Artykuł metodologiczny

Bezkomórkowa synteza białek na bazie Escherichia coli: Protokoły dla solidnej, elastycznej i dostępnej technologii platformy

DOI:

10.3791/58882

⸱

25 lutego 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 2Center for Applications in Biotechnology, California Polytechnic State University, San Luis Obispo, 3Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University, 4Department of Chemical and Biological Engineering, Northwestern University, 5Chemistry of Life Processes Institute, Northwestern University, 6Center for Synthetic Biology, Northwestern University, 7Interdisciplinary Biological Sciences Program, Northwestern University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół szczegółowo opisuje kroki, koszty i sprzęt niezbędny do generowania ekstraktów komórkowych na bazie E. coli i przeprowadzania reakcji syntezy białek in vitro w ciągu 4 dni lub krócej. Aby wykorzystać elastyczny charakter tej platformy do szerokich zastosowań, omawiamy warunki reakcji, które można dostosować i zoptymalizować.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ciągu ostatnich 50 lat, Cell-Free Protein Synthesis (CFPS) stała się potężną technologią pozwalającą wykorzystać zdolność transkrypcyjną i translacyjną komórek w probówce. Eliminując potrzebę utrzymania żywotności komórki i eliminując barierę komórkową, CFPS ma fundamentalne znaczenie dla nowych zastosowań w bioprodukcji tradycyjnie trudnych białek, a także zastosowań w szybkim prototypowaniu inżynierii metabolicznej i genomiki funkcjonalnej. Nasze metody wdrażania platformy CFPS opartej na E. coli umożliwiają nowym użytkownikom dostęp do wielu z tych aplikacji. W tym miejscu opisujemy metody przygotowania ekstraktu przy użyciu wzbogaconych pożywek, kolb z przegrodami oraz powtarzalnej metody lizy komórek opartej na przestrajalnej sonikacji. Ekstrakt ten może być następnie wykorzystany do ekspresji białek zdolnych do wytworzenia 900 μg/ml lub więcej super folderowego białka zielonej fluorescencji (sfGFP) w ciągu zaledwie 5 godzin od konfiguracji eksperymentalnej do analizy danych, pod warunkiem, że wcześniej przygotowano odpowiednie zapasy odczynników. Szacowany koszt początkowy uzyskania odczynników wynosi 4,500 USD, które pozwolą na utrzymanie tysięcy reakcji przy szacunkowym koszcie 0,021 USD za μg wyprodukowanego białka lub 0,019 USD za μl reakcji. Ponadto metody ekspresji białek odzwierciedlają łatwość konfiguracji reakcji obserwowaną w dostępnych na rynku systemach dzięki optymalizacji wstępnych mieszanek odczynników, przy ułamku kosztów. Aby umożliwić użytkownikowi wykorzystanie elastycznego charakteru platformy CFPS do szerokich zastosowań, zidentyfikowaliśmy różne aspekty platformy, które można dostroić i zoptymalizować w zależności od dostępnych zasobów i pożądanych wyników ekspresji białek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synteza białek bez komórek (CFPS) pojawiła się jako technologia, która w ciągu ostatnich 50 lat otworzyła szereg nowych możliwości w zakresie produkcji białek, genomiki funkcjonalnej, inżynierii metabolicznej i nie tylko1,2. W porównaniu ze standardowymi platformami ekspresji białek in vivo, CFPS zapewnia trzy kluczowe zalety: 1) bezkomórkowy charakter platformy umożliwia produkcję białek, które byłyby potencjalnie toksyczne lub obce dla komórki3,4,5,6; 2) inaktywacja genomowego DNA i wprowadzenie matrycowego DNA kodującego gen(-y) będący przedmiotem zainteresowania (genów) kierujący całą energię ogólnoustrojową w reakcji na produkcję białka (białek) będącego przedmiotem zainteresowania; oraz 3) Otwarty charakter platformy umożliwia użytkownikowi modyfikowanie i monitorowanie warunków reakcji i składu w czasie rzeczywistym7,8. Ten bezpośredni dostęp do reakcji wspiera rozszerzanie systemów biologicznych o rozszerzoną chemię i warunki redoks w celu produkcji nowych białek i dostrajania procesów metabolicznych2,9,10. Bezpośredni dostęp pozwala również użytkownikowi na połączenie reakcji CFPS z testami aktywności w systemie jednogarnkowym w celu szybszego zaprojektowania, budowy i testowania11. Zdolność do przeprowadzania reakcji CFPS w małych kropelkach lub na urządzeniach papierowych dodatkowo wspiera wysiłki badawcze o wysokiej przepustowości i szybkie prototypowanie12,13,14,15,16. W wyniku tych zalet oraz charakteru systemu typu plug and play, CFPS w unikalny sposób umożliwił różnorodne zastosowania biotechnologiczne, takie jak produkcja białek, które są trudne do rozpuszczalnej ekspresji in vivo17,18,19,20, wykrywanie choroby21,22,23, na żądanie biomanufacturing18,24,25,26,27, and education28,29, z których wszystkie pokazują elastyczność i użyteczność platformy bezkomórkowej.

Systemy CFPS mogą być generowane z różnych surowych lizatów zarówno z prokariotycznych, jak i eukariotycznych linii komórkowych. Pozwala to na różnorodne opcje w systemie wyboru, z których każda ma zalety i wady w zależności od interesującego nas zastosowania. Systemy CFPS różnią się również znacznie pod względem czasu przygotowania, kosztów i wydajności. Najczęściej stosowane ekstrakty komórkowe są produkowane z kiełków pszenicy, retikulocytów królika, komórek owadów i komórek Escherichia coli, przy czym te ostatnie są jak dotąd najbardziej opłacalne, a jednocześnie dają najwyższe objętościowe plony białka30. Podczas gdy inne systemy CFPS mogą być korzystne ze względu na ich wrodzoną maszynerię modyfikacji potranslacyjnej, nowe aplikacje wykorzystujące maszynerię opartą na E. coli są w stanie wypełnić lukę, generując na żądanie specyficznie fosforylowane i glikozylowane białka31,32,33,34,35.

Reakcje CFPS mogą być przeprowadzane zarówno w formacie wsadowym, bezkomórkowym (CECF) lub bezkomórkowym (CFCF) o ciągłym przepływie. Format wsadowy jest układem zamkniętym, którego czas reakcji jest ograniczony ze względu na zmniejszające się ilości reagentów i akumulację hamujących produktów ubocznych reakcji. Metody CECF i CFCF wydłużają czas trwania reakcji, a tym samym skutkują zwiększoną objętościową wydajnością białka w porównaniu z reakcją okresową. Osiąga się to poprzez umożliwienie usunięcia produktów ubocznych syntezy białek z naczynia reakcyjnego, podczas gdy nowe reagenty są dostarczane przez cały przebieg reakcji2. W przypadku CFCF białko będące przedmiotem zainteresowania może być również usunięte z komory reakcyjnej, podczas gdy w przypadku CECF białko będące przedmiotem zainteresowania pozostaje w komorze reakcyjnej składającej się z półprzepuszczalnej membrany36,37. Metody te są szczególnie cenne w przezwyciężaniu słabych wydajności objętościowych trudnych do ekspresji białek będących przedmiotem zainteresowania38,39,40,41,42,43. Wyzwania związane z wdrażaniem podejść CECF i CFCF polegają na tym, że: 1) chociaż skutkują one bardziej efektywnym wykorzystaniem biomaszynerii odpowiedzialnej za transkrypcję i translację, wymagają znacznie większych ilości odczynników, co zwiększa całkowity koszt, oraz 2) wymagają bardziej złożonych konfiguracji reakcji i specjalistycznego sprzętu w porównaniu z formatem partii44. W celu zapewnienia dostępności dla nowych użytkowników, opisane w niniejszym dokumencie protokoły koncentrują się na formacie serii przy objętościach reakcji 15 μl ze szczegółowymi zaleceniami dotyczącymi zwiększenia objętości reakcji do skali mililitrowej.

Metody przedstawione tutaj umożliwiają osobom niebędącym ekspertami z podstawowymi umiejętnościami laboratoryjnymi (takim jak studenci studiów licencjackich) wdrożenie wzrostu komórek, przygotowania ekstraktu i konfiguracji reakcji w formacie wsadowym dla systemu CFPS opartego na E. coli. Takie podejście jest opłacalne w porównaniu z dostępnymi na rynku zestawami bez poświęcania łatwości konfiguracji reakcji opartej na zestawie. Co więcej, takie podejście umożliwia zastosowania w laboratorium i w terenie. Decydując się na wdrożenie CFPS, nowi użytkownicy powinni dokładnie ocenić skuteczność konwencjonalnych systemów ekspresji białek dla inwestycji w start-upy, ponieważ CFPS może nie być lepszy w każdym przypadku. Opisane tutaj metody CFPS umożliwiają użytkownikowi bezpośrednie wdrażanie różnorodnych zastosowań, w tym genomiki funkcjonalnej, testów wysokoprzepustowych, produkcji białek, które są trudne do ekspresji in vivo, a także zastosowań terenowych, w tym biosensorów i zestawów edukacyjnych do biologii syntetycznej. Dodatkowe zastosowania, takie jak inżynieria metaboliczna, dostrajanie warunków ekspresji białek, wykrywanie chorób i zwiększanie skali przy użyciu metod CECF lub CFCF, są nadal możliwe, ale mogą wymagać doświadczenia z platformą CFPS w celu dalszej modyfikacji warunków reakcji. Nasze metody łączą wzrost w wzbogaconych pożywkach i kolbach z przegrodami, ze stosunkowo szybkimi i powtarzalnymi metodami lizy komórek poprzez sonikację, a następnie uproszczoną konfigurację reakcji CFPS, która wykorzystuje zoptymalizowane premiksy45. Chociaż metody wzrostu komórek stały się nieco ustandaryzowane w tej dziedzinie, metody lizy komórek różnią się znacznie. Oprócz sonikacji, powszechne metody lizy obejmują wykorzystanie prasy francuskiej, homogenizatora, ubijaków perełkowych lub lizozymu oraz innych biochemicznych i fizycznych metod rozbijania46,47,48,49. Za pomocą naszych metod uzyskuje się około 2 ml surowego ekstraktu komórkowego na 1 l komórek. Ta ilość ekstraktu komórkowego może wspierać czterysta reakcji CFPS po 15 μl, z których każda wytwarza ~ 900 μg / ml białka reporterowego sfGFP z plazmidu matrycowego pJL1-sfGFP. Ta metoda kosztuje 0,021 USD/μg wytworzonego sfGFP (0,019 USD/μL reakcji), z wyłączeniem kosztów pracy i sprzętu (rysunek uzupełniający 1). Zaczynając od zera, metoda ta może być wdrożona w ciągu 4 dni przez jedną osobę, a powtarzające się reakcje CFPS mogą być zakończone w ciągu kilku godzin (Rysunek 1). Dodatkowo objętość protokołu można zwiększyć w celu uzyskania większych partii przygotowania odczynnika w celu dostosowania go do potrzeb użytkownika. Co ważne, przedstawiony tutaj protokół może być wdrażany przez osoby niebędące ekspertami przeszkolonymi w laboratorium, takie jak studenci studiów licencjackich, ponieważ wymaga on jedynie podstawowych umiejętności laboratoryjnych. Opisane poniżej procedury oraz towarzyszący im film wideo zostały specjalnie opracowane w celu poprawy dostępności platformy CFPS E. coli do szerokiego zastosowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie podłoża i wzrost komórek

  1. Dzień 1
    1. Komórki E. coli BL21*(DE3) należy rozsiać po wyrobisku glicerolu na płytce agarowej LB i inkubować przez co najmniej 18 godzin w temperaturze 37 °C.
    2. Przygotować 50 ml pożywki LB i sterylizować roztwór w autoklawie w cyklu ciekłym przez 30 minut w temperaturze 121 °C. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
  2. Dzień 2
    1. Przygotować 750 ml 2x pożywki YTP i 250 ml 0,4 M roztworu D-glukozy zgodnie z opisem w informacjach uzupełniających.
    2. Wlać 2x pożywkę YTP do autoklawowanej kolby z przegrodami o pojemności 2,5 l, a roztwór D-glukozy do autoklawowanej szklanej butelki o pojemności 500 ml. Oba roztwory należy sterylizować w autoklawie w cyklu ciekłym przez 30 minut w temperaturze 121 °C.
    3. Upewnij się, że oba sterylne roztwory są przechowywane w temperaturze 37 °C, jeśli wzrost komórek jest wykonywany następnego dnia, aby zmaksymalizować tempo wzrostu po inokulacji. Nie łączyć roztworów do momentu zaszczepienia.
      UWAGA: W razie potrzeby roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1-2 dni, chociaż media 2x YTP są bardzo podatne na zanieczyszczenie.
    4. Rozpocznij nocną hodowlę BL21(DE3) poprzez zaszczepienie 50 ml pożywki LB pojedynczą kolonią BL21(DE3) przy użyciu wysterylizowanej pętli i sterylnej techniki, aby uniknąć zanieczyszczenia.
    5. Umieść 50 ml kultury BL21*(DE3) LB w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C i 250 obr./min i hoduj przez noc przez 15-18 godzin.
    6. Przygotuj i wysterylizuj wszystkie materiały wymagane w dniach 3 i 4, w tym: dwie butelki wirówki o pojemności 1 l, 4 zimne probówki stożkowe o pojemności 50 ml (zważ i zapisz masę trzech) oraz wiele probówek do mikrofug o pojemności 1,5 ml.
  3. Dzień 3
    1. Usunąć 50 ml nocnej kultury BL21*(DE3) w LB z inkubatora do wytrząsania i zmierzyć OD600 na spektrofotometrze, używając rozcieńczenia 1:10 z pożywką LB. Obliczyć objętość hodowli nocnej niezbędną do dodania do 1 l pożywki dla wyjściowego OD600 0,1 (na przykład, jeśli OD600 o rozcieńczeniu 1:10 jest odczytywany jako 0,4, zaszczepić 25 ml nierozcieńczonego OD600 = 4,0 kultury przez noc do 1 l 2x YTPG).
    2. Usunąć podgrzane 2x pożywki YTP i roztwory D-glukozy z inkubatora w temperaturze 37 °C wraz z 50 ml kultury LB. Stosując sterylną technikę, ostrożnie wlej roztwór D-glukozy do pożywki 2x YTP (omijając boki przegrody kolby).
      UWAGA: Dodatek D-Glucose uzupełnia przepis na 1 L 2x YTPG.
    3. Zachowując sterylną technikę, zaszczepić 1 l 2x roztworu YTPG odpowiednią ilością 50 ml kultury, aby rozpocząć hodowlę 1 l przy 0,1 OD600. Natychmiast umieścić zaszczepioną 1 l kulturę w inkubatorze z wytrząsaniem o temperaturze 37 °C przy 200 obr./min.
    4. Wykonaj pierwszy odczyt OD600 po pierwszej godzinie wzrostu (faza opóźnienia trwa zwykle 1 godzinę). Nie rozcieńczaj kultury. Kontynuuj wykonywanie pomiarów OD600 mniej więcej co 20-30 minut, aż OD600 osiągnie 0,6.
    5. Po osiągnięciu OD600 = 0,6 dodaj 1 ml 1M IPTG (końcowe stężenie w 1 l kultury = 1 mM) do 2x kultury YTPG.
      UWAGA: Idealna indukcja OD600 wynosi 0,6; Dopuszczalny jest jednak zakres 0,6-0,8. Indukcja przez IPTG służy do endogennego wytwarzania polimerazy RNA T7 (T7RNAP).
    6. Po indukcji mierz OD600 mniej więcej co 20-30 minut, aż osiągnie 3.0.
      UWAGA: W tym czasie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C. Przygotować zimny bufor S30 zgodnie z opisem w informacjach uzupełniających. Jeśli bufor S30 jest przygotowany wcześniej, upewnij się, że naziemna telewizja cyfrowa nie została dodana do dnia użycia.
    7. Gdy OD600 osiągnie 3,0 (Rysunek 2A), wlej kulturę do zimnej 1 litrowej butelki wirówkowej w lodowatej kąpieli wodnej. Przygotuj wypełnioną wodą butelkę wirówkową o pojemności 1 l o równej wadze, która będzie używana jako waga w wirówce.
      UWAGA: Wartości absorbancji różnią się w zależności od instrumentu. Chociaż OD600 zbioru BL21(DE3) nie jest zmienną wrażliwą, zaleca się, aby użytkownik ocenił i zoptymalizował tę zmienną jako środek rozwiązywania problemów. Większe spektrofotometry mogą skutkować stosunkowo niższymi odczytami OD600 w porównaniu z mniejszymi spektrofotometrami kuwetowymi.
    8. Odwirować butelki o pojemności 1 l przez 10 minut w temperaturze 5 000 x g i temperaturze 10 °C do komórek granulek.
    9. Powoli odlewać supernatant i zutylizować go zgodnie z procedurami dotyczącymi odpadów biologicznych obowiązującymi w instytucji. Umieść granulkę na lodzie.
    10. Za pomocą sterylnej szpatułki zeskrob osad komórek z butelki wirówki i przenieś go do zimnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    11. Dodać 30 ml zimnego buforu S30 do stożkowej probówki i ponownie zawiesić osad komórkowy poprzez wirowanie z krótkimi seriami (20 - 30 s) i okresami odpoczynku (1 min) na lodzie, aż do całkowitego zawieszenia bez kawałków.
    12. Po całkowitym zawieszeniu osadu należy użyć kolejnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml z wodą jako równowagi i wirować przez 10 minut przy 5000 x g i temperaturze 10 °C (wstępnie schłodzonej do 4 °C).
      UWAGA: Na tym kończy się 1z 3 prań wymaganych podczas zbierania komórek.
    13. Wylać supernatant i zutylizować go zgodnie z procedurami dotyczącymi odpadów biologicznych obowiązującymi w instytucji. Zawiesić osad w 20-25 ml zimnego buforu S30 i odwirować przez 10 minut przy 5000 x g i 10 °C (wstępnie schłodzony do 4 °C).
      UWAGA: Na tym kończy się 2z 3 prań.
    14. Ponownie wylej supernatant i zutylizuj go zgodnie z procedurami dotyczącymi odpadów biologicznych instytucji. Dodać dokładnie 30 ml buforu S30 i ponownie odwirować, aby ponownie zawiesić osad.
    15. Używając 3 wstępnie zważonych, zimnych stożkowych probówek o pojemności 50 ml i serologicznego napełniacza pipet sterylną pipetą, podwielokrotność 10 ml zawieszonej mieszaniny peletów/buforu S30 do każdej z 3 stożkowych probówek.
      UWAGA: Dzielenie komórek na 3 probówki nie jest wymagane, ale ten krok skutkuje mniejszymi granulkami komórek (~ 1 g) dla większej wygody w późniejszych krokach.
    16. Odwirować wszystkie probówki, używając odpowiednich wag w razie potrzeby, przez 10 minut w temperaturze 5000 x g i 10 °C (wstępnie schłodzone do 4 °C).
      UWAGA: Na tym kończy się ostatni etap prania.
    17. Wylać supernatant i zutylizować go zgodnie z procedurami dotyczącymi odpadów biologicznych obowiązującymi w instytucji. Usunąć nadmiar buforu S30, ostrożnie wycierając wnętrze stożkowej rurki i nakrętki czystą chusteczką; Unikaj dotykania granulki.
    18. Ponownie zważyć probówki na wadze analitycznej i zapisać końcową masę granulek na każdej probówce.
      UWAGA: W tym momencie protokół może zostać wstrzymany. Granulki można błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do roku, aż będą potrzebne do przygotowania ekstraktu.

2. Przygotowanie surowego ekstraktu komórkowego - Dzień 4

  1. Do przygotowania ekstraktu utrzymuj komórki w chłodzie na lodzie podczas każdego etapu. Dodać 1 ml zimnego buforu S30 na 1 g masy komórkowej osadu. Upewnij się, że ditiotreitol (DTT) został uzupełniony do buforu S30 do końcowego stężenia 2 mM.
    UWAGA: W tym czasie schłodzić mikrowirówkę do temperatury 4 °C.
  2. Ponownie zawiesić osad komórkowy poprzez wirowanie z krótkimi seriami (20 - 30 s) i okresami odpoczynku (1 min) na lodzie, aż do całkowitego zawieszenia. Jeśli ponowne zawieszenie jest trudne, pozostaw granulki na lodzie na 30 minut do rozmrożenia.
  3. Przenieś 1,4 ml zawieszonych komórek do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml.
  4. Umieścić jedną probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą 1,4 ml zawieszonych komórek w lodowatej łaźni wodnej w zlewce. Sonikacja przez 45 sekund, a następnie 59 s przerwy przez łącznie 3 cykle, z amplitudą ustawioną na 50%. Zamknij i odwróć probówki, aby delikatnie wymieszać w okresach wyłączenia. W sumie dostarcz 800-900 J energii do każdej 1,5 ml probówki do mikrofuge zawierającej 1,4 ml zawieszonych komórek (Rysunek 3A i 3B).
    UWAGA: Ten krok jest wrażliwy na używany typ i model sonikatora i powinien być zoptymalizowany, jeśli sprzęt jest inny niż wymieniony dla tej procedury. Dwa uzupełniające się podejścia mogą być użyte do zwiększenia ilości ekstraktu przygotowanego na tym etapie: 1) wiele probówek do mikrofuge o pojemności 1,5 ml może być sonikowanych równolegle, i/lub 2) większe objętości mogą być sonikowane w probówkach stożkowych (do 15 ml resuspension komórek na probówkę), skalując ilość dostarczanej energii zgodnie z wcześniejszym opisem 29, 45.
  5. Natychmiast po zakończeniu sonikacji dodaj 4,5 μl 1 M DTT (uzupełniając dodatkowe 2 mM DTT) do 1,4 ml lizatu i kilkakrotnie odwróć w celu wymieszania. Umieść rurkę na lodzie. Powtórzyć kroki 2.4 i 2.5 dla wszelkich dodatkowych probówek z zawieszonymi komórkami przed przystąpieniem do wirowania.
  6. Próbki z mikrowirówki w temperaturze 18 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 minut (Rysunek 3C).
  7. Odpipetować supernatant do nowej probówki do mikrofiltrów o pojemności 1,5 ml. Nie przeszkadzaj pelletowi; Lepiej jest pozostawić trochę supernatantu, aby utrzymać czystość, niż rozbijać osad w celu maksymalizacji plonów.
  8. Inkubować supernatant z poprzedniego etapu przy prędkości obrotowej 250 obr./min i temperaturze 37 °C przez 60 minut, przyklejając probówki do platformy wytrząsającej inkubatora (jest to reakcja odpływu).
  9. Próbki z mikrowirówki o masie 10 000 x g i temperaturze 4 °C przez 10 min.
  10. Usunąć supernatant bez naruszania osadu i przenieść go do nowej probówki. Utwórz wiele 100 μl porcji ekstraktu do przechowywania.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a ekstrakt można błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C przez okres do roku, aż będzie potrzebny do reakcji CFPS. Co najmniej 5 cykli zamrażania i rozmrażania można przejść bez szkody dla wydajności ekstrakcji (Rysunek 4).

3. Bezkomórkowa synteza białek Reakcje w formacie wsadowym

  1. Rozmrozić roztwory A i B, matryca DNA, ekstrakt BL21(DE3) (jeśli jest zamrożony), T7RNAP i podwielokrotność wody o jakości cząsteczkowej.
    UWAGA: Wzór reakcji CFPS można znaleźć w informacjach uzupełniających. Receptury roztworów A i B są podane w Informacjach Uzupełniających i odpowiadają specyficznym stężeniom dla wielu odczynników wspierających system energetyczny oparty na PANOx-SP dla CFPS. Rola każdego odczynnika i dopuszczalne różnice w tych stężeniach odczynników, które mogą wspierać CFPS, zostały określone50. Protokół oczyszczania T7RNAP można znaleźć w Informacjach Uzupełniających51. Uzupełniający T7RNAP może zwiększyć wydajność objętościową, ale nie jest konieczny, jeśli T7RNAP jest indukowany podczas wzrostu komórek. Matrycę plazmidowego DNA (pJL1-sfGFP) można przygotować za pomocą zestawu maxiprep z dwoma płukaniami przy użyciu buforu płuczącego w zestawie, a następnie oczyszczaniem DNA po przetworzeniu za pomocą zestawu do oczyszczania PCR (Figura 2B). Liniowe matryce DNA mogą być również stosowane w reakcjach CFPS.
  2. Oznacz niezbędną ilość probówek do mikrofuge potrzebnych do reakcji CFPS.
    UWAGA: Reakcje mogą być przeprowadzane w naczyniach o różnych rozmiarach, ale mniejsze naczynie może zmniejszyć objętościową wydajność białka (Rysunek 2C). Zwiększenie skali reakcji w naczyniu tej samej wielkości może również zmniejszyć wydajność objętościową w funkcji zmniejszenia wymiany tlenu z powodu zmniejszenia stosunku powierzchni do objętości. Przy zwiększaniu objętości reakcji powyżej 100 μl zaleca się stosowanie płytek studzienkowych z płaskim dnem 31,37,52.
  3. Dodać 2,2 μl roztworu A, 2,1 μl roztworu B, 5 μl ekstraktu BL21*(DE3), 0,24 μg T7RNAP (16 μg/ml stężenie końcowe), 0,24 ng matrycy DNA (stężenie końcowe 16 ng/μl) i wodę, aby doprowadzić końcową objętość do 15 μL.
    UWAGA: Roztwory wirowe A i B należy często stosować podczas ustawiania reakcji, aby uniknąć sedymentacji składników i zapewnić, że każda reakcja otrzymuje jednorodną porcję każdego roztworu. Unikaj wirowania ekstraktu, zamiast tego odwróć probówkę, aby wymieszać.
  4. Po dodaniu wszystkich odczynników do reakcji, wymieszaj każdą probówkę, pipetując w górę i w dół lub delikatnie wirując, upewniając się, że końcowa mieszanina reakcyjna jest połączona w pojedynczą kulkę o pojemności 15 μl na dnie probówki do mikrofugi o pojemności 1,5 ml.
  5. Umieścić każdą reakcję w inkubatorze o temperaturze 37 °C bez wstrząsania przez 4 godziny lub w temperaturze 30 °C przez noc.
    UWAGA: Udane reakcje można ocenić jakościowo wizualnie na podstawie zielonego koloru produktu sfGFP w mieszaninie reakcyjnej CFPS (Rysunek 3D). Ekspresję interesującego białka można również potwierdzić za pomocą SDS-PAGE (rysunek uzupełniający 2).

4. Kwantyfikacja białka reporterowego, [sfGFP]

  1. Załadować 48 μl 0,05 M HEPES, pH 8 do każdego dołka potrzebnego do oznaczania ilościowego (zwykle wykonywanego w trzech egzemplarzach na probówkę reakcyjną).
  2. Usunąć reakcje z inkubatora. Pipetować w górę i w dół, aby wymieszać każdą reakcję, a następnie przenieść 2 μl reakcji do 48 μl 0,05 M HEPES, pH 8. Ponownie pipetować w górę iw dół do dołka, aby wymieszać.
  3. Po załadowaniu i wymieszaniu wszystkich reakcji umieść 96-dołkową płytkę we fluorometrze i zmierz fluorescencję punktu końcowego sfGFP.
    UWAGA: Długości fal wzbudzenia i emisji dla kwantyfikacji fluorescencji sfGFP wynoszą odpowiednio 485 nm i 510 nm.
  4. Korzystając z wcześniej wygenerowanej krzywej wzorcowej, wyznacz [sfGFP] na podstawie uzyskanych odczytów fluorescencji.
    UWAGA: Instrukcje dotyczące generowania wzorcowej krzywej stężenia sfGFP w funkcji intensywności fluorescencji znajdują się w informacjach uzupełniających (rysunek uzupełniający 3). Użytkownicy będą musieli ustalić standardową krzywą dla swojego instrumentu, ponieważ czułość instrumentu może się różnić.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiliśmy protokół przygotowania ekstraktu z E. coli oparty na sonikacji, który może być realizowany w ciągu czterech dni, z Rysunek 1 demonstruje podział procedur w ciągu każdego dnia. Kroki, które można wykonać każdego dnia, są plastyczne z różnymi punktami wstrzymania, ale stwierdziliśmy, że ten przepływ pracy jest najbardziej efektywny do wykonania. Dodatkowo, zarówno granulki komórkowe (krok 1.3.18), jak i w pełni przygotowany ekstrakt (kr...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bezkomórkowa synteza białek stała się potężną i umożliwiającą wykorzystanie jej w wielu zastosowaniach, od bioprodukcji po szybkie prototypowanie układów biochemicznych. Szeroki zakres zastosowań jest wspierany przez możliwość monitorowania, manipulowania i rozszerzania maszyn komórkowych w czasie rzeczywistym. Pomimo rosnącego wpływu tej technologii platformy, szeroka adaptacja pozostaje powolna ze względu na niuanse techniczne w implementacji metod. Dzięki tym wysiłkom staramy się zapewnić prostotę i przejrzystość wdra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują dr Jennifer VanderKelen, Andrei Laubscher i Tony'emu Turretto za wsparcie techniczne, Wesleyowi Kao, Layne'owi Williamsowi i Christopherowi Hightowi za pomocne dyskusje. Autorzy potwierdzają również wsparcie finansowe ze strony Bill and Linda Frost Fund, Center for Applications in Biotechnology's Chevron Biotechnology Applied Research Endowment Grant, Cal Poly Research, Scholarly, and Creative Activities Grant Program (RSCA 2017) oraz National Science Foundation (NSF-1708919). MZL dziękuje za stypendium dla absolwentów Uniwersytetu Stanowego Kalifornii. MCJ dziękuje Army Research Office W911NF-16-1-0372, National Science Foundation przyznaje granty MCB-1413563 i MCB-1716766, grant Centrum Doskonałości Laboratorium Badawczego Sił Powietrznych FA8650-15-2-5518, grant Agencji ds. Redukcji Zagrożeń Obronnych HDTRA1-15-10052/P00001, Fundację Davida i Lucile Packardów, program Camille Dreyfus Teacher-Scholar Program, grant BER Departamentu Energii DE-SC0018249, program naukowy Human Frontiers (RGP0015/2017), DOE Joint Genome Institute ETOP Grant oraz Chicago Biomedical Consortium przy wsparciu Searle Funds z Chicago Community Trust za wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bulion LuriaThermoFisher12795027
TryptoneFisher Bioodczynniki73049-73-7
EkstraktBioodczynniki Fisher1/2/8013
NaClSigma-AldrichS3014-1KG
Fosforan potasu dwuzasadowySigma-Aldrich60353-250G
Fosforan potasu jednozasadowySigma-AldrichP9791-500G
D-GlucoseSigma-AldrichG8270-1KG
KOHSigma-AldrichP5958-500G
IPTGSigma-AldrichI6758-1G
Mg(OAc)2Sigma-AldrichM5661-250G
K(OAc)Sigma-AldrichP1190-1KG
Tris(OAc)Sigma-AldrichT6066-500G
DTTThermoFisher15508013
tRNASigma-Aldrich10109541001
Kwas folinowySigma-AldrichF7878-100MG
NTPsThermoFisherR0481
Kwas szczawiowySigma-AldrichP0963-100G
NADSigma-AldrichN8535-15VL
CoASigma-AldrichC3144-25MG
PEPSigma-Aldrich860077-250MG
K(Glu)Sigma-AldrichG1501-500G
NH4(Glu)MP Biomedicals02180595.1
Mg(Glu)2Sigma-Aldrich49605-250G
SpermidynaSigma-AldrichS0266-5G
PutrescynaSigma-AldrichD13208-25G
HEPESThermoFisher11344041
Woda molekularnaSigma-Aldrich7732-18-5
Kwas L-asparaginowySigma-AldrichA7219-100G
L-WalinaSigma-AldrichV0500-25G
L-TryptofanSigma-AldrichT0254-25G
L-FenyloalaninaSigma-AldrichP2126-100G
L-IzoleucynaSigma-AldrichI2752-25G
L-LeucynaSigma-AldrichL8000-25G
L-CysteinaSigma-AldrichC7352-25G
L-MetioninaSigma-AldrichM9625-25G
L-AlaninaSigma-AldrichA7627-100G
L-ArgininaSigma-AldrichA8094-25G
L-AsparaginaSigma-AldrichA0884-25G
GlicynaSigma-AldrichG7126-100G
L-GlutaminaSigma-AldrichG3126-250G
L-HistadineSigma-AldrichH8000-25G
L-LizynaSigma-AldrichL5501-25G
L-ProlineSigma-AldrichP0380-100G
L-SerineSigma-AldrichS4500-100G
L-TreoninaSigma-AldrichT8625-25G
L-TyrozynaSigma-AldrichT3754-100G
Fisherbrand Premium Probówki do mikrowirówek: 2,0 mlFisher Scientific05-408-138
Probówki do mikrowirówek premium Fisherbrand: 1,5 mlFisher Scientific05-408-129
Probówki do mikrowirówek Fisherbrand Premium: 0,6 mlFisher Scientific05-408-120
Zestaw do przygotowania plazmidu PureLink HiPureProcesor
QSonicaQ125-230V/50HzSonda o średnicy 3,175 mm
Avanti J-E WirówkaBeckman Coulter369001
JLA-8.1000 RotorBeckman Coredter366754
1L Rurka wirówkowaBeckman CoulterA99028
Tunair 2.5L z przegrodą Shake FlaskSigma-AldrichZ710822
Microfuge 20Beckman CoulterB30134
Nowy Brunszwik Innova 42/42R InkubatorEppendorfM1335-0000
Cytacja 5BioTek
Strep-Tactin XT IBA2-4998-000
pJL1-sfGFPAddgene69496
BL21(DE3)New England BioLabs
drożdżowy ultradźwiękowy ThermoFisher K210007 Zestaw startowy

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jiang, L., Zhao, J., Lian, J., Xu, Z. Cell-free protein synthesis enabled rapid prototyping for metabolic engineering and synthetic biology. Synthetic and Systems Biotechnology. 3 (2), 90-96 (2018).
  2. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnology Advances. 30 (5), 1185-1194 (2012).
  3. Watanabe, M. Cell-Free Protein Synthesis for Structure Determination by X-ray Crystallography. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 607, 149-160 (2010).
  4. Martemyanov, K. A., Shirokov, V. A., Kurnasov, O. V., Gudkov, A. T., Spirin, A. S. Cell-Free Production of Biologically Active Polypeptides: Application to the Synthesis of Antibacterial Peptide Cecropin. Protein Expression and Purification. 21 (3), 456-461 (2001).
  5. Renesto, P., Raoult, D. From genes to proteins: in vitro expression of rickettsial proteins. Annals of the New York Academy of Sciences. 990, 642-652 (2003).
  6. Xu, Z., Chen, H., Yin, X., Xu, N., Cen, P. High-Level Expression of Soluble Human b-Defensin-2 Fused With Green Fluorescent Protein in Escherichia coli Cell-Free System. Applied Biochemistry and Biotechnology. 127 (1), 053-062 (2005).
  7. Baumann, A. In-situ observation of membrane protein folding during cell-free expression. PLoS ONE. 11 (3), 1-15 (2016).
  8. Wang, Y., Percival, Y. H. P. Cell-free protein synthesis energized by slowly-metabolized maltodextrin. BMC Biotechnology. 9, 1-8 (2009).
  9. Whittaker, J. W. Cell-free protein synthesis: the state of the art. Biotechnology Letters. 35 (2), 143-152 (2013).
  10. Martin, R. W. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. 9 (1), 1203(2018).
  11. Kwon, Y. C., Song, J. K., Kim, D. M. Cloning-Independent Expression and Screening of Enzymes Using Cell-Free Protein Synthesis Systems. Methods in Molecular Biology. 1118, 97-108 (2014).
  12. Chappell, J., Jensen, K., Freemont, P. S. Validation of an entirely in vitro approach for rapid prototyping of DNA regulatory elements for synthetic biology. Nucleic Acids Research. 41 (5), 3471-3481 (2013).
  13. Takahashi, M. K. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
  14. Karim, A. S., Jewett, M. C. A cell-free framework for rapid biosynthetic pathway prototyping and enzyme discovery. Metabolic Engineering. 36, 116-126 (2016).
  15. Dudley, Q. M., Anderson, K. C., Jewett, M. C. Cell-Free Mixing of Escherichia coli Crude Extracts to Prototype and Rationally Engineer High-Titer Mevalonate Synthesis. ACS Synthetic Biology. 5 (12), 1578-1588 (2016).
  16. Pardee, K. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
  17. Zawada, J. F. Microscale to manufacturing scale-up of cell-free cytokine production-a new approach for shortening protein production development timelines. Biotechnology and Bioengineering. 108 (7), 1570-1578 (2011).
  18. Sullivan, C. J. A cell-free expression and purification process for rapid production of protein biologics. Biotechnology Journal. 11 (2), 238-248 (2016).
  19. Li, J. Cell-free protein synthesis enables high yielding synthesis of an active multicopper oxidase. Biotechnology Journal. 11 (2), 212-218 (2016).
  20. Heinzelman, P., Schoborg, J. A., Jewett, M. C. pH responsive granulocyte colony-stimulating factor variants with implications for treating Alzheimer's disease and other central nervous system disorders. Protein Engineering Design and Selection. 28 (10), 481-489 (2015).
  21. Pardee, K. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
  22. Slomovic, S., Pardee, K., Collins, J. J. Synthetic biology devices for in vitro and in vivo diagnostics. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (47), 14429-14435 (2015).
  23. Gootenberg, J. S. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  24. Pardee, K. Portable, On-Demand Biomolecular Manufacturing. Cell. 167 (1), 248-259 (2016).
  25. Karig, D. K., Bessling, S., Thielen, P., Zhang, S., Wolfe, J. Preservation of protein expression systems at elevated temperatures for portable therapeutic production. Journal of the Royal Society, Interface. 14 (129), (2017).
  26. Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage. BioTechniques. 56 (4), 186-193 (2014).
  27. Hunt, J. P., Yang, S. O., Wilding, K. M., Bundy, B. C. The growing impact of lyophilized cell-free protein expression systems. Bioengineered. 8 (4), 325-330 (2017).
  28. Stark, J. C. BioBitsTM Bright: A fluorescent synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  29. Huang, A. BioBitsTM Explorer: A modular synthetic biology education kit. Science Advances. 4 (8), (2018).
  30. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-Free Protein Synthesis: Pros and Cons of Prokaryotic and Eukaryotic Systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  31. Oza, J. P. Robust production of recombinant phosphoproteins using cell-free protein synthesis. Nature Communications. 6 (1), 8168(2015).
  32. Zemella, A. Cell-free protein synthesis as a novel tool for directed glycoengineering of active erythropoietin. Scientific Reports. 8 (1), 8514(2018).
  33. Jaroentomeechai, T. Single-pot glycoprotein biosynthesis using a cell-free transcription-translation system enriched with glycosylation machinery. Nature Communications. 9 (1), 2686(2018).
  34. Kightlinger, W. Design of glycosylation sites by rapid synthesis and analysis of glycosyltransferases. Nature Chemical Biology. 14 (6), 627-635 (2018).
  35. Schoborg, J. A. A cell-free platform for rapid synthesis and testing of active oligosaccharyltransferases. Biotechnology and Bioengineering. 115 (3), 739-750 (2018).
  36. Chekulayeva, M. N., Kurnasov, O. V., Shirokov, V. A., Spirin, A. S. Continuous-Exchange Cell-Free Protein-Synthesizing System: Synthesis of HIV-1 Antigen Nef. Biochemical and Biophysical Research Communications. 280 (3), 914-917 (2001).
  37. Hong, S. H. Improving Cell-Free Protein Synthesis through Genome Engineering of Escherichia coli Lacking Release Factor 1. ChemBioChem. 16 (5), 844-853 (2015).
  38. Endo, Y., Otsuzuki, S., Ito, K., Miura, K. Production of an enzymatic active protein using a continuous flow cell-free translation system. Journal of Biotechnology. 25 (3), 221-230 (1992).
  39. Volyanik, E. V., Dalley, A., Mckay, I. A., Leigh, I., Williams, N. S., Bustin, S. A. Synthesis of Preparative Amounts of Biologically Active Interleukin-6 Using a Continuous-Flow Cell-Free Translation System. Analytical Biochemistry. 214 (1), 289-294 (1993).
  40. Martin, G. A., Kawaguchi, R., Lam, Y., DeGiovanni, A., Fukushima, M., Mutter, W. High-yield, in vitro protein expression using a continuous-exchange, coupled transcription/ translation system. BioTechniques. 31 (4), 948-950 (2001).
  41. Stech, M., Quast, R. B., Sachse, R., Schulze, C., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. A Continuous-Exchange Cell-Free Protein Synthesis System Based on Extracts from Cultured Insect Cells. PLoS ONE. 9 (5), e96635(2014).
  42. Quast, R. B., Sonnabend, A., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield cell-free synthesis of human EGFR by IRES-mediated protein translation in a continuous exchange cell-free reaction format. Scientific Reports. 6 (1), 30399(2016).
  43. Thoring, L., Dondapati, S. K., Stech, M., Wüstenhagen, D. A., Kubick, S. High-yield production of "difficult-to-express" proteins in a continuous exchange cell-free system based on CHO cell lysates. Scientific Reports. 7 (1), 11710(2017).
  44. Hoffmann, M., Nemetz, C., Madin, K., Buchberger, B. Rapid translation system: A novel cell-free way from gene to protein. Biotechnology annual review. 10, 1-30 (2004).
  45. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5 (1), 8663(2015).
  46. Katsura, K. A reproducible and scalable procedure for preparing bacterial extracts for cell-free protein synthesis. Journal of Biochemistry. 162 (June), 357-369 (2017).
  47. Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 1-15 (2016).
  48. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  49. Krinsky, N. A Simple and Rapid Method for Preparing a Cell-Free Bacterial Lysate for Protein Synthesis. PLoS ONE. 11 (10), (2016).
  50. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  51. Swartz, J. R., Jewett, M. C., Woodrow, K. A. Cell-Free Protein Synthesis With Prokaryotic Combined Transcription-Translation. Recombinant Gene Expression. (267), 169-182 (2004).
  52. Voloshin, A. M., Swartz, J. R. Efficient and scalable method for scaling up cell free protein synthesis in batch mode. Biotechnology and Bioengineering. 91 (4), 516-521 (2005).
  53. Vernon, W. B. The role of magnesium in nucleic-acid and protein metabolism. Magnesium. 7 (5-6), 234-248 (1988).
  54. Pratt, J. M. Transcription and Translation: A Practical Approach. , IRL Press. New York. (1984).
  55. Kim, D. M., Kigawa, T., Choi, C. Y., Yokoyama, S. A Highly Efficient Cell-Free Protein Synthesis System from Escherichia coli. European Journal of Biochemistry. 239 (3), 881-886 (1996).
  56. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4 (1), 8(2010).
  57. Zubay, G. In Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems. Annual Review of Genetics. 7 (1), 267-287 (1973).
  58. Kigawa, T. Preparation of Escherichia coli cell extract for highly productive cell-free protein expression. Journal of Structural and Functional Genomics. 5 (1/2), 63-68 (2004).
  59. Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. Streamlining Escherichia Coli S30 Extract Preparation for Economical Cell-Free Protein Synthesis. Biotechnology Progress. 21 (2), 460-465 (2008).
  60. Yang, W. C., Patel, K. G., Wong, H. E., Swartz, J. R. Simplifying and streamlining Escherichia coli-based cell-free protein synthesis. Biotechnology Progress. 28 (2), 413-420 (2012).
  61. Foshag, D. The E. coli S30 lysate proteome: A prototype for cell-free protein production. New Biotechnology. 40 (Pt B), 245-260 (2018).
  62. Caschera, F. Bacterial cell-free expression technology to in vitro systems engineering and optimization. Synthetic and Systems Biotechnology. 2 (2), 97-104 (2017).
  63. Chizzolini, F., Forlin, M., Yeh Martín, N., Berloffa, G., Cecchi, D., Mansy, S. S. Cell-Free Translation Is More Variable than Transcription. ACS Synthetic Biology. 6 (4), 638-647 (2017).
  64. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, 34(2014).
  65. Sawasaki, T., Ogasawara, T., Morishita, R., Endo, Y. A cell-free protein synthesis system for high-throughput proteomics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (23), 14652-14657 (2002).
  66. Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: Biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
  67. Garcia, D. C. Elucidating the potential of crude cell extracts for producing pyruvate from glucose. Synthetic Biology. 3 (1), 1-9 (2018).
  68. Hurst, G. B. Proteomics-Based Tools for Evaluation of Cell-Free Protein Synthesis. Analytical Chemistry. 89 (21), 11443-11451 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakt z E coliliza metod sonikacjiekspresja bia ekprotok wirowaniasuperfolder GFPmiareczkowanie magnezuoczyszczanie DNAprzygotowanie reakcjianaliza fluorometryczna

Powiązane artykuły