pomyślną intubację i utrzymanie znieczulenia.

4. Operacja zwężenia lewego przedsionka

1. Zaznacz miejsce nacięcia 2 cm poniżej lewej pachy szczura za pomocą linijki.
2. Wykonaj 2 cm lewe boczne nacięcie ściany klatki piersiowej nożyczkami.
3. Oddziel mięśnie międzyżebrowe między czwartym a piątym żebrem, używając prostych i zakrzywionych kleszczy, aż do wejścia do jamy klatki piersiowej.
4. Włóż zwijacz klatki piersiowej do jamy klatki piersiowej. Kontynuuj używanie prostych i zakrzywionych kleszczy do oddzielenia mięśnia międzyżebrowego, aby uzyskać bezpośrednią wizualizację grasicy i serca.
5. Podnieś grasicę za pomocą prostych kleszczy. Usuń grasicę pokrywającą serce nożyczkami. Unikaj cięcia lub wbijania się w główne naczynia krwionośne.
6. Ostrożnie przełóż szew monofilamentowy 5-0 przez powierzchnię lewej komory, tuż poniżej uszka lewego przedsionka. Unikaj przechodzenia igły przez główne tętnice wieńcowe.
7. Po założeniu szwu i braku znaczącego krwawienia zawiąż luźny węzeł.
8. Pociągnij nić do szwów w górę i do przodu, aby wyjąć serce z klatki piersiowej.
9. Gdy serce zostanie wyjęte z klatki piersiowej, szybko przyłóż średnio-duży klips do lewego przedsionka, tuż nad zastawką mitralną.
   UWAGA: Klips jest zamknięty do połowy, a końcówka klipsa uciska lewy przedsionek, powodując zwężenie lewego przedsionka.
10. Szybko włóż serce z powrotem do klatki piersiowej. Upewnij się, że serce nie znajduje się poza klatką piersiową dłużej niż 30 sekund.
11. Usuń szew podtrzymujący używany do podnoszenia serca.
12. Zamknij klatkę piersiową szwem monofilamentowym 5-0, używając prostego przerywanego wzoru.
13. Włożyć rurkę do klatki piersiowej o pojemności 23 g dołączoną do strzykawki o pojemności 10 ml do klatki piersiowej, a następnie przystąpić do zamykania mięśni i skóry ściany klatki piersiowej za pomocą prostych przerywanych szwów.
14. Pobrać powietrze, krew i wysięk opłucnowy przez włożoną rurkę do klatki piersiowej za pomocą dołączonej strzykawki o pojemności 10 cm3, a następnie pociągnąć rurkę.
15. Zamknij warstwę skóry szwem monofilamentowym 5-0, używając prostego przerywanego wzoru.
16. Buprenorfinę podawać podskórnie w dawce 0,01 mg/kg.
17. Wyłącz izofluran.
18. Odłącz respirator po zaobserwowaniu spontanicznego oddychania.
19. Trzymaj szczura zaintubowanego i pozwól mu dojść do siebie na poduszce grzewczej, aż się obudzi.
20. Bezpiecznie ekstubować szczura po zaobserwowaniu jednego lub więcej z następujących objawów: szczur zaczyna poruszać czterema kończynami, odzyskuje odruch prostowania, odzyskuje odruch wymiotny lub wykazuje spontaniczne mikcie.

5. Opieka pooperacyjna

1. Co 8 - 12 godzin podawać podskórnie buprenorfinę w dawce 0,01 mg/kg. Karprofen w dawce 5 mg/kg mc. podaje się podskórnie codziennie przez 2 dni, a następnie, w razie potrzeby, jeśli szczur nie porusza się dobrze i wygląda, jakby odczuwał ból.
2. Zaraz po operacji należy podać podskórnie 5 ml zwykłej soli fizjologicznej, ponieważ szczur może mieć trudności z piciem z kranu z wodą, bezpośrednio po operacji.

6. Potwierdzenie sukcesu zwężenia lewego przedsionka za pomocą echokardiografii

1. Wykonaj echokardiografię przezklatkową 2 tygodnie po operacji, aby określić prędkość napływu lewej komory.
2. Znieczulić szczura, postępując zgodnie z krokami opisanymi w sekcji 1.
3. Po indukcji znieczulenia należy utrzymać znieczulenie za pomocą stożka nosowego z 2% izofluranem zmieszanym z 2 l/min powietrza w pomieszczeniu.
4. Ogol ścianę klatki piersiowej szczura golarką do włosów i użyj kremu do depilacji, aby usunąć pozostałe włosy.
5. Umieść sondę ultrasonograficzną na wierzchołku serca, który znajduje się wokół piątej przestrzeni międzyżebrowej po lewej stronie klatki piersiowej. Przesuwaj sondę w tym obszarze, aż uzyskasz dobry widok z czterech komór.
6. Zmierz prędkość dopływu lewej komory za pomocą trybu Dopplera fali pulsacyjnej tuż nad pierścieniem zastawki mitralnej.
7. Prędkość dopływu lewej komory większa niż 2,0 m/s jest wymagana do rozwoju umiarkowanego nadciśnienia płucnego po 8 - 10 tygodniach od operacji LAS.

7. Operacja pozorowana

1. Z wyjątkiem zastosowania klipsa (krok 4.9), wykonaj wszystkie powyższe kroki, aby stworzyć szczury kontrolne (SOC) w tym samym wieku.

Wyniki

Skuteczność LAS jest potwierdzana za pomocą echokardiografii 2 tygodnie po operacji. Szczury z prędkością przepływu wlotowego do LV przekraczającą 2,0 m/s, mierzoną w rzucie czterojamowym, uznaje się za zwierzęta z rozwiniętą istotną stenozą (Rycina 1), u których w 8–10 tygodniu po zabiegu LAS niezawodnie rozwija się umiarkowana PH oraz arterjalizacja żył płucnych.

Dziesięć tygodni po operacji LAS s...

Dyskusja

Szczur LAS jest nowym modelem PH grupy 2, który spotkał się już z dużym zainteresowaniem ze strony naukowców z tej dziedziny^12,13. W porównaniu z dwoma istniejącymi modelami grupy 2, a mianowicie zwężeniem żyły płucnej (PVS) model¹⁴, wykorzystującym prosięta,^{oraz modelem} szczura z pasmem nadwieńcowym aorty (SAB) 8,9,10, model szczurzy LAS ma kilka zalet.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
5-0 Szew prolenowy	Johnson & Johnson - Ethicon	8725H	Szew polipropylenowy z technologią HEMO-SEAL
Aparat do znieczulenia	Wakenyaku Co., Ltd.	BRTK-100A Pompa	powietrza i aparat do znieczulania
Drut prowadnikowy angiocewnika	Samodzielnie wykonany		prowadnik 10 cm przyklejony do strzykawki o pojemności 1 cm
Retraktor klatki piersiowej	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	F-2
Rurka na klatkę piersiową 23G	Samodzielnie wykonana		strzykawka o pojemności 10 ml przymocowana do igły 23G plus plastikowa rurka
Zakrzywione kleszcze	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	A-14
Poduszka grzewcza	Vivaria	MP-916-NV	Utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 stopni Celsjusza
Klipsy podwiązywalne Horizon		Teleflex REF 003200	Rozmiar Średnio-duży
Aplikator do podwiązywania Horizon do średniego i dużego rozmiaru Horizon	Teleflex	REF 337085	Klipsy do podwiązywania Kątowa szczęka, (20 cm)
Uchwyt na igłę	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	MC-40
Respirator dla gryzoni	CWE Inc	SAR-830/P	Respirator dla małych zwierząt
Nożyczki	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	B-12	Nożyczki proste, najlepiej z okrągłymi końcówkami
Kleszcze proste	Natsume Seisakusho Co., Ltd.	A-7
Depresor języka	Uchida Yoko Co., Ltd.	8-615-2417	Użyj szerokiego końca