Artykuł metodologiczny

Zakażenie i wykrywanie poliomawirusa Merkla

DOI:

10.3791/58950

⸱

7 lutego 2019

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Laboratory of Cellular Oncology, National Cancer Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół infekowania pierwotnego ludzkiego fibroblastu skórnego MCPyV. Protokół obejmuje izolację fibroblastów skóry, przygotowanie wirionów MCPyV, zakażenie wirusem, barwienie immunofluorescencyjne i fluorescencyjną hybrydyzację in situ. Protokół ten można rozszerzyć w celu scharakteryzowania interakcji MCPyV-gospodarz i odkrycia innych typów komórek zakażonych przez MCPyV.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zakażenie poliomawirusem z komórek Merkla (MCPyV) może prowadzić do raka z komórek Merkla (MCC), wysoce agresywnej formy raka skóry. Badania mechanistyczne mające na celu pełne zbadanie biologii molekularnej MCPyV i mechanizmów onkogennych były utrudnione przez brak odpowiednich modeli hodowli komórkowych. W tym miejscu opisujemy zestaw protokołów do przeprowadzania i wykrywania infekcji MCPyV pierwotnych ludzkich komórek skóry. Protokoły opisują izolację ludzkich fibroblastów skóry, przygotowanie rekombinowanych wirionów MCPyV oraz wykrywanie infekcji wirusowej zarówno za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (IF), jak i reakcji łańcuchowej hybrydyzacji DNA in situ (HCR), która jest bardzo czułym podejściem do hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH). Zawarte w nich protokoły mogą być adaptowane przez zainteresowanych badaczy w celu zidentyfikowania innych typów komórek lub linii komórkowych, które wspierają infekcję MCPyV. Opisane podejście opracowane w ramach projektu FISH można również zaadaptować do wykrywania niskich poziomów wirusowego DNA obecnego w zakażonej skórze ludzkiej.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poliomawirus z komórek Merkla (MCPyV) to mały, dwuniciowy wirus DNA, który jest związany z rzadkim, ale agresywnym rakiem skóry, rakiem z komórek Merkla (MCC)1,2. Śmiertelność MCC, około 33%, przewyższa śmiertelność czerniaka3,4. MCPyV ma kolisty genom o wielkości ~5 kb1,5 podzielony przez niekodujący region regulatorowy (NCRR) na wczesne i późne regiony kodowania1. NCRR zawiera wirusowe pochodzenie replikacji (Ori) i dwukierunkowe promotory transkrypcji wirusa6,7. Wczesny region koduje białka antygenu nowotworowego zwane dużym T (LT), małym T (sT), 57kT, alternatywnym LT ORF (ALTO), a także autoregulacyjnym miRNA1,8,9,10. Późny region koduje białka kapsydu VP1 i VP211,12,13. LT i sT są najlepiej przebadanymi białkami MCPyV i wykazano, że wspierają replikację wirusowego DNA i nowotworzenie indukowane przez MCPyV5. Klonalna integracja DNA MCPyV z genomem gospodarza, którą zaobserwowano nawet w 80% MCC, jest prawdopodobnie czynnikiem sprawczym dla rozwoju nowotworu wirusowo-dodatniego14,15.

Częstość występowania MCC potroiła się w ciągu ostatnich dwudziestu lat16. Bezobjawowe zakażenie MCPyV jest również szeroko rozpowszechnione w populacji ogólnej17,18,19. Wraz z rosnącą liczbą diagnoz MCC i wysokim rozpowszechnieniem infekcji MCPyV istnieje potrzeba lepszego zrozumienia wirusa i jego potencjału onkogennego. Jednak wiele aspektów biologii MCPyV i mechanizmów onkogennych pozostaje słabo poznanych20. Dzieje się tak głównie dlatego, że MCPyV słabo replikuje się w ustalonych liniach komórkowych11,12,21,22,23 i do niedawna nie odkryto komórek skóry zdolnych do podtrzymywania infekcji MCPyV22. Badania mechanistyczne mające na celu pełne zbadanie MCPyV i jego interakcji z komórkami gospodarza były utrudnione przez brak systemu hodowli komórkowych do namnażania wirusa5.

Odkryliśmy, że pierwotne ludzkie fibroblasty skórne (HDF) wyizolowane z ludzkiego napletka noworodka wspierają silne zakażenie MCPyV zarówno in vitro, jak i ex vivo24. Na podstawie tego badania ustaliliśmy pierwszy model infekcji kulturą komórkową dla MCPyV24. Opierając się na tym systemie modelowym, wykazaliśmy, że indukcja genów metaloproteinazy macierzy (MMP) przez szlak sygnałowy WNT/β-kateniny i inne czynniki wzrostu stymuluje infekcję MCPyV. Co więcej, odkryliśmy, że zatwierdzony przez FDA antagonista MEK, trametynib, skutecznie hamuje infekcję MCPyV5,25. Na podstawie tych badań ustaliliśmy również zestaw protokołów do izolowania ludzkich fibroblastów skórnych24,25, przygotowując wiriony MCPyV11,12, przeprowadzając infekcję MCPyV na ludzkich fibroblastach skóry24,25 i wykrywając białka MCPyV przez barwienie IF26. Ponadto dostosowaliśmy technologię łańcuchowej reakcji hybrydyzacji DNA in situ (HCR)27, aby opracować wysoce czułą technikę FISH (HCR-DNA FISH) do wykrywania DNA MCPyV w zakażonych ludzkich komórkach skóry. Te nowe metody będą przydatne do badania cyklu zakaźnego MCPyV, a także odpowiedzi komórkowej na zakażenie MCPyV. Naturalne komórki rezerwuarowe gospodarza, które utrzymują infekcję MCPyV, oraz komórki, które powodują nowotwory MCC, pozostają nieznane. Techniki, które opisujemy w tym manuskrypcie, mogą być stosowane do badania różnych typów komórek ludzkich w celu identyfikacji zarówno komórek rezerwuarowych, jak i pochodzenia guzów MCC. Nasze sprawdzone metody, takie jak HCR-DNA FISH, mogą być również wykorzystane do wykrywania innych wirusów nowotworowych DNA i charakteryzowania interakcji między komórkami gospodarza.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ludzkie napletki noworodków uzyskano z Centrum Badań nad Chorobami Skóry w Penn. Dorosłe ludzkie fibroblasty uzyskano z odrzuconej normalnej skóry po operacji. Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Pensylwanii.

1. Izolacja ludzkich fibroblastów skórnych

  1. Użyj nożyczek, aby odciąć tłuszcz i tkankę podskórną z napletka ludzkiego noworodka i przeciąć próbkę skóry na połówki lub ćwiartki.
  2. Inkubować tkankę w 5 ml 10 mg/ml dypazy II w PBS uzupełnionym antybiotykiem przeciwgrzybiczym w temperaturze 4 °C przez noc.
  3. W sterylnym naczyniu o długości 10 cm ostrożnie oddziel naskórek od warstw skóry za pomocą kleszczy do mikrodysekcji.
  4. Przenieś powstałą tkankę skórną do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml kolagenazy typu IV o stężeniu 2 mg/ml w pożywce wolnej od FBS, uzupełnionej antybiotykiem przeciwgrzybiczym.
  5. Próbkę inkubować w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 4–6 godzin, okresowo wytrząsając, aż pozostanie tylko kilka makroskopowych agregatów tkankowych.
  6. Uwolnij pojedyncze komórki ze skóry właściwej, pipetując energicznie w górę i w dół (rozcierając) dziesięć razy za pomocą pipety o pojemności 10 ml.
  7. Wirować przy 180 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant.
  8. Umieść zdysocjowane komórki w pożywce DMEM uzupełnionej 10% płodową surowicą cielęcą, 1% aminokwasami endogennymi i 1% L-glutaminą w temperaturze 37 °C w 5% CO2 .

2. Rekombinowany preparat wirionu MCPyV

  1. Trawić 50 μg plazmidu pR17b (przenoszącego genom MCPyV) z 250 U BamHI-HF w objętości 200 μl (4 godziny w temperaturze 37 °C), aby oddzielić genom wirusa od szkieletu wektora (Rysunek 2).
  2. Dodać 1200 μl buforu PB (uzupełnionego 10 μl 3 M NaAc, pH 5,2) do strawionego DNA i oczyść za pomocą 2 miniprep kolumn wirowych (pojemność 20 μg DNA). Eluować wytrawiony plazmid pR17b z każdej kolumny za pomocą 200 μl buforu TE (10 mM Tris-HCl, pH8,0, 1 mM EDTA).
  3. Przygotować reakcję ligacji w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodać 400 μl oczyszczonego plazmidowego DNA z kroku 2.2, 8,6 ml 1,05x buforu ligazy T4 i 6 μl ligazy T4 o wysokim stężeniu. Inkubować w temperaturze 16 °C przez noc.
  4. Dodać 45 ml buforu PB (uzupełnionego 10 μl 3 M NaAc, pH 5,2) do ligacji i użyć kolektora próżniowego, aby załadować przez 2 kolumny wirowe miniprep. Eluować każdą kolumnę za pomocą 50 μl buforu TE. Spodziewaj się plonu około 30 μg DNA.
  5. Późnym popołudniem/wieczorem wysiewaj 6 x 106 293TT28 komórek do 10 cm naczynia zawierającego pożywkę DMEM uzupełnioną 10% płodową surowicą cielęcą, 1% aminokwasami endogennymi i 1% L-glutaminą bez higromycyny B.
  6. Następnego ranka upewnij się, że komórki są w około 50% zlewne. Transfekcja przy użyciu 66 μl odczynnika do transfekcji (1,1 μL/cm2), 12 μg ponownie zligowanego izolatu MCPyV DNA R17b z kroku 2.4, 8,4 μg plazmidu o ekspresji ST pMtB i 9,6 μg plazmidu o ekspresji LT pADL*29.
  7. Kiedy transfekowane komórki są prawie zlewające się, następnego dnia trypsynizuj komórki i przenieś je do 15-centymetrowego naczynia w celu dalszej ekspansji.
  8. Opcjonalnie należy pobrać niewielką liczbę komórek 293TT po rozprężeniu i przeprowadzić barwienie IF dla MCPyV LT (CM2B4) i VP1 (MCV VP1 rabbit30) w celu określenia wydajności transfekcji. Na tym etapie jądrowy sygnał LT może być widoczny, ale ekspresja VP1 prawdopodobnie nie będzie wykrywalna.
  9. Gdy 15-centymetrowa szalka stanie się prawie zlewająca (zwykle 5-6 dni po początkowej transfekcji), przenieś komórki do trzech 15-centymetrowych szalek. Zbierz komórki z 15-centymetrowych szalek, gdy staną się prawie zlewające się i postępuj zgodnie z poniższym protokołem zbierania wirusa.
    UWAGA: Opcjonalnie przeprowadź kontrolę jakości IF zgodnie z opisem w kroku 2.8. Na tym etapie większość komórek powinna być zarówno MCPyV LT, jak i VP1 dodatnia.
  10. Aby zebrać wirusa, trypsynizuj komórki, wiruj w temperaturze 180 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usuń supernatant. Dodać jedną objętość osadu komórkowego DPBS-Mg (DPBS z 9,5 mM MgCl2 i 1x antybiotyk-antybiotyk). Następnie dodać 25 mM siarczanu amonu (z 1 M roztworu podstawowego o pH 9), a następnie 0,5% Triton X-100 (z 10% roztworu podstawowego), 0,1% benzonazy i 0,1% DNazy zależnej od ATP. Dobrze wymieszać i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
  11. Inkubować mieszaninę przez 15 minut na lodzie, a następnie dodać 0,17 objętości 5M NaCl. Wymieszaj i inkubuj na lodzie przez kolejne 15 minut. Wirować przez 10 minut w temperaturze 12 000 x g w wirówce o temperaturze 4 °C. Jeśli supernatant nie jest przezroczysty, delikatnie odwróć probówkę i powtórz etap wirowania. Przenieść supernatant do nowej probówki.
  12. Zawiesić osad za pomocą jednej objętości DPBS uzupełnionej 0,8 M NaCl i ponownie odwirować, jak opisano w kroku 2.11.
  13. Połączyć supernatanty z kroku 2.11 i 2.12 i ponownie odwirować zgodnie z opisem w kroku 2.11.
  14. Wlewaj gradienty jodiksanolu do cienkościennych probówek poliamerowych o pojemności 5 ml, podkładając (27%, następnie 33%, a następnie 39%) w krokach ~0,7 ml za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w długą igłę lub pipetę p1000.
  15. Obciążyć 3 ml sklarowanego supernatantu zawierającego wirusa na przygotowany gradient jodiksanolu.
  16. Wirować przez 3,5 h przy 234 000 x g i temperaturze 16 °C w wirniku SW55ti. Ustaw przyspieszanie i zwalnianie na wolne.
  17. Po ultraodwirowaniu zebrać 12 frakcji w silikonowanych probówkach (każda frakcja to ~400 μL).
  18. Przeanalizuj frakcje pod kątem obecności wirusa za pomocą odczynnika dsDNA i/lub Western blot dla VP1 (MCV VP1 rabbit30). Połącz frakcje gradientu z pikową zawartością dsDNA i/lub VP1 i scharakteryzuj stado za pomocą ilościowego PCR, aby obliczyć ekwiwalent genomu wirusa31. Przechowywać zapas wirionu MCPyV w temperaturze -80 °C.

3. Infekcja

  1. Utrzymuj pierwotne ludzkie fibroblasty skóry w DMEM za pomocą 10% płodowej surowicy cielęcej, 1% aminokwasów endogennych i 1% L-glutaminy. Po osiągnięciu konfluencji rozłup fibroblasty 1:4 bez wirowania w dół.
    UWAGA: Aby uzyskać najwyższą skuteczność infekcji MCPyV, należy użyć pierwotnych fibroblastów między pasażami 5 i 12, które aktywnie dzielą się w czasie posiewu.
  2. Aby zainfekować ludzkie fibroblasty skóry, odessać pożywkę i przemyć komórki DPBS.
  3. Dodaj 1 ml 0,05% trypsyny-EDTA do naczynia i inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5-10 minut.
  4. Sprawdź pod mikroskopem, aby upewnić się, że komórki schodzą z naczynia.
  5. Dodać 10 ml pożywki DMEM/F12 zawierającej 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF i 3 μM CHIR99021, z których wszystkie stymulują infekcję MCPyV24, do naczynia i przenieść roztwór komórkowy do probówki o pojemności 15 ml.
  6. Wirować komórki w masie 180 x g przez 2 minuty i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w pożywce DMEM/F12 zawierającej 20 ng/ml EGF, 20 ng/ml bFGF i 3μM CHIR99021 przy 2-4 x 104 komórkach na ml.
  7. Wysiewać 200 μl zawiesiny komórkowej uzupełnionej 1 mg/ml kolagenazy typu IV do każdego dołka 96-dołkowej płytki. Rozmrozić wirion MCPyV na lodzie. Dodać 109 odpowiedników genomu wirusa wirionów MCPyV (obliczonych w kroku 2.18) na 1 μl jodiksanolu na każde 2500 do 5000 komórek, które mają być zakażone. Delikatnie postukaj w bok płytki i umieść ją w inkubatorze.
  8. Po inkubacji w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 48-72 h dodać 20% FBS do każdej studzienki.
  9. Pozostawić infekcję do postępu w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 72-96 godzin.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

  1. Napraw komórki otrzymane w kroku 3.9 za pomocą 3% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut.
  2. Umyj komórki dwukrotnie PBS.
  3. Inkubować komórki w buforze blokującym/permeabilizacyjnym (0,5% Triton X-100, 3% BSA w PBS przefiltrowanym przez filtr 0,22 μm) w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  4. Inkubować komórki z następującymi przeciwciałami pierwszorzędowymi: mysim monoklonalnym anty-MCPyV LT (CM2B4) (1:1000) i króliczym poliklonalnym przeciwciałem anty-MCPyV VP1 (1:2000), w RT przez 3 godziny.
  5. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
  6. Inkubować komórki z przeciwciałami drugorzędowymi: kozią anty-mysią IgG Fluor 594 (1:1000) i Fluor 488 kozią anty-króliczą IgG (1:500) w temperaturze RT przez 1 godzinę.
  7. Umyj komórki trzykrotnie PBS.
  8. Przeciwbarwić komórki 0,5 μg/ml DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenyloindol, Dichlorowodorek).
  9. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych i przeanalizuj za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

5. DNA in situ HCR

UWAGA: Ta technika wymaga, aby komórki były umieszczane na szkiełkach nakrywkowych. W tym celu opisane powyżej warunki infekcji (krok 3) można przeskalować do formatu płytki 24-dołkowej.

  1. Utrwalić komórki hodowane na szkiełkach nakrywkowych za pomocą 4% PFA w PBS przez 10 minut. Umyj szkiełka nakrywkowe dwukrotnie PBS, a następnie potraktuj je 70% etanolem, aby przepuszczalność komórek w temperaturze 4 °C przez noc.
    UWAGA: Utrwalone próbki mogą pozostawać w tym stanie przez kilka dni.
  2. Próbki należy wstępnie zhybrydyzować, zastępując etanol buforem do hybrydyzacji sondy i inkubując przez 60 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Rozcieńczyć sondę(-y) (1 μM) (tabela 1) w roztworze buforowym do hybrydyzacji sondy w rozcieńczeniu 1:500 na 30 minut przed zakończeniem etapu wstępnej hybrydyzacji i inkubować w temperaturze 45 °C.
  4. Pod koniec inkubacji odpipetować ~10 μl rozcieńczonej mieszanki sondy na szkiełko nakrywkowe na szkiełko mikroskopowe. Umieść szkiełka nakrywkowe, komórką do dołu, na odpowiednich kropelkach mieszanki sondy hybrydyzacyjnej. Uszczelnij krawędzie i grzbiety szkiełek nakrywkowych do szkiełek za pomocą dużej ilości cementu gumowego.
  5. Podgrzewać szkiełka z dodanymi sondami w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, ustawiając szkiełka na płaskiej stronie bloku grzewczego. Przenieść szkiełka do wilgotnej komory i inkubować w temperaturze 45 °C przez noc. Aby zrobić prostą nawilżoną komorę, lekko zwilż sterylne ręczniki papierowe o dH2O i umieść na dnie plastikowego pojemnika, który zamyka gumową uszczelką.
    UWAGA: Podczas podgrzewania cement gumowy może przez chwilę bulgotać. Upewnij się jednak, że plomba nie pęknie.
  6. Ostrożnie oderwij cement gumowy za pomocą kleszczy i umieść szkiełka nakrywkowe komórką do góry z powrotem w dołkach 24-dołkowej płytki. Umyj szkiełka nakrywkowe buforem do przemywania sondy w temperaturze RT trzy razy.
  7. Inkubować szkiełko nakrywkowe w buforze do amplifikacji (200 μl na płytkach 24-dołkowych) w temperaturze 30-60 minut RT.
  8. W międzyczasie wyżarzaj każdą z dwóch oznaczonych oligonukleotydowych spinek do włosów, rozpoznając sondy (Tabela 1) w oddzielnych probówkach PCR, podgrzewając do 94 °C przez 90 s i schładzając do RT przez 30 minut, chroniąc przed światłem. Wymieszać dwie spinki do włosów w buforze do amplifikacji, każda w rozcieńczeniu 1:50.
  9. Przygotować powierzchnię do reakcji amplifikacji, rozciągając film parafinowy na otwartej powierzchni pokrywy 24-dołkowej płytki. Odpipetować 50-100 μl kropelek mieszaniny spinki do włosów/buforu wzmacniającego na folię parafinową dla każdego szkiełka nakrywkowego. Użyj kleszczyków, aby ostrożnie usunąć szkiełka nakrywkowe z roztworu do wstępnego amplifikacji. Wysuszyć szkiełko nakrywkowe, dotykając krawędzi porowatą jednorazową chusteczką i położyć komórką do dołu na kropli amplifikacji.
  10. Umieść pokrywkę płytki przytrzymującą szkiełka nakrywkowe w wilgotnej komorze i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej w ciemności.
  11. Ponownie umieść szkiełka nakrywkowe w studzienkach. Próbki należy inkubować z 5x SSCT [5x chlorek sodu cytrynian sodu (SSC) 0,1% Tween 20 przefiltrowany przez filtr 0,22 μm] zawierający 0,5 μg/ml DAPI przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Przemyć próbki dwukrotnie za pomocą 5x SSCT w RT.
  12. Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych. Przeanalizuj komórki i zobrazuj próbki za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisany w tym manuskrypcie pozwolił na izolację prawie jednorodnej populacji HDF (Rysunek 1). Jak wykazano barwieniem immunofluorescencyjnym, prawie 100% ludzkich komórek skóry właściwej wyizolowanych przy użyciu warunków opisanych w tym protokole było pozytywnie wybarwionych na obecność markerów fibroblastów skórnych, wimentyny i kolagenu I24, ale ujemnych dla ludzkiego markera keratynocytów napletka K14 (Rycina 1)....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisane powyżej metody, w tym izolacja fibroblastów skóry z ludzkiej tkanki skórnej, przygotowanie rekombinowanych wirionów MCPyV, zakażenie hodowanych komórek, barwienie immunofluorescencyjne oraz czuła metoda FISH zaadaptowana z technologii HCR, która powinna umożliwić naukowcom analizę infekcji MCPyV27. Jednym z najważniejszych etapów prowadzących do zakażenia MCPyV in vitro jest produkcja preparatów wirionowych o wysokim mianie. Korzystając z opisanego tutaj protokołu otrzymywania rekombinowan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Meenhardowi Herlynowi (Wistar Institute) i Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) za dostarczenie odczynników i wsparcia technicznego. Dziękujemy również członkom naszych laboratoriów za pomocną dyskusję. Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 i R01CA142723), NCI Cancer Center Support Grant (NCI P30 CA016520) oraz nagrodę Penn CFAR (P30 AI 045008).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Surowica płodu cielęcegoHyCloneSH30071.03
MEM Roztwór aminokwasów endogennych, 100XThermo Fisher Scientific11140050
GLUTAMAX I, 100XThermo Fisher Scientific35050061L-Glutamina
DPBS, bez wapnia, bez magnezuThermo Fisher Scientific14190136
0,05% Trypsyna-EDTAThermo Fisher Scientific25300-054
DMEM/F12 mediumThermo Fisher Scientific11330-032
Rekombinowane ludzkie białko EGF, CFR& Systemy D236-EG-200Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza
CHIR99021Cayman Chemical13122Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza
CHIR99021SigmaSML1046Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza
Kolagenaza typu IVThermo Fisher Scientific17104019
Dispase IIRoche4942078001
Antybiotyk-AntybiotykThermo Fisher Scientific15240-062Chronić przed światłem
DMEM ThermoFisher Scientific11965084
Alexa Fluor 594 kozia anty-mysia IgGThermo Fisher ScientificA11032Chronić przed światłem
Alexa Fluor 488 koza anty-królik IgGThermo Fisher ScientificA11034Chronić przed światłem
OptiPrep Density Gradient MediumSigmaD1556Ochrona przed światłem
ParaformaldehydSigmaP6148
anty-MCPyV LT (CM2B4)Santa Cruzsc-136172Część # B2717
MCV VP1 królikKrólicza surowica poliklonalna #10965https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm
HygromycynaRoche10843555001
Podstawowe czynniki wzrostu fibroblastów (bFGF), ludzki rekombinowanyCorning354060Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza
Nukleaza benzonazowaSigmaE8263
Bezpieczna dla plazmidu DNaza zależna od ATP EPICENTREE3101K
Bufor hybrydyzacyjny sondyTechnologie
Bufor do płukania sondyTechnologiemolekularne
Bufor wzmacniającymolekularne
Spinki do włosów z oznaczeniem Alexa 594Technologie molekularneB4Ochrona przed światłem
Triton X-100SigmaX100
Quant-iT PicoGreen dsDNAOdczynnik Thermo Fisher ScientificP7581
BamHI-HFNEBR3136
Buffer PBQiagen19066
niebieska kolumna wirowa miniprepQiagen27104
50mL stożkowe probówki wirówkoweCorning352070
T4 ligazaNEBM0202T
MagicMark XPThermo Fisher ScientificLC5602
molekularne Technologie

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
  2. Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
  3. Lemos, B., Nghiem, P. Merkel cell carcinoma: more deaths but still no pathway to blame. Journal of Investigative Dermatology. 127 (9), 2100-2103 (2007).
  4. Agelli, M., Clegg, L. X. Epidemiology of primary Merkel cell carcinoma in the United States. Journal of the American Academy of Dermatology. 49 (5), 832-841 (2003).
  5. Liu, W., MacDonald, M., You, J. Merkel cell polyomavirus infection and Merkel cell carcinoma. Current Opinion in Virology. 20, 20-27 (2016).
  6. Harrison, C. J., et al. Asymmetric Assembly of Merkel Cell Polyomavirus Large T-Antigen Origin Binding Domains at the Viral Origin. Journal of Molecular Biology. 409 (4), 529-542 (2011).
  7. Kwun, H. J., et al. The Minimum Replication Origin of Merkel Cell Polyomavirus Has a Unique Large T-Antigen Loading Architecture and Requires Small T-Antigen Expression for Optimal Replication. Journal of Virology. 83 (23), 12118-12128 (2009).
  8. Carter, J. J., et al. Identification of an overprinting gene in Merkel cell polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (31), 12744-12749 (2013).
  9. Seo, G. J., Chen, C. J., Sullivan, C. S. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with the ability to autoregulate viral gene expression. Virology. 383 (2), 183-187 (2009).
  10. Theiss, J. M., et al. A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence. PLOS Pathogens. 11 (7), 1004974(2015).
  11. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Buck, C. B. Glycosaminoglycans and sialylated glycans sequentially facilitate Merkel cell polyomavirus infectious entry. PLOS Pathogens. 7 (7), 1002161(2011).
  12. Schowalter, R. M., Reinhold, W. C., Buck, C. B. Entry Tropism of BK and Merkel Cell Polyomaviruses in Cell Culture. PLoS One. 7 (7), 42181(2012).
  13. Schowalter, R. M., Buck, C. B. The Merkel cell polyomavirus minor capsid protein. PLOS Pathogens. 9 (8), 1003558(2013).
  14. Houben, R., Schrama, D., Becker, J. C. Molecular pathogenesis of Merkel cell carcinoma. Experimental Dermatology. 18 (3), 193-198 (2009).
  15. Chang, Y., Moore, P. S. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annual Review of Pathology. 7, 123-144 (2012).
  16. Hodgson, N. C. Merkel cell carcinoma: Changing incidence trends. Journal of Surgical Oncology. 89 (1), 1-4 (2005).
  17. Tolstov, Y. L., et al. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. International Journal of Cancer. 125 (6), 1250-1256 (2009).
  18. Schowalter, R. M., Pastrana, D. V., Pumphrey, K. A., Moyer, A. L., Buck, C. B. Merkel cell polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human skin. Cell Host & Microbe. 7 (6), 509-515 (2010).
  19. Foulongne, V., et al. Human Skin Microbiota: High Diversity of DNA Viruses Identified on the Human Skin by High Throughput Sequencing. PLoS One. 7 (6), 38499(2012).
  20. Hopcraft, S. E., Damania, B. Tumour viruses and innate immunity. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 372 (1732), (2017).
  21. Feng, H., et al. Cellular and viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One. 6 (7), 22468(2011).
  22. Neumann, F., et al. Gene Expression and Particle Production by a Consensus Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV) Genome. PLoS One. 6 (12), 29112(2011).
  23. Tsang, S. H., Wang, X., Li, J., Buck, C. B., You, J. Host DNA damage response factors localize to merkel cell polyomavirus DNA replication sites to support efficient viral DNA replication. Journal of Virology. 88 (6), 3285-3297 (2014).
  24. Liu, W., et al. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus Infection. Cell Host & Microbe. 19 (6), 775-787 (2016).
  25. Liu, W., Krump, N. A., MacDonald, M., You, J. Merkel Cell Polyomavirus Infection of Animal Dermal Fibroblasts. Journal of Virology. 92 (4), (2018).
  26. Liu, W., et al. BRD4 regulates Nanog expression in mouse embryonic stem cells and preimplantation embryos. Cell Death Differ. 21 (12), 1950-1960 (2014).
  27. Choi, H. M., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  28. Buck, C. B., Pastrana, D. V., Lowy, D. R., Schiller, J. T. Efficient intracellular assembly of papillomaviral vectors. Journal of Virology. 78 (2), 751-757 (2004).
  29. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/support.htm (2018).
  30. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm (2018).
  31. ccr.cancer.gov. , Available from: https://home.ccr.cancer.gov/lco/NativeMCVproduction.htm (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

ludzkie fibroblasty sk ryizolacja wirusabarwienie immunofluorescencyjnehybrydyzacja in situdetekcja wirusowego DNAmodel hodowli kom rkowejekspresja bia ka wirusowegomikroskopia fluorescencyjnast enie wirusa

Powiązane artykuły