Identyfikacja markerów powierzchniowych pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych poprzez znakowanie metaboliczne sialoglikanu

Podsumowanie

Prezentowany tutaj jest protokół, który łączy system kohodowli neuronalno-śródbłonkowej in vitro i metaboliczną inkorporację sialoglikanu z bioortogonalnymi grupami funkcyjnymi w celu rozszerzenia pierwotnych nerwowych komórek macierzystych i progenitorowych oraz oznaczenia ich powierzchniowych sialoglykoprotein do obrazowania lub analizy spektrometrii mas markerów powierzchni komórki.

Streszczenie

Neuronalne komórki macierzyste i progenitorowe (NSPC) są komórkową podstawą złożonych struktur i funkcji mózgu. Znajdują się one w wyspecjalizowanych niszach in vivo i mogą być izolowane i namnażane in vitro, służąc jako ważny zasób do przeszczepu komórek w celu naprawy uszkodzeń mózgu. Jednak NSPC są niejednorodne i nie są jasno zdefiniowane na poziomie molekularnym ani oczyszczone z powodu braku specyficznych markerów powierzchni komórek. Przedstawiony protokół, który został już wcześniej opisany, łączy system kohodowli nerwowo-śródbłonkowej z metodą znakowania glikanów metabolicznych w celu identyfikacji powierzchniowego sialoglykoproteomu pierwotnych NSPC. System kohodowli NSPC-śródbłonek umożliwia samoodnawianie i ekspansję pierwotnych NSPC in vitro, generując wystarczającą liczbę NSPC. Sialoglikany w hodowanych NSPC są znakowane przy użyciu nienaturalnego reportera metabolicznego kwasu sjalowego z bioortogonalnymi grupami funkcyjnymi. Porównując sialoglykoproteom z samoodnawiających się NSPC namnażanych w kokulturze śródbłonka z różnicującą się hodowlą neuronalną, identyfikujemy listę białek błonowych, które są wzbogacone w NSPC. W szczegółach protokół obejmuje: 1) ustanowienie kokultury NSPC-śródbłonek i kultury różnicującej NSPC; 2) znakowanie azydocukrem per-O-acetylowaną N-azydoacetylomannosaminą (Ac₄ManNAz); oraz 3) koniugacja biotyny ze zmodyfikowanym sialoglykanem do obrazowania po utrwaleniu hodowli neuronalnej lub ekstrakcji białka z hodowli neuronalnej do analizy spektrometrii mas. Następnie kandydaci na markery powierzchniowe wzbogacone o NSPC są wybierani poprzez analizę porównawczą danych spektrometrii mas zarówno z ekspandowanego NSPC, jak i zróżnicowanych kultur neuronowych. Protokół ten jest bardzo czuły w identyfikacji białek błonowych o niskiej obfitości w materiałach wyjściowych i może być stosowany do odkrywania markerów w innych systemach z odpowiednimi modyfikacjami

Wprowadzenie

Neuronalne komórki macierzyste są definiowane jako populacja komórek multipotencjalnych, które mogą się samoodnawiać, aby utrzymać pulę komórek macierzystych i różnicować się w neurony i glej. Są to główne typy komórek w układzie nerwowym i mogą oferować ogromny potencjał terapeutyczny w medycynie regeneracyjnej poprzez przeszczepianie komórek do chorych i uszkodzonych mózgów^1,2. Wraz z postępem rozwoju populacja nerwowych komórek macierzystych staje się niejednorodna^3,4, a odsetek nerwowych komórek macierzystych w mózgu stopniowo maleje⁵. Ogólnie rzecz biorąc, embrionalne nerwowe komórki macierzyste i inne nerwowe komórki progenitorowe, zbiorczo nazywane nerwowymi komórkami macierzystymi i progenitorowymi (NSPC), znajdują się w strefach rozrodczych, strefie komorowej i strefie podkomorowej u myszy⁶. W mózgu embrionalnym nerwowe komórki macierzyste generują neurony bezpośrednio lub pośrednio przez pośrednie komórki progenitorowe (IPC), a u niektórych gatunków przez zewnętrzne progenitory strefy podkomorowej (oRGs)^7,8. Specyficzna sygnatura molekularna, morfologia, lokalizacja w niszy komórek macierzystych i potencjał różnicowania określają rolę każdego podtypu w organogenezie mózgu i zastosowaniach klinicznych⁹. Jednak obecnie dostępne markery powierzchni komórek nie mogą jednoznacznie rozróżniać i oczyszczać różnych podtypów NSPC, co ogranicza zrozumienie i wykorzystanie tych podtypów.

Identyfikacja głównych znaczników powierzchni NSPC jest ograniczona przez trzy główne przeszkody. Pierwszym z nich jest ograniczona liczba komórek NSPC w tkance, co utrudnia przygotowanie próbek białek na powierzchni komórki do powszechnej analizy spektrometrii mas. Drugim ograniczeniem jest trudność w wytwarzaniu czystych podtypów komórek w celu generowania danych dotyczących białek błonowych specyficznych dla podtypu. Wreszcie trzecim wyzwaniem jest niski stosunek białek powierzchniowych komórek do białek całych komórek, co utrudnia ich wykrywanie za pomocą analizy spektrometrii mas.

Aby przezwyciężyć te problemy, opracowaliśmy podejście chemoproteomiczne do selektywnego wzbogacania i identyfikowania białek powierzchniowych komórek w pierwotnych NSPC poprzez metaboliczne znakowanie sialoglykoprotein¹⁰. Aby wygenerować wystarczającą liczbę NSPC, skorzystaliśmy z ustalonego protokołu do ekspansji i utrzymania pierwotnych embrionalnych NSPC w niezróżnicowanych stanach in vitro, poprzez kohodowlę NSPC z liniami komórkowymi śródbłonka mózgu myszy przy użyciu przepuszczalnej wkładki macierzy nośnej (np. Transwell) system¹¹. W przeciwieństwie do tego, NPSC hodowane samodzielnie bez komórek śródbłonka generują zróżnicowane potomstwo^11,12. W ten sposób próbki białek z tych dwóch systemów hodowli mogą być analizowane porównawczo w celu zidentyfikowania białek, które ulegają zróżnicowanej ekspresji w NSPC i zróżnicowanych neuronach. Ponieważ większość białek powierzchniowych komórek jest modyfikowana przez kwas sjalowy¹³, nienaturalny analog prekursora kwasu sjalowego N-azydoacetylmannozamin-tetraacylowany (Ac₄ManNAz) został użyty do przejęcia wewnętrznego szlaku metabolicznego, tak że endogenne, nowo zsyntetyzowane syloglikany są znakowane grupami azydowymi, generując chemiczny uchwyt¹⁴. Poprzez reakcje bioortogonalne za pośrednictwem azydo-alkinów, które sprzężają biotynę z sialoglikanami, białka powierzchniowe komórek mogą być wizualizowane i wzbogacane w celu identyfikacji proteomicznej za pomocą fluoroforu sprzężonego ze streptawidyną lub matrycy¹⁴.

Tutaj przeprowadzamy barwienie żelem SDS-PAGE analizy powierzchni sialoglykoproteomu z NSPC rozprężonych w kokulturze śródbłonka i różnicujących komórki w systemie niekokulturowym. Selektywnie oczyszczamy również powierzchniowy sialoglykoproteom w dwóch systemach hodowli w celu porównania proteomicznego. Nasz protokół, w porównaniu z tradycyjnymi protokołami oczyszczania powierzchni komórek opartymi na wirowaniu¹⁵, zwiększa skuteczność ekstrakcji poprzez zmniejszenie procedur ekstrakcji białek powierzchniowych poprzez specyficzną koniugację znaczników i oczyszczanie powinowactwa. Tymczasem zwiększa czystość ekstrakcji białek powierzchniowych komórek w oparciu o założenie, że sialilacja zachodzi głównie w białkach powierzchniowych komórki. Chociaż czynniki śródbłonka nie mogą całkowicie zablokować różnicowania ekspandowanych NSPC, badanie porównawcze między kokulturą a kulturą zróżnicowaną zapewnia wygodną metodę wskazania białek powierzchniowych wzbogaconych komórkami macierzystymi bez konieczności analizy białek z NPC oczyszczonych przez FACS¹⁶. Uważamy, że to podejście można zastosować do badań białek powierzchniowych w innych układach z odpowiednimi modyfikacjami.

Protokół

Wszystkie protokoły na zwierzętach użyte w tym badaniu zostały zatwierdzone przez IACUC (Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt) Uniwersytetu Tsinghua i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi IACUC. Zakład dla zwierząt laboratoryjnych na Uniwersytecie Tsinghua został akredytowany przez AAALAC (Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International). W przypadku oceny stopnia zaawansowania zarodków, środek dnia, w którym zidentyfikowano czop pochwowy, obliczono jako dzień embrionalny 0,5 (E0,5).

UWAGA: Wszystkie komórki są hodowane w inkubatorze komórkowym w warunkach 37 °C i 5% CO₂ .

1. Przygotowanie hodowli śródbłonka myszy w przepuszczalnych wkładkach podporowych

UWAGA: Komórki BEND3 są utrzymywane zgodnie z instrukcjami producenta.

1. Przygotuj pożywkę komórkową BEND3 (BM), dodając 50 ml FBS i 5 ml penicyliny-streptomycyny do 500 ml DMEM i dobrze wymieszaj.
2. Odessać pożywkę z naczynia i przemyć kulturę komórek BEND3 1 ml PBS jeden raz. Dodać 1 ml 0,25% trypsyny-EDTA do komórek i inkubować komórki przez 4 minuty w temperaturze 37 °C.
3. Dodaj 1 ml BM do komórek, aby zneutralizować trypsynę-EDTA i delikatnie pipetuj w górę iw dół, aby całkowicie zdysocjować komórki. Przenieść zawiesinę komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml i osadu przez odwirowanie w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut przy 400 x g.
4. Odessać supernatant z probówki i ponownie zawiesić komórki za pomocą 9 ml świeżego BM, a następnie dodać 1 ml zawiesiny komórek do jednej przepuszczalnej wkładki nośnej. Dodać kolejne 2 ml świeżego BM na studzienkę w dolnej komorze matrycy. Kontynuuj hodowlę komórek przez jeden dzień.

2. Przygotowanie hodowli pierwotnych NSPC kory mózgowej myszy

1. Przygotowanie płytki hodowlanej, pożywki do trawienia papainy i korowej pożywki do hodowli przylegającej (AM)
   1. Pokryj płytki 6-dołkowe poli-L-lizyną (PLL), dodając 1 ml roztworu PLL na studzienkę do płytek 6-dołkowych. Następnie inkubować płytki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
   2. Przenieść roztwór PLL do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Umyj płytki 3 razy wodą podwójnie destylowaną. Wysuszyć talerze na powietrzu i odłóż je na bok do czasu użycia.
   3. Przygotuj pożywkę do trawienia papainy, dodając 50 j. papainy, 50 μl L-glutaminy i 50 μl 100 mg/ml acetylo-L-cysteiny do 5 ml DMEM. Krótko wymieszać pożywkę i ogrzać ją do 37 °C przez 30 minut w celu aktywacji enzymu.
   4. Przygotuj pożywkę do hodowli przylegającej do komórek korowych (AM): dodaj 500 μl L-glutaminy, 500 μl pirogronianu sodu, 500 μl 100 mg/ml N-acetylo-L-cysteiny, 500 μl N2, 1 ml witaminy B27 i 5 μl 100 μg/ml bFGF do 50 ml DMEM. Przed użyciem dobrze wymieszać podłoże i ogrzać je do temperatury 37 °C.
2. Przygotowanie pierwotnych komórek kory mózgowej i późniejsze posiew
   1. Poświęć ciężarną mysz z E10.5 przez zwichnięcie szyjki macicy.
      nuta: W E10.5 większość komórek proliferuje NSPC w korze mózgowej, dając początek dużym klonom potomstwa in vitro.
   2. Wysterylizuj brzuch 75% etanolem. Użyj cienkich nożyczek i kleszczy z mikroząbkami, aby otworzyć brzuch, przecinając skórę i leżący pod nią mięsień wzdłuż prawej strony środkowej linii. Delikatnie usuń macicę z jamy brzusznej za pomocą ząbkowanych kleszczy i wytnij ją z jamy brzusznej drobnymi nożyczkami.
   3. Umyj macicę 40 ml wstępnie schłodzonego HBSS na 10 cm szalce Petriego. Następnie przenieś macicę na nową 10-centymetrową szalkę Petriego i ponownie umyj ją 40 ml wstępnie schłodzonego HBSS.
   4. Przenieś macicę na nową 10-centymetrową szalkę Petriego z 40 ml wstępnie schłodzonego HBSS. Usuń zarodki z macicy i błony owodniowej, a następnie odetnij główki zarodków od pni za pomocą mikrokleszczyków Jewelers.
   5. Umyj głowy 40 ml wstępnie schłodzonego HBSS i przenieś je na nową 10-centymetrową szalkę Petriego z 40 ml wstępnie schłodzonego HBSS. Użyj mikrokleszczyków jubilerskich, aby usunąć skórę i chrząstki pokrywające mózg, a następnie odetnij korę mózgową i zbierz je w stożkowej probówce o pojemności 15 ml ze wstępnie schłodzonym HBSS.
   6. Osadzać korę przez odwirowywanie przez 3 minuty w temperaturze 4 °C i 300 x g. Odessać supernatant z probówki, a następnie dodać aktywowaną pożywkę do trawienia papainą i 15 μl 4 mg/ml DNazy I do osadu tkankowego.
   7. Ponownie zawiesić na krótko osad tkankowy poprzez delikatne wirowanie. Inkubować tkankę w temperaturze 37 °C przez 30 minut. W tym czasie rozluźnij tkankę poprzez krótkie wirowanie co 10 minut.
      nuta: Pod koniec trawienia w probówce nie powinny być widoczne żadne kawałki tkanki.
   8. Komórki korowe osadzać przez odwirowywanie przez 10 minut w temperaturze 4 °C i 450 x g. Odessać supernatant z probówki i przemyć osad komórkowy wstępnie schłodzonym DMEM. Powtórz ten krok raz.
      nuta: Podczas trawienia i mycia należy uważać, aby nie pipetować tkanek i osadu komórkowego z grubsza, aby uniknąć uszkodzenia komórek dużą siłą ścinającą.
   9. Odessać supernatant z probówki, a następnie dodać do probówki 1,5 ml wstępnie schłodzonego HBSS. Zdeocjuj osad komórek korowych na pojedyncze komórki, delikatnie pipetując. Policz numer komórki za pomocą hemocytometru.
   10. Dodaj 2 ml AM i 2 x 10⁴ komórek korowych na studzienkę do płytek 6-dołkowych. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 3 godziny, aby komórki mogły przyłączyć się do płytki.

3. Konfiguracja kokultury neuronalno-śródbłonkowej i systemu znakowania Ac₄ManNAz

1. Dzień po posianiu komórek BEND3 we wkładkach, najpierw delikatnie zassać pożywkę w dolnej komorze, a następnie wkładki. Umyj powierzchnię wkładek 3 razy za pomocą wstępnie podgrzanego DMEM. Umyj zewnętrzną powierzchnię wkładów, spłukując je wstępnie podgrzanym DMEM.
2. Dodaj 1 ml wstępnie podgrzanego AM do jednej wkładki, a następnie przenieś wkładki do studzienek z pierwotnymi komórkami korowymi. Inkubować kokulturę w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ przez 12 godzin.
3. Rozpuść Ac₄ManNAz w DMSO, aby osiągnąć stężenie wyjściowe 200 mM. 12 godzin po założeniu kokultury nerwowo-śródbłonkowej dodać 1 μl materiału Ac₄ManNAz na dolną komorę i 0,5 μl osadu na wkładkę do kokultury. Natychmiast i delikatnie wstrząśnij talerzami, aby dobrze wymieszać podłoże. W przypadku komórek kontrolnych dodaj równą objętość DMSO.
4. Hodować komórki przez kolejne 5 dni w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Przygotuj AM z 10x bFGF jako pożywką do ponownego karmienia (RM). W tym czasie dodaj 100 μl RM na wkładkę i 200 μl RM na dolną komorę, aby co drugi dzień dokarmiać komórki śródbłonka i nerwowe. Podczas ponownego karmienia nie należy dostarczać do hodowli Ac₄ManNAz ani DMSO.

4. Barwienie immunofluorescencyjne sialoglykoprotein w rozszerzonych pierwotnych NSPC i zróżnicowanych neuronach

1. Przygotować kompleks BTTAA-CuSO₄ 1 30x bulion zawierający 1,5 mM CuSO₄ i 9 mM BTTAA w wodzie podwójnie destylowanej. Przygotować świeżo sprzężony z biotyną bufor 1 zawierający 50 μM biotyny-alkinu, 2,5 mM askorbinianu sodu i 1x kompleks_BTTAA-CuSO4 w PBS.
2. Usuń wkładki z płytek współkulturowych. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków dolnych i raz umyć komórki nerwowe wstępnie podgrzanym PBS.
3. Odessać PBS ze studzienek. Dodać 1 ml wstępnie schłodzonego 4% roztworu PBS paraformaldehydu na dołek do komórek i utrwalić komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie umyj komórki 3 razy wstępnie schłodzonym PBS.
4. Odessać PBS z dołków i dodać do komórek 1 ml świeżo przygotowanego buforu sprzężonego z biotyną 1 na studzienkę. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
5. Odessać bufor reakcyjny ze studzienek. Umyj komórki 3 razy PBS. Przygotować bufor barwiący zawierający 1% FBS i 1 μg/ml Alexa Fluor 647-streptawidyny. Dodać 1 ml buforu barwiącego na dołek do komórek i inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
6. Odessać bufor barwiący ze studzienek i umytych komórek 3 razy za pomocą wstępnie schłodzonego PBS. Przygotować bufor blokujący zawierający 5% BSA i 0,3% niejonowego detergentu-100 w PBS. Dodać 1 ml buforu blokującego na studzienkę do komórek i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
7. Przygotować roztwór przeciwciała pierwszorzędowego, rozcieńczając razem przeciwciała anty-nestyny i anty-β-tubuliny III w buforze blokującym w proporcjach odpowiednio 1:20 i 1:1 000. Usuń bufor blokujący z dołków i dodaj 1 ml roztworu przeciwciała pierwszorzędowego na studzienkę do komórek. Inkubować komórki w temperaturze 4 °C przez noc.
8. Usunąć pierwszorzędowy roztwór przeciwciała z dołków. Umyj komórki 3 razy wstępnie schłodzonym PBS. Przygotuj drugorzędowy roztwór przeciwciała, rozcieńczając razem Alexa Fluor 488 kozią anty-mysią IgG1, Alexa Fluor 546 kozią anty-mysią IgG2b i DAPI w bufor blokujący w rozcieńczeniu 1:1,000. Odessać PBS z dołków i dodać 1 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych na studzienkę do komórek. Inkubować komórki w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
9. Odessać roztwór przeciwciała ze studzienek i umyć komórki 3 razy wstępnie schłodzonym PBS. Następnie komórki są gotowe do przechwycenia obrazu.

5. Oczyszczanie sialoglykoprotein z rozszerzonych pierwotnych NSPC i zróżnicowanych neuronów

1. Przygotować BTTAA-CuSO₄ complex 2 15x stock zawierający 1,5 mM CuSO₄ i 3 mM BTTAA w wodzie podwójnie destylowanej. Przygotować białkowy bufor do resuspensji A zawierający 4% SDS i 10 mM EDTA w wodzie podwójnie destylowanej; bufor do reprodukcji białek B zawierający 150 mM NaCl, 50 mM trietanoloaminy i 1% polioksyetylenooleilowego eteru (np. Brij97) w podwójnie destylowanej wodzie o pH 7,4. Przed użyciem należy zmieszać bufor A:bufor B = 1:8 (obj./obj.) w celu przygotowania pełnego buforu do resuspensji białka. Przygotować białkowy bufor do przemywania 1 zawierający 2% SDS w PBS; białkowy bufor płuczący 2 zawierający 8 M mocznika w 250 mM wodorowęglanie amonu (ABC); oraz bufor do przemywania białek 3 zawierający 2,5 M NaCl w PBS.
2. Usuń wkładki z płytek współkulturowych. Odessać pożywkę hodowlaną z dołków dennych i raz umyć komórki nerwowe wstępnie schłodzonym PBS.
3. Odessać PBS z dołków i dodać 200 μl wstępnie schłodzonego buforu RIPA na dołek do płytek. Inkubuj płytki na lodzie przez 5 minut. Zebrać lizę białka do probówek o pojemności 1,5 ml. Osadzać resztki komórek przez odwirowywanie przez 10 minut w temperaturze 4 °C i 12 000 x g.
4. Przenieść supernatant do nowych probówek o pojemności 1,5 ml. Określ stężenie białka za pomocą zestawu BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Dostosuj stężenie białka do 1 mg/ml.
5. Dodaj 100 μM alkino-biotyny, 2,5 mM askorbinianu sodu i 1x kompleks BTTAA-CuSO₄ 2 do 1 ml lizy białek i dobrze wymieszaj roztwór. Inkubować mieszaninę w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
6. Przenieść roztwór reakcyjny do 20 ml wstępnie schłodzonego metanolu w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze -30 °C przez noc w celu wytrącenia białek.
7. Wytrącić białko przez odwirowanie przez 15 minut w temperaturze 4 °C i 4 500 x g. Umyj granulki białka dwukrotnie 20 ml wstępnie schłodzonego metanolu. Odessać supernatant z probówki. Zawiesić osad białkowy z 4 ml buforu do resuspensji białka i przenieść rezawiesinę białka do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
8. Weź 50 μl kulek streptawidyny i umyj je 3 razy PBS. Dodać umyte kulki do wysiedlenia białka. Inkubować roztwór w temperaturze 4 °C przez 3 godziny na rotatorze pionowym z prędkością obrotową 20 obr./min.
9. Płukać kulki sekwencyjnie 6 rodzajami: buforem do płukania białek 1, buforem do płukania białek 2, buforem do płukania białek 3, 0,5 M ABC, 0,25 M ABC i 0,05 M ABC.
10. Po umyciu ponownie zawiesić kulki z 20 μl PBS i przenieść kulki do nowej probówki o pojemności 1,5 ml. Dodaj 20 μl 2x buforu ładującego białko do kulek i traktuj w temperaturze 95 °C przez 10 minut. Próbki białek należy następnie poddać SDS-PAGE i wybarwić błękitem brylantowym Coomassie R-250 zgodnie z instrukcjami producenta. Pokrój białka w żelu zgodnie ze wskazaniami błękitu brylantowego Coomassie R-250 do analizy spektrometrii mas.

Wyniki

Cała procedura ekspansji in vitro i metabolicznego znakowania pierwotnych embrionalnych NSPC trwa 6 dni (Rysunek 1A). Jakość linii komórkowej BEND3 i świeżo wyizolowanych pierwotnych NSPC są kluczem do udanego eksperymentu. Komórki BEND3 są źródłem rozpuszczalnych czynników, które stymulują samoodnowę i proliferację NSPC. Należy upewnić się, że komórki BEND3 są wolne od wszelkich zanieczyszczeń i aktywnie dzielą się przy minimalnej śmierci komórki przed wspólną hodowlą...

Dyskusja

Markery powierzchniowe są powszechnie stosowane do znakowania i oczyszczania określonych typów komórek in vitro i in vivo^17,18. Odkrycie markerów powierzchniowych w znacznym stopniu przyczynia się do rozwoju medycyny regeneracyjnej i badań nad komórkami macierzystymi, dostarczając narzędzi molekularnych do selektywnego wzbogacania populacji komórek macierzystych z normalnych lub patologicznych tkanek i szalek hodowlanych, oferując oczyszczone zasoby komórkowe do ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
BEND3	ATCC	CRL-229
DMEM	Gibco	11960044
L-glutamina	Gibco	25030081	1%
Pirogronian sodu	Sigma	P5280	1%
N2 suplement	Gibco	17502048	1 do 100
N-acetylo-L-cysteina	Sigma	A7250	1 mM
Papaina	Worthington	LS003726	10 U/ml
B27 suplement	Gibco	17504044	1 do 50
Poli-L-lizyna	Sigma	P4707
Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów	Gibco	PHG0261	10 ng / ml
Penicylina-Streptomycyna	Gibco	15140122	1%
Surowica bydlęca	płodu Gibco	10099141	10%
HBSS	Gibco	14175095
Tripsin-EDTA, 0,25%	Gibco	25200056
DPBS	Gibco	14190094
Transwell	Corning	3450
Paraformaldehyd	Sigma	158127	4%
Sacharoza	Sangon	A100335
DAPI	Gibco	62248
Bufor RIPA	Thermo Scientific	89900
Bufor ładujący SDS-PAGE 2x	Solarbio	P1018
6-dołkowa płytka	Corning	3335
Tris-Glycine protein gel	invitrogen	xp00100box
Mysie monoklonalne badanie rozwojowe anty-Nestin	Hybridoma Bank	Rat-401	1 do 20
Mysia monoklonalna anty-beta-tubulina III	Sigma	T8860	1 do 1,000
Alexa Fluor 488 koza anty-mysia IgG1	invitrogen	A-21121	1 do 1,000
Alexa Fluor 546 koza anty-mysia IgG2b	invitrogen	A-21143	1 do 1,000
Albumina bydlęca V	Amresco	0332
Triton X-100	Amresco	0694
BCA zestaw testowy	Thermo Scientific	23225
Dimetylosulfotlenek	Sigma	D2650
Brij97	Aladdin	B129088
CuSO4	Sigma	209198
Alkino-biotyna	Kliknij Narzędzia chemiczne	TA105
BTTAA	Kliknij Narzędzia chemiczne	1236
Ac4ManNAz	Kliknij Narzędzia chemiczne	1084	100 µ M
9AzSia	zsyntetyzowane w laboratorium
Askorbinian sodu	Sigma	A4034
Metanol	Sigma	34860
EDTA	Sangon	A100322
NaCl	Sangon	A100241
SDS	Sangon	A100227
Mąka Alexa 647-sprzężona streptawidyna	invitrogen	S21374	1 do 1,000
Trietanoloamina	Sigma	V900257
Dynabeads M-280 Streptawidyna	invitrogen	60210
Wodorowęglan amonu	Sigma	9830
Coomassie Brilliant Blue R-250	Thermo Scientific	20278
Isoflurane	RWD Life Science Co.	970-00026-00
DNaza I	Sigma	DN25	12 &mikro; g/ml
Mocznik	Sigma	U5378