Artykuł metodologiczny

Test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych do badań przesiewowych pod kątem aktywności proteolitycznej: zastosowania do aktywacji białka kolca koronawirusa

DOI:

10.3791/58892

⸱

9 stycznia 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, College of Veterinary Medicine, Cornell University, 2Department of Microbiology, College of Agricultural and Life Sciences, Cornell University, 3Virologie et Immunologie Moléculaires, Domaine de Vilvert, INRA, 4Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy test rozszczepienia peptydów fluorogennych, który pozwala na szybkie badanie przesiewowe aktywności proteolitycznej proteaz na peptydach reprezentujących miejsce cięcia peptydów fuzji wirusów. Metoda ta może być również stosowana na dowolnym innym motywie aminokwasowym w sekwencji białka w celu zbadania aktywności proteazy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wirusy otoczkowe, takie jak koronawirusy lub wirus grypy, wymagają proteolitycznego rozszczepienia swojego białka fuzyjnego, aby móc zainfekować komórkę gospodarza. Często wirusy wykazują tropizm komórkowy i tkankowy i są przystosowane do określonych proteaz komórkowych lub tkankowych. Co więcej, wirusy te mogą wprowadzać mutacje lub insercje do swojego genomu podczas replikacji, które mogą wpływać na rozszczepienie, a tym samym mogą przyczyniać się do adaptacji do nowego gospodarza. Tutaj przedstawiamy fluorogenny test rozszczepienia peptydów, który umożliwia szybkie badanie przesiewowe peptydów naśladujących miejsce cięcia białek fuzji wirusa. Technika ta jest bardzo elastyczna i może być stosowana do badania aktywności proteolitycznej pojedynczej proteazy na wielu różnych podłożach, a ponadto umożliwia również badanie aktywności wielu proteaz na jednym lub więcej substratach peptydowych. W tym badaniu użyliśmy peptydów naśladujących motywy miejsca cięcia białka kolca koronawirusa. Przetestowaliśmy koronawirusy bliskowschodniego zespołu oddechowego pochodzącego od ludzi i wielbłądów (MERS-CoV), aby wykazać, że pojedyncze i podwójne podstawienie w miejscu rozszczepienia może zmienić aktywność furyny i radykalnie zmienić wydajność rozszczepienia. Zastosowaliśmy również tę metodę w połączeniu z bioinformatyką do zbadania aktywności rozszczepienia furyny białek kolców koronawirusa kotów z różnych serotypów i szczepów. Ta metoda oparta na peptydach jest mniej pracochłonna i czasochłonna niż konwencjonalne metody stosowane do analizy aktywności proteolitycznej wirusów, a wyniki można uzyskać w ciągu jednego dnia.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fuzja wirusa z błoną komórkową gospodarza jest kluczowym krokiem w cyklu życia wirusów otoczkowych i ułatwia wejście do komórki i replikację wirusa. Zazwyczaj wirusy posiadają wyspecjalizowane białko (lub białka), które wiąże się z receptorami na błonie komórkowej gospodarza i wyzwala fuzję błony wirus-komórka1. Białka fuzji wirusowej zostały pogrupowane w trzy główne klasy (I-III)1. Wiele wirusów, które stanowią obecnie poważny problem dla zdrowia publicznego, takich jak wirus grypy (reprezentujący długotrwałe odzwierzęce pojawienie się ptaków) i koronawirus bliskowschodniego zespołu oddechowego (MERS-CoV) (reprezentujący niedawne pojawienie się chorób odzwierzęcych u wielbłądów), wykorzystuje tak zwane białka fuzyjne klasy I, które wymagają przetwarzania proteolitycznego przez proteazy gospodarza, aby wywierać swoją aktywność fuzogeniczną2. Podobnie koronawirus kotów (FCoV), który stanowi poważne zagrożenie chorobowe dla kotów dzikich i domowych, również posiada białko fuzyjne klasy I. Białka fuzyjne wirusa klasy I są zwykle syntetyzowane jako nierozkurczony prekursor i na ogół składają się z dwóch domen, które są odpowiedzialne odpowiednio za wiązanie receptora i wyzwalanie zdarzenia fuzji. Do tej pory hemaglutynina grypy (HA) jest najlepiej poznanym białkiem fuzyjnym, a liczne badania opisały jej mechanistyczną rolę we wnikaniu i fuzji komórek gospodarza3. W tym przypadku rozszczepienie białka fuzyjnego zachodzi w określonej sekwencji lub miejscu rozszczepienia w obrębie HA, a w połączeniu ze zmianami konformacyjnymi zależnymi od pH powoduje ekspozycję wirusowego peptydu fuzyjnego1,2.

Peptyd fuzyjny i poprzedzająca go sekwencja rozpoznawania proteazy są kluczowe dla patogeniczności i adaptacji gospodarza wirusa. Zmiany w sekwencji rozpoznawania proteazy mogą znacząco zmienić rozszczepienie, co może mieć dramatyczne konsekwencje dla wirusa i gospodarza4. Z jednej strony może znieść rozszczepienie, a tym samym wyeliminować cykl życiowy wirusa. Ale z drugiej strony, mutacja może zwiększyć specyficzność substratu dla danej proteazy i/lub pozwolić "nowej" proteazie na rozszczepienie białka fuzyjnego. Następnie może to również rozszerzyć tropizm komórek i tkanek, jak zaobserwowano, np. w przypadku podtypów wirusa grypy5,6. Zwykle wirusy grypy ptaków o niskiej zjadliwości (LPAI) i większość wirusów grypy ludzkiej są ograniczone do przewodu pokarmowego lub dróg oddechowych ze względu na ograniczoną lokalizację proteaz, które je aktywują. Zazwyczaj peptyd fuzyjny takich białek HA jest poprzedzony sekwencją czterech aminokwasów, która składa się z 1-2 nienastępujących po sobie aminokwasów zasadowych, która jest rozpoznawana przez proteazy serynowe podobne do trypsyny, takie jak trypsyna, matryptaza lub TMPRSS27,8. Kiedy wirus nabywa insercje lub mutacje, które zmieniają miejsce rozszczepienia na miejsce wielozasadowe, pozwala furynie aktywować kwas hialuronowy i potencjalnie spowodować znacznie poważniejszą infekcję ogólnoustrojową6,9. Wirusy te są określane jako wirus ptasiej grypy o wysokiej zjadliwości (HPAI), typowy dla szczepów H5N1.

W przeciwieństwie do grypy HA, wiele koronawirusów, takich jak MERS-CoV, ma dwa różne miejsca rozszczepienia w swoim białku kolca. Miejsce S1/S2 oddziela N-końcową domenę wiążącą receptor (S1) od C-końcowej domeny fuzyjnej (S2), z drugim miejscem cięcia, zwanym S2', za miejscem S1/S2, w pobliżu peptydu fuzyjnego10. Zasugerowano, że miejsca są rozszczepiane sekwencyjnie, w S1/S2, a następnie S2'. W przeciwieństwie do HA większości szczepów wirusa grypy, miejsca S1/S2 i S2 białka S MERS-CoV można rozpoznać po proteazach z rodziny konwertazy proproteinowej (PC), takich jak furyna. Członkowie tej rodziny rozszczepiają sparowane reszty zasadowe z motywem R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, dowolny aminokwas)2. Ogólnie rzecz biorąc, aminokwasy znajdujące się przed miejscem rozszczepienia są określane jako P1, P2, P3 itp. licząc od miejsca rozszczepienia, a aminokwasy znajdujące się poniżej są oznaczone jako P1', P2', P3' itd. 11. Szczepy FCoV mogą mieć pojedyncze lub podwójne miejsce rozszczepienia. Podobnie jak MERS-CoV, niektóre szczepy FCoV mają również dwa miejsca rozszczepienia (S1/S2 i S2') w białku S. Cecha ta jest jednak wyłączona dla serotypu I FCoV (klad A). Natomiast członkowie grupy serotyp II (klad B) mają tylko jedno miejsce rozszczepienia (S2')2,12. Sugeruje się, że kilka proteaz rozszczepia miejsca cięcia FCoV, w tym furyna, proteazy podobne do trypsyny i katepsyna. Zaproponowano, że białko S jelitowego FCoV (znanego również jako koronawirus jelitowy kotów lub FECV) prawdopodobnie zostanie rozszczepione przez furynę w miejscu S1 / S2, a mutacje w tym miejscu (jak również w S2') prowadzą do zmian w wymaganiach dotyczących proteazy. Mutacje te zostały związane ze zmianami tropizmu i patogenności tych wirusów, co pozwoliło wirusowi stać się ogólnoustrojowym i makrofagowo-tropowym (znanym również jako wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej kotów lub FIPV)13.

Wirusy naturalnie wprowadzają mutacje do swoich genomów podczas każdego cyklu replikacji i często opisywane są nowe podtypy i szczepy grypy, MERS-CoV i FCoV14,15,16. W ramach szybkiej oceny mającej na celu ocenę zagrożenia dla zdrowia publicznego związanego z pojawiającymi się wirusami, kluczowe znaczenie ma zbadanie zmian w miejscu rozszczepienia i jego wpływu na zakres proteaz aktywujących te wirusy. W tym miejscu opisujemy test oparty na peptydach, który pozwala bardzo szybko ocenić, w jaki sposób zmiany miejsca rozszczepienia w białku S MERS-CoV wpływają na specyficzność substratową danej proteazy i szybko przebadać różne proteazy pod kątem ich zdolności do rozszczepiania danej lub wielu sekwencji4. W drugim zestawie eksperymentów wykorzystaliśmy tę technikę do określenia aktywności rozszczepienia furyny na różnych serotypach i szczepach FCoV.

Peptydy użyte w tym teście są modyfikowane parą transferu energii rezonansu fluorescencji (FRET), 7-metoksykumaryno-4-yl acetylem (MCA) na N-końcu i N-2,4-dinitrofenylem (DNP) na C-końcu. Podczas testu MCA jest wzbudzany i emituje energię świetlną, która jest gaszona przez DNP, o ile para znajduje się w bliskiej odległości od siebie. Jeśli jednak dojdzie do rozszczepienia, DNP nie jest już w stanie wygasić emisji i może być ona odczytana przez czytnik płytek fluorescencyjnych. Zmiany fluorescencji są mierzone podczas eksperymentu w celu określenia szybkości rozszczepienia peptydu i obliczenia prędkości, z jaką proteaza rozszczepia określony peptyd (znany również jako Vmax)17.

Aby zaprojektować peptydy, gen odpowiedniego białka fuzyjnego musi zostać zsekwencjonowany i/lub udostępniony w bazie danych. Jednak metoda ta jest mniej pracochłonna i kosztowna niż metody konwencjonalne, które zwykle wymagają klonowania genu białka fuzyjnego do wektorów ekspresyjnych w celu ekspresji w komórkach ssaków w celu analizy rozszczepienia. Od początku do końca może to potrwać od kilku dni do kilku tygodni, podczas gdy przedstawione tutaj testy peptydowe można wykonać w ciągu jednego dnia, gdy tylko peptydy i proteazy będą dostępne. Przygotowanie testu trwa od 5 do 30 minut w zależności od liczby próbek, a czas pracy w czytniku płytek fluorescencyjnych wynosi 1 godzinę. Analiza danych może ponownie potrwać do 2 godzin, w zależności od wielkości próby.

Tutaj wybraliśmy dwa różne przykłady do zaprezentowania testu. W pierwszym przykładzie przedstawiamy dane, które porównują rozszczepienie MERS-CoV pochodzące od ludzi i wielbłądów za pośrednictwem furyny, aby ocenić potencjał szczepów pochodzących od wielbłądów do aktywacji u ludzi, jeśli przekroczą barierę gatunkową. W drugim przykładzie użyliśmy testu peptydów fluorogenicznych, aby określić rozszczepienie za pośrednictwem furyny miejsc S1 / S2 ' i S2 ' lub miejsca S2' odpowiednio dwóch szczepów FCoV serotypu I i dwóch serotypów II. W tych eksperymentach użyliśmy rozszczepienia trypsyny jako kontroli pozytywnej.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Projektowanie i przygotowanie peptydów

  1. Uzyskaj sekwencję białka fuzyjnego, które Cię interesuje, z publicznej bazy danych, takiej jak NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) lub bazy danych patogenów wirusowych (https://www.viprbrc.org). Wybierz miejsce rozpoznawania proteazy poprzedzające peptyd fuzyjny i uwzględnij 2-3 aminokwasy przed i za tą sekwencją.
  2. Zamawiając peptydy, zmodyfikuj je za pomocą pary FRET 7-metoksykumaryno-4-ylu acetylu (MCA) na N-końcu i N-2,4-dinitrofenylu (DNP) na C-końcu.
    UWAGA: Kilku dostawców oferuje te modyfikacje. Cena i czas dostawy zależą od wybranego dostawcy. Istnieją jednak alternatywne modyfikacje, które różnią się czułością i wymagają dostosowania czytnika płytek pod względem długości fal.
  3. Zawiesić peptyd zgodnie z zaleceniami producenta, delikatnie pipetując w górę iw dół. Na przykład ponownie zawiesić peptydy w 70% etanolu do końcowego stężenia 1 mM.
  4. Opcjonalnie dodać probówkę zawierającą peptyd i rozpuszczalnik do kąpieli sonicyjnej, aż do całkowitego ponownego zawieszenia, jeśli peptyd nie ulega zbyt dobremu zawieszeniu przez pipetowanie.
  5. Podzielić peptyd na rurki zwilżające światło lub odporne na wilgoć, aby chronić peptyd przed bieleniem. Utrzymuj małe rozmiary porcji, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania/rozmrażania (np. 100 μL). Porcje należy przechowywać w temperaturze -20°C.

2. Przygotowanie czytnika płytek fluorescencyjnych

  1. Włącz czytnik płytek i poczekaj, aż autotest zostanie zakończony.
  2. Otwórz oprogramowanie operacyjne na podłączonym komputerze i upewnij się, że jest ono połączone z czytnikiem płytek.
  3. Otwórz ustawienie temperatury i ustaw na 30 °C (lub temperaturę wymaganą do optymalnej wydajności proteazy).
  4. Kliknij Kontrola | Konfiguracja instrumentu, aby skonfigurować eksperyment.
  5. Wybierz opcję Kinetyczny.
  6. Wybierz opcję Fluorescencja.
  7. Wprowadź długości fal wzbudzenia i emisji: odpowiednio 330 nm i 390 nm.
  8. Usuń zaznaczenie opcji Automatyczne wyłączanie.
  9. Wybierz opcję Średnia, normalna czułość.
  10. Wybierz czas trwania testu wynoszący 1 godzinę i wybierz jeden pomiar co 60 sekund.
  11. Ustaw mieszanie na 5 s przed pierwszym pomiarem i 3 s przed każdym pomiarem
  12. Wybierz studzienki do odczytania i rozpocznij test.

3. Przygotowanie testu

  1. Przygotować bufor do oznaczania, obliczając odpowiednie ilości dla każdego składnika i dodając go. W przypadku furyny należy przygotować bufor składający się ze 100 mM HEPES, 1 mM CaCl2, 1 mM 2-merkaptoetanolu, 5% Triton X-100. W przypadku trypsyny należy użyć standardowego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
    UWAGA: Objętości 10 ml lub mniejsze są wystarczające. W zależności od proteazy (proteaz) użytej w teście bufor jest różny.
  2. Schłodzić bufor na lodzie.
  3. Umieść płytkę testową na lodzie z cienką metalową płytką pod spodem, aby wspomóc chłodzenie i stabilność. Użyj solidnej czarnej polistyrenowej płytki 96-dołkowej z płaskim dnem i niepoddanej obróbce.
    UWAGA: Konieczne jest stosowanie czarnych płytek, aby zapobiec fluorescencyjnemu "wyciekowi" z sąsiednich studni.
  4. Oblicz odpowiednią ilość proteazy do dodania dla każdej reakcji na podstawie wcześniejszych publikacji lub danych eksperymentalnych. W przypadku furyny należy użyć 1 jednostki na reakcję, co odpowiada 0,5 μl. W przypadku trypsyny użyj 0,5 μl trypsyny TPCK o stężeniu 160 nM.
  5. Na próbkę należy przygotować 3 kontrpróby techniczne na test o łącznej objętości 100 μl na próbkę.
    UWAGA: Oceniono eksperymentalnie, że nie ma znaczenia, czy pipetowanie odbywa się w normalnych warunkach oświetleniowych, czy w przyciemnionym świetle. Jednak peptydy nie powinny być wystawione na działanie światła przez dłuższy czas.
  6. Odpipetować odpowiednią ilość buforu do oznaczania (94,5 μl, zgodnie z opisem w kroku 3.1) do każdego dołka.
  7. Dodaj proteazę do każdej studzienki. Zarówno w przypadku furyny, jak i trypsyny TPCK, należy użyć 0,5 μl na próbkę. Do 6 dołków (3 dołki dla ślepej próby i 3 dołki dla kontroli peptydowej) dodaj 0,5 μl buforu zamiast odpowiedniej proteazy.
  8. Dodać peptyd do końcowego stężenia 50 μM do każdej studzienki, z wyjątkiem ślepej próby. W takim przypadku należy odpipetować 5 μl peptydu przygotowanego zgodnie z opisem w kroku 1.3. Dodać 5 μl buforu do ślepej próby kontrolnej zamiast peptydu.
    UWAGA: Początkowo przetestowano kilka stężeń peptydu z opisanymi stężeniami enzymów, aby upewnić się, że enzymy są nasycone.
  9. Włóż płytkę do czytnika płytek fluorescencyjnych i kliknij przycisk start.

4. Analiza danych

  1. Zapisz plik eksperymentu.
  2. Kliknij Eksportuj i wyeksportuj plik jako .txt.
  3. Zaimportuj plik .txt do arkusza kalkulacyjnego.
  4. Dla każdej kontrpróby technicznej na próbkę należy utworzyć wykres przedstawiający względne jednostki fluorescencyjne (RFU) na osi y w funkcji czasu na osi x (rysunek uzupełniający 1).
  5. Wybierz zakres danych, w którym wykres znajduje się w zakresie liniowym i znajduje się najbliżej początku wzrostu fluorescencji.
  6. Wykreśl wybrane dane na drugim wykresie i dodaj liniową linię trendu.
  7. Wybierz w opcjach linii trendu Wyświetl równanie na wykresie. Równanie pokaże Vmax.
  8. Obliczyć średnią Vmax dla każdej próbki z 3 kontrprób technicznych.
  9. Powtórz eksperyment jeszcze dwa razy, aby uzyskać 3 kontrpróby biologiczne.
  10. Obliczyć odchylenie standardowe na podstawie danych z 3 niezależnych kontrprób biologicznych.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W pierwszej części tego badania użyliśmy peptydów, które reprezentują miejsce cięcia S2' trzech różnych białek S MERS-CoV: z prototypowego ludzkiego szczepu EMC/2012 (Genbank AFS88936.1) oraz z dwóch wybranych szczepów MERS-CoVs pochodzących z wielbłądów, NRCE-HKU205 (Genbank AHL18090.1) i Mor215 (Genbank AVN89324.1), wyizolowanych odpowiednio w Egipcie i Maroku (Tabela 1)16,Rozdział 18.

W porównaniu ze szczepem EMC/2012, miejsce rozszczepienia HKU205 S2' ma dwie mutacje w pozycjach P2 i P1', które mogą potencjalnie wpłynąć na jego rozpoznanie przez furynę i zmienić efektywność rozszczepienia (Tabela 1). Ponadto byliśmy zainteresowani zbadaniem, czy i w jaki sposób każda indywidualna mutacja znaleziona w szczepie HKU205 wpływa na rozszczepienie furyny. W związku z tym włączyliśmy dwa peptydy, w których poszczególne substytucje zostały wprowadzone do sekwencji peptydowej EMC/2012 (EMC/2012 mutA-S S2' i EMC/2012 mutS-I S2') (Tabela 1). Furin był w stanie skutecznie rozszczepić peptyd EMC/2012 z Vmax 6,3 ± 1,2 RFU/min, podczas gdy wykryliśmy prawie brak rozszczepienia przy użyciu peptydu S2' szczepu HKU205 (Vmax 0,5 ± 0,1 RFU/min) (Rysunek 1a). Podczas badania peptydu EMC/2012 mutA-S S2' stwierdziliśmy, że rozszczepienie było znacznie zmniejszone w porównaniu z sekwencją typu dzikiego (Vmax 3,6 ± 1 RFU/min). Podczas testowania peptydu EMC/2012 mutS-I S2' (Vmax 1,1 ± 0,9 RFU/min) (Rysunek 1a).

Ostatnio zgłoszono izolaty MERS-CoV z Afryki Zachodniej, które filogenetycznie różnią się od MERS-CoV znalezionych na Półwyspie Arabskim16. Jednym z ostatnio opisanych izolatów jest szczep Mor213, który przenosi leucynę zamiast argininy w pozycji P4 w miejscu S2' (Tabela 1), co może potencjalnie wpływać na jego rozpoznawanie przez furynę i zmieniać efektywność rozszczepienia. Nasz test peptydowy wykazał, że miejsce Mor213 S2' jest tylko minimalne w porównaniu z miejscem EMC/2012 (Rysunek 1b). Vmax dla peptydu Mor213 wynosi 1,0 ± 0,1.

W drugiej części tego badania użyliśmy tego samego testu peptydowego do oceny rozszczepienia białka FCoV S za pośrednictwem furyny. Użyliśmy peptydów naśladujących miejsce cięcia S1/S2 dwóch wirusów serotypu I FCoV: FECV I And-4 (z laboratorium Whittaker) i FIPV I Black (Genbank AB088223.1). Użyliśmy również peptydów naśladujących miejsce S2' tych wirusów, a także dwóch szczepów FCoV serotyp II: FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) i FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) (Tabela 1). Zazwyczaj rozszczepienie furyny występuje, gdy zasadnicze reszty (arginina i lizyna) są obecne w pozycjach P1 i P4 w miejscu rozszczepienia. Sugeruje się, że mutacje w pozycjach P1, P4 i P1' zakłócają rozszczepialność furyny, zmieniając w ten sposób wymagania dotyczące proteazy białka. (Tabela 1). Rozszczepienie furyny zaobserwowano dla prototypowego peptydu S1/S2 FECV I And-4 S1/S2 (Vmax 100,36 ± 7,61 RFU/min), ale nie w zmutowanym peptydzie S1/S2 FIPV I Black S1/S2 (Vmax -1,37 ± 1,29 RFU/min) (Rysunek 2A). Podobnie furyna była w stanie rozszczepić prototypowy peptyd S2' FECV II 1683 S2' (Vmax 5,46 ± 0,97 RFU/min), ale nie zmutowane peptydy S2' FECV I And-4 S2' (Vmax 0,26 ± 0,11 RFU/min), FIPV I Black S2' (Vmax 0,30 ± 0,14 RFU/min) i FIPV II 1146 S2' (Vmax -0,36 ± 0,11 RFU/min) (Rysunek 2B). Użyliśmy trypsyny jako pozytywnej kontroli rozszczepienia peptydów i zaobserwowaliśmy rozszczepienie trypsyny we wszystkich zastosowanych peptydach (rysunek uzupełniający 2).

figure-results-1

Tabela 1. Zastosowane peptydy i odpowiadające im sekwencje aminokwasów. Peptydy stosowane w testach zawierają parę (7-metoksykumaryno-4-ylo) acetyl/2,4-dinitrofenyl (MCA/DNP) FRET. Reszty argininy (R) w miejscu rozszczepienia P4 i P1, które są rozpoznawane przez furynę, są pogrubione. Reszty w kolorze czerwonym odpowiadają mutacjom w porównaniu z sekwencjami referencyjnymi.

figure-results-2
Rysunek 1. Proteolityczne rozszczepienie peptydów fluorogenicznych MERS-CoV S2 pochodzących od ludzi i wielbłądów. ZA. Test rozszczepienia furyny w miejscu wystąpienia ludzkiego MERS-CoV EMC/2012 S2' i szczepu HKU205 pochodzącego z wielbłąda (podwójny mutant), wraz z pojedynczymi wariantami zmutowanymi EMC/2012 (mutA-S i mutS-I). Ur. Test rozszczepienia furyny w ludzkim miejscu MERS-CoV EMC/2012 S2' i szczep Mor213 pochodzącym z wielbłąda. W przypadku paneli A i B peptydy inkubowano z rekombinowaną furyną, a wzrost fluorescencji spowodowany przetwarzaniem proteolitycznym mierzono za pomocą fluorometru. Testy przeprowadzono w trzech egzemplarzach, a wyniki reprezentowały średnie Vmax z trzech niezależnych eksperymentów (n=3). Słupki błędów wskazują SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 2. Proteolityczne rozszczepienie peptydów fluorogenicznych w miejscach FCoV, S1/S2 i S2' za pośrednictwem furyny.A. Test rozszczepienia furyny w miejscach FECV I And-4 i FIPV I Black S1/S2. Peptydy inkubowano z rekombinowaną furyną. Ur. Test rozszczepienia furyny w miejscach FECV I And-4, FIPV I Black, FECV II 1683 i FIPV II 1146 S2'. Wzrost fluorescencji spowodowany przetwarzaniem proteolitycznym mierzono za pomocą fluorometru. Testy przeprowadzono w trzech egzemplarzach, a wyniki reprezentowały średnie Vmax z trzech niezależnych eksperymentów (n=3). Słupki błędów wskazują SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca 1: Wartości Vmax używane dla Rysunek 1 i Rysunek 2. Wartości Vmax zostały obliczone na podstawie wykresów, jak pokazano w Uzupełnieniu Rysunek 1 i jak opisano w sekcji 4 Protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Uzupełniające Rysunek 1: Ilustracja surowych danych pochodzących z oprogramowania do odczytu płyt. Wzrost fluorescencji w czasie: wykresy, które zostały użyte do wyznaczenia Vmax. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Uzupełniające Rysunek 2: Proteolityczne rozszczepienie miejsc FCoV S1/S2 i S2' za pośrednictwem trypsyny. Test rozszczepienia trypsyny w miejscach FECV I And-4 i FIPV I Black S1/S2 oraz w miejscach FECV I And-4, FIPV I Black, FECV II 1683 i FIPV II 1146 S2'. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj test peptydów fluorogenicznych, który pozwala na szybkie badanie przesiewowe sekwencji białek pod kątem ich proteolitycznego rozszczepienia przez proteazy. W naszym pierwszym przykładzie wybraliśmy różne motywy miejsca rozszczepienia białka kolca (S) MERS-CoV, aby zilustrować jedno zastosowanie w tym teście. Kilka wirusów otoczkowych, które posiadają białka fuzyjne klasy I, takich jak MERS-CoV, SARS-CoV (zespół ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej) i grypa, stanowią poważne problemy dla zdrowia publicznego, a nowe podtypy stale ewoluują, które mają potencjał do przekraczania barier gatunkowych od ich naturalnych gospodarzy do ludzi 1,15,16. Wyizolowanie wirusów i hodowla ich w laboratorium nie zawsze jest wykonalne lub wymaga specjalnych laboratoriów, które nie są dostępne w każdej placówce badawczej. W związku z tym istnieje potrzeba opracowania metod oceny potencjalnego zagrożenia dla zdrowia publicznego związanego z pojawiającymi się wirusami, które można przeprowadzić w normalnych warunkach laboratoryjnych. Oprócz wirusów atakujących ludzi, niektóre wirusy zwierzęce, takie jak FCoV, mają również te same białka fuzyjne klasy I, a zatem mają podobne cechy jak ich ludzkie odpowiedniki. Wyizolowanie tych wirusów może być również wyzwaniem, co sprawia, że konieczne jest wykorzystanie innowacyjnych narzędzi do ich badania.

Kluczowym krokiem w cyklu życiowym wyżej wymienionych wirusów jest wnikanie do komórek gospodarza i fuzja, w której pośredniczy proteolityczne przetwarzanie odpowiedniego białka fuzyjnego przez proteazygospodarza 1,2. Standardowym sposobem badania tej części cyklu życiowego wirusa jest sklonowanie genu białka fuzyjnego do wektora ekspresji ssaków, transfekcyjnych komórek ssaków, które pozwalają na ekspresję białka, inkubacji lub kotransfekcji z proteazą będącą przedmiotem zainteresowania, wyizolowania białka i przeprowadzenia analizy western blot. Metoda ta wiąże się z kilkoma ograniczeniami: dostępnością wirusowego DNA/RNA do klonowania, kosztami syntezy genu, jeśli nie jest dostępne DNA lub RNA, dostępnością przeciwciała do wykrywania białka fuzyjnego i jego produktu (produktów) rozszczepienia, a przeprowadzenie całego badania może potrwać do kilku tygodni. Staje się to nawet bardziej czasochłonne, kosztowne i pracochłonne, jeśli celem badania jest zbadanie kilku mutacji w miejscu rozszczepienia, ponieważ wymaga to mutagenezy ukierunkowanej na miejsce. Opisany przez nas test peptydów fluorogenicznych nie ma tych ograniczeń. Peptydy, które są przedmiotem zainteresowania, mogą być projektowane w oparciu o publicznie dostępne sekwencje, istnieje kilku dostawców, którzy zapewniają szeroką gamę rekombinowanych proteaz, które są istotne dla tego rodzaju badań, a test wraz z analizą można przeprowadzić w ciągu jednego dnia.

W naszym przykładzie zbadaliśmy rozszczepienie za pośrednictwem furyny miejsca rozpoznawania proteazy S2' białka S MERS-CoV pochodzącego od ludzi i wielbłądów z Egiptu i Maroka. Zarówno ludzka EMC/2012, jak i wielbłądzia HKU205 S2 zawierają typowy dla RXXR motyw rozszczepienia furyny. Jednak zgodnie z algorytmem oceny rozszczepienia PiTou 2.0 nie przewiduje się, aby miejsce HKU205 S2' zostało rozszczepione przez furynę, co potwierdziliśmy eksperymentalnie19. Powodem, dla którego HKU5 S2' nie jest przetwarzany przez furynę, może być izoleucyna w pozycji P1'. Kiedy przetestowaliśmy dwa peptydy, które przenosiły poszczególne mutacje w sekwencji EMC/2012 S2', byliśmy w stanie potwierdzić, że izoleucyna w P1' w dużej mierze znosi rozszczepienie, podczas gdy substytucja alaniny do seryny spowodowała zmniejszenie rozszczepienia. Na stronie Mor213 S2 nie ma motywu rozszczepienia furyny i nie było zaskoczeniem, że prawie nie wykryto dekoltu. Zbadaliśmy również, w jaki sposób furyna rozszczepia miejsca rozpoznawania proteazy S1/S2 i S2' białka FCoV S. Udało nam się zaobserwować rozszczepienie furyny obu peptydów FECV (FECV I And-4 S1/S2 i FECV II 1683 S2'), podczas gdy zmutowane sekwencje wirusów FIPV nie zostały rozszczepione przez furynę.

Porównując rozszczepienie peptydu EMC/2012 S2' za pośrednictwem furyny (ryc. 1A) z peptydami FECV I i -4 S1/2 (ryc. 2A), stwierdziliśmy, że istniała około 26-krotna różnica w Vmax. Można to wytłumaczyć motywem rozszczepienia furyny w obu sekwencjach (tab. 1). Podczas gdy minimalnym wymogiem dla rozszczepienia furyny jest motyw RXXR, sekwencja RXRR jest znacznie bardziej korzystna2. W związku z tym peptyd S2' EMC/2012, który ma motyw RSAR, jest rozszczepiany z mniejszą swoistością w porównaniu z peptydem FECV I And-4 S1/2, który zawiera miejsce rozszczepienia furyny RSRR (Tabela 1).

Jednak jednym z głównych ograniczeń testu jest to, że peptydy nie odzwierciedlają trzeciorzędowej struktury białka, w którym są zwykle osadzone. Rozszczepienie białka fuzyjnego na całej długości odsłania peptyd fuzyjny i wyzwala wejście do komórki gospodarza1. Na interakcję między proteazą a białkiem fuzyjnym może mieć również wpływ trzeciorzędowa struktura białka fuzyjnego, podczas gdy zakładamy, że peptydy są mniej więcej liniowe. W związku z tym rozszczepienie wykryte w teście peptydowym może być sztuczne i może nie odzwierciedlać sytuacji in vivo. Stwierdzono to w przypadku rozszczepienia podtypu HA grypy H3N2 przez matryptazę. Podczas gdy kilka grup opisało rozszczepienie H3N2 HA przez matryptazę w testach peptydowych, wykazano również, że inkubacja pełnej długości białka HA H3N2 i matryptazy w hodowli komórkowej nie dała fuzogennego białka HA 4,20,21. Istnieją inne przykłady, które pokazują, że biologicznie ważna regulacja rozszczepienia proteolitycznego odbywa się na poziomie konformacji białek. Opisano, że białka fuzyjne czasami potrzebują serii zdarzeń poprzedzających fuzję, aby móc odsłonić miejsca rozszczepienia po fuzji. Na przykład białko fuzyjne wirusa lasu Semliki wymaga przegrupowania strukturalnego podczas wielu zdarzeń prefuzyjnych, aby odsłonić swoje białko fuzyjne i udostępnić je do aktywacji proteolitycznej22. W związku z tym wyniki uzyskane w teście peptydów fluorogenicznych muszą zostać zatwierdzone za pomocą testów fuzji komórkowej lub podobnych eksperymentów. Jednak test peptydowy nadal pozwala na szybkie badanie przesiewowe kilku kombinacji proteazy / peptydu oraz na zmniejszenie nakładu pracy i czasu eksperymentów kontrolnych, ponieważ kombinacje, które nie wykazują rozszczepienia, z dużym prawdopodobieństwem wykażą ten sam wynik in vivo.

Drugie poważne ograniczenie testu dotyczy proteaz. Do tej pory możliwe jest badanie tylko proteaz rozpuszczalnych, ale nie proteaz transbłonowych. W zależności od intencji eksperymentu może to stanowić problem. Na przykład HA grypy są aktywowane przez szereg transbłonowych proteaz zlokalizowanych na błonach komórkowych8. Do pewnego stopnia problem ten można obejść, stosując rozpuszczalne proteolityczne domeny aktywne, ale wyniki należy interpretować z ostrożnością i walidować konwencjonalnymi metodami. Chcemy odwołać się do wspomnianego wcześniej przykładu z matryptazą i jej aktywnością wobec H3N2 HA. In vivo matryptaza znajduje się w błonie komórkowej, ale dostępnym na rynku enzymem jest rozpuszczalna domena katalityczna. Jak omówiono w odniesieniu do białek fuzyjnych, możliwe jest, że wymaga to również interakcji proteazy o pełnej długości z substratem białkowym o pełnej długości w celu uzyskania rozszczepienia, a testowanie tylko pojedynczych domen może skutkować fałszywie dodatnimi wynikami.

Metodologia ta okazała się skuteczna w badaniu rozszczepienia określonych sekwencji aminokwasów przez furynę. Jednak zastosowania tej techniki rozciągają się na każdą dostępną proteazę (np. katepsyny, konwertazę proproteinową), co czyni ją użyteczną metodą przesiewową kandydatów peptydowych do rozszczepienia proteazy. Co więcej, wykazano, że test ten może być również stosowany do testowania skuteczności inhibitorów proteazy, a tym samym zapewnia szybkie i łatwe narzędzie do badań przesiewowych inhibitorów białek23.

Opisany tutaj test rozszczepienia peptydów fluorogenicznych stanowi dodatek do bioinformatycznych algorytmów oceny rozszczepienia, które przewidują rozszczepienie peptydu przez określoną proteazę, na podstawie właściwości i sekwencji aminokwasów. Te dwie techniki, w połączeniu z tradycyjnymi technikami western blot, mogą być stosowane jako skuteczna metoda badania rozszczepienia proteazy in vitro.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie badań nad projektem MERS przedstawionym w tym manuskrypcie zostało zapewnione przez grant NIH R21 AI111085. Badanie koronawirusa kotów było wspierane przez granty badawcze z Morris Animal Foundation, Winn Feline Foundation i Cornell Feline Health Center. Chcielibyśmy również podziękować Malikowi Peirisowi za udostępnienie nam sekwencji Mor213 zanim stała się ona publicznie dostępna.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PeptydyBiomatikN/A
TPCK4352157-1KT
HEPESSigma-AldrichH3375
CaCl2Sigma-AldrichC1016
2-merkaptoetanolSigma-AldrichM6250
Triton-X100Sigma-AldrichX100
PBSCorning21-040-CV
SpectraMax GeminiXPS Urządzenia molekularneXPS
SoftMax Pro 6.5.1 Urządzenia molekularneNie dotyczy Płytka
96-dołkowa (lity polistyren z płaskim dnem i niepoddany obróbce)Costar3915
Rurki tłumiące światłoWatson Lab131-915BL lub 131-915BR
Microsoft ExcelMicrosoftN/A
Prism 7GraphPadN/A
Furin NEB P8077S Trypsyna, Sigma-Aldrich z powłoką

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Virology. 479-480, 498-507 (2015).
  2. Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. , (2014).
  3. Hamilton, B. S., Whittaker, G. R., Daniel, S. Influenza virus-mediated membrane fusion: Determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion. Viruses. 4 (7), 1144-1168 (2012).
  4. Straus, M. R., Whittaker, G. R. A peptide-based approach to evaluate the adaptability of influenza A virus to humans based on its hemagglutinin proteolytic cleavage site. PloS one. 12 (3), e0174827(2017).
  5. Kawaoka, Y., Webster, R. G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (2), 324-328 (1988).
  6. Abdelwhab, E. S. M., et al. A Unique Multibasic Proteolytic Cleavage Site and Three Mutations in the HA2 Domain Confer High Virulence of H7N1 Avian Influenza Virus in Chickens. Journal of Virology. 90 (1), 400-411 (2016).
  7. Steinhauer, D. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology. 258 (1), 1-20 (1999).
  8. Böttcher-Friebertshäuser, E., Klenk, H. D., Garten, W. Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium. Pathogens and disease. 69 (2), 87-100 (2013).
  9. Horimoto, T., Nakayama, K., Smeekens, S. P., Kawaoka, Y. Proprotein-processing endoproteases PC6 and furin both activate hemagglutinin of virulent avian influenza viruses. Journal of Virology. 68 (9), 6074-6078 (1994).
  10. Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5871-5876 (2009).
  11. Polgar, L. General Aspects of Proteases. Mechanisms of Protease Action. , 43-76 (1989).
  12. Whittaker, G. R., André, N. M., Millet, J. K. Improving Virus Taxonomy by Recontextualizing Sequence-Based Classification with Biologically Relevant Data: the Case of the Alphacoronavirus 1 Species. mSphere. 3 (1), 1-8 (2018).
  13. Licitra, B. N., et al. Mutation in spike protein cleavage site and pathogenesis of feline coronavirus. Emerging Infectious Diseases. 19 (7), 1066-1073 (2013).
  14. Sanjuan, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., Belshaw, R. Viral Mutation Rates. Journal of Virology. 84 (19), 9733-9748 (2010).
  15. Trombetta, C., Piccirella, S., Perini, D., Kistner, O., Montomoli, E. Emerging Influenza Strains in the Last Two Decades: A Threat of a New Pandemic? Vaccines. 3 (1), 172-185 (2015).
  16. Chu, D. K. W., et al. MERS coronaviruses from camels in Africa exhibit region-dependent genetic diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 1-6 (2018).
  17. Caprioli, R. M., Smith, L. Determination of Km and Vmax for Tryptic Peptide Hydrolysis Using Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 58 (6), 1080-1083 (1986).
  18. Millet, J. K., Goldstein, M. E., Labitt, R. N., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging microbes and infections. 5 (12), e126-e129 (2016).
  19. Tian, S., Huajun, W., Wu, J. Computational prediction of furin cleavage sites by a hybrid method and understanding mechanism underlying diseases. Scientific Reports. 2, (2012).
  20. Hamilton, B. S., Gludish, D. W. J., Whittaker, G. R. Cleavage Activation of the Human-Adapted Influenza Virus Subtypes by Matriptase Reveals both Subtype and Strain Specificities. Journal of Virology. 86 (19), 10579-10586 (2012).
  21. Beaulieu, A., et al. Matriptase Proteolytically Activates Influenza Virus and Promotes Multicycle Epithelium Replication in the Human Airway. Journal of virology. 30 (878), 4237-4251 (2013).
  22. Hammar, L., Markarian, S., Haag, L., Lankinen, H., Salmi, A., Holland Cheng, R. Prefusion rearrangements resulting in fusion peptide exposure in Semliki Forest virus. Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 7189-7198 (2003).
  23. Hamilton, B. S., Chung, C., Cyphers, S. Y., Rinaldi, V. D., Marcano, V. C., Whittaker, G. R. Inhibition of influenza virus infection and hemagglutinin cleavage by the protease inhibitor HAI-2. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (2), 1070-1075 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Fluorogenic Peptide Cleavage AssayProteolytic Activity ScreeningCoronavirus Spike ProteinFurin Cleavage ActivityFRET Peptide DesignFluorescence Plate ReaderKinetic Fluorescence AssayPeptide Substrate AnalysisProtease Inhibitor CharacterizationViral Fusion Protein Activation

Powiązane artykuły