Artykuł metodologiczny

Ekspansja dwuwymiarowych mat z nanowłókien elektroprzędzonych do rusztowań trójwymiarowych

6.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58918

⸱

7 stycznia 2019

 ,  ,  , 
1Department of Surgery-Transplant and Mary & Dick Holland Regenerative Medicine Program, University of Nebraska Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł demonstruje technikę rozbudowy tradycyjnej, dwuwymiarowej (2D) elektroprzędzonej maty z nanowłókien w trójwymiarowe (3D) rusztowanie poprzez rozhermetyzowanie podkrytycznego płynu CO2. Te rozszerzone rusztowania są 3D, ściśle naśladują komórkowe wskazówki nanotopograficzne i zachowują funkcje cząsteczek biologicznych zamkniętych w nanowłóknach.

Streszczenie

Elektroprzędzenie było preferowaną technologią w produkcji syntetycznego, funkcjonalnego rusztowania ze względu na biomimikrę macierzy zewnątrzkomórkowej i łatwość kontroli składu, struktury i średnicy włókien. Jednak pomimo tych zalet, tradycyjne rusztowania z nanowłókien elektroprzędzonych mają ograniczenia, takie jak niezorganizowana orientacja nanowłókien, niska porowatość, mały rozmiar porów, a głównie dwuwymiarowe maty. W związku z tym istnieje ogromna potrzeba opracowania nowego procesu wytwarzania rusztowań z elektroprzędzonych nanowłókien, który może przezwyciężyć powyższe ograniczenia. W tym miejscu przedstawiono nowatorską i prostą metodę. Tradycyjna mata z nanowłókien 2D jest przekształcana w rusztowanie 3D o pożądanej grubości, odległości szczeliny, porowatości i wskazówkach nanotopograficznych, aby umożliwić zasiewanie i proliferację komórek poprzez rozhermetyzowanie podkrytycznego płynu CO2 . Oprócz zapewnienia rusztowania dla regeneracji tkanek, metoda ta daje również możliwość enkapsulacji cząsteczek bioaktywnych, takich jak peptydy przeciwdrobnoustrojowe, w celu miejscowego dostarczania leków. Rusztowania z ekspandowanych nanowłókien CO2 mają ogromny potencjał w regeneracji tkanek, gojeniu się ran, modelowaniu tkanek 3D i miejscowym dostarczaniu leków.

Wprowadzenie

Koncepcja stworzenia syntetycznego rusztowania, które może być wszczepiane pacjentom, aby wspomóc naprawę i regenerację tkanek, jest jedną z tych, które przenikają dziedzinę medycyny regeneracyjnej od dziesięcioleci. Idealne rusztowanie syntetyczne służy do indukowania migracji komórek z otaczających zdrowych tkanek, zapewnia architekturę do wysiewu komórek, adhezji, sygnalizacji, proliferacji i różnicowania, wspiera unaczynienie, pozwala na odpowiednie natlenienie i dostarczanie składników odżywczych oraz promuje aktywność immunologiczną gospodarza, aby zapewnić sukces po implantacji1. Dodatkowo może być używany jako nośnik do osadzania cząsteczek przeciwdrobnoustrojowych, które wspomagają gojenie się ran1,3,6,7,8,9. Zdolność do kontrolowania czasowego uwalniania tych cząsteczek biologicznych z syntetycznego rusztowania jest kolejnym pożądanym atrybutem, który jest brany pod uwagę przy projektowaniu rusztowań1.

Elektroprzędzenie jest dobrze wykorzystywaną techniką do produkcji rusztowań z nanowłókien1,2,3,4,5,6. Poprzednie próby stworzenia rusztowania z nanowłókien, takiego jak to omawiane tutaj, były podejmowane z różnym powodzeniem. Jednak tradycyjne rusztowania z nanowłókien mają ograniczone możliwości osiągnięcia tych celów. Tradycyjne rusztowania z nanowłókien to głównie dwuwymiarowe maty1,3. Te nieekspandowane rusztowania są gęsto upakowane z małymi rozmiarami porów; Ogranicza to infiltrację, migrację i różnicowanie komórek, ponieważ nie promuje środowiska wystarczająco podobnego do tych występujących in vivo1,7,8,9. Z tego powodu opracowano nowsze techniki przygotowania rusztowań z nanowłókien 3D elektroprzędzonych, aby zmienić nieodłączne wady, które towarzyszą matom z nanowłókien 2D. Techniki te skutkują rusztowaniami 3D; Mają one jednak ograniczone zastosowanie ze względu na metody produkcji wymagające roztworów wodnych i procedury liofilizacji. Przetwarzanie to powoduje losowy rozkład nanowłókien bez ograniczonej organizacji, odpowiedniej grubości i/lub pożądanej porowatości, aby zapewnić odpowiednie wskazówki nanotopograficzne, które są niezbędne do migracji i proliferacji komórek. Czynniki te powodują, że poprzednie rusztowania z nanowłókien 3D były elektroprzędzone, ale nie miały odpowiedniej mimikry żywych tkanek1,7,8,9.

Ostatnie próby opracowania rozszerzonego, 3D rusztowania z lepszą biomimikrą macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) zostały przeprowadzone przy użyciu roztworu wodnego roztworu borowodorku sodu (NaBH4) i wstępnie zaprojektowanych form, aby pomóc w lepszej kontroli kształtu powstałego rusztowania7,8. Jednak ta metoda nie jest idealna, ponieważ wymaga użycia roztworów wodnych, reakcji chemicznych i liofilizacji, które mogą zakłócać działanie polimerów i wszelkich zamkniętych w kapsułkach biomolekuł, które są rozpuszczalne w wodzie. Zastosowane dodatki mogą również powodować skutki uboczne podczas regeneracji tkanek8,9. Opisana w tym artykule metoda rozprężania CO2 znacznie skraca czas przetwarzania, eliminuje potrzebę stosowania roztworów wodnych oraz zachowuje ilość i funkcjonalność biologicznie aktywnych cząsteczek w większym stopniu niż wcześniej ustalone metody9.

W poprzednich badaniach, antybiotyki, srebro, 1α,25 dihydroksywitamina D3 i peptyd przeciwbakteryjny LL-37 zostały załadowane do rusztowań z nanowłókien pojedynczo i w połączeniu, aby zbadać potencjał tych rusztowań do uwalniania środków wspomagających gojenie się ran9,10,12,13. W celu zademonstrowania tej metody rozszerzania rusztowania z nanowłókien, Coumarine 6, barwnik fluorescencyjny, zostanie załadowany do rusztowania, aby zademonstrować potencjał osadzania rusztowania w różnych pożądanych związkach. Ta metoda wytwarzania rusztowań z ekspandowanych nanowłókien w połączeniu z kapsułkowanymi cząsteczkami bioaktywnymi ma ogromny potencjał w regeneracji tkanek, gojeniu się ran, tworzeniu modeli tkanek 3D i miejscowym podawaniu leków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury in vivo opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Komitet IACUC w Centrum Medycznym Uniwersytetu Nebraska.

1. Przygotuj rozwiązania do standardowego elektroprzędzenia

  1. W szklanej probówce o pojemności 20 ml rozpuścić 2 g poli(ε-kaprolaktonu) (PCL, Mw = 80 kDa) w mieszaninie rozpuszczalników dichlorometanu (DCM) i N,N-dimetyloformamidu (DMF) w proporcji 4:1 (v/v) przy stężeniu 10% (w/v).
    UWAGA: Z DCM i DMF należy obchodzić się w dobrze wentylowanym okapie, aby uniknąć narażenia na opary. Nie wystawiaj DCM na działanie tworzyw sztucznych.
  2. Umieść szklaną probówkę w rotatorze laboratoryjnym, aż roztwór stanie się klarowny. Roztwór może mieszać się z dnia na dzień.
  3. W przypadku zamiaru osadzenia w rusztowaniu materiałów bioaktywnych, takich jak peptydy lub leki, należy sporządzić oddzielny roztwór i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do użycia.
    1. Przygotować roztwór barwnika fluorescencyjnego (50 μg/ml) przy użyciu 20 ml roztworu PCL.

2. Ustaw aparat do elektroprzędzenia (Rysunek 1A)

  1. Dodać roztwór PCL do strzykawki o pojemności 20 ml z dołączoną igłą w rozmiarze 21. Upewnij się, że w strzykawce i związanych z nią rurkach nie ma powietrza.
  2. Umieść obracający się stalowy bęben z kolektorem gruntowym w odległości 12 cm od końcówki igły.
  3. Za pomocą zacisków krokodylkowych podłącz prąd stały (DC) High Voltage zasilacz do igły i upewnij się, że kolektor jest uziemiony.
    UWAGA: Zawsze wyłączaj zasilanie przed przystąpieniem do jakichkolwiek podłączonych materiałów.

3. Elektroprzędzenie

  1. Dla 20 ml roztworu PCL należy ustawić parametry pompy strzykawkowej w następujący sposób: średnica = 20,27 mm, natężenie przepływu = 0,5 ml/h. Sprawdź, czy na końcu igły tworzą się kropelki.
  2. Jeśli pożądane jest włączenie cząsteczek bioaktywnych, należy ustawić aparaturę tak, aby umożliwić współosiowe elektroprzędzenie (rysunek 1B). Stwórz niestandardową dyszę współosiową za pomocą igieł podskórnych.
    UWAGA: Takie dysze są również dostępne w handlu. Należy pamiętać, że przygotowuje się roztwór barwnika, aby symulować dodawanie takich cząsteczek.
    1. Przygotuj 1% roztwór barwnika fluorescencyjnego kumaryny 6 w wodzie. Dodaj 3 ml 1% barwnika do małej strzykawki. Podłączyć strzykawkę do tej samej dyszy współosiowej, co roztwór PCL. Jeszcze raz upewnij się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
    2. Dla tego roztworu o objętości 3 ml należy ustawić parametry pompy strzykawkowej w następujący sposób: średnica = 9,49 mm, natężenie przepływu = 0,02 ml/h. Sprawdź, czy na końcu igły tworzą się kropelki.
  3. Przyłożyć potencjał elektryczny 20 kV między dyszą przędzalniczą (iglicą o rozmiarze 22) a kolektorem gruntowym znajdującym się w odległości 20 cm od dyszy przędzalniczej. Zbierz wyrównane maty z nanowłókien w bębnie obracającym się z prędkością 2,000 obr./min. Zbierz maty z nanowłókien PCL, gdy osiągną grubość ~1 mm.

4. Generacja mat z nanowłókien PCL z otworami w układzie.

  1. Wytwarzaj maty z nanowłókien PCL.
    1. Kulki PCL rozpuścić w mieszaninie rozpuszczalników składającej się z DCM i DMF w stosunku 4:1(v/v) przy stężeniu 10% (PCL) (w/v). Pompować roztwór PCL z natężeniem przepływu 0,7 ml/h za pomocą pompy strzykawkowej, podczas gdy potencjał 20 kV jest przykładany między dyszą przędzalniczą (22-gwiastą igłą) a uziemionym kolektorem umieszczonym w odległości 12 cm od dyszy przędzalniczej.
    2. Zebrać membranę z nanowłókien za pomocą obracającego się bębna o prędkości obrotowej większej niż 500 obr./min.
  2. Zanurz maty z nanowłókien PCL w cieczyN2 na 5 minut (tj. zesztywniały). Trzymaj maty z nanowłókien PCL w cieczy N2 i przebijaj maty z nanowłókien PCL dziurkaczem o średnicy 0.5 mm.

5. Rozszerzanie mat z nanowłókien 2D z/bez otworów w układach za pomocą podkrytycznej cieczy CO2 (Rysunek 2).

  1. Umieść maty z nanowłókien PCL w ciekłym azocie na 5 minut i pokrój na kwadraty o wymiarach 1 cm x 1 cm za pomocą ostrych nożyczek chirurgicznych, zanurzając je w ciekłym azocie, aby uniknąć deformacji krawędzi.
  2. Umieść pociętą matę w probówce wirówkowej o pojemności 30 ml z ~1 g suchego lodu. Szczelnie zakręć pokrywkę i pozwól, aby suchy lód zmienił się w ciekły CO2 .
  3. Gdy płyn utworzy się w rurce, szybko zwolnij ciśnienie, otwierając nakrętkę.
    UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem i suchym lodem należy używać odpowiedniego sprzętu ochronnego. Nie otwieraj rurki pod ciśnieniem w kierunku twarzy. Probówka wirówkowa nie powinna być używana wielokrotnie.
  4. Zdejmij i obserwuj dmuchane rusztowanie z rury. Umieść rusztowanie w nowej probówce wirówkowej z suchym lodem i powtarzaj, aż do uzyskania pożądanej grubości. Wysterylizuj rusztowania z ekspandowanych nanowłókien w tlenku etylenu przed inkubacją z komórkami.

6. Charakterystyka rusztowań z ekspandowanych nanowłókien

  1. Scharakteryzuj morfologię i strukturę rusztowań z ekspandowanych nanowłókien za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM).
    1. Umieścić próbki za pomocą dwustronnej taśmy przewodzącej na metalowym kołku i pokryć platyną przez 40 s za pomocą napylarki napylającej pod ciśnieniem 40 mA.
    2. Zbadaj włókna za pomocą SEM zgodnie z wcześniejszymi badaniami9. Zbierz obrazy przy napięciu przyspieszającym 15 kV.
  2. Scharakteryzuj profile uwalniania in vitro i bioaktywność uwalnianych peptydów.
    1. Waga 10 mg membran z nanowłókien przed i po rozprężaniu w CO2 .
    2. Zanurz próbki w buforze PBS i zbierz 10 μl supernatantu w różnych punktach czasowych (0-28 dni).
    3. Użyj zestawu do testu immunoenzymatycznego immunosorbentu (ELISA), aby określić ilościowo stężenie peptydu LL-37 w pobranym supernatancie.
  3. Zbadaj infiltrację komórkową in vivo i odpowiedź gospodarza.
    1. Umieść 9-tygodniowe szczury Sprague-Dawley (SD) w komorze anestezjologicznej, podłącz do oparów izofluranu i znieczul szczury. Przenieś szczury na stół operacyjny po tym, jak szczury staną się całkowicie znieczulone bez uczuć. Podczas operacji należy stale znieczulać szczury za pomocą stożka nosowego izofluranu z parownikiem. Ogol włosy na grzbietach szczurów za pomocą golarki dla zwierząt i wysterylizuj je jodem i alkoholowym peelingiem do skóry. Za pomocą skalpela należy utworzyć kieszenie podskórne poprzez 1,5 cm nacięcia w miejscach nadrdzeniowych na grzbiecie.
    2. Włóż jedno rusztowanie z ekspandowanego włókna nanowłókna (o grubości 1,5 mm) do kieszeni podskórnej za pomocą pęsety do każdego nacięcia. Zamknij nacięcie za pomocą zszywacza.
    3. W 1, 2 i 4 tygodniu należy poddać szczury eutanazji z 95% CO2 . Delikatnie wypreparuj eksplant i otaczającą tkankę za pomocą nożyczek chirurgicznych. Przed analizą histologiczną zanurz tkankę w formalinie na co najmniej 3 dni, a następnie zanurz w parafinie. Przeciąć tkankę za pomocą mikrotomu, a następnie wykonać barwienie trichromem Hematoksyliny i eozyny (H&E), Massona.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykazano skuteczność przekształcania tradycyjnych dwuwymiarowych (2D) mat z nanowłókien otrzymywanych metodą elektroprzędzenia w trójwymiarowe (3D) rusztowania poprzez deprecjonizację podkrytycznego płynu CO2 w różnym zakresie: grubość rusztowań wzrosła z 1 mm dla próbek niepoddanych obróbce do 2,5 mm i 19,2 mm po jednej i dwóch obróbkach CO2 (Rycina 3A-C). Porowatość – cecha architektury krytyczna dla zasiewiania komóre...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zbadano przekształcenie tradycyjnych elektroprzędzonych mat z nanowłókien 2D w rozszerzone rusztowania 3D poprzez rozhermetyzowanie CO2 . Tradycyjne maty z nanowłókien 2D są z powodzeniem rozszerzane za pomocą podkrytycznego płynu CO2 . Krytycznymi etapami są wytwarzanie mat z nanowłókien 2D w optymalnym stanie i cięcie mat bez deformacji krawędzi (np. przy użyciu ostrych nożyczek chirurgicznych). To rusztowania z nanowłókien ekspandowanych CO2 mają wiele zalet ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty z National Institute of General Medical Science (NIGMS) w NIH (2P20 GM103480-06 i 1R01GM123081 do J.X.), Otis Glebe Medical Research Foundation, NE LB606, oraz fundusze startowe z University of Nebraska Medical Center.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
PolikaprolaktonSigma-Aldrich440744
N,N-dimetyloformamidFisher ChemicalD-199-1
DichlorometanFisher ChemicalAC61093-1000
Coumarin 6Sigma-Aldrich546283
Obrotowy stalowy bębenDostosowanySłuży jako kolektor podczas elektroprzędzenia.
Pompa strzykawkowaFisher Scientific14-831-200Wirowanie koncentryczne wymaga dwóch pojedynczych pomp strzykawkowych.
RevolverLab Net InternationalH5600Regulowany rotator laboratoryjny do mieszania roztworów
Igła podskórna (27G x 1 1/2 ")EXCELINT International Co26426Jest to część pokazanego przykładu niestandardowej końcówki koncentrycznej.
Igła podskórna (21G x 1 1/2 ")EXCELINT International Co26416Jest to część pokazanego przykładu niestandardowej końcówki koncentrycznej.
Wysokonapięciowy zasilacz prądu stałegoGamma Badania wysokiego napięciaES30
Skaningowy mikroskop elektronowyFEINova 2300
Mikroskop fluorescencyjnyZeissAxio Imager 2
LL 37 Zestaw ELISAHycult BiotechHK321-02

Bibliografia

  1. Chen, S., et al. Recent advances in electrospun nanofibers for wound healing. Nanomedicine. 12 (11), 1335-1352 (2017).
  2. Khandalavala, K., Jiang, J., Shuler, F. D., Xie, J. Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization. Journal of Visualized Experiments. (98), e52626(2015).
  3. Xie, J., Li, X., Xia, Y. Put electrospun nanofibers to work for biomedical research. Macromolecular Rapid Communication. 29 (22), 1775-1792 (2008).
  4. Xie, J., et al. Nanofiber membranes with controllable microwells and structural cues and their use in forming cell microarrays and neuronal networks. Small. 7 (3), 293-297 (2011).
  5. Xie, J., et al. Radially aligned, electrospun nanofibers as dural substitutes for wound closure and tissue regeneration applications. ACS. 4 (9), 5027-5036 (2010).
  6. Xie, J., et al. "Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site. Nanoscale. 2 (6), 923-926 (2010).
  7. Jiang, J., et al. Expanded 3D Nanofiber Scaffolds: Cell Penetration. Neovascularization, and Host Response. Advanced Healthcare Materials. 5 (23), 2993-3003 (2016).
  8. Jiang, J., et al. Expanding Two-Dimensional Electrospun Nanofiber Membranes in the Third Dimension by a Modified Gas-Foaming Technique. ACS Biomaterials Science & Engineering. 10 (1), 991-1001 (2015).
  9. Jiang, J., et al. CO2-expanded nanofiber scaffolds maintain activity of encapsulated bioactive materials and promote cellular infiltration and positive host response. Acta Biomaterialia. 68, 237-248 (2018).
  10. Chen, S., et al. Nanofiber-based sutures induce endogenous antimicrobial peptide. Nanomedicine. 12 (10), 2597-2609 (2017).
  11. Dhand, C., et al. Bio-inspired crosslinking and matrix-drug interactions for advanced wound dressings with long-term antimicrobial activity. Biomaterials. 138, 153-168 (2017).
  12. Jiang, J., et al. Local sustained delivery of 25-hydroxyvitamin D3 for production of antimicrobial peptides. Pharmaceutical Research. 32 (9), 2851-2862 (2015).
  13. Jiang, J., et al. 1α, 25-dihydroxyvitamin D3-eluting nanofibrous dressings induce endogenous antimicrobial peptide expression. Nanomedicine (Lond). 13 (12), 1417-1432 (2018).
  14. Ma, B., Xie, J., Jiang, J., Shuler, F. D., Bartlett, D. E. Rational design of nanofiber scaffolds for orthopedic tissue repair and regeneration. Nanomedicine. 8 (9), 1459-1481 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Wytwarzanie rusztowa 3Dekspansja nadkrytycznego CO2przygotowanie roztworu polimerukonfiguracja aparatury do elektroprz dzeniaprzetwarzanie w ciek ym azocietraktowanie suchym lodemanaliza porowato ci rusztowaniaproliferacja zasiewanych kom rekenkapsulacja cz steczek bioaktywnych

Powiązane artykuły