Artykuł metodologiczny

Identyfikacja repertuaru przeciwciał mysich i ludzkich za pomocą sekwencjonowania nowej generacji

14K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58804

⸱

15 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Center for Influenza Virus Research, National Institute of Infectious Diseases, 3School of Science and Technology, Kwansei Gakuin University, 4Department of Pathology, National Institute of Infectious Diseases, 5Division of Infectious Diseases Pathology, Department of Global Infectious Diseases, Tohoku University Graduate School of Medicine, 6Division of Molecular Pathobiology, Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido University, 7Division of Collaboration and Education, Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido University, 8Global Station for Zoonosis Control, GI-CoRE, Hokkaido University, 9Department of Immunology, National Institute of Infectious Diseases, 10Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokoły analizy i wizualizacji struktury i budowy całego repertuaru przeciwciał. Wiąże się to z pozyskiwaniem ogromnych sekwencji RNA przeciwciał za pomocą sekwencjonowania nowej generacji.

Streszczenie

Ogromna zdolność adaptacyjna rozpoznawania antygenu przez przeciwciała jest podstawą nabytego układu odpornościowego. Pomimo naszego zrozumienia mechanizmów molekularnych leżących u podstaw wytwarzania szerokiego repertuaru przeciwciał przez nabyty układ odpornościowy, nie udało nam się jeszcze uzyskać globalnego obrazu pełnego repertuaru przeciwciał. W szczególności repertuar limfocytów B został uznany za czarną skrzynkę ze względu na astronomiczną liczbę klonów przeciwciał. Jednak technologie sekwencjonowania nowej generacji umożliwiają przełomowe odkrycia, które pozwalają nam lepiej zrozumieć repertuar limfocytów B. W tym raporcie opisujemy prostą i skuteczną metodę wizualizacji i analizy całego repertuaru przeciwciał mysich i ludzkich. Z narządów odpornościowych, reprezentatywnie dla śledziony u myszy i komórek jednojądrzastych krwi obwodowej u ludzi, przygotowano całkowite RNA, dokonano odwrotnej transkrypcji i amplifikacji metodą 5'-RACE. Stosując uniwersalny starter do przodu i startery antysensowne dla domen stałych specyficznych dla klasy przeciwciał, mRNA przeciwciał były jednolicie amplifikowane w proporcjach odzwierciedlających ich częstość w populacjach przeciwciał. Amplikony sekwencjonowano za pomocą sekwencjonowania nowej generacji (NGS), uzyskując ponad 105 sekwencji przeciwciał na próbkę immunologiczną. Opisujemy protokoły analiz sekwencji przeciwciał, w tym adnotację segmentu genu V(D)J, widok z lotu ptaka na repertuar przeciwciał oraz nasze metody obliczeniowe.

Wprowadzenie

System przeciwciał jest jednym z fundamentów nabytego układu odpornościowego. Jest bardzo silny przeciwko inwazyjnym patogenom ze względu na swoją ogromną różnorodność, delikatną specyficzność rozpoznawania antygenu i klonalną ekspansję komórek B specyficznych dla antygenu. Szacuje się, że repertuar limfocytów B wytwarzających przeciwciała wynosi więcej niż 1015 u jednej osoby1. Ta ogromna różnorodność jest generowana za pomocą rekombinacji genu VDJ w loci2. Opisanie całego repertuaru limfocytów B i ich dynamicznych zmian w odpowiedzi na immunizację antygenową jest zatem trudne, ale niezbędne do pełnego zrozumienia odpowiedzi przeciwciał przeciwko atakującym patogenom.

Ze względu na ich astronomiczną różnorodność, repertuar komórek B był uważany za czarną skrzynkę; jednak pojawienie się technologii NGS umożliwiło przełomowe odkrycia w lepszym zrozumieniu ich złożoności3,4. Z powodzeniem przeanalizowano cały repertuar przeciwciał, najpierw u danio pręgowanego5, następnie myszy6 i ludzi6,7. Chociaż NGS stał się obecnie potężnym narzędziem w badaniach nad adaptacyjną odpowiedzią immunologiczną, brakuje podstawowych analiz podobieństw i różnic w repertuarze przeciwciał u poszczególnych zwierząt.

U myszy stwierdzono, że repertuar IgM jest prawie identyczny u poszczególnych osób, podczas gdy repertuary IgG1 i IgG2c znacznie różnią się między osobami8. Oprócz profilu użycia genu V, obserwowana częstość występowania profilu VDJ w naiwnych obwodowych komórkach B jest bardzo podobna u różnych osób8. Analiza sekwencji aminokwasów regionu VDJ wykazała również występowanie tych samych sekwencji połączeniowych u różnych myszy znacznie częściej niż wcześniej sądzono8. Wyniki te wskazują, że mechanizmy powstawania repertuaru przeciwciał mogą być deterministyczne, a nie stochastyczne5,8,9. Proces rozwoju repertuaru przeciwciał u myszy został również z powodzeniem przeanalizowany przy użyciu NGS, aby jeszcze bardziej podkreślić potencjał NGS do szczegółowego odkrycia układu odpornościowego przeciwciał10.

W tym raporcie opisujemy prostą i skuteczną metodę wizualizacji i analizy repertuaru przeciwciał na poziomie globalnym.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucji i za zgodą Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Narodowego Instytutu Chorób Zakaźnych. Pobieranie próbek PBMC od zdrowych dorosłych ochotników, wykorzystanych jako reprezentatywny wynik w niniejszym raporcie, zostało przeprowadzone za zgodą Komisji Etycznej Narodowego Instytutu Chorób Zakaźnych w Tokio w Japonii, a od każdego uczestnika uzyskano pisemną świadomą zgodę przy użyciu formularza zatwierdzonego przez komisję etyczną.

1. Projekt podkładu

  1. Zaprojektuj uniwersalny starter do przodu do cDNA w celu amplifikacji mRNA immunoglobuliny bez odchylenia od starterów PCR, stosowanych w technikach 5'-RACE11,12 i SMART-PCR13.
  2. W przypadku amplifikacji genu immunoglobuliny VH zaprojektuj sekwencje specyficzne dla klasy immunoglobulin w obszarze stałym jako startery odwrotne8,14 (Rysunek 1A).
    UWAGA: Sekwencje znaczników multipleksowych można dodać do dowolnego z tych starterów, aby oznaczyć cząsteczki biblioteki z różnych źródeł próbek. Można również dodać sekwencje dla zagnieżdżonego PCR, zgodnie z instrukcją używanego zestawu15.
Uniwersalny podkład do przodu5'- AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
Odwrócone startery dla mysich immunoglobulin (Ref.8)
IgM_CH1:5'- CACCAGATTCTTATCAGAGAGGGGGCTCTC -3'
IgG1_CH1:5'- CATCCCAGGGTCACCATGGAGTTAGTTTGG -3'
IgG2c_CH1:5'- GTACCTCCACACACAGGGGAGTGGATAG -3'
IgG3_CH1:5'-ATGTGTCACTGCAGCCAGGGAAGGAGGA-3'
IgA_CH1:5'-GAATCAGGCAGCCGATTATCACGGGATCAC-3'
Igκ_CH1:5'- GCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG -3'
Igλ_CH1:5'- CTBGAGCTCYTCAGRGGAAGGTGGAAACA -3'
Odwrócone startery dla ludzkich immunoglobulin (Ref.14)
IgM_CH1:5'- GGGAATTCTCACAGGAGACG -3'
IgG_CH1:5'- AAGACCGATGGGCCCTTG -3'
IgD_CH1:5'- GGGTGTCTGCACCCTGATA -3'
IgA_CH1:5'- GAAGACCTTGGGGCTGGT -3'
IgE1_CH1:5'- GAAGACGGATGGGCTCTGT -3'
IgE2_CH1:5'- TTGCAGCAGCGGGTCAAGGG -3'
Igκ_CH1:5'- TGCTCATCAGATGGCGGGAAGAT -3'
Igλ_CH1:5'- AGAGGAGGGCGGGAACAGAGTGA -3'

Tabela 1: Sekwencje starterów do amplifikacji immunoglobulin metodą PCR

2. Izolacja kwasów nukleinowych z komórek i tkanek odpornościowych

UWAGA: Poniższa procedura służy do ekstrakcji kwasów nukleinowych ze śledziony myszy. Ma jednak zastosowanie do innych tkanek odpornościowych i komórek ludzkich, takich jak węzły chłonne lub komórki jednojądrzaste krwi obwodowej (PBMC) (Rysunek 1B).

  1. Wypreparować tkankę, np. śledzionę od 8-tygodniowej myszy C57BL/6 i przepuścić ją przez siatkę ze stali nierdzewnej (200 do 400 μm) z 2 ml buforu PBS w celu uzyskania rozproszonych komórek. Przenieść zawiesinę komórek do probówki mikrowirówkowej o pojemności 2,0 ml i wirować przez 5 minut w temperaturze 600 × g i temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant.
  2. Dodać 800 μl buforu lizującego ACK (150 mM NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0,1 mM Na2EDTA, pH 7,2) do osadu i inkubować na lodzie przez 2 minuty w celu lizy czerwonych krwinek w tkance.
  3. Przemyć komórki tkanek 2 ml PBS 3x, a następnie odwirować przez 5 minut w temperaturze 600 × g i temperaturze 4 °C.
  4. Dodać 800 μl odczynnika izotiocyjanianu fenolu/guanidyny do osadu, dokładnie wymieszać i inkubować w temperaturze około 25 °C przez 5 minut.
  5. Dodać chloroform (200 μl), wstrząsać ręcznie przez 15 s, a następnie inkubować przez 2 minuty w temperaturze około 25 °C.
  6. Rozdzielić fazy przez odwirowanie przez 15 minut w temperaturze 12 000 × g i temperaturze 25 °C i przenieść górną fazę wodną do świeżej probówki.
  7. Dodać jedną objętość 70% etanolu, krótko odwirować i nałożyć na kolumnę wirową z krzemionki.
  8. Wypłucz RNA za pomocą 30–100 μl wody.
  9. Określić ilościowo początkowe stężenie RNA za pomocą fluorometru (tabela materiałów).
  10. Oczyszczony RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Synteza cDNA i amplifikacja PCR

UWAGA: Opisana poniżej metoda opiera się na 5'-RACE11,12 i technikach SMART-PCR13. Szczegóły i optymalizacja reakcji są opisane w instrukcji zestawu 15. Materiałem wyjściowym dla immunoglobuliny myszy jest próbka z kroku 2.10. Materiałem wyjściowym dla immunoglobuliny ludzkiej jest próbka z tkanek ludzkich, np. PBMC, traktowana zgodnie z opisem w krokach 2.3–2.10.

  1. Zsyntetyzuj pierwszą nić cDNA od 2 do 10 μg całkowitej matrycy RNA przy użyciu startera 5'-RACE CDS (zawierającego oligo-dT) i oligonukleotydu SMART-PCR (tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta15.
    1. W przypadku immunoglobuliny mysiej amplifikacja cDNA metodą PCR za pomocą polimerazy DNA o wysokiej wierności przy użyciu uniwersalnego startera do przodu i starterów odwrotnych specyficznych dla klasy immunoglobulin (Tabela 1). Ustaw warunki cykli termicznych jako: 94 °C przez 2 minuty, następnie 40 cykli po 94 °C przez 30 s, 59 °C przez 30 s i 72 °C przez 30 s, a następnie ostatni krok przedłużania w 72 °C przez 5 minut
      UWAGA: Typowe eksperymenty wzmacniają klasy immunoglobulin IgM, IgG1, IgG2c, Igk i Igl, aby przyjrzeć się naiwnym, zależnym od Th1 i Th2-zależnym limfocytom B (Figura 3).
    2. W przypadku immunoglobuliny ludzkiej należy przeprowadzić 1. PCR przy użyciu uniwersalnego startera do przodu i specyficznych dla klasy immunoglobulin starterów odwrotnych (Tabela 1) z sekwencjami znaczników. Dołączyć sekwencje indeksowe dla każdej próbki za pomocą 2ndPCR przy użyciu starterów sekwencji indeksowej. Stosować następujące warunki PCR i polimerazę Taq: 94 °C przez 2 min, 21 cykli (1st PCR) lub 32 cykle (2nd PCR) w temperaturze 94 °C przez 30 s, 59 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s.
      UWAGA: Typowe eksperymenty wzmacniają klasy immunoglobulin IgM, IgD, IgG (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4), IgA (IgA1 i IgA2), IgE, Igk i Igl, aby przyjrzeć się wszystkim populacjom komórek B (Figura 4).
  2. Poddać produkty PCR elektroforezie w żelu agarozowym i oczyścić fragmenty o objętości od 600 do 800 pz za pomocą kolumny wirowej z membraną krzemionkową.
    1. Elektroforezę próbki z ppkt 3.2.1 lub 3.2.2 na 2% żelu agarozowym.
    2. Zobrazuj prążki DNA na transiluminatorze UV i wytnij plasterek żelu zawierający szerokie pasmo od 600 do 800 pz.
    3. Dodać 10 μl roztworu wiążącego błonę na 10 mg plastra żelu. Wymieszać i inkubować w temperaturze 50–65 °C, aż do całkowitego rozpuszczenia żelu.
    4. Przenieść roztwór żelu na kolumnę wirową z membraną krzemionkową. Przemyć raz buforem płuczącym i wymyć DNA 50 μl wody wolnej od nukleaz (tabela materiałów).
  3. Oznacz ilościowo oczyszczone amplikony za pomocą fluorometru i puluj amplikony z każdej klasy immunoglobulin w równych ilościach do sekwencjonowania NGS.
    UWAGA: Zazwyczaj odzyskiwano DNA amplikonu o wielkości 2-10 μg dla każdej klasy immunoglobulin. Wymieszać każdy roztwór próbki równomiernie w ilości DNA, aby uzyskać 50 μl roztworu zawierającego 10-20 ng DNA/μl.
  4. Określ rozmiar i koncentrację bibliotek za pomocą elektroforezy opartej na mikrokapilarnach z chipem do wymiarowania DNA (tabela materiałów). Przechowywać biblioteki w temperaturze -20 °C.

4. Sekwencjonowanie bibliotek NGS

  1. Wygeneruj plik SampleSheet.cvs dla przebiegu sekwencjonowania, określając nazwę próbki, informacje o indeksie i instrukcję, aby uzyskać tylko pliki .fastq.
  2. Rozmrozić kasetę z odczynnikiem (Tabela materiałów) i biblioteki.
  3. Zrobić 0,2 N NaOH i rozcieńczyć biblioteki, aby uzyskać pożądane stężenie molowe.
  4. Wypłucz i osusz komorę przepływową. Dodać 600 μl rozcieńczonego i zdenaturowanego roztworu bibliotecznego do studzienki wkładu z odczynnikiem.
  5. Rozpocznij sekwencjonowanie.

5. Kontrola jakości danych NGS

  1. Przeprowadź kontrolę jakości danych FASTQ za pomocą "FASTX-Toolkit"16.
    UWAGA: Podstawowy przykład używanych ustawień parametrów jest następujący:
    fastq_quality_trimmer -v -t 20 -l 200 -i [nazwa_pliku.fastq] -o [nazwa_pliku.fastq]
    fastq_quality_filter -v -q 20 -p 80 -i [nazwa_pliku.fastq] -o [nazwa_pliku.fastq]
    fastx_reverse_complement -v -i [nazwa_pliku.fastq] -o [nazwa_pliku.fastq]
  2. Sformatuj pliki wyjściowe do "fasta nucleic acid (.fna)" za pomocą następującego polecenia:
    fastq_to_fasta -v -n -i [nazwa_pliku.fastq] -o [nazwa_pliku.fna]

6. Ekstrakcja i analiza sekwencji immunoglobulin z danych .fna

UWAGA: Przykładowe programy zostały zaimplementowane w środowisku UNIX. Użyj ich jako przykładowych odniesień, ponieważ wydajność może zależeć od systemu operacyjnego i środowiska sprzętowego. Autorzy nie ponoszą odpowiedzialności za błędy lub pominięcia. Języki programowania, Perl17, R18 oraz wymagane moduły muszą być zainstalowane zgodnie z instrukcjami na cytowanych stronach internetowych. program IgBLAST należy zainstalować zgodnie z instrukcją na odpowiedniej stronie internetowej19,20.

  1. Pobierz poniższe przykłady wewnętrznych programów do analiz repertuarowych ze strony https://github.com/KzPipeLine/KzPipeLine:
    03_PipeLine_Mouse.zip; Zestaw przykładowych programów do analiz sekwencji przeciwciał myszy.
    05_PipeLine_Human.zip; Zestaw przykładowych programów do analiz sekwencji ludzkich przeciwciał.
  2. Wyodrębnij odczyty przeciwciał w danych sekwencji: Wyodrębnij sekwencje immunoglobuliny (Ig) każdej klasy Ig z danych (.fna ) za pomocą programu Perl, który przeszukuje sekwencje sygnatur w każdym stałym regionie immunoglobuliny (Tabela 2).
    1. W przypadku genów łańcucha ciężkiego (IgH) immunoglobuliny myszy wyodrębnij odczyty za pomocą następującego polecenia:
      $ perl 01_KzMFTIgCmgggaNtdVer3_Kz160607.pl [Nazwa pliku wejściowego] [Nazwa pliku wyjściowego (sufiks)]
    2. W przypadku genów łańcucha lekkiego immunoglobuliny myszy (IgL) wyodrębnia się odczyty za pomocą następującego polecenia:
      $ perl 01_KzMFTCkltNtdVer1_170810.pl [Nazwa pliku wejściowego] [Nazwa pliku wyjściowego (sufiks)]
    3. W przypadku genów łańcucha ciężkiego ludzkiej immunoglobuliny (IgH) wyodrębnij odczyty za pomocą następującego polecenia:
      $ perl 01_KzMfHuIgHCmgadeNtdVer1_Kz180312.pl [Nazwa pliku wejściowego] [Nazwa pliku wyjściowego (sufiks)]
    4. W przypadku genów łańcucha lekkiego ludzkiej immunoglobuliny (IgL) wyodrębnij odczyty za pomocą następującego polecenia:
      $ perl 01_KzMfHuIgCkltNtd_180316.pl [Nazwa pliku wejściowego] [Nazwa pliku wyjściowego (sufiks)]
  3. Opisz i sprawdź produktywność rekombinacji genu V(D)J:
    UWAGA: Metoda opisana poniżej wykorzystuje autonomiczną klasę IgBLAST19 do adnotacji segmentów genu V(D)J w sekwencji. Ustaw bazę danych dla genów V(D)J i ustawienia parametrów dla IgBLAST zgodnie z opisem20.
    1. Opisz geny łańcucha ciężkiego (IgH) immunoglobuliny myszy za pomocą następującego polecenia:
      $ igblastn -germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIghV_NtdDb.txt -germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIghJ_NtdDb.txt -germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt -organism mouse -domain_system imgt -query ./$InFile -auxiliary_data $IGDATA/optional_file/mouse_gl.aux -show_translation -outfmt 7 >> ./$OutName
    2. Opisz geny łańcucha lekkiego immunoglobuliny myszy (IgL) za pomocą następującego polecenia:
      $ igblastn -germline_db_V $IGDATA/ImtgMouseIgkV_NtdDb.txt -germline_db_J $IGDATA/ImtgMouseIgkJ_NtdDb.txt -germline_db_D $IGDATA/ImtgMouseIghD_NtdDb.txt -organism mouse -domain_system imgt -query ./$InFile -auxiliary_data $IGDATA/optional_file/mouse_gl.aux -show_translation -outfmt 7 >> ./$OutName
    3. Opisz geny ludzkiego łańcucha ciężkiego immunoglobuliny (IgH) za pomocą następującego polecenia:
      $ igblastn -germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIghV_NtdDb.txt -germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIghJ_NtdDb.txt -germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt -organism human -domain_system imgt -query ./$InFile -auxiliary_data $IGDATA/optional_file/Human_gl.aux -show_translation -outfmt 7 >> ./$OutName
    4. Opisz geny ludzkiego łańcucha lekkiego immunoglobuliny (IgL) za pomocą następującego polecenia:
      $ igblastn -germline_db_V $IGDATA/ImtgHumanIgkV_NtdDb.txt -germline_db_J $IGDATA/ImtgHumanIgkJ_NtdDb.txt -germline_db_D $IGDATA/ImtgHumanIghD_NtdDb.txt -organism human -domain_system imgt -query ./$InFile -auxiliary_data $IGDATA/optional_file/human_gl.aux -show_translation -outfmt 7 >> ./$OutName
  4. Wizualizacja globalnej cechy repertuaru przeciwciał.
    1. Wizualizuj repertuar IgH myszy za pomocą następującego polecenia:
      $ . 00a1_3DView_MoIgH_Kz180406.sh
      UWAGA: Plik wejściowy to nazwa_pliku.fna (dane sekwencji), najlepiej plik wyjściowy z wersji 6.2.1. Plik ten należy umieścić w niższym katalogu (folderze) o nazwie "nazwa_pliku". W wierszu 50 skryptu powłoki przypisz "nazwę pliku" dla Para_4.
    2. Wizualizuj ludzki repertuar IgH za pomocą następującego polecenia:
      $ . 00a1_3DView_HuIgH_Kz180411.sh
      UWAGA: Plik wejściowy to dane sekwencji filename.fna, najlepiej plik wyjściowy 6.2.3. Ten plik należy umieścić w dolnym katalogu (folderze) o nazwie "nazwa_pliku". W wierszu 46 skryptu powłoki przypisz "nazwę pliku" dla Para_4.
    3. Wizualizuj repertuar IgL myszy za pomocą następującego polecenia:
      $ . 00_2DViewS_MoIgL_Kz180406.sh
      UWAGA: W tym rurociągu Igk i Igl są przetwarzane jednocześnie. Plik wejściowy to nazwa_pliku.fna (dane sekwencji), najlepiej plik wyjściowy z 6.2.2. Plik ten należy umieścić w dolnym katalogu (folderze) o nazwie "nazwa_pliku". W wierszu 53 skryptu powłoki przypisz "nazwę pliku" dla Para_4. Nazwa pliku wyjściowego, kończąca się na "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt", podaje współrzędne dwuwymiarowego wykresu słupkowego (Rysunek 3, IgL).
    4. Wizualizuj ludzki repertuar IgL za pomocą następującego polecenia:
      $ . 00_2DView_HuIgL_Kz180319.sh
      UWAGA: W tym rurociągu Igk i Igl są przetwarzane jednocześnie. Plikiem wejściowym są dane sekwencji nazwa_pliku.fna, najlepiej plik wyjściowy 6.2.4. Plik ten należy umieścić w niższym katalogu (folderze) o nazwie "nazwa_pliku". W wierszu 53 skryptu powłoki przypisz "filename" dla Para_4. Nazwa pliku wyjściowego kończąca się na "_IgKlCount.txtDim2Rpm.txt" podaje współrzędne dwuwymiarowego wykresu słupkowego (Rysunek 4, IgL).

Wyniki

Repertuary przeciwciał myszy

Ogólną perspektywę repertuaru przeciwciał mysich można uzyskać z komórek lub tkanek, takich jak śledziona, szpik kostny, węzły chłonne lub krew. Rycina 3 przedstawia reprezentatywne wyniki repertuarów IgM, IgG1, IgG2c oraz lekkich łańcuchów immunoglobulin (IgL) ze śledziony naiwnej myszy. Podsumowanie liczby odczytów przedstawiono w Tabeli 3. Na przykład 166 175/475 144 odczytów zawierało specyficzną sekwencję sygnaturową dla IgM (Tabela 2), a 133 371/166 175 odczytów zostało zidentyfikowanych przez program IgBLAST19 jako produktywne sekwencje VDJ.

Rysunek 3 przedstawia profil repertuaru rearanżacji VDJ za pomocą 3D-VDJ-plot, w którym wielkość każdej kuli reprezentuje względną liczbę odczytów; innymi słowy, liczbę mRNA przeciwciał w całych komórkach B. Siatka 3D składa się ze 110 IGHV, 12 IGHD i 4 IGHJ, które są ułożone tak, aby odzwierciedlać ich kolejność na chromosomie. Ponadto geny jednoznacznie nieprzypisane przez IgBLAST zostały zgromadzone oddzielnie na ostatniej pozycji dla każdej linii IGHV, IGHD i IGHJ, co dało łącznie 7 215 węzłów w prostopadłościanie.

Ponadto na Rysunku 3 przedstawiono wykres 2D-VJ obrazujący profil rearanżacji VJ w repertuarze IgL. Długość każdego słupka na tym wykresie reprezentuje względną liczbę odczytów. Oś X reprezentuje 101 genów IGLVκ oraz 3 geny IGLVλ, a oś Y reprezentuje 4 geny IGLJκ oraz 3 geny IGLJλ. Nieopisane geny V i J są przedstawione na prawej krawędzi wykresu.

Sekwencje regionu determinującego komplementarność 3 (CDR3) tych produktywnych odczytów, które odpowiadają za większość swoistości wiązania antygenu, są podane w wynikach programu IgBLAST. Sekwencje CDR3 można analizować statystycznie, uwzględniając powtórzenia biologiczne lub techniczne, zgodnie z wcześniej opisaną metodą8,10.

Ludzkie repertuary przeciwciał

Perspektywę ludzkiego repertuaru przeciwciał jako całości można analizować w oparciu o różne tkanki, w tym mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) lub tkanki patologiczne. Rycina 4 przedstawia reprezentatywne wyniki repertuarów IgM, całkowitego IgG (IgG1, IgG2, IgG3 i IgG4), całkowitego IgA (IgA1 i IgA2), IgD, IgE oraz IgL z prawidłowych PBMC. Podsumowanie liczby odczytów przedstawiono w Tabeli 3. Na przykład 90 238/1 582 754 odczytów zawierało sekwencję sygnaturową specyficzną dla IgM, a 67 896/90 238 odczytów było produktywnych pod kątem VDJ.

Profil repertuaru rearanżacji VDJ przedstawiono na wykresie 3D-VDJ, na którym rozmiar każdej kuli reprezentuje względną liczbę odczytów; innymi słowy, liczbę mRNA przeciwciał z całkowitej populacji PBMC (Rycina 4). Siatka 3D składa się z 56 genów IGHV, 27 IGHD i 6 IGHJ, ułożonych w kolejności ich występowania na chromosomie. Dodatkowo geny przypisane niejednoznacznie przez program IgBLAST są reprezentowane oddzielnie w ostatniej pozycji dla każdej linii IGHV, IGHD i IGHJ, co daje łącznie 11 172 węzły w prostopadłościanie.

Profil rearanżacji VJ w repertuarze IgL przedstawiono na dwuwymiarowym wykresie VJ (2D-VJ-plot), w którym długość każdego słupka reprezentuje względną liczbę odczytów (Rysunek 4). Oś x przedstawia 41 genów IGLVκ i 32 geny IGLVλ, a oś y przedstawia 5 genów IGLJκ i 5 genów IGLJλ. Nieadnotowane geny V i J są przedstawione na prawej krawędzi wykresu.

Sekwencje CDR3 człowieka są zawarte w wynikach programu IgBLAST i mogą być analizowane statystycznie zgodnie z wcześniej opisaną metodą8,10.

Klasa immunoglobulinySensAntysens
Mysie ciężkie łańcuchy immunoglobuliny (C57BL/6)
IgMAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCGACATTTGGGAAGGACTGACT
IgG1AAAACGACACCCCCATCTGTCGACAGATGGGGGTGTCGTTTT
(wariant IgG1)AAAACAACACCCCCATCAGTCGACTGATGGGGGTGTTGTTTT
IgG2cAAAACAACAGCCCCATCGGTCGACCGATGGGGCTGTTGTTTT
IgG3GTGATCCCGTGATAATCGGCTAGCCGATTATCACGGGATCAC
IgATCCCTTGGTCCCTGGCTGCAGTCCCTTGGTCCCTGGCTGCAG
Mysie lekkie łańcuchy immunoglobuliny (C57BL/6)
IgκCTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCGCTCACTGGATGGTGGGAAGATGGATACAG
Igλ1TGTTTCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCGAGCTCGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGAAACA
Igλ2TGTTTCCACCTTCCTCTGAGGAGCTCAAGCTTGAGCTCCTCAGAGGAAGGTGGAAACA
Igλ3TGTTTCCACCTTCCCCTGAGGAGCTCCAGCTGGAGCTCCTCAGGGGAAGGTGGAAACA
Igλ4TGTTCCCACCTTCCTCTGAAGAGCTCAAGCTTGAGCTCTTCAGAGGAAGGTGGGAACA
Ludzkie ciężkie łańcuchy immunoglobuliny
IgMGGGAGTGCATCCGCCCCAACGTTGGGGCGGATGCACTCCC
IgGGCTTCCACCAAGGGCCCATCGATGGGCCCTTGGTGGAAGC
IgAGCATCCCCGACCAGCCCCAAGACCGATGGGGCTGTTGTTTT
IgDGCACCCACCAAGGCTCCGGATCCGGAGCCTTGGTGGGTGC
IgEGCCTCCACACAGAGCCCATCGATGGGCTCTGTGTGGAGGC
Ludzkie lekkie łańcuchy immunoglobuliny
IgκACTGTGGCTGCACCATCTGCGCAGATGGTGCAGCCACAGT
Igλ1,2,6GTCACTCTGTTCCCGCCCTCGAGGGCGGGAACAGAGTGAC
Igλ3,7GTCACTCTGTTCCCACCCTCGAGGGTGGGAACAGAGTGAC

Tabela 2: Podsumowanie sekwencji sygnaturowych immunoglobulin

Mysi IgHCałkowita liczba odczytówIgMIgG1IgG2c
Proszę podać tekst źródłowy do przetłumaczenia.475,144
zawierający IgC166,175229,67136,628
produktywny VDJ133,371196,58331,446
Mysi IgLCałkowita liczba odczytówIgKappaIgLambda
Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.527,668
zawierający IgC178,94821,446
VJ-produktywne160,92416,988
Ludzkie IgHCałkowita liczba odczytówIgMIgGIgAIgDIgE
Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia.1,582,754
zawierający IgC90,2385,29894,06175,5492,932
produktywne VDJ67,8962,77578,20356,4953
Ludzki IgLCałkowita liczba odczytówIgKappaIgLambda
Proszę podać tekst do przetłumaczenia.1,582,754
zawierające IgC120,31664,148
produktywny VJ97,16952,324

Tabela 3: Podsumowanie liczby odczytów w eksperymentach

figure-results-1
Rycina 1: Schematyczny przedstawienie strategii sekwencjonowania służącej do analizy repertuarów przeciwciał u poszczególnych myszy. (A) Całkowite RNA z komórek odpornościowych lub tkanek poddano odwrotnej transkrypcji, a następnie amplifikacji metodą PCR przy użyciu uniwersalnego primera forward oraz specyficznych dla klasy immunoglobulin primerów reverse. Amplikony z każdej klasy immunoglobulin połączono i przygotowano do sekwencjonowania nowej generacji.(B) Powtórzenia biologiczne, takie jak śledziony od myszy C57BL/6, potraktowano w następujący sposób: z próbek śledziony wyizolowano całkowite RNA, a cDNAs amplifikowano metodą 5'-RACE przy użyciu primera uniwersalnego oraz primera specyficznego dla klasy przeciwciał. Następnie przygotowano je do sekwencjonowania nowej generacji z wykorzystaniem primerów znakujących dla poszczególnych myszy. Części ryciny zostały zaadaptowane z8 za zgodą autora. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-2
Rysunek 2: Schemat algorytmu przetwarzania danych służącego do analizy repertuarów przeciwciał u poszczególnych myszy. Odczyty amplikonów uzyskane po sekwencjonowaniu nowej generacji przetwarzano w następujący sposób: (1) sprawdzono sekwencje odczytów pod kątem obecności sekwencji sygnaturowych specyficznych dla klasy przeciwciał; (2) zbadano sekwencje pod kątem fragmentów genów V, D i J przy użyciu IMGT/HighV-Quest i/lub IgBLAST; (3) zebrano sekwencje zawierające produktywne złącze VDJ; oraz (4) sekwencje te wykorzystano do analizy ogólnych cech repertuaru, CDR3 itp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Globalna wizualizacja danych dla repertuarów przeciwciał mysich. Ogólne profile repertuarów każdej klasy przeciwciał zostały zwizualizowane za pomocą wykresu 3D-VDJ-plot. Oś x reprezentuje 110 genów IGHV uporządkowanych zgodnie z ich ułożeniem na chromosomie. Oś y i z reprezentują odpowiednio 12 genów IGHD oraz 4 genów IGHJ. Objętość sfer w każdym węźle reprezentuje liczbę odczytów. Czerwone sfery: nieadnotowane geny V, D i J. Rozkłady odczytów IgL przedstawiono na wykresie 2D-VJ-plot, w którym długość każdego słupka reprezentuje względną liczbę odczytów. Oś x reprezentuje 101 genów IGLVκ i 3 geny IGLVλ, a oś y reprezentuje 4 geny IGLJκ i 3 geny IGLJλ. Nieadnotowane geny V i J są przedstawione na prawej krawędzi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rycina 4: Globalna wizualizacja danych dla ludzkich repertuarów przeciwciał. Ogólne profile repertuarów każdej klasy przeciwciał zostały zwizualizowane za pomocą wykresu 3D-VDJ-plot. Oś x przedstawia 56 genów IGHV uporządkowanych zgodnie z ich położeniem na chromosomie. Osie y oraz z reprezentują odpowiednio 27 genów IGHD i 6 genów IGHJ. Objętość sfer w każdym węźle odpowiada liczbie odczytów. Czerwone sfery: niezaadnotowane geny V, D i J. Odczyty IgL są rozmieszczone na wykresie 2D-VJ-plot, w którym długość każdego słupka reprezentuje względną liczbę odczytów. Oś x przedstawia 41 genów IGLVκ oraz 32 geny IGLVλ, a oś y przedstawia 5 genów IGLJκ oraz 5 genów IGLJλ. Niezaadnotowane geny V i J są przedstawione na prawej krawędzi. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Opisana tutaj metoda wykorzystuje NGS do RNA przeciwciał amplifikowanych metodą 5'-RACE. W przeciwieństwie do metod wykorzystujących zdegenerowane startery genu 5'-VH, mRNA każdej klasy przeciwciał są równomiernie amplifikowane przy użyciu uniwersalnych starterów do przodu. Ponadto zastosowanie starterów antysensownych specyficznych dla regionu stałego 1 (CH1) genu przeciwciała umożliwia profilowanie repertuarowe specyficznych klas immunoglobulin. Jest to bardzo korzystne dla analizy odpowiedzi przeciwciał specyficznej dla danej klasy, a także dla porównania repertuaru naiwnych i uodpornionych 8,9.

Najbardziej prawdopodobną pułapką tej metody jest niedostatek amplifikowanych wiadomości immunoglobulinowych. Głębokość repertuaru przeciwciał uzyskana za pomocą tego protokołu zasadniczo zależy od amplifikacji PCR opisanej w krokach 3.1 i 3.2. Jeśli głębokość repertuaru nie zostanie uzyskana prawidłowo, zdecydowanie zaleca się zmianę proporcji matrycowego cDNA i starterów w krokach 3.2.1 lub 3.2.2.

Ogólnie rzecz biorąc, około 20% odczytów przeciwciał wytwarzanych przez NGS to sekwencje niejednoznaczne21. Nawet przy ustalonych "metodach korekcyjnych" 5-10% pozostaje niejednoznacznych3. W związku z tym przeanalizowaliśmy sekwencję i przefiltrowaliśmy surowe odczyty zawierające sekwencje sygnatur odpowiadające stałym regionom immunoglobulin (CμH1, Cγ1H1, Cγ2cH1 itp.). W związku z tym analiza hipermutacji somatycznych wymaga dokładnych badań.

Jednym z ograniczeń tej metody jest to, że nie można wywnioskować pary łańcuchów ciężkich i lekkich immunoglobulin. Stąd spojrzenie repertuarowe uzyskane tą metodą nie jest holistyczne. Możliwe jest jednak przybliżenie par o najwyższej pozycji w rankingu poprzez analizę statystyczną danych10. Niedawno doniesiono również o nowej metodzie sekwencjonowania par immunoglobulin 3,4.

Sekwencje immunoglobulin w danych wyjściowych .fna zostały wyekstrahowane na podstawie obecności sekwencji sygnatur genów immunoglobulin. Segmenty genów V, D i J zostały następnie oznaczone i oceniono produktywność rearanżacji V(D)J. Opisano również sekwencje regionu 3 determinującego komplementarność (CDR3). Te systematyczne badania sekwencji immunoglobulin w danych .fna zostały z pożytkiem dostarczone przez serwer IMGT/HighV-QUEST 22,23,24. Jednak zbudowanie zautomatyzowanego potoku przetwarzania ma tę zaletę, że można analizować duże dane eksperymentalne. Rurociąg dostosowany do każdego celu jest możliwy do skonfigurowania przy użyciu autonomicznego protokołu IgBLAST19. Takie podejście wymaga podstawowych umiejętności programowania, ale jest bardzo przydatne do szczegółowych analiz układu immunoglobulin. Opisane potoki są przykładami dostosowanego protokołu (rysunek 2).

Liczba odczytanych przeciwciał jest proporcjonalna do ilości RNA przeciwciał w próbce, odzwierciedlając składniki przeciwciał układu przeciwciał w danych punktach czasowych 5,8,25. Opisana tutaj metoda daje widok z lotu ptaka na konstytucję V(D)J repertuaru przeciwciał przy użyciu programów R 8,18,26.

Globalny wgląd w repertuar przeciwciał IgM u poszczególnych nieleczonych myszy ujawnił wysoce konserwatywny profil VDJ w porównaniu z profilami IgG1 lub IgG2c8. Doniesiono, że kombinacje VDJ niedojrzałych danio pręgowanego są wysoce stereotypowe9. W przeciwieństwie do tego, ludzkie kombinacje VDJ są zgłaszane jako wysoce skośne6. Wysoce konserwatywne deterministyczne profile VDJ w naiwnych komórkach B są prawdopodobnie generowane albo przez skośne rearanżacje VDJ, albo negatywną selekcję z autoantygenami obecnymi w organizmie. Na przykład IGHV11-2 ulega ekspresji preferencyjnie w repertuarze płodowych IgM27 , a tę dominację przypisuje się autoreaktywności IGHV11-2 wobec starzejących się erytrocytów27. Co ciekawe, IGHV11-2 był również najczęstszym głównym repertuarem w naszej wcześniej opublikowanej analizie naiwnej IgM8.

Opisana tutaj metoda jest przydatna do rozszyfrowywania repertuarów przeciwciał reagujących na antygen poprzez kompleksową analizę przestrzeni repertuaru przeciwciał generowanej w poszczególnych ciałach, unikając przypadkowego pominięcia kluczowych repertuarów przeciwciał 8,10. Metoda ta pozwala również na szczegółowe badanie dynamiki sieci przeciwciał, co ułatwiłoby przyspieszone odkrywanie przeciwciał ochronnych przeciwko nowo pojawiającym się patogenom.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant od AMED w ramach grantu o numerze JP18fk0108011 (KO i SI) i JP18fm0208002 (TS, KO, i YO), oraz dotację z Ministerstwa Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii (15K15159) dla KO. Dziękujemy Sayuri Yamaguchi i Satoko Sasaki za cenną pomoc techniczną. Serdecznie dziękujemy firmie Editage (www.editage.jp) za redakcję w języku angielskim.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki paskowe 0,2 mlThermo Fisher ScientificAB0452120 pasków
100 pz Drabinka DNATOYOBODNA-0350,5 ml
2100 Systemy bioanalizatorówAgilent TechnologiesG2939BA /2100
Kwas octowyWako017-00256500 ml
Agaroza, NuSieve GTGLonza50084
Amon ChlorekWako017-02995500 g
ChloroformWako038-02606500 ml
Dulbecco's PBS (-)" Nissui"NISSUI 08192
Kwas etylenodiamino-N,N,N',N'-tetraoctowy sól disodowa dwuwodna (2NA)Wako345-01865500 g
Falcon 40 µ m Sitko do komórekFalcon35234050/Case
rurka zamka 1,7mL SPRZĘT BMBM-15
rurka blokująca 2,0 mLSPRZĘT BMBM-20
MiSeq Reagent Kit v2illuminaMS-102-2003500 cykli
MiSeq SystemilluminaSY-410-1003
Spektrofotometr NanoDrop 2000c Thermo Fisher Scientific
Wodorowęglan potasuWako166-03275500 g
PureLink RNA MiniKit technologie życia12183018A
Fluorometr Qubit 3.0Thermo Fisher ScientificQ33216
Zestaw testowy Qubit dsDNA HSTesty
Thermo Fisher Scientific Q32854 500SMARTer WYŚCIG 5'/3' Zestaw Klonat 
Wersja gorącego startu TaKaRa Ex Taq Takara Bio Inc. Karabin Jądrowy RR006A 
Baza TrizmaSigmaT60661 kg
Odczynnik TRIzolAmbionThermo Fisher Scientific15596026100 ml
Ultra Clear qPCR CapsThermo Fisher ScientificAB0866120 pasków
UltraPure Ethidium BromekThermo Fisher Scientific15585011
Wizard SV Żel i system czyszczenia PCR Promega A9282
634858 (wersja angielska)

Bibliografia

  1. Schroeder, H. W. Jr Similarity and divergence in the development and expression of the mouse and human antibody repertoires. Developmental & Comparative Immunology. 30 (1-2), 119-135 (2006).
  2. Tonegawa, S. Somatic generation of antibody diversity. Nature. 302 (5909), 575-581 (1983).
  3. Georgiou, G., et al. The promise and challenge of high-throughput sequencing of the antibody repertoire. Nature Biotechnology. 32 (2), 158-168 (2014).
  4. Lees, W. D., Shepherd, A. J. Studying Antibody Repertoires with Next-Generation Sequencing. Methods in Molecular Biology. 1526, 257-270 (2017).
  5. Weinstein, J. A., Jiang, N., White, R. A. 3rd, Fisher, D. S., Quake, S. R. High-throughput sequencing of the zebrafish antibody repertoire. Science. 324 (5928), 807-810 (2009).
  6. Arnaout, R., et al. High-resolution description of antibody heavy-chain repertoires in humans. PLoS One. 6 (8), e22365(2011).
  7. Boyd, S. D., et al. Individual variation in the germline Ig gene repertoire inferred from variable region gene rearrangements. Journal of Immunology. 184 (12), 6986-6992 (2010).
  8. Kono, N., et al. Deciphering antigen-responding antibody repertoires by using next-generation sequencing and confirming them through antibody-gene synthesis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 487 (2), 300-306 (2017).
  9. Jiang, N., et al. Determinism and stochasticity during maturation of the zebrafish antibody repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (13), 5348-5353 (2011).
  10. Sun, L., et al. Distorted antibody repertoire developed in the absence of pre-B cell receptor formation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 495 (1), 1411-1417 (2018).
  11. Olivarius, S., Plessy, C., Carninci, P. High-throughput verification of transcriptional starting sites by Deep-RACE. Biotechniques. 46 (2), 130-132 (2009).
  12. Yeku, O., Frohman, M. A. Rapid amplification of cDNA ends (RACE). Methods in Molecular Biology. 703, 107-122 (2011).
  13. Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: a SMART approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30 (4), 892-897 (2001).
  14. Vollmers, C., Sit, R. V., Weinstein, J. A., Dekker, C. L., Quake, S. R. Genetic measurement of memory B-cell recall using antibody repertoire sequencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13463-13468 (2013).
  15. SMARTer RACE 5’/3’ Kit User Manual (634858, 634859). , (2018).
  16. FASTX-Toolkit. , Available from: http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/ (2018).
  17. Perl. , Available from: https://perldoc.perl.org/ (2018).
  18. R: A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2016).
  19. Ye, J., Ma, N., Madden, T. L., Ostell, J. M. IgBLAST: an immunoglobulin variable domain sequence analysis tool. Nucleic Acids Research. 41 (Web Server issue), W34-W40 (2013).
  20. IgBLAST. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/faq.html (2018).
  21. Prabakaran, P., Streaker, E., Chen, W., Dimitrov, D. S. 454 antibody sequencing - error characterization and correction. BMC Research Notes. 4, 404(2011).
  22. Lefranc, M. P., et al. IMGT, the international ImMunoGeneTics information system. Nucleic Acids Research. 37 (Database issue), D1006-D1012 (2009).
  23. Alamyar, E., Duroux, P., Lefranc, M. P., Giudicelli, V. IMGT((R)) tools for the nucleotide analysis of immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) V-(D)-J repertoires, polymorphisms, and IG mutations: IMGT/V-QUEST and IMGT/HighV-QUEST for NGS. Methods in Molecular Biology. 882, 569-604 (2012).
  24. IMGT/HighV-QUEST. , Available from: http://www.imgt.org/HighV-QUEST/login.action (2018).
  25. Glanville, J., et al. Precise determination of the diversity of a combinatorial antibody library gives insight into the human immunoglobulin repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (48), 20216-20221 (2009).
  26. rgl: 3D Visualization Using OpenGL. , R package version 0.95.1247 (2015).
  27. Hardy, R. R., Wei, C. J., Hayakawa, K. Selection during development of VH11+ B cells: a model for natural autoantibody-producing CD5+ B cells. Immunological Reviews. , 60-74 (2004).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Repertuar przeciwciaadnotacja V D Jmetoda 5 RACEamplifikacja immunoglobulincytometria przep ywowaanaliza bioinformatycznamononuklearne kom rki krwi obwodowejtkanka ledzionyelektroforeza w elu

Powiązane artykuły