Tutaj prezentujemy protokół infekowania pierwotnego ludzkiego fibroblastu skórnego MCPyV. Protokół obejmuje izolację fibroblastów skóry, przygotowanie wirionów MCPyV, zakażenie wirusem, barwienie immunofluorescencyjne i fluorescencyjną hybrydyzację in situ. Protokół ten można rozszerzyć w celu scharakteryzowania interakcji MCPyV-gospodarz i odkrycia innych typów komórek zakażonych przez MCPyV.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Zakażenie i wykrywanie poliomawirusa Merkla
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zakażenie poliomawirusem z komórek Merkla (MCPyV) może prowadzić do raka z komórek Merkla (MCC), wysoce agresywnej formy raka skóry. Badania mechanistyczne mające na celu pełne zbadanie biologii molekularnej MCPyV i mechanizmów onkogennych były utrudnione przez brak odpowiednich modeli hodowli komórkowych. W tym miejscu opisujemy zestaw protokołów do przeprowadzania i wykrywania infekcji MCPyV pierwotnych ludzkich komórek skóry. Protokoły opisują izolację ludzkich fibroblastów skóry, przygotowanie rekombinowanych wirionów MCPyV oraz wykrywanie infekcji wirusowej zarówno za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego (IF), jak i reakcji łańcuchowej hybrydyzacji DNA in situ (HCR), która jest bardzo czułym podejściem do hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ (FISH). Zawarte w nich protokoły mogą być adaptowane przez zainteresowanych badaczy w celu zidentyfikowania innych typów komórek lub linii komórkowych, które wspierają infekcję MCPyV. Opisane podejście opracowane w ramach projektu FISH można również zaadaptować do wykrywania niskich poziomów wirusowego DNA obecnego w zakażonej skórze ludzkiej.
Wprowadzenie
Poliomawirus z komórek Merkla (MCPyV) to mały, dwuniciowy wirus DNA, który jest związany z rzadkim, ale agresywnym rakiem skóry, rakiem z komórek Merkla (MCC)1,2. Śmiertelność MCC, około 33%, przewyższa śmiertelność czerniaka3,4. MCPyV ma kolisty genom o wielkości ~5 kb1,5 podzielony przez niekodujący region regulatorowy (NCRR) na wczesne i późne regiony kodowania1. NCRR zawiera wirusowe pochodzenie replikacji (Ori) i dwukierunkowe promotory transkrypcji wirusa
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Ludzkie napletki noworodków uzyskano z Centrum Badań nad Chorobami Skóry w Penn. Dorosłe ludzkie fibroblasty uzyskano z odrzuconej normalnej skóry po operacji. Wszystkie protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Pensylwanii.
1. Izolacja ludzkich fibroblastów skórnych
- Użyj nożyczek, aby odciąć tłuszcz i tkankę podskórną z napletka ludzkiego noworodka i przeciąć próbkę skóry na połówki lub ćwiartki.
- Inkubować tkankę w 5 ml 10 mg/ml dypazy II w PBS uzupełnionym antybiotykiem przeciwgrzybiczym w temperaturze 4 °C przez noc.
- W sterylnym naczyniu o długości 10 cm ostrożnie ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Protokół opisany w niniejszym manuskrypcie pozwolił na izolację niemal jednorodnej populacji HDF (Rysunek 1). Jak wykazano w barwieniu immunofluorescencyjnym, niemal 100% ludzkich komórek skóry właściwej wyizolowanych zgodnie z warunkami opisanymi w niniejszym protokole wykazalo pozytywne barwienie na markery fibroblastów skóry właściwej: wimentynę oraz kolagen I.24, lecz wykazują brak ekspresji markera keratynocytów przesłonki prącia .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisane powyżej metody, w tym izolacja fibroblastów skóry z ludzkiej tkanki skórnej, przygotowanie rekombinowanych wirionów MCPyV, zakażenie hodowanych komórek, barwienie immunofluorescencyjne oraz czuła metoda FISH zaadaptowana z technologii HCR, która powinna umożliwić naukowcom analizę infekcji MCPyV27. Jednym z najważniejszych etapów prowadzących do zakażenia MCPyV in vitro jest produkcja preparatów wirionowych o wysokim mianie. Korzystając z opisanego tutaj protokołu otrzymywania rekombinowan.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Dr. Meenhardowi Herlynowi (Wistar Institute) i Dr. M. Celeste Simon (University of Pennsylvania) za dostarczenie odczynników i wsparcia technicznego. Dziękujemy również członkom naszych laboratoriów za pomocną dyskusję. Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health (NIH) (R01CA187718, R01CA148768 i R01CA142723), NCI Cancer Center Support Grant (NCI P30 CA016520) oraz nagrodę Penn CFAR (P30 AI 045008).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Surowica płodu cielęcego | HyClone | SH30071.03 | |
| MEM Roztwór aminokwasów endogennych, 100X | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| GLUTAMAX I, 100X | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | L-Glutamina |
| DPBS, bez wapnia, bez magnezu | Thermo Fisher Scientific | 14190136 | |
| 0,05% Trypsyna-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11330-032 | |
| Rekombinowane ludzkie białko EGF, CF | R& Systemy D | 236-EG-200 | Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza |
| CHIR99021 | Sigma | SML1046 | Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza |
| Kolagenaza typu IV | Thermo Fisher Scientific | 17104019 | |
| Dispase II | Roche | 4942078001 | |
| Antybiotyk-Antybiotyk | Thermo Fisher Scientific | 15240-062 | Chronić przed światłem |
| DMEM Thermo | Fisher Scientific | 11965084 | |
| Alexa Fluor 594 kozia anty-mysia IgG | Thermo Fisher Scientific | A11032 | Chronić przed światłem |
| Alexa Fluor 488 koza anty-królik IgG | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Chronić przed światłem |
| OptiPrep Density Gradient Medium | Sigma | D1556 | Ochrona przed światłem |
| Paraformaldehyd | Sigma | P6148 | |
| anty-MCPyV LT (CM2B4) | Santa Cruz | sc-136172 | Część # B2717 |
| MCV VP1 królik | Królicza surowica poliklonalna #10965 | https://home.ccr.cancer.gov/lco/BuckLabAntibodies.htm | |
| Hygromycyna | Roche | 10843555001 | |
| Podstawowe czynniki wzrostu fibroblastów (bFGF), ludzki rekombinowany | Corning | 354060 | Przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza |
| Nukleaza benzonazowa | Sigma | E8263 | |
| Bezpieczna dla plazmidu DNaza zależna od ATP EPICENTRE | E3101K | ||
| Bufor hybrydyzacyjny sondy | Technologie | ||
| Bufor do płukania sondy | Technologie | molekularne | |
| Bufor wzmacniający | molekularne | ||
| Spinki do włosów z oznaczeniem Alexa 594 | Technologie molekularne | B4 | Ochrona przed światłem |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Quant-iT PicoGreen dsDNA | Odczynnik Thermo Fisher Scientific | P7581 | |
| BamHI-HF | NEB | R3136 | |
| Buffer PB | Qiagen | 19066 | |
| niebieska kolumna wirowa miniprep | Qiagen | 27104 | |
| 50mL stożkowe probówki wirówkowe | Corning | 352070 | |
| T4 ligaza | NEB | M0202T | |
| MagicMark XP | Thermo Fisher Scientific | LC5602 |
Bibliografia
- Gjoerup, O., Chang, Y. Advances in Cancer Research. Vande Woude, G., Klein, G. 106, Academic Press. 1-51 (2010).
- Feng, H., Shuda, M., Chang, Y., Moore, P. S. Clonal integration of a polyomavirus in human Merkel cell carcinoma. Science. 319, 1096-1100 (2008).
- Lemos, B., Nghiem, P.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
