Artykuł metodologiczny

Analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości

9.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58926

⸱

16 stycznia 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Doane University, 2Department of Biology, Doane University, 3Department of Pathology and Microbiology, University of Nebraska Medical Center, 4Department of Physics and Engineering, Doane University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy użycie wysokoprzepustowego bioreaktora mikroprzepływowego połączonego z mikroskopem fluorescencyjnym do analizy wpływu naprężeń ścinających na biofilmy Pseudomonas aeruginosa wyrażające białka zielonej fluorescencji, w tym ustawienie instrumentu, określenie pokrycia biofilmu, tempa wzrostu i właściwości morfologicznych.

Streszczenie

Do badania wzrostu i morfologii biofilmu bakteryjnego użyto wysokoprzepustowego mikroprzepływowego bioreaktora in vitro w połączeniu z mikroskopią fluorescencyjną, w tym Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). W tym miejscu opiszemy, w jaki sposób system może być wykorzystany do badania kinetyki wzrostu i właściwości morfologicznych, takich jak chropowatość powierzchni i entropia tekstury szczepu PA01 P. aeruginosa, który wyraża wzmocnione białko zielonej fluorescencji (PA01-EGFP). Szczegółowy protokół opisuje, jak hodować i wysiewać kultury PA01-EGFP, jak ustawić mikroskop i autorun oraz przeprowadzić analizę obrazu w celu określenia szybkości wzrostu i właściwości morfologicznych przy użyciu różnych sił ścinających, które są kontrolowane przez urządzenie mikroprzepływowe. W tym artykule przedstawimy szczegółowy opis techniki mającej na celu usprawnienie badania biofilmów PA01-EGFP, które ostatecznie mogą być zastosowane do innych szczepów biofilmów bakterii, grzybów lub glonów przy użyciu platformy mikroprzepływowej.

Wprowadzenie

W niniejszym materiale zaprezentujemy metodę pomiaru wpływu naprężeń ścinających na tworzenie fluorescencyjnych biofilmów Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) PA01 z wykorzystaniem zautomatyzowanego, wysokoprzepustowego systemu mikroprzepływowego.

Biofilmy to społeczności mikroorganizmów, takich jak bakterie, zorganizowane przez pozakomórkową substancję polimerową, które przylegają do podłoża i zazwyczaj występują na styku cieczy i powierzchni stałej1. Społeczności biofilmu mogą być korzystne dla środowiska, na przykład poprzez poprawę jakości wody w rurociągach wodociągowych oraz w bioremediacji związków trudnotlenialnych2,3. Jednak biofilmy mogą być również wysoce szkodliwe dla zdrowia ludzi, prowadząc do niepożądanych konsekwencji. Na przykład urządzenia medyczne, takie jak implanty biodra i kolana, są jednym z rodzajów powierzchni, na których akumulacja biofilmu stanowi wyzwanie i powoduje poważne powikłania medyczne4,5. Biofilmy mogą również przedostawać się do naturalnych systemów wodnych, takich jak rzeki i jeziora, oraz przenikać do rur wodociągowych, co prowadzi do zanieczyszczenia wody pitnej bakteriami i w konsekwencji do infekcji6,7,8. Biofilmy tworzące się w środowisku morskim przylegają do statków i innych sztucznych podłoży, stanowiąc poważny problem gospodarczy i środowiskowy, ponieważ zwiększone tarcie prowadzi do wzrostu zużycia paliwa9,10. W celu zapobiegania tym problemom opracowano powłoki przeciwdrobnoustrojowe, takie jak Tributyltin, które są jednak toksyczne dla organizmów morskich1.

P. aeruginosa to gram-ujemna bakteria o wysokich zdolnościach adaptacyjnych do różnorodnych warunków środowiskowych i odżywczych12. P. aeruginosa jest częstą przyczyną zakażeń pozaszpitalnych i szpitalnych; stwierdzono, że jest ściśle powiązana z urazami, takimi jak ciężkie oparzenia, oraz z gospodarzami z obniżoną odpornością, m.in. w przypadku mukowiscydozy (CF)5,12,13, AIDS oraz u pacjentów z chorobami nowotworowymi5,13. Tworzenie biofilmu przez P. aeruginosa jest najsilniej powiązane z mukowiscydozą, w której przewlekłe infekcje płuc stanowią główną przyczynę zgonów w przebiegu tej choroby5.

W niniejszym raporcie wykorzystano szczep referencyjny P. aeruginosa PA01, który został zmodyfikowany genetycznie w celu ekspresji ulepszonego zielonego białka fluorescencyjnego (PA-EGFP). EGFP jest mutantową formą GFP o silniejszych właściwościach fluorescencyjnych, co umożliwia analizę biofilmu in situ przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej14,15,16. Ten rodzaj analizy fluorescencyjnej jest korzystny w badaniu biofilmów, ponieważ GFP nie wpływa w znacznym stopniu na wzrost i funkcje komórek17. Na przykład komórki Escherichia coli znakowane GFP rosły prawidłowo i stale, nie wykazując żadnych efektów toksycznych w porównaniu z bakteriami kontrolnymi17. Inne doniesienia potwierdzają tę tezę18,19,20. Ponadto zastosowanie reportera fluorescencyjnego, takiego jak EGFP, jest szybkie i proste, a mierzone są jedynie żywe komórki, ponieważ komórki martwe szybko przestają fluorescować21.

Biofilmy mogą rozwijać się w różnych warunkach środowiskowych, w tym przy różnych prędkościach przepływu. Na przykład filmy mogą rosnąć w warunkach wysokiego naprężenia ścinającego, jak w rzekach, gdzie wysoki przepływ wody prowadzi do większej różnorodności mikrobiologicznej2. Przeciwnie, stojąca woda w stawach lub biofilmy jamy ustnej są poddane znacznie mniejszej sile ścinającej23. Oprócz prędkości przepływu istnieją inne czynniki wpływające na adhezję biofilmu, w tym chropowatość i hydrofobowość powierzchni, skład pożywki, a nawet powierzchnia komórki bakteryjnej1,4,7,24. Warunki te mogą również powodować zmienność w strukturze przestrzennej lub morfologii biofilmu. Obejmuje to warunki środowiskowe, takie jak naprężenie ścinające wywierane przez płynący płyn lub gradienty dostępności składników odżywczych, oraz czynniki biologiczne, takie jak gatunki obecne w systemie, ruchliwość komórek i specyficzne białka obecne w zewnątrzkomórkowej substancji polimerowej25,26,27. W zależności od warunków biofilm może mieć strukturę trawnikową (gładką i płaską), natomiast w innych warunkach biofilm może być chropowaty, puszysty lub nawet przypominać grzyby28. Chociaż różnica jakościowa między strukturami trawnikowymi a grzybopodobnymi w biofilmach jest wyraźnie widoczna na obrazach mikroskopowych, zrozumienie związku między strukturą filmu a procesami biologicznymi w jego obrębie wymaga systematycznych i ilościowych metod opisu morfologii. Właściwości morfologiczne sugerowane przez badaczy do analizy obejmują porowatość, wymiar fraktalny, długość dyfuzyjną, powierzchnię mikrokolonii na podłożu, objętość mikrokolonii, współczynnik chropowatości oraz entropię teksturalną29,30.

Bioreaktory są wykorzystywane w badaniach nad biofilmami do naśladowania warunków rzeczywistych31. Reaktory przepływu kroplowego (DFR) reprezentują środowisko o niskim ścinaniu, w którym składniki odżywcze w pożywce powoli przepływają przez komórki przywierające z czasem do powierzchni, tworząc biofilm o wysokiej gęstości komórkowej32. Reaktory CDC to bioreaktory, które tworzą środowisko cieczy o wysokim naprężeniu ścinającym poprzez sterowanie prętem mieszającym, który stale obraca się w zbiorniku wypełnionym pożywką33. Te rodzaje bioreaktorów są proste w konfiguracji, ale ich zakres jest ograniczony ze względu na stosunkowo małą wielkość próbek, wysokie zużycie pożywki, duże ilości produkowanych odpadów biologicznie niebezpiecznych z przepływów kroplowych pożywki (od 125 µL/minute dla reaktorów przepływu kroplowego do ponad 1 mL/min dla reaktorów CDC) oraz konieczność autoklawowania dużych ilości szkła laboratoryjnego i zużytej pożywki34. Biofilmy nie rosną równomiernie na powierzchni w reaktorze przepływu kroplowego, ponieważ niskie ścinanie pożywki powoduje powstawanie smug wzdłuż większych konglomeratów bakterii P. aeruginosa; w konsekwencji wzrost biofilmu nie jest jednorodny, a nierównomierne próbki nie mogą być łatwo analizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej35,36.

Niektóre typowe ograniczenia bioreaktorów można pokonać, stosując mikrofluidyczny bioreaktor o średniej przepustowości, w którym wymagane są jedynie mililitry pożywki, a płytki reakcyjne są niewielkie i łatwo utylizowane po autoklawowaniu37. Ponadto, w zależności od liczby studzienek, w jednym cyklu pracy reaktora można przeprowadzić wiele powtórzeń, co dostarcza wystarczającej ilości danych do wykonania istotnej analizy statystycznej. Na Rysunku 1 przedstawiono poszczególne komponenty systemu mikrofluidyczno-mikroskopowego, które umożliwiają kontrolę warunków, w tym temperatury i szybkości przepływu38,39,40. Bioreaktor jest sprzężony z mikroskopią fluorescencyjną w celu wizualizacji fluorescencji znacznika EGFP w szczepie PA01 w zastosowanych warunkach niskiego i wysokiego ścinania, co ma odzwierciedlać bardziej realistyczne scenariusze występujące w środowisku lub w dziedzinie biomedycznej.

Układ mikroskopii i spektroskopii, schemat; analiza optyczna i widmowa w badaniach naukowych.
Rycina 1Poszczególne komponenty układu mikroprzepływowego. Poszczególne komponenty są wymienione od lewej do prawej: 1. kamera CCD, 2. odwrócony mikroskop wysokiej rozdzielczości zautomatyzowanym stolikiem, zautomatyzowanym modułem fluorescencyjnym i modułem autofokusa, 3. stolik do płytek, 4. interfejs systemu obrazowania, 5. manualne sterowanie stolikiem mikroskopu, 6. pułapka par, 7. sterownik systemu obrazowania (w tym sterownik temperatury), 8. sterowniki sprzętowe, 9. sterownik fluorescencji, 10. zasilacz awaryjny (UPS), 1. zewnętrzny dysk twardy do przechowywania obrazów, 12. stacja robocza PC. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Fragment płytki mikrofluidycznej przedstawiono na Rysunku 2. Najczęściej stosowane płytki składają się z 48 studni. Jeden eksperyment wymaga jednej studni wlotowej i jednej wylotowej, czyli łącznie 2 studni. Pozwala to na przeprowadzenie 24 równoległych eksperymentów z różnymi warunkami, takimi jak różne szczepy bakteryjne, preparaty przeciwdrobnoustrojowe oraz pożywki zmienne między kanałami, przy jednoczesnej kontroli przepływu ścinającego dla każdej kolumny sześciu kanałów. Temperatura eksperymentalna jest również kontrolowana za pomocą jednego ustawienia temperatury dla całej płytki. Kanały mikrofluidyczne wykazują, że każdy z nich posiada obszar serpentynowy, który zapewnia odpowiednie ciśnienie wsteczne i kontrolowane ścinanie.

Schemat urządzenia mikroprzepływowego; mikroskopia w jasnym polu, fluorescencyjna; zestaw do analizy komórkowej.
Rysunek 2: Wizualizacja kanałów mikroprzepływowych i okna obserwacyjnego. Dwa otwory wlotowe i wylotowe z łączącymi je kanałami mikroprzepływowymi zostały zaznaczone barwnikami czerwonym i zielonym. Barwnik uwidacznia obszar serpentynowy w każdym kanale, który wytwarza odpowiednie ciśnienie wsteczne i kontrolowane naprężenie ścinające podczas przepływu cieczy. Każdy kanał obserwacyjny (wewnątrz czerwonego okręgu) może być obrazowany z wykorzystaniem wybranych długości fal. Przedstawiono obrazy z mikroskopii w polu jasnym (góra) oraz fluorescencyjnej (dół) pojedynczego kanału z biofilmem PA01-EGFP przy użyciu obiektywu 20X. Pasek skali = 80 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Przedstawiono instrukcję krok po kroku, która umożliwi użytkownikom bioreaktorów mikroprzepływowych sprzężonych z mikroskopią fluorescencyjną przeprowadzanie nowatorskich eksperymentów z biofilmem w różnych warunkach ścinania. Metoda ta pozwoli na rozszerzenie zakresu doświadczeń o inne mikroorganizmy poza bakteriami, takie jak grzyby i algi, które znajdują zastosowanie w medycynie i ochronie środowiska41,42,43. Szczegółowy opis obejmuje sposób hodowli PA01-EGFP, inokulację płytki 48-dołkowej, konfigurację urządzenia mikroprzepływowego i oprogramowania, ustawienie mikroskopu fluorescencyjnego oraz demonstrację analizy programowej w celu wyznaczenia stopnia pokrycia biofilmem, szybkości wzrostu i właściwości morfologicznych, takich jak chropowatość powierzchni.

Protokół

1. Przygotowanie pożywek

  1. Przygotować pożywkę minimalną (MM) z 0,25% glukozy. Aby przygotować 1 L MM z 0,25% glukozy, do wody (dH2O) dodać 20 mL sterylnego roztworu soli M9, 2 mL sterylnego 1 M MgSO4, 10 µL sterylnego 1 M CaCl2 oraz 12,5 mL sterylnej 20% (w/v) glukozy, do uzyskania końcowej objętości 1 L.
  2. Przenieść odpowiednią ilość pożywki do sterylnej butelki, stosując techniki sterylne. Przygotować ilość zależną od liczby używanych kanałów. Zazwyczaj każdy kanał wymaga 20 µL do przygotowania (primingu), 30 µL do zasiewu oraz 130 µL do 24-godzinnego eksperymentu.
  3. Umieścić butelkę w inkubatorze lub łaźni wodnej ustawionej na temperaturę eksperymentalną. Pożywka powinna osiągnąć temperaturę eksperymentu przed użyciem, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza w mikrokanałach.

2. Przygotowanie kultury nocnej i eksperymentalnej PA01-EGFP.

  1. Wlej 15 mL pożywki eksperymentalnej do sterylnej kolby z bocznym ramieniem i zaszczep ją jedną lub dwiema koloniami z płytki agarowej z posiewem PA01-EGFP. Namnażaj kulturę przez 12-16 h w inkubatorze z wytrząsarką w temperaturze 37 °C przy 180-20 rpm.
  2. Zmierz OD60 hodowli nocnej. Gdy OD600 przekroczy wartość 0,80, rozcieńcz hodowlę nocną świeżą pożywką MM do końcowego OD wynoszącego 0,8. Umieść kulturę eksperymentalną w inkubatorze lub łaźni wodnej w temperaturze 37 °C do momentu zasiewania kanałów mikroprzepływowych. Ponownie sprawdź OD600 bezpośrednio przed zasiewaniem, aby upewnić się, że nie zmieniło się ono znacząco w stosunku do docelowego OD60, który w tym przypadku wynosi 0,8.

3. Uruchamianie sprzętu

  1. Skonfiguruj stację systemową zgodnie z instrukcją obsługi, analogicznie do konfiguracji przedstawionej w Rycina 1Aby uniknąć błędu podczas łączenia instrumentu z oprogramowaniem, należy włączyć instrument w następującej kolejności:
    Stacja robocza PC
    Moduł fluorescencji. Upewnij się, że migawka fluorescencyjna jest włączona (niebieska kontrolka przycisku migawki świeci się).
    Kontrolery sprzętowe
    Sterownik systemu obrazowania (patrz Tabela materiałów)
    Kamera CCD
    Stanowisko obrazowania (mikroskop)
    UWAGA: Temperaturę płyty grzejnej należy dostosować do pożądanej temperatury eksperymentalnej.
  2. Uruchom aplikację sterującą i wprowadź numer płytki znajdujący się na etykiecie z boku płytki.
    UWAGA: Po uruchomieniu aplikacji sterującej pojawią się dwa osobne okna aplikacji: jedno dla oprogramowania sterującego mikroskopem/obrazowaniem oraz drugie dla modułu sterującego, który kontroluje pompę i interfejs płytki wielodołkowej. Jest to przedstawione w Rysunek S1gdzie w górnej części otwarte jest menu „Multi Dimensional Acquisition”, a w dolnej moduł sterujący (Control Module) jest ustawiony na automatyczny rozruch (autorun).

4. Przygotowanie i zasiewanie płytki mikroprzepływowej

UWAGA: Przygotowanie powierzchni, wysiew, przywieranie bakterii i ich wzrost zostały przedstawione na Rysunku 3.

  1. Wyjmij 48-dołkową płytkę mikrofluidyczną z opakowania, upewniając się, że nie dotykasz szklanej powierzchni na spodzie płytki. Przetrzyj szklaną płytkę na spodzie dołka za pomocą chusteczki do soczewek, tkaniny beztkaninowej lub ściereczki pozostawiającej mało włókien.
  2. Aby przygotować kanały mikrofluidyczne, pipetuj 20 µL MM o temperaturze 37 °C do dołka wyjściowego, uważając, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Umieść płytkę w uchwycie na płytki i przetrzyj powierzchnię styku etanolem, pozwól jej wyschnąć, a następnie zamocuj ją w uchwycie.
  3. W Trybie Ręcznym (Manual Mode) modułu sterującego ustaw Płyn (Fluid) jako LB w 37 °C oraz Maksymalne Ścinanie (Max Shear) na 5,0 dyne/cm2. Kliknij dołki wyjściowe, aby uruchomić przepływ z dołka wyjściowego do wejściowego, przygotowując kanały. Po 5 min przygotowania wstrzymaj przepływ w celu przygotowania do zasiewania. Ostrożnie zdejmij płytkę z uchwytu i pipetuj pozostałe medium z dołka wyjściowego, nie usuwając medium z wewnętrznego kręgu prowadzącego do kanałów mikrofluidycznych.
  4. Aby zasiać kanały eksperymentalne, najpierw pipetuj 30 µL MM dołka wejściowego, a następnie 30 µL kultury bakteryjnej dołka wyjściowego. Ponownie umieść płytkę w uchwycie, upewniając się, że powierzchnia styku została przetarta przed położeniem na niej płytki.
  5. W module sterującym ustaw ostrość na pojedynczym kanale, korzystając z podglądu kamery na żywo po umieszczeniu uchwytu z płytką na stole mikroskopu. Monitorując obraz na żywo, wznowij przepływ przy wartości 1,0-2,0 dyne/cm2 przez około 2-4 s, aby umożliwić komórkom wejście do kanału eksperymentalnego, ale nie do kanałów serpentynowych. Pozostaw płytkę na stole z kontrolą temperatury przez 1 h w celu umożliwienia przywierania komórek. Podczas 1-godzinnej inkubacji można skonfigurować moduł sterujący i oprogramowanie Montage do automatycznego uruchomienia (Krok 5).
    UWAGA: Czas potrzebny na zasiewanie będzie różnić się w zależności od medium i organizmu, dlatego należy go uważnie monitorować za pomocą podglądu na żywo aż do optymalizacji i traktować jako ogólne ramy czasowe. Stopień zasiewania w obrębie całej płytki może być zróżnicowany, co może wymagać dłuższego czasu przepływu dla niektórych kolumn kanałów w celu uzyskania pełnego zasiewania.
  6. Po okresie przywierania delikatnie zdejmij płytkę ze stołu i w pierwszej kolejności pipetuj bakterie z dołka wyjściowego, unikając zakłócenia przepływu w kanale. Używając nowej końcówki do pipety, usuń medium z dołków wejściowych.

Przebieg przygotowania, wysiewu i adhezji; schemat bioreaktora; przepływ pożywki; proces wzrostu hodowli.
Rysunek 3Przegląd eksperymentalny przygotowania, zasiewu i przyczepiania szczepu PA01-EGFP w kanałach mikroprzepływowych. Opisano proces przygotowania (priming), wysiewania oraz adhezji. Pierwszy etap przygotowania polega na wprowadzeniu świeżej pożywki do odpływu. Wysiewanie polega na wprowadzeniu równych objętości pożywki oraz kultury bakteryjnej odpowiednio do studni wejściowej i wyjściowej. Kultura nie powinna przekroczyć segmentu obserwacyjnego kanału eksperymentalnego (czerwona linia), aby uniknąć zapchania kanałów serpentynowych. Po zakończeniu okresu inkubacji świeża pożywka płynie nieprzerwanie z wejścia, przez komorę obserwacyjną, do odpływu. Inicjuje to adhezję i wzrost biofilmu bakteryjnego. Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

5. Konfiguracja oprogramowania

  1. W oprogramowaniu otwórz funkcję „Multiple Dimensional Acquisition”, aby kontrolować akwizycję obrazów z mikroskopu. W menu „Main” wybierz opcje „Timelapse”, „Multiple Stage Positions” oraz „Multiple Wavelengths” (Rysunek S1A).
    1. Konfigurując ustawienia Saving, utwórz prostą Base Name, upewniając się, że zaznaczono opcję Increment base name if file exists. Kliknij Select Directory, aby wybrać folder, w którym będą zapisywane wszystkie pliki. W polu Description wprowadź istotne szczegóły eksperymentu.
    2. W zakładce Timelapse ustaw Duration (czas trwania) eksperymentu na 24 h. Aby kontrolować częstotliwość akwizycji obrazów, ustaw Time Interval tak, aby obrazy były pobierane co 5 min przez cały czas trwania eksperymentu. Number of Time Points dostosuje się automatycznie do ustawionych parametrów.
    3. Ustaw pozycje stolika, korzystając z podglądu na żywo z kamery mikroskopu w polu jasnym, aby zapewnić prawidłowe rozmieszczenie i ostrość. Zaczynając od obiektywu 10X, ustaw ostrość na środku kanału, znajdując się nad lub pod numerami kanałów wygrawerowanymi na płytce. Przełącz na obiektyw 20X, znajdując optymalny obszar widzenia i płaszczyznę ogniskową w obrębie kanału. Dodaj pozycję do listy lub zastąp zapisaną pozycję kanału nowymi ustawieniami.
    4. W menu Wavelengths ustaw liczbę długości fal na 3. Dla długości fali 1 (W1) wybierz FITC 100% CAM z czasem ekspozycji 10 ms. Dla długości fali 2 (W2) wybierz Brightfield 50% CAM 50% VIS z minimalnym czasem ekspozycji 3 ms. Dla długości fali 3 (W3) wybierz filtr All Closed, aby na ostatnim kanale nie pozostało światło pomiędzy kolejnymi akwizycjami.
  2. Podczas konfiguracji Modułu Sterowania upewnij się, że uruchomienie ręczne zostało zatrzymane.
    1. W menu Edit Autorun w zakładce Protocol Setup ustaw nowy protokół na czas trwania 24 h, z przepływem w kierunku w przód przy pożądanej szybkości ścinania. Szybkość ścinania jest zmieniana w celu zbadania wpływu szybkości ścinania na wzrost biofilmu. Kliknij Add i zapisz protokół za pomocą Save As.
    2. W zakładce Sequence Setup utwórz nową sekwencję, wybierając LB@37degrees jako domyślny płyn dla wszystkich kanałów. W ramach Step Iteration 1 dla kanałów 1-12 wybierz protokół z pierwszą pożądaną szybkością ścinania i aktywuj wszystkie kanały. Dla kanałów 13-24 wybierz protokół z drugą pożądaną szybkością ścinania i aktywuj wszystkie kanały. Wybierz Apply i zapisz sekwencję za pomocą Save As.
    3. W menu Autorun wybierz zapisaną sekwencję, która ma zostać użyta do automatycznego uruchomienia.

6. Konfiguracja eksperymentu czasowego wzrostu biofilmu

  1. Pipetuj maksymalnie 1 30 µL sterylnego MM do otworu wejściowego płytki mikrofluidycznej. Umieść płytkę z powrotem na platformie do płytek i przetrzyj interfejs etanolem, pozwalając mu całkowicie wyschnąć przed uszczelnieniem płytki. 
  2. Umieść platformę do płytek na stoliku mikroskopu i upewnij się, że protokoły i sekwencje są poprawnie skonfigurowane. Wybierz Start, aby szybko uruchomić automatyczny bieg, a następnie kliknij Acquire, aby rozpocząć zbieranie obrazów z mikroskopu.
  3. Dostosuj ostrość i położenie wszystkich pozycji stolika pomiędzy poszczególnymi akwizycjami obrazów. Wybierz Pause i, korzystając z trybu obrazowania na żywo w długości fali pola jasnego, wybierz Go To, aby przejrzeć każdą pozycję stolika. Wprowadź nowe ustawienia, wybierając Set to Current. Kliknij Resume przed kolejnym zaplanowanym czasem akwizycji.

7. Przegląd i analiza sekwencji obrazów po eksperymencie czasowego wzrostu biofilmu

  1. Aby przejrzeć każdy kanał po 24-godzinnym automatycznym pomiarze (autorun), należy w oprogramowaniu otworzyć Analiza danych wielowymiarowych, znajdujący się pod Narzędzia analityczneKliknij Wybierz plik bazowy | Wybierz katalog do folderu z sekwencjami obrazów dla interesującego eksperymentu. Na liście Zbiory danych w folderze, który się pojawi, należy wybrać nazwę podstawową interesujących danych.
  2. Po wybraniu interesujących danych należy kliknąć Widok aby przeanalizować te dane. Wybierz długość fali, dla której mają zostać przeanalizowane te dane Długość fali okno (Rycina S2).
  3. Przejrzyj sekwencję obrazów dla każdego kanału, wybierając numer kanału poniżej Położenie stolika oraz wykorzystując elementy sterujące wideo do analizy danych dla 289 punktów czasowych (przy założeniu, że obrazy są pozyskiwane co 5 min w ciągu 24 h). Należy odnotować przydatne dane dotyczące wzrostu.
    UWAGA: W każdym kanale należy monitorować powstawanie pęcherzyków powietrza i zatorów, które mogą zakłócić wzrost biofilmu wewnątrz kanału, wpływając tym samym na dane. Jeżeli jednak zjawiska te wystąpią w późniejszym etapie pomiaru, dane zebrane przed ich pojawieniem się mogą okazać się użyteczne.
  4. Po przejrzeniu i wybraniu danych przeznaczonych do analizy, należy utworzyć stosy obrazów dla każdego kanału. W sekcji Plik menu, wybierz Otwórz Specjalne | Buduj Stos | Nazwy NumerowaneW Budowa stosu okno, wybierz Wybierz pierwszy obraz przycisk, a następnie wybierz pierwszy obraz dla stosu w folderze plików; wybierz Wybierz ostatni obraz przycisk, a następnie wybierz plik odpowiadający ostatniemu obrazowi w stosie. Kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. aby otworzyć stos zawierający wszystkie obrazy z danego kanału w kolejności chronologicznej. Stosy można zapisać pod nazwą Plik menu, Zapisz jako w formacie plików TIFF.
    UWAGA: Nie tworzyć stosów (stacks) z obrazami miniatur (thumb images). Pliki te nie są zbyt użyteczne i mogą zostać usunięte w celu zwolnienia miejsca na dysku twardym. Ponadto pliki obrazów są zapisywane w następujący sposób:

    NAZWA_PODSTAWOWA_DŁGOŚĆFALI_kANAŁ#_oBRAZ#.

    Na przykład plik 07062018_W1FITC 10_s12_t12 odpowiada kanałowi 12, punktowi czasowemu 12 oraz obrazowi z danych z kamery dla pierwszej długości fali – FITC 10%, z nazwą bazową „07062018”.
  5. Na koniec należy wybrać Zapisz jako z Plik menu rozwijane, aby zapisać sekwencję jako stos plików TIFF. Stosy mogą być również nakładane na siebie i zapisywane jako film. Kwestia ta jest omówiona w kroku 9.
  6. Przed ilościowym oznaczeniem procentowego pokrycia powierzchni należy skalibrować odległości na obrazach. Pod Narzędzia analitycznekliknij w Kalibracja odległościWybierz odpowiedni pomiar kalibracyjny i kliknij Zastosuj do wszystkich otwartych obrazów.
  7. Gdy stos znajduje się na pierwszym obrazie sekwencji, kliknij w Próg przycisk. Użycie Automatyczne progowanie dla jasnych obiektów do progu sygnału fluorescencyjnego (długość fali FITC) i Automatyczny próg dla ciemnych obiektów należy zastosować progowanie w polu jasnym. Dostosuj próg do stopnia pokrycia, który reprezentuje pokrycie obrazu.
    1. W celu wyznaczenia progów fluorescencji należy wykorzystać kanał z komórkami niefluoryzującymi, aby ustalić sygnał tła, a następnie ustawić minimalną wartość progu w celu wykluczenia sygnału wykrytego w kanałach zawierających te niefluoryzujące komórki. Zapewni to, że pomiar sygnału nie doprowadzi do przeszacowania obszaru fluorescencji. Wartości te mogą różnić się w zależności od poszczególnych serii pomiarów, dlatego zaleca się zastosowanie co najmniej jednego, a najlepiej większej liczby kanałów dla kontroli niefluoryzujących.
    2. W przypadku progów dla jasnego pola, jeśli nie wszystkie komórki są pokryte pomarańczowym sygnaturem progu, należy dostosować maksymalną wartość progu za pomocą suwaka na pasku narzędzi lub korzystając z Obraz progowy (znajdujące się pod Narzędzia analityczne), tak aby wszystkie komórki były objęte obszarem, a jakiekolwiek tło zostało wykluczone.
      UWAGA: Choć w idealnym przypadku wartości progowe byłyby stosowane dla wszystkich obrazów w stosie oraz dla wszystkich kanałów, wartości wybrane dla jednego obrazu/kanału mogą nie być odpowiednie dla innych obrazów lub kanałów, w związku z czym użytkownik może potrzebować okresowej korekty zakresu progowania. Z tego powodu zaleca się zawsze zapisywanie maksymalnych i minimalnych wartości progowych na wypadek późniejszej konieczności weryfikacji danych.
  8. Aby określić stopień pokrycia, w ramach Narzędzia analityczne, kliknij Wyświetl statystyki regionuUpewnij się, że Zastosowanie progu zostało sprawdzone, the Cały obraz zostaje wybrany, a pod Uzyskane danenależy upewnić się, że wybrano żądane pomiary/ustawienia (pole progu, średnia, odchylenie standardowe, minimum, maksimum oraz % pola progu). Kliknij w Otwórz dziennik i upewnij się, że wybrany jest plik DDE przed kliknięciem Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.Wybierz Microsoft Excel i kliknij OKW otwartym arkuszu kliknij Dane dziennika do automatycznego zapisu pomiarów analizowanego obrazu.
  9. Pozostawiając ten arkusz otwarty, należy go użyć do zebrania wszystkich danych z analizy obrazów dla jednego stosu. W stosie należy przejść do czwartego obrazu i ustawić progowanie na wartości optymalne. Kliknij w Dane dziennika w Pokaż statystyki regionu ekranie, a wartości są rejestrowane w arkuszu kalkulacyjnym. Powtórz tę czynność podczas analizy obrazów co 15 min.

8. Inne analizy, w tym pomiar morfologii i pokrycia powierzchni przy użyciu skryptów Python z pakietu Biofilm Morphology Suite

  1. Zainstaluj dystrybucję Pythona 3.6 zawierającą standardowe moduły naukowe, korzystając ze standardowej naukowej dystrybucji Pythona, takiej jak Anaconda, dostępna pod adresem https://www.anaconda.com/download.
  2. Pobierz pakiet Biofilm Morphology Suite z serwisu GitHub w przeglądarce, przechodząc pod adres https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git, a następnie wybierz Klonuj lub pobierz (zielony przycisk) i wybierz Pobierz plik ZipRozpakuj plik i przenieś foldery z kodem do katalogu roboczego.
  3. Zmierz procentowy stopień pokrycia po progowaniu, kopiując stos obrazów do „Zakres merytorycznyfolder. Użyj okna terminala, aby przejść do tego folderu, a następnie uruchom skrypt za pomocą polecenia

    python bfCoverage.py tiffStackName.tif

    z poziomu interfejsu wiersza poleceń, gdzie tiffStackName.tif jest nazwą pliku zawierającego stos obrazów TIFF. Plik tekstowy zawierający pomiary stopnia pokrycia dla każdego punktu czasowego zostanie utworzony pod nazwą tiffStackName.txt oraz zostanie utworzony plik graficzny z wykresem pokrycia w funkcji czasu o nazwie tiffStackName.png.
  4. Należy zastosować tę samą procedurę opisaną w kroku 8.3 w celu zmierzenia pozostałych cech morfologicznych: akumulacji biofilmu, współczynnika chropowatości oraz entropii teksturalnej. Do pomiaru akumulacji należy użyć skryptu bfAcc.py, do pomiaru współczynnika chropowatości skryptu roughCoef.py, a do pomiaru entropii teksturalnej skryptu TEvsTime.py.

9. Inne aplikacje programowe - tworzenie nakładek i filmów

  1. W przypadku użycia wielu długości fal, należy stworzyć stosy nakładkowe obejmujące te długości fal. Otwórz wszystkie interesujące stosy i skalibruj odległość zgodnie z procedurą opisaną w kroku 7.6.
    1. W sekcji Analysis Tools wybierz Overlay Images. Ustaw źródłami wybrane stosy. W stosie FITC kliknij tęczowe koło i wybierz zielony filtr kolorów, aby wyróżnić tę długość fali.
    2. Użyj funkcji bal, aby dostosować nałożenie tak, aby stos FITC był widoczny na obrazach. Po wprowadzeniu wszystkich korekt wybierz All Planes dla obu stosów i kliknij Apply. Zapisz nałożenia w taki sam sposób, jak stosy opisane w kroku 7.5, lub jako film opisany w kroku 9.2.
  2. Aby zapisać stosy lub nałożenia jako film timelapse, w sekcji MM Standard i Stack kliknij Make Movie. Jako źródło wybierz pożądany stos lub nałożenie. Kliknij Save i zapisz plik jako Microsoft Video 1 z jakością ustawioną w zakresie 70-80.

Wyniki

Rycina 4a przedstawia procentową powierzchnię przekroczenia progu w czasie podczas 24-godzinnego pomiaru przy przepływach ścinających wynoszących 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2. Pokrycie biofilmem lub procentowa powierzchnia przekroczenia progu (C [%]) różniło się dla wszystkich trzech ustawień ścinania. Pokrycie biofilmem następowało najszybciej przy ścinaniu 1,0 dyne/cm2 , gdzie powierzchnia progu zwiększyła się z 2-5% do 10% po 20 min wzrostu i osiągnęła fazę stacjonarną po 40 min. Przy 0,5 dyne/cm2 pokrycie biofilmem było opóźnione i zaczęło wzrastać w 400 min, osiągając 10% pokrycia po 80 min. Przy najniższym ścinaniu 0,2 dyne/cm2 wyraźnie zaobserwowano najwolniejszy wzrost pokrycia biofilmem, gdzie procent pokrycia zaczął wzrastać w 50 min, ale nigdy nie przekroczył progu 65% powierzchni. Wyniki te wskazują, że ścinanie miało bezpośredni wpływ na powierzchniowe pokrycie biofilmem. Wyższe ścinanie wydawało się być warunkiem bardziej optymalnym dla wzrostu biofilmu, prawdopodobnie ze względu na fakt, że medium dostarczało bakteriom więcej składników odżywczych, dzięki czemu biofilm mógł szybciej proliferować.

Dynamika wzrostu biofilmu analizowana za pomocą wykresów stopnia pokrycia, akumulacji, chropowatości i entropii.
Rysunek 4: Procentowa powierzchnia progowa, całkowita akumulacja biofilmu, współczynnik chropowatości i entropia teksturalna. a) Procentowy próg powierzchni (C [%]) w czasie, przy zastosowaniu wartości 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2 w okresie 24 godzin. Dane uzyskano z jednego kanału dla każdego warunku ścinania. b) Całkowita akumulacja biofilmu (miara względna) w funkcji czasu dla wartości 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2 w okresie 24 h. Linie czarne to dopasowania metodą najmniejszych kwadratów do modelu wykładniczego. Dane uzyskano z jednego kanału dla każdego warunku ścinania. c) Współczynnik szorstkości PA01-EGFP przy wartościach naprężenia ścinającego 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2 monitorowane przez 24 h. Dane uzyskano z jednego kanału dla każdego warunku ścinania. d) Entropia teksturalna PA01-EGFP przy zastosowaniu wartości naprężenia ścinającego 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2. Dane uzyskano z jednego kanału dla każdego warunku ścinania (Valquier-Flynn, H., Sutlief, A.L., Wentworth, C.D., 2018). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 4b jest zgodny z wynikami przedstawionymi na Rysunku 4a. Akumulację biofilmu (N[rel]) zmierzono w oparciu o założenie, że sygnał GFP w danym punkcie obrazu jest proporcjonalny do gęstości żywych komórek w tej pozycji. Wykazano, że całkowita względna akumulacja biofilmu wzrosła w funkcji czasu przy wartościach 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2 w okresie 24 h, a szybkość wzrostu spadała wraz z przejściem od najwyższego do najniższego naprężenia ścinającego. Istnieje wyraźny przedział czasowy wykazujący wzrost wykładniczy, z którego można obliczyć ilościową szybkość wzrostu.

Rysunek 4c przedstawia współczynnik chropowatości (Ra) przy przepływach ścinających wynoszących 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2. Chropowatość powierzchni, określona za pomocą współczynnika chropowatości, mierzy wariancję profilu grubości filmu. Formalna definicja brzmi:

Wzór na średni błąd ważony; równanie matematyczne; analiza statystyczna; obliczanie stopy błędu.

gdzie Ti  to i-ty pomiar grubości, Ta to średnia grubość, a N to liczba pomiarów grubości30. Procedura opisana w niniejszym badaniu mierzy grubość powiązaną z żywymi komórkami. Płaska struktura komórek spowoduje uzyskanie współczynnika chropowatości równego zero, natomiast znaczne odchylenia grubości od średniej spowodują uzyskanie współczynnika chropowatości większego od jeden. Podobnie jak w przypadku wpływu sił ścinających na tempo wzrostu i procentowy próg pokrycia filmu, biofilmy wykazywały różną topografię w czasie. Ogólnie Ra malał w czasie dla wszystkich warunków ścinania, co wskazuje na to, że wszystkie powierzchnie stały się gładsze. Jednak w porównaniu z najniższym ścinaniem wynoszącym 0,2 dyne/cm, wyższe ustawienia ścinania 0,5 i 1,0 dyne/cm2 doprowadziły do uzyskania gładszej powierzchni w czasie, co wskazuje, że szybszy przepływ ścinający przyczynił się do uzyskania gładszej i bardziej równomiernej powierzchni, a przy najwyższym ścinaniu 1,0 dyne/cm2 wartość spadła poniżej 0,2 Ra.

Gładkość, regularność lub chropowatość powierzchni mogą być również wyrażone za pomocą entropii teksturalnej (TE). TE jest właściwością wykorzystywaną w analizie obrazu do pomiaru stopnia przypadkowości w obrazie dwuwymiarowym. Jej obliczanie opiera się na macierzy współwystępowania poziomów szarości, zdefiniowanej przez Haralick et al., która analizuje, czy wartości pikseli w jednym miejscu są skorelowane z wartościami pikseli w innym miejscu4. Wysoki stopień korelacji prowadzi do niskiej entropii. Rysunek 4d przedstawia TE dla przepływów ścinających o wartościach 0,2, 0,5 i 1,0 dyne/cm2. Wartość TE wzrastała w czasie dla wszystkich warunków ścinania, jednak przy najwyższym naprężeniu ścinającym 1,0 dyne/cm maksymalna wartość TE (1,0) została osiągnięta wcześniej niż przy niższych naprężeniach ścinających, mianowicie w 90 min. Najniższe ścinanie o wartości 0,2 dyne/cm2 wykazywało najniższą wartość TE (0,8), osiągając maksimum po 10 min. Natomiast dla pośredniego naprężenia ścinającego 0,5 dyne/cm2 maksymalna wartość TE (1,2) została osiągnięta znacznie później niż w warunkach wysokiego lub niskiego naprężenia ścinającego.

Współczynnik chropowatości oraz TE mierzą różne cechy. Podczas gdy płaski film charakteryzowałby się niskim współczynnikiem chropowatości i niską entropią, film ze znacznymi różnicami w grubości miałby wysoki współczynnik chropowatości, ale nadal mógłby wykazywać niską entropię, jeśli zmienność ta byłaby sinusoidalna, a nie losowa. W tym przypadku Ra malało wraz ze wzrostem naprężenia ścinającego i czasu, natomiast trendy TE nie mogą być bezpośrednio powiązane z naprężeniem ścinającym przyłożonym do tworzącego się biofilmu w czasie.

Konfiguracja akwizycji wielowymiarowej, interfejs oprogramowania z diagramem płytki wielodołkowej do analizy spektroskopowej.
Rycina S1Przechwytywanie obrazu okien oprogramowania sterującego. Okno oprogramowania z otwartym menu Multi Dimensional Acquisition (góra). Moduł sterowania ustawiony na AutoRun (dół). Aby wyświetlić tę figurę w powiększeniu, kliknij tutaj.

Interfejs oprogramowania mikroskopowego do analizy obrazu; zintegrowana analiza morfometryczna, akwizycja danych.
Rycina S2Przechwycenie obrazu oprogramowania do analizy danych. Okno aplikacji po wybraniu interesującego zestawu danych przy użyciu Przegląd wielowymiarowych danych narzędzie z Narzędzia analityczne menu Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Omawiana tutaj procedura analizy systemu mikroprzepływowego i obrazu koncentruje się na wykonywaniu eksperymentów z biofilmem mikroprzepływowym w celu określenia właściwości morfologicznych, które nie wymagają pełnych informacji trójwymiarowych, zwykle uzyskiwanych z badań mikroskopem konfokalnym. Obejmowały one pokrycie podłoża mikrokolonii (pokrycie procentowe), chropowatość powierzchni mierzoną współczynnikiem chropowatości oraz entropię tekstury. Przedstawiono również metodę szacowania całkowitej względnej akumulacji komórek biofilmu, na podstawie której można obliczyć tempo wzrostu w fazie logarytmicznej.

W tej metodzie należy podkreślić kilka małych, ale istotnych kroków. Wycieranie granicy faz alkoholem pomaga uniknąć zanieczyszczenia innymi bakteriami podczas przechodzenia od eksperymentu do eksperymentu, ale także od studni do studni w jednym eksperymencie. Gruntowanie i zasiewanie są również bardzo ważne, ponieważ gruntowanie pozwala użytkownikowi określić, które kanały pozwalają mediom przepływać przez kanały bez żadnych zakłóceń lub zatykania. Kanały nie powinny być również zakłócane (tzn. powinny być stale wypełnione mediami) po zalaniu, aby zwiększyć szanse na udany eksperyment bez pęcherzyków powietrza i zatkania. Etap wysiewu może być zróżnicowany w zależności od rodzaju bakterii, dlatego powinien być zoptymalizowany pod kątem przyczepiania komórek. Na przykład, jeśli wydaje się, że komórki nie przyczepiają się, może być konieczne zmodyfikowanie powierzchni płytki mikroprzepływowej przed wysiewem lub może być konieczne dłuższe czas inkubacji. Bardzo ważne jest również, aby upewnić się, że mikroskop jest prawidłowo ustawiony do uzyskania ostrego obrazu i powinien być okresowo monitorowany przez cały czas trwania eksperymentu, aby zapewnić uzyskanie wysokiej jakości obrazów. Jeśli ostrość jest wyłączona, mikroskop można i należy regulować w miarę trwania eksperymentu. W czasie akwizycji obrazu ostatnia długość fali powinna być ustawiona na All Closed (Wszystkie, Zamknięte ), aby uniknąć ekspozycji filtrów i oświetlenia tylko na jeden kanał w czasie oczekiwania, który występuje między akwizycjami obrazu. Ponadto analiza obrazu, która określa % pokrycia powierzchni, została zaprojektowana we własnym zakresie, ponieważ podręcznik oprogramowania montażowego nie opisywał wyraźnie procedury. Ponadto, w celu rozszerzenia analizy obrazu i określenia innych cech, takich jak chropowatość powierzchni itp., kod open source oparty na Pythonie45 został opracowany we własnym zakresie i udostępniony w repozytorium gitHub. Istnieją również ograniczenia dotyczące ilości danych, które mogą być przechowywane i zarządzane na lokalnym dysku twardym, dlatego potrzebny jest zewnętrzny dysk twardy lub udostępnianie danych online, takie jak CyVerse46.

Konwencjonalne bioreaktory, takie jak reaktor CDC i reaktor z przepływem kroplowym34, wymagają dużej ilości mediów, zapewniają mniejsze rozmiary próbek i wymagają dużej ilości sterylizacji sprzętu. Z kolei do zalet tej platformy o wyższej przepustowości należy możliwość kontrolowania ścinania, natężenia przepływu oraz założenie, że eksperymenty in vitro bardzo przypominają warunki in vivo . Do wad systemu należy mnogość akcesoriów i oprogramowania, które wymagają skrupulatnej konfiguracji, która musi być wykonywana w odpowiedniej kolejności zdarzeń. Co więcej, instrukcja dołączona do sprzętu nie wyjaśnia w pełni każdego etapu eksperymentów i poleceń oprogramowania, w związku z czym podczas eksperymentów dochodzi do wielu błędów, w tym zatykania kanałów, braku wzrostu lub przyczepienia, a także braku wysokiej jakości obrazów mikroskopowych lub filmów. Sam instrument i materiały eksploatacyjne, takie jak płytki mikroprzepływowe, są również stosunkowo drogie, a ich cena wynosi ponad 200 USD za płytkę i nie nadają się do wielokrotnego użytku. Tak więc, chociaż technika ta daje potężne rezultaty, wiedza techniczna wymagana do jej stosowania jest stosunkowo wysoka i wymaga wielokrotnego szkolenia przez ekspertów w tej dziedzinie. Niniejszy raport próbuje rozwiązać ten problem, dostarczając przewodnik dla nowych użytkowników tych bioreaktorów w celu zbadania charakterystyki biofilmów.

System mikroprzepływowy, który jest w stanie przeprowadzać analizę komórkową, zyskał znaczną uwagę w różnych metodach naukowych, takich jak mikrobiologia, immunologia, hematologia, onkologia i badania nad komórkami macierzystymi. Mówiąc dokładniej, technologia ta zaowocowała wieloma publikacjami opisującymi tematy, które są bardzo istotne dla zastosowań medycznych37,47, w tym mikrobiolną adhezję doustną48, określanie wpływu biosurfaktantów na Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus49,50, interakcje patogenów gospodarza w E. coli51, przyleganie Streptococcus 52oraz leczenie mukowiscydozy53. Biorąc pod uwagę fakt, że ten system mikroprzepływowy jest bardzo wszechstronny, przewiduje się, że coraz więcej systemów będzie dystrybuowanych na całym świecie.

Należy dokładnie rozważyć niektóre konkretne kroki protokołu. Pożywkę można rozcieńczyć do 50% za pomocądH 2O, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków i zatykaniu, ale w tym przypadku nie jest to wymagane. Konkretna wartość OD600 używana do wysiewu musi zostać określona za pomocą próbnych przebiegów eksperymentu wzrostu, aby zobaczyć, co działa najlepiej dla określonego zestawu zastosowanych warunków. Pęcherzyki w studzienkach przed uszczelnieniem mogą prowadzić do powstawania pęcherzyków w kanałach mikroprzepływowych i powinny być usuwane przez wystrzelenie lub odessanie końcówką pipety. Ważne jest, aby bakterie nie przedostawały się do małych kanałów serpentynowych. Dzięki równym objętościom mediów na wejściu i wyjściu podczas procesu wysiewu, przepływ spowodowany ciśnieniem z objętości cieczy będzie kontrolowany, tak aby przepływ był spowodowany tylko ciśnieniem przyłożonym z układu. Odległości kalibracyjne powinny być ustawione podczas instalacji przez przedstawiciela firmy. Te ustawienia są specyficzne dla każdej kamery.

Istnieje kilka wyzwań, które pojawiają się podczas znajdowania najbardziej reprezentatywnego progu dla obrazu. Ustawienie maksymalnych wartości progowych może być trudne, jeśli średnia intensywność pikseli w różnych obszarach tła nie jest spójna, z powodu wybrania pozycji stołu montażowego, która nie znajduje się w środku kanału, lub z powodu zanieczyszczeń na płycie. W standardzie MM kliknij Proces, a następnie wybierz narzędzie Korekcja tła i cieniowania , aby skorygować te niespójności. Jednak to narzędzie jest zazwyczaj pomocne tylko wtedy, gdy użytkownik zrobił zdjęcia kanałów przed udostępnieniem, które może użyć jako obrazów referencyjnych. Lub, jeśli obrazy referencyjne tła/cieniowania są niedostępne, użytkownik będzie musiał użyć swojego osądu, aby ustawić wartość progową, która obejmuje większość obszaru komórki bez dołączania tła dla całego obrazu. Można też wybrać reprezentatywne obszary do pomiaru, które wykluczają obszary niespójności, klikając opcję Region prostokątny, Region elipsy lub Region trasowania , aby wybrać region i wybrać opcję Aktywny region , a nie Cały obraz w oknie Pokaż statystykę regionu (w obszarze Narzędzia analizy)). Jeśli reprezentatywny obszar jest używany do progowania obrazu w jasnym polu, ten sam obszar powinien być używany do pomiaru odpowiedniego obrazu FITC. Pomocne jest zarejestrowanie określonych statystyk przestrzennych (po lewej, u góry, szerokość, wysokość, powierzchnia, obwód) związanych z tym reprezentatywnym regionem, dzięki czemu ten sam obszar zostanie znaleziony i zmierzony na odpowiednim obrazie FITC.

Aby zapobiec gromadzeniu się danych na dysku twardym, które spowoduje spowolnienie komputera, można kupić zewnętrzny dysk twardy do przechowywania danych. Inną opcją przechowywania danych i ułatwiania ich udostępniania jest platforma bioinformatyczna CyVerse. Utwórz konto w systemie CyVerse, przechodząc do http://www.cyverse.org/. Po zalogowaniu uruchom środowisko Discovery, a następnie wybierz "Zaloguj się do CyVerse". Wybierz "Dane" i przejdź do folderu. Jeśli stos obrazów znajduje się na komputerze lokalnym, wybierz "Prześlij", a następnie "Proste przesyłanie z pulpitu". Znajdź plik stosu obrazów i wybierz go do przekazania. Plik lub folder można udostępnić współpracownikom, jeśli mają konto CyVerse i mają uprawnienia. Publiczne udostępnianie folderu danych wymaga dodania metadanych do każdego pliku przy użyciu standardów zatwierdzonych przez CyVerse. Procedura ta nie będzie tutaj omawiana, ponieważ nie wchodzi w zakres niniejszej pracy.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była możliwa dzięki grantom z National Institute for General Medical Science (NIGMS) (5P20GM103427), składnika National Institutes of Health (NIH)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chlorek amonu, ACSVWRBDH9208-500GCzęść minimalnego składu podłoża
BioFlux 1000 48-dołkowa płyta o niskim ścinaniuFluxion Biosciences910-0047
System obrazowania mikroprzepływowego BioFluxion 1000ZFluxion BiosciencesBF 1000Z
Dihydrek chlorku wapnia, klasa ACDVWR97061-904Część minimalnego składu podłoża
Dekstroza, bezwodna, ACSVWRBDH9230-500GCzęść minimalnego składu pożywki
Siarczan magnezuACS VWREM-MX0070-1Część minimalnego składu podłoża
Fosforan potasu jednozasadowy, klasa ACSVWRBDH9268-500GCzęść minimalnego składu podłoża
Pseudomonas Aeurginosa GFPATCC15692GFPSzczep bakteryjny Pseudomonas aeurinosa PA01 z modyfikacją GFP wykorzystany w tym badaniu.
Chlorek sodu, ACSVWRBDH9286-500GCzęść minimalnego składu pożywki
Fosforan sodu, jednozasadowy, bezwodny, klasa odczynnikaVWR97061-942Część minimalnego składu podłoża
klasy

Bibliografia

  1. Donlan, R. M., et al. Model System for Growing and Quantifying Streptococcus pneumoniae Biofilms In Situ and in Real Time. Applied and Environmental Microbiology. 70 (8), 4980-4988 (2004).
  2. Lührig, K., et al. Bacterial Community Analysis of Drinking Water Biofilms in Southern Sweden. Microbes and Environments. 30 (1), 99-107 (2015).
  3. Singh, R., Paul, D., Jain, R. Biofilms: implications in bioremediation. Trends in Microbiology. 14 (9), 389-397 (2006).
  4. Veerachamy, S., et al. Bacterial adherence and biofilm formation on medical implants: A review. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine. 228 (10), 1083-1099 (2014).
  5. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Establishment of Pseudomonas aeruginosa infection: lessons from a versatile opportunist. Microbes and Infection. 2 (9), 1051-1060 (2000).
  6. Percival, S. L., Knapp, J. S., Edyvean, R., Wales, D. S. Biofilm Development On Stainless Steel In Mains Water. Water Research. 32 (1), 243-253 (1998).
  7. Percival, S. L., Knapp, J. S., Wales, D. S., Edyvean, R. G. J. The effect of turbulent flow and surface roughness on biofilm formation in drinking water. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. 22 (3), 152-159 (1999).
  8. Ling, F., Whitaker, R., LeChevallier, M. W., Liu, W. -T. Drinking water microbiome assembly induced by water stagnation. The ISME Journal. , 1(2018).
  9. Moss, B. Water pollution by agriculture. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363 (1491), 659-666 (2008).
  10. Schultz, M. P., Bendick, J. A., Holm, E. R., Hertel, W. M. Economic impact of biofouling on a naval surface ship. Biofouling. 27 (1), 87-98 (2011).
  11. Tornero, V., Hanke, G. Chemical contaminants entering the marine environment from sea-based sources: A review with a focus on European seas. Marine Pollution Bulletin. 112 (1-2), 17-38 (2016).
  12. LaBauve, A. E., Wargo, M. J. Growth and Laboratory Maintenance of Pseudomonas aeruginosa. Current Protocols in Microbiology. 25 (1), 1-8 (2012).
  13. He, J., et al. The broad host range pathogen Pseudomonas aeruginosa strain PA14 carries two pathogenicity islands harboring plant and animal virulence genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (8), 2530-2535 (2004).
  14. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  15. Zhang, G., Gurtu, V., Kain, S. R. An Enhanced Green Fluorescent Protein Allows Sensitive Detection of Gene Transfer in Mammalian Cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 227 (3), 707-711 (1996).
  16. Patterson, G. H., Knobel, S. M., Sharif, W. D., Kain, S. R., Piston, D. W. Use of the green fluorescent protein and its mutants in quantitative fluorescence microscopy. Biophysical Journal. 73 (5), 2782-2790 (1997).
  17. Chalfie, M., Tu, Y., Euskirche, G., Ward, W. W., Prashert, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
  18. Heim, R., Prasher, D., Tsien, R. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 12501-12504 (1994).
  19. Bakke, R., Kommedal, R., Kalvenes, S. Quantification of biofilm accumulation by an optical approach. Journal of Microbiological Methods. 44 (1), 13-26 (2001).
  20. Heydorn, A., et al. Statistical analysis of Pseudomonas aeruginosa biofilm development: impact of mutations in genes involved in twitching motility, cell-to-cell signaling, and stationary-phase sigma factor expression. Applied and Environmental Microbiology. 68 (4), 2008-2017 (2002).
  21. Wilson, E., et al. Using Fluorescence Intensity of Enhanced Green Fluorescent Protein to Quantify Pseudomonas aeruginosa. Chemosensors. 6 (21), (2018).
  22. Fang, H., Chen, Y., Huang, L., He, G. Analysis of biofilm bacterial communities under different shear stresses using size-fractionated sediment. Scientific Reports. 7 (1), 1299(2017).
  23. Saunders, K. A., Greenman, J. The formation of mixed culture biofilms of oral species along a gradient of shear stress. Journal of Applied Microbiology. 89 (4), 564-572 (2001).
  24. Valquier-Flynn, H., Wilson, C. L., Holmes, A. E., Wentworth, C. D. Growth Rate of Pseudomonas aeruginosa Biofilms on Slippery Butyl Methacrylate-Co-Ethylene Dimethacrylate (BMA-EDMA), Glass and Polycarbonate Surfaces. Journal of Biotechnology & Biomaterials. 7 (4), (2017).
  25. Trulear, M. G., Characklis, W. G. Dynamics of biofilm processes. Journal (Water Pollution Control Federation). 54 (9), 1288-1301 (1982).
  26. Machineni, L., Rajapantul, A., Nandamuri, V., Pawar, P. D. Influence of Nutrient Availability and Quorum Sensing on the Formation of Metabolically Inactive Microcolonies Within Structurally Heterogeneous Bacterial Biofilms: An Individual-Based 3D Cellular Automata Model. Bulletin of Mathematical Biology. 79 (3), 594-618 (2017).
  27. Jiao, Y., et al. Identification of Biofilm Matrix-Associated Proteins from an Acid Mine Drainage Microbial Community. Applied and Environmental Microbiology. 77 (15), 5230-5237 (2011).
  28. Flemming, H. C., Wingender, J. The Biofilm Matrix. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 632-633 (2010).
  29. Yang, X., Beyenal, H., Harkin, G., Lewandowski, Z. Quantifying biofilm structure using image analysis. Journal of Microbiological Methods. 39 (2), 109-119 (2000).
  30. Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
  31. Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews in Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
  32. Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (3), 783-788 (2009).
  33. Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology. 151, 757-762 (2005).
  34. Swartz, K., Stephenson, R., Hernandez, M., Jambang, N., Boles, B. R. The use of Drip Flow and Rotating Disk Reactors for Staphylococcus aureus biofilm analysis. Journal of Visual Experiments. (46), e2470(2010).
  35. Werner, E., et al. Stratified Growth in Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 70 (10), 6188-6196 (2004).
  36. Wilson, C., et al. The Quantitative Assessment of Pseudomonas aeruginosa (PA)14 Biofilm Surface Coverage on Slippery Liquid Infused Polymer Surfaces (SLIPS). International Journal of Nanotechnology in Medicine & Engineering. 3 (3), 35-42 (2018).
  37. Samarian, D. S., Jakubovics, N. S., Luo, T. L., Rickard, A. H. Use of a High-throughput In Vitro Microfluidic System to Develop Oral Multi-species Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (94), 52467(2014).
  38. Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics Expanding the Frontiers of Microbial Ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
  39. Kim, J., Park, H. -D., Chung, S. Microfluidic Approaches to Bacterial Biofilm Formation. Molecules. 17 (8), 9818-9834 (2012).
  40. Mosier, A. P., Cady, N. C. Analysis of bacterial surface interactions using microfluidic systems. Science Progress. 94 (4), 431-450 (2011).
  41. Nobile, C. J., Johnson, A. D. Candida albicans Biofilms and Human Disease. Annual Review of Microbiology. 69, 71-92 (2015).
  42. Chandra, J., Kuhn, D. M., Mukherjee, P. K., Hoyer, L. L., McCormick, T., Ghannoum, M. A. Biofilm Formation by the Fungal Pathogen Candida albicans: Development, Architecture, and Drug Resistance. Journal of Bacteriology. 183 (18), 5385-5394 (2001).
  43. Vasconcelos, M. A., et al. Effect of Algae and Plant Lectins on Planktonic Growth and Biofilm Formation in Clinically Relevant Bacteria and Yeasts. BioMed Research International. 2014, 9(2014).
  44. Haralick, R. M., Shanmugam, K., Dinstein, I. Textural Features for Image Classification. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 3 (6), 610-621 (1973).
  45. Wentworth, C. D. Biofilm Morphology Suite. , Available from: https://github.com/cdwentworth/Biofilm-Morphology-Suite.git (2018).
  46. Cyverse. , Available from: https://user.cyverse.org/services/mine (2018).
  47. Benoit, M. R., Conant, C. G., Ionescu-Zanetti, C., Schwartz, M., Matin, A. New Device for High-Throughput Viability Screening of Flow Biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 76 (13), 4136-4142 (2010).
  48. Ding, A. M., Palmer, R. J., Cisar, J. O., Kolenbrander, P. E. Shear-Enhanced Oral Microbial Adhesion. Applied and Environmental Microbiology. 76 (4), 1294-1297 (2010).
  49. Diaz De Rienzo, M. A., Stevenson, P. S., Marchant, R., Banat, I. M. Effect of biosurfactants on Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus biofilms in a BioFlux channel. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (13), 5773-5779 (2016).
  50. Moormeier, D. E., Bayles, K. W. Staphylococcus aureus Biofilm: A Complex Developmental Organism. Molecular Microbiology. 104 (3), 365-376 (2017).
  51. Tremblay, Y. D. N., Vogeleer, P., Jacques, M., Harel, J. High-Throughput Microfluidic Method To Study Biofilm Formation and Host-Pathogen Interactions in Pathogenic Escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology. 81 (8), 2827-2840 (2015).
  52. Nobbs, A. H., Lamont, R. J., Jenkinson, H. F. Streptococcus Adherence and Colonization. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 73 (3), 407-450 (2009).
  53. Díez-Aguilar, M., Morosini, M. I., Köksal, E., Oliver, A., Ekkelenkamp, M., Cantón, R. Use of Calgary and Microfluidic BioFlux Systems To Test the Activity of Fosfomycin and Tobramycin Alone and in Combination against Cystic Fibrosis Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 62 (1), 01650-01717 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wzrost biofilmumikroskopia fluorescencyjnakinetyka wzrostuchropowato powierzchnientropia teksturyanaliza obrazu
Analiza naprężeń ścinających w żywych komórkach u Pseudomonas aeruginosa przy użyciu zautomatyzowanego systemu mikroprzepływowego o wyższej przepustowości
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.