W tym protokole pokazujemy, jak hodować dorosłe osobniki Astyanax mexicanus, hodować larwy i przeprowadzać immunohistochemię na rybach po larwie, aby porównać fenotypy morfotypów powierzchniowych i jaskiniowych.
Artykuł metodologiczny
Hodowla meksykańskiego Tetra Astyanax mexicanus w celu analizy fenotypów postlarwalnych i immunohistochemii całego wierzchowca
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Populacje Astyanax mexicanus przystosowane do życia w rzekach i jaskiniach wykazują różnice w morfologii, fizjologii i zachowaniu. Badania skoncentrowane na porównaniu dorosłych form ujawniły genetyczne podstawy niektórych z tych różnic. Mniej wiadomo o tym, jak populacje różnią się w stadiach larwalnych (na początku żerowania). Takie badania mogą dostarczyć informacji na temat tego, w jaki sposób ryby jaskiniowe przeżywają w dorosłym życiu w swoim naturalnym środowisku. Metody porównywania rozwoju po larwach w laboratorium wymagają ustandaryzowanych reżimów akwakultury i żywienia. Tutaj opisujemy, jak hodować ryby na diecie bogatego w składniki odżywcze wrotka w wodzie bez recyrkulacji przez okres do dwóch tygodni po zapłodnieniu. Pokazujemy, jak zbierać ryby po larwach z tego systemu szkółkarskiego i przeprowadzać barwienie immunologiczne całej góry. Barwienie immunologiczne jest atrakcyjną alternatywą dla analizy ekspresji transgenu w celu zbadania rozwoju i funkcji genów u A. mexicanus. Metoda szkółkarska może być również stosowana jako standardowy protokół do ustalania populacji dopasowanych do zagęszczenia w celu wzrostu do postaci dorosłych.
Wprowadzenie
Meksykańska tetra, Astyanax mexicanus, to pojedynczy gatunek ryb, który istnieje jako populacje żyjące w rzekach (ryby powierzchniowe) i wiele populacji żyjących w jaskiniach (ryby jaskiniowe) nazwanych od jaskiń, które zamieszkują (np. Tinaja, Molino, Pachón). Coraz więcej badaczy wykorzystuje A. mexicanus do badania genetycznych i rozwojowych podstaw behawioralnych1,2,3,4, metabolic5,6,7,8, oraz ewolucja morfologiczna9, 10,11. Dostępne zasoby do badań nad A. mexicanus obejmują sekwencjonowany i opisany genome12; transkryptom13; tabela etapowa rozwoju14; i metody hodowli15,16,17, tworzenie transgenics18, oraz edycja genów19. Rozpowszechnienie dodatkowych narzędzi i zaktualizowanych standardowych protokołów przyspieszy rozwój społeczności badawczej zajmującej się rybami jaskiniowymi (zobacz tę metodę collection20).
Naszym celem jest dodanie do istniejącego repertuaru narzędzi poprzez dostarczenie solidnej metody oceny aktywności genów in situ u post-larwalnego A. mexicanus, w sposób porównywalny między laboratoriami. Osiągnięcie tego celu wiąże się z dwoma wyzwaniami. Po pierwsze, istnieje potrzeba wprowadzenia ustandaryzowanych reżimów wylęgu i hodowli ryb między laboratoriami, ponieważ różnice w parametrach, takich jak karmienie i gęstość, wpływają na wzrost i dojrzewanie, wpływając w ten sposób na aktywność genów. Po drugie, istnieje zapotrzebowanie na znormalizowaną, ale elastyczną metodę badania wzorców aktywności genów u ryb po larwalach. Zajmujemy się tymi kwestiami tutaj, ustanawiając standardowe praktyki hodowli ryb do stadiów larwalnych i wprowadzając solidny protokół immunohistochemiczny całej góry (IHC) do oceny ekspresji genów u A. mexicanus.
Najpierw pokazujemy, jak hodować ryby poprzez naturalne tarło i rozpoznawać zapłodnione jaja. Następnie opisano, jak wykluwać zapłodnione jaja (larwy) i przenosić je do pojemników szkółkowych, gdzie są utrzymywane w gęstości 20 ryb na pojemnik przez dwa tygodnie bez recyrkulacji lub wymiany wody. Po 5 dniach od zapłodnienia ryby rozwinęły się do stadium polarwalnego (nie mają już zapasu żółtka) i są karmione glonami Brachionus plicatilis (wrotki) jako bogate w składniki odżywcze źródło pożywienia, które nie wymaga codziennego uzupełniania. Metoda ta zapewnia spójne parametry wzrostu dla rozwoju larwalnego i postlarwalnego.
Aby ocenić funkcję genu, pokazujemy, jak usunąć ryby z pojemników w szkółce i wykonać całościowe IHC. Przedstawiona metoda IHC została zaadaptowana z protokołów opracowanych do użytku z Danio rerio21 i jest skuteczna w badaniu antygenów we wszystkich badanych tkankach A. mexicanus, w tym w mózgu, jelicie i trzustce. IHC jest szybszą alternatywą dla generowania zwierząt transgenicznych do badania ekspresji genów i lokalizacji białek. Protokół ten będzie przydatny w badaniach mających na celu hodowlę A. mexicanus i porównanie fenotypów ryb powierzchniowych i jaskiniowych w stadiach larwalnych.
Protokół
Procedury opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Harvard Medical School.
1. Hodowla
UWAGA: Istnieje kilka opublikowanych metod hodowli15,16,17,20, które również mogą być użyte na tym etapie. Przed hodowlą dorosłe ryby są utrzymywane w cyklu 10:14 światło: ciemność w temperaturze 23 °C i karmione dietą granulowaną (patrz Tabela Materiałów) raz dziennie. Ryby mogą być hodowane w systemie recyrkulacyjnym z filtracją mechaniczną i sterylizacją UV. Hodowlę można również przeprowadzić w zbiornikach statycznych (bez recyrkulacji), ale ryb nie należy pozostawiać w zbiorniku statycznym na dłużej niż 3 dni, ponieważ jakość wody szybko się pogarsza.
- Napełnij zbiornik o pojemności 5 galonów wodą gotową dla ryb (odchlorowana woda dostosowana do: pH = 7,1 +/- 2, przewodność = 900 +/- 150 μS, temperatura = 23 °C).
- Umieść plastikową siatkę (patrz Materiały) na dnie zbiornika. W przypadku hodowli w zbiornikach statycznych należy przymocować podgrzewacz wody z boku zbiornika. W przypadku hodowli w systemie recyrkulacyjnym należy umieścić podgrzewacz wody w misce systemowej.
UWAGA: Plastikowa siatka zapobiega spożywaniu jaj przez osoby dorosłe. - Umieść jedną samicę i dwa samce ryb A. mexicanus w wieku powyżej 1 roku życia w zbiorniku. Pozwól rybom zaaklimatyzować się przez 30 minut.
- Ustaw temperaturę grzałki na 24 °C (lub o 1 °C wyższą niż temperatura początkowa).
- Po 24 godzinach zwiększyć temperaturę o 1 °C.
- Po 24 godzinach zwiększ temperaturę o 1 °C. Codziennie sprawdzaj zbiorniki pod kątem jaj, świecąc latarką na dno zbiornika. Wstrzymaj ryby z jedzeniem w tym 3-dniowym okresie.
- Jeśli tarło nie zostało wywołane po 3 dniach, wyłącz grzałkę i pozwól, aby woda powróciła do temperatury pokojowej (RT) przed przeniesieniem ryb do ich pierwotnego zbiornika.
2. Wylęganie zapłodnionych jaj
- Po zidentyfikowaniu jaj w zbiorniku hodowlanym usuń dorosłe osobniki i plastikową siatkę, a następnie zmniejsz ilość wody do głębokości 10 cm za pomocą zlewki lub kubka.
UWAGA: Aby oszacować czas tarła, użyj pipety transferowej, aby umieścić kilka jaj na szalce Petriego i obejrzyj je za pomocą mikroskopu stereoskopowego, aby określić etap14 i oszacować czas zapłodnienia. - Przenieś zbiornik na wygodną powierzchnię roboczą i usuń wszelkie nieprzezroczyste jaja lub kał, pozostawiając w zbiorniku tylko półprzezroczyste, płodne jaja.
UWAGA: W tym czasie można zarejestrować liczbę płodnych jaj. - Napełnij zbiornik wodą gotową dla ryb (patrz krok 1.1) i dodaj 6-7 kropli błękitu metylenowego do zbiornika, gdy woda się napełni.
UWAGA: Końcowe stężenie błękitu metylenowego wynosi około 1,5 ppm. - Dodaj grzałkę i bełkotkę akwariową (dołączoną do pompy powietrza, z regulatorem) do zbiornika.
- Ustaw grzałkę na 24 °C i wyreguluj regulator strumienia powietrza, aby wytwarzał delikatny strumień pęcherzyków.
- Umieść pokrywę na zbiorniku, aby utrzymać temperaturę wody.
UWAGA: Jaja powinny zacząć wykluwać się w ciągu 24 godzin od tarła.
3. Przenoszenie wyklutych larw do pojemników szkółkarskich
- Dodać 20 g soli (patrz Materiały) do 8 l wody gotowej do spożycia ryb (patrz krok 1.1) i mieszać aż do rozpuszczenia. Napełnij każdy pojemnik przedszkolny o pojemności 1,5 l (patrz Materiały) 1 litrem przygotowanej wody.
- Za pomocą pipety transferowej przenieś wyklute larwy do przygotowanych pojemników szkółkarskich o gęstości 20 ryb w pojemniku.
UWAGA: Latarka czołowa może być przydatna do zlokalizowania i przeniesienia wyklutych larw. - Po usunięciu wszystkich widocznych wyklutych larw, należy zamieszać wodę w zbiorniku, mieszając i/lub wdmuchując strumienie wody w krawędzie i rogi zbiornika za pomocą pipety.
UWAGA: Pomoże to ujawnić larwy, które zostały pominięte przy pierwszym przejściu. - Na tym etapie należy usunąć niewykorzystane larwy, postępując zgodnie z wytycznymi Urzędu ds. Dobrostanu Laboratoriów (OLAW). Dodaj podchloryn sodu do zbiornika, aby osiągnąć końcowe stężenie 6,15%. Odczekaj co najmniej 5 minut przed wylaniem do zlewu.
- Oznacz każdy pojemnik szkółkarski datą i godziną nawożenia. Codziennie przeglądaj pojemniki szkółkarskie i kontynuuj usuwanie martwych larw.
4. Przygotowanie pokarmu dla ryb na bazie rotifera
- Zobacz Spis materiałów, aby uzyskać informacje na temat pozyskiwania wrotków. Postępuj zgodnie z opisanym protokołem, aby zainstalować, konserwować i zbierać wrotki22.
- Przygotuj pokarm dla ryb, dodając 3 ml mieszanki glonów (patrz tabela materiałów) do 1 litra zebranych wrotków. Ta mieszanka zostanie dodana bezpośrednio do pojemników szkółkarskich jako zapas żywności.
5. Karmienie ryb po larwach
- Gdy ryby są 5 dni po zapłodnieniu (dpf), dodaj 3 ml pokarmu dla ryb (przygotowanego w kroku 4.2) do każdego pojemnika w odchowalni. Przy optymalnym zagęszczeniu wrotki powinny być widoczne w gęstych grupach w rogach pojemników szkółkarskich i mniej widoczne w środku pojemnika. Dodaj dodatkową mieszankę wrotka, aż do osiągnięcia odpowiedniej gęstości.
- Codziennie sprawdzaj pojemniki pod kątem obecności wrotków i dodawaj więcej, jeśli stężenie się wyczerpie. Kontynuuj usuwanie martwych larw.
- Gdy ryby osiągną 14 dpf, przenieś je do zbiornika wyposażonego w system recyrkulacyjny o gęstości 5 ryb/l wody.
UWAGA: W tym czasie można zarejestrować liczbę żyjących ryb po larwalach.
6. Immunohistochemia całego wierzchowca ryb po larwach
- Usunąć ryby po larwach w pożądanym stadium z pokarmu na 24 godziny, przelewając pojemnik podchowalniczy zawierający ryby przez sitko z nylonowej siatki i umieszczając sitko w pojemniku z czystą wodą gotową do spożycia dla ryb (patrz krok 1.1).
UWAGA: Konieczne jest usunięcie całego jedzenia. Nawet niewielkie ilości pokarmu w jelitach są autofluorescencyjne i wpływają na obrazowanie. - Zbierz i poddaj rybę eutanazji.
UWAGA: Protokół eutanazji powinien być zgodny z wytycznymi OLAW i zostać zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Ich Wykorzystania. Zauważyliśmy, że sama trikaina nie powoduje eutanazji ryb po larwie, a ryby zaczynają się poruszać po przeniesieniu z tricainy na utrwalacz, jeśli ryby nie są również trzymane na lodzie.- Przygotować roztwór trikainy w zlewce, dodając 0,4 g tricainy-S i 0,8 g wodorowęglanu sodu do 1 l wody dejonizowanej i umieścić go na lodzie.
- Wlej wodę zawierającą rybę przez sitko z nylonowej siatki, aby zebrać rybę. Delikatnie zanurz sitko w lodowatym roztworze trikainy i pozostaw na lodzie na 10 minut.
- Napraw uśpioną rybę.
- Użyj pipety transferowej z naciętą końcówką, aby przenieść rybę do stożkowej rurki.
- Usunąć roztwór trikainy za pomocą pipety transferowej i zastąpić utrwalaczem. Inkubuj z kołysaniem.
UWAGA: Czas utrwalania i utrwalania należy określić na podstawie zastosowanego przeciwciała. 10% roztwór formaliny (4% formaldehydu, patrz materiały) przez noc w temperaturze 4 °C jest odpowiedni dla przeciwciał wymienionych w Tabeli Materiałów.
UWAGA: Formalina jest toksyczna i łatwopalna. Nosić środki ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny i gogle przeciwbryzgowe) i obsługiwać w kapturze chemicznym. Roztwory zawierające formalinę należy usunąć jako odpady niebezpieczne. - Użyj pipety transferowej, aby ostrożnie usunąć utrwalacz, nie przeszkadzając rybom. Dodać 3 ml buforowanego fosforanem roztworu soli fizjologicznej i trytonu [PBS z 0,1% Trytonem (PBST), patrz Materiały] i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej z kołysaniem.
- Usunąć PBST i zastąpić świeżym PBST i inkubować przez 15 minut. Powtórzyć to "mycie" jeszcze raz.
UWAGA: Ryby można przechowywać w PBS zawierającym 0,02% azydku sodu w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.
- Wykonaj barwienie immunologiczne całego wierzchowca.
- Przygotować 50 ml roztworu blokującego [PB-0,5% Triton X, 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 1% dimetylosulfotlenku (DMSO), 0,02% azydku sodu, 5% surowicy osła].
UWAGA: Azydek sodu i DMSO są toksyczne. Podczas obsługi należy używać środków ochrony osobistej (rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary przeciwbryzgowe). Wszelkie roztwory należy utylizować jako odpady niebezpieczne. - Za pomocą pipety transferowej przenieś rybę do szklanej fiolki o pojemności 4 ml z zakrętką. Użyj pipety transferowej, aby usunąć PBST i dodać 3 ml roztworu blokującego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z kołysaniem.
- Za pomocą pipety transferowej usunąć roztwór blokujący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym. Inkubować przez noc w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
UWAGA: Na przykład dodać rozcieńczenie 1:250 mysiego przeciwciała monoklonalnego anty-HuC/HuD Neuronal Protein (patrz Tabela materiałów, aby uzyskać listę przeciwciał, które zostały z powodzeniem zastosowane u A. mexicanus). Na tym etapie należy dołączyć zestaw ryb bez dodatku przeciwciał pierwszorzędowych. Objętość przeciwciał powinna być wystarczająca, aby pokryć rybę i pozwolić na pobudzenie. - Umyj rybę 3 razy PBST, jak opisano w kroku 6.3.4. Zastąp PBST przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w roztworze blokującym i inkubuj przez noc w temperaturze pokojowej z mieszaniem.
UWAGA: Dla każdego przeciwciała należy określić optymalne stężenia przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych, czas inkubacji i temperaturę inkubacji. Noc w RT była skuteczna dla przeciwciał wymienionych w Tabeli Materiałów. - Umyć rybę 3 razy za pomocą PBST, przy czym każde płukanie trwa 15 minut, jak opisano w kroku 6.3.4.
- Przenieś rybę do PBS w celu krótkotrwałego przechowywania przed przystąpieniem do sekcji, montażu lub podziału ryby.
- Przygotować 50 ml roztworu blokującego [PB-0,5% Triton X, 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 1% dimetylosulfotlenku (DMSO), 0,02% azydku sodu, 5% surowicy osła].
Wyniki
Tabela 1 przedstawia wyniki hodowli ryb powierzchniowych oraz ryb jaskiniowych z populacji Tinaja, Molino i Pachón w statycznych zbiornikach hodowlanych w ciągu jednego roku. Tarło ryb powierzchniowych i Pachón z zapłodnionymi embrionami zawsze prowadziło do wyklucia larw, podczas gdy w przypadku ryb Molino i Tinaja zdarzały się niepowodzenia (odpowiednio 2/6 i 2/18 zdarzeń tarłowych nie zakończyło się wykluciem larw). Występuje zmienność w wielkości clutches, która nie wydaje się być związana z wiekiem ryb rodzicielskich. Tabela 2 przedstawia całkowitą liczbę wyklutych larw z wybranych zdarzeń tarłowych oraz wiek ryb rodzicielskich. Ogólnie stwierdzono, że ryby powierzchniowe produkują największą liczbę larw na tarło (średnio 1,550 ± 894, n = 5), a następnie ryby Pachón (średnio 879 ± 680, n = 6), Tinaja (średnio 570 ± 373, n = 11) i Molino (średnio 386 ± 276, n = 3). Liczba produkowanych larw jest zazwyczaj większa niż ta wymagana do jednego eksperymentu lub do wzrostu do wieku dorosłego. Zazwyczaj przygotowujemy 6-18 pojemników odchowujących (120-360 larw), a pozostałe ryby są uśmiercane.
Aby ocenić skuteczność protokołu hodowli w wylęgarni, odnotowano liczbę wyklutych larw oraz przeżywalność ryb w stadium polarwalnym z udanych tarł. Tabela 3 przedstawia dane z jednego miesiąca hodowli w zbiornikach recyrkulacyjnych i zawiera liczbę larw przeniesionych do pojemników wylęgarni, które przeżyły do 14 dpf. W tym miesiącu wskaźnik przeżywalności wynosił od 41-81%, co przełożyło się na 65-293 ryby na populację dostępnych do eksperymentów lub hodowli do wieku dorosłego.
Aby sprawdzić, czy immunobarwienie całego preparatu przebiegło pomyślnie, porównano fluorescencję próbek inkubowanych z przeciwciałem pierwszorzędowym z próbkami inkubowanymi wyłącznie z przeciwciałem drugorzędowym. Sygnał fluorescencyjny jest widoczny tylko u ryb inkubowanych z przeciwciałem pierwszorzędowym. Protokół ten został przez nas pomyślnie zastosowany do znakowania neuronów10 (Rycina 1) oraz komórek trzustki6 w stadiach do 12,5 dpf zarówno w morfotypach powierzchniowych, jak i jaskiniowych.
Rycina 1: Oznakowanie neuronów. Immunobarwienie całych organizmów A. mexicanus. Obraz ryby powierzchniowej w 12,5 dpf (a) oraz ryby jaskiniowej Pachón (b). Obraz regionu środkowego ciała [żółty obszar kreskowany pokazany na (a) i (b)] ryby powierzchniowej (c) oraz ryby jaskiniowej Pachón (d) zabarwionych przeciwciałem pan-neuronalnym (Hu). (e) Obraz konfokalny fragmentu jelita ryby powierzchniowej przedstawiający neurony jelitowe (Hu) i ich projekcje (acetylowana tubulina). Do wykonania tego obrazu jelito zostało wypreparowane i zamontowane w medium zawierającym DAPI w celu zabarwienia jąder. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| populacja | próby | zdarzenia tarła | sprzęgła |
| powierzchnia | 94 | 23 | 23 |
| Molino | 110 | 6 | 4 |
| Pachón | 167 | 13 | 13 |
| Tinaja | 242 | 18 | 16 |
Tabela 1: Podsumowanie danych z jednego roku hodowli A. mexicanus w zbiornikach statycznych. Liczba prób rozrodu, wynikające z nich zdarzenia tarłowe oraz liczba zdarzeń tarłowych, które doprowadziły do wyklucia larw.
| populacja | wiek rodziców | wyklute larwy |
| powierzchnia | 1 rok | 989 |
| powierzchnia | 1 rok | 1050 |
| powierzchnia | 3 lata | 2214 |
| powierzchnia | 3 lata | 432 |
| powierzchnia | 3 lata | 1768 |
| powierzchnia | 4 lata | 2852 |
| Pachón | 1 rok | 1194 |
| Pachón | 1 rok | 1933 |
| Pachón | 1,5 roku | 371 |
| Pachón | 3 lata | 480 |
| Pachón | 4 lata | 1190 |
| Pachón | 4 lata | 110 |
| Tinaja | 9 miesięcy | 259 |
| Tinaja | 9 miesięcy | 253 |
| Tinaja | 10 miesięcy | 1100 |
| Tinaja | 11 miesięcy | 857 |
| Tinaja | 1 rok | 713 |
| Tinaja | 1 rok | 853 |
| Tinaja | 1 rok | 542 |
| Tinaja | 1,5 roku | 360 |
| Tinaja | 1,5 roku | 58 |
| Tinaja | 1,5 roku | 1100 |
| Tinaja | 4 lata | 185 |
| Molino | 2,5 roku | 460 |
| Molino | 2,5 roku | 619 |
| Molino | 3 lata | 81 |
Tabela 2: Przybliżony wiek samic oraz liczba wylęgłych larw z poszczególnych zdarzeń tarła w wybranych populacjach A. mexicanus.
| populacja | próby | zdarzenia tarła | sprzęgła | wielkość clutches (liczebność lęgu) | larwy przeniesione do kubków hodowlanych | ryby w stadium polarywnym w 14. dniu po zapłodnieniu (14dpf) | przeżywalność (%) |
| powierzchnia | 4 | 3 | 2 | 576 & 1728 | 360 | 174 | 48 |
| Molino | 4 | 2 | 1 | 228 | 159 | 65 | 41 |
| Tinaja | 4 | 1 | 1 | 1952 | 175 | 93 | 53 |
| Pachón | 4 | 1 | 1 | 1696 | 360 | 293 | 81 |
Tabela 3: Podsumowanie danych z jednego miesiąca hodowli A. mexicanus w systemie recyrkulacyjnym i wychowu larw.Liczba prób rozrodu, skuteczne zdarzenia tarłowe, clutches, z których wykluły się larwy, średnia liczba larw w jednym clutches, larwy przeniesione do pojemników wylęgarni oraz postlarwalne ryby obecne w pojemnikach wylęgarni po 14 dniach.
Dyskusja
Porównanie aktywności genów między powierzchniowym a jaskiniowym A. mexicanus wymaga starannie kontrolowanych parametrów środowiskowych i metod, które można powielić w różnych laboratoriach. Nasz protokół hodowli A. mexicanus zapewnia stałą zawartość składników odżywczych podczas rozwoju po larwalach. Zgodnie z tym reżimem żywienia, funkcja genów może być z pewnością porównywana między populacjami przy użyciu solidnego protokołu immunohistochemicznego, który prezentujemy. W tym miejscu omawiamy znaczenie tej metody, a także jej ograniczenia i przyszłe zastosowania.
Aby osiągnąć wzrost dopasowany do gęstości, odkryliśmy, że ryby po larwach mogą być hodowane bez recyrkulacji wody przez dwa tygodnie w pojemnikach o pojemności 1,5 litra na diecie składającej się z wrotków. Protokół ten może być również stosowany do hodowli ryb w systemie recyrkulacyjnym; Jednak wrotki muszą być dodawane codziennie, aby zrekompensować te utracone w wyniku odpływu ze zbiornika. Nowo wyklute nauplia artemii są powszechnie stosowane jako źródło pożywienia w akwakulturze, ale odkryliśmy, że stosowanie wrotków ma znaczące zalety, w tym: obniżoną cenę, lepszą bioasekurację, spójne odżywianie i lepszą jakość wody (patrz poniżej).
Po pierwsze, tygodniowy koszt materiałów eksploatacyjnych wynosi 4 dolary za wrotki, w porównaniu do 14 dolarów za Artemię. Jeśli chodzi o bioasekurację, wrotki są hodowane w laboratorium w kontrolowanych warunkach, podczas gdy artemia jest pozyskiwana ze środowiska naturalnego i podlega naturalnej zmienności zawartości drobnoustrojów lub patogenów23. Ponadto skład odżywczy nauplii artemii jest zdeterminowany środowiskowo, a zatem niespójny. Po wykluciu nauplii rozwijają się dzięki własnym zapasom energii; W miarę rozwoju szybko tracą wartość odżywczą i powinny być optymalnie podawane rybom w ciągu kilku godzin. Artemia rozpoczyna żerowanie w 12 domu po wykluciu, co stanowi pierwszy raz, kiedy mogą być wzbogacone w składniki odżywcze; Jednak na tym etapie stały się zbyt duże, aby można je było spożyć za pomocą 5 DPF ryb. Dla porównania, wrotki stale żywią się mikroalgami morskimi, co skutkuje wysoką zawartością składników odżywczych, niezależnie od tego, kiedy wrotki są zbierane. Wrotki są znacznie mniejsze niż nauplii Artmeia (160 vs 400 mikronów), co ułatwia rybom chwytanie i połykanie. Ryby powierzchniowe po larwach i ryby jaskiniowe zjadają wrotki w podobnych ilościach, co sugeruje brak różnicy w preferencjach lub zdolności do chwytania wrotków10.
W końcu naupliusa artemii zaczynają umierać w słodkiej wodzie kilka godzin po wprowadzeniu. Niezjedzone naupliusy ulegną rozkładowi, gwałtownie pogarszając jakość wody, jeśli nie zostaną usunięte ręcznie. Usuwanie martwej artemii jest czasochłonne i niebezpieczne dla ryb po larwie, które są niewiele większe od artemii i mogą zostać przypadkowo usunięte lub zranione. Wrotki mogą żyć w nieskończoność w pojemnikach szkółkarskich i przez cały czas dostarczać pokarm rybom bez znaczącego wpływu na jakość wody.
Podczas gdy używanie wrotków jako źródła pożywienia przynosi znaczne korzyści, aby utrzymać bulion wrotków, glony muszą być codziennie dodawane do systemu hodowli. Można to osiągnąć za pomocą automatycznego podajnika, który dozuje płynne glony do pojemnika na kultury wrotka (patrz tabela materiałów). Wrotki muszą być również zbierane z tego zestawu co 24-48 godzin, aby utrzymać zdrowie kultury. Naukowcy, którzy rozmnażają ryby bardzo rzadko (na przykład raz w roku) i nie są zainteresowani dokonywaniem porównań między populacjami w stadiach larwalnych, mogą preferować artemię jako źródło pożywienia, ponieważ otorbione zarodki mogą wykluć się w dowolnym momencie.
Zalecamy śledzenie liczby wyklutych i ocalałych larw w celu monitorowania powodzenia wylęgu i wzrostu. Jeśli większość zarodków lub larw umrze, może to być spowodowane zanieczyszczeniem bakteryjnym lub grzybiczym. Zaleca się monitorowanie jakości wody gotowej dla ryb i sterylizację wszelkich urządzeń za pomocą 70% etanolu. Pojemniki szkółkarskie mogą być ponownie użyte po ich oczyszczeniu i wysterylizowaniu. Aby zminimalizować ryzyko choroby, ważne jest również, aby usunąć martwe ryby z pojemników szkółkarskich i nie dodawać wrotków przed 5 dpf, kiedy ryby zaczynają jeść.
A. mexicanus osiągają dojrzałość płciową w wieku około jednego roku. Jest to ograniczenie w wytwarzaniu transgenicznego A. mexicanus w porównaniu z Danio rerio (danio pręgowany), które są w stanie rozmnażać się w wieku 10-12 tygodni24. Immunohistochemia (IHC) jest alternatywną metodą badania ekspresji genów i lokalizacji białek. Opisany tutaj protokół może być dostosowywany na każdym etapie i stosowany do wykrywania antygenów w dowolnej tkance będącej przedmiotem zainteresowania. Należy jednak zauważyć, że niektóre tkanki mogą być trudniejsze do uwidocznienia u ryb powierzchniowych ze względu na pigmentację (barierę, która nie istnieje u niepigmentowanych ryb jaskiniowych), co może wpływać na interpretację badań porównawczych. Aby rozwiązać ten potencjalny problem, powierzchniowy pigment ryb można wybielić po utrwaleniu przy użyciu 3% nadtlenku wodoru.
IHC wymaga skutecznego utrwalenia tkanki, blokowania i penetracji przeciwciał. Metody dla każdego z nich różnią się w zależności od interesującej tkanki i białka. Czas utrwalania i utrwalania musi zachować architekturę komórki przy jednoczesnym zachowaniu epitopu antygenu. W tym protokole używamy utrwalacza sieciującego (paraformaldehydu) i pomijamy utrwalacz denaturujący (taki jak metanol lub aceton). Odkryliśmy, że inkubacja w acetonie zmniejszyła sygnał przeciwciał dla markerów neuronalnych i trzustkowych. Etap blokowania jest niezbędny, aby zapobiec wiązaniu się przeciwciał z białkami niedocelowymi w tkance. W tej metodzie wykorzystuje się kombinację normalnej surowicy (5%) i BSA (0,2%) w roztworze blokującym. Roztwór blokujący zawiera przeciwciała i białka, które wiążą się z reaktywnymi miejscami na białkach w tkance, zmniejszając niespecyficzne wiązanie przeciwciał pierwszorzędowych i drugorzędowych.
Aby osiągnąć penetrację przeciwciał, tkanka musi być przepuszczalna. Można to osiągnąć za pomocą detergentów lub rozpuszczalników denaturujących, ale należy je zoptymalizować, aby zachować epitop antygenu. Nasz protokół wykorzystuje kombinację Tritonu i dimetylosulfotlenku (DMSO). Triton i DMSO są włączane do etapów blokowania i inkubacji przeciwciał w stężeniach odpowiednio 0,5% i 1%. Korzystając z tego stężenia, zaobserwowaliśmy barwienie w mózgu, trzustce, jelicie i mięśniach, co sugeruje, że jest ono prawdopodobnie skuteczne w penetracji wszystkich tkanek. Wielkość ryb może również wpływać na penetrację. Protokół ten nie był testowany na rybach w wieku dłuższym niż 14 dni (około 7 mm długości). Aby rozwiązać problem z barwieniem, zaleca się zmianę etapów utrwalania, blokowania i penetracji przeciwciał. Ważne jest również zbadanie zachowania sekwencji immunogenu z białkiem A. mexicanus będącym przedmiotem zainteresowania przy użyciu dostępnego genomu25.
A. mexicanus jest doskonałym modelem do badania ewolucji, ponieważ populacje tego samego gatunku, które ewoluowały w dramatycznie różnych środowiskach, mogą być bezpośrednio porównywane w laboratorium. Standardowe protokoły hodowlane, zarówno w laboratoriach, jak i między nimi, są niezbędne do zrozumienia różnic biologicznych między rybami powierzchniowymi a jaskiniowymi. W naszym artykule przedstawiono metodę badania rozwoju i aktywności genów u ryb po larwach narażonych na stałe parametry wzrostu.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty z National Institutes of Health [HD089934, DK108495].
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| niebieski metylenowy | przeciwgrzybiczy | Kordon | B016CBHZUS |
| Finnex | 4711457836017 | 100W Cyfrowy grzejnik sterujący | |
| airstone | Lee's Aquarium & Produkty dla zwierząt | 10838125202 | jednorazowa sól z kamienia powietrznego |
| Instant Ocean | 51378014021 | Sea Salt | |
| szkółkowy | IPC | 21545-002 | Przezroczyste pojemniki o pojemności 40 uncji lub 1,5 l Pipeta |
| transferowa | VWR | 414004-002 | Pipety z plastikową bańką |
| Zestaw startowy kompaktowego systemu hodowli (CCS) z wrotkami Brachionus plicatilis (typ L) | Marikultura trzciny | na | pokarm dla ryb |
| RGcomplete | APBreed | 817656016572 | 32 uncji butelka karmy dla wrotków |
| Programowalna automatyczna pompa dozująca DP-4 | Jebao | DP-4 | automatyczny podajnik do wrotków |
| Tricane-S | Western Chemical | MS 222 | znieczulenie |
| ryb wodorowęglan sodu | Sigma-Aldrich | S5761-500G | do siatki nylonowej w roztworze tricanu |
| sitko | HIC (Harold Import Co.) | 735343476235 | formaliny o średnicy 3 cali |
| , neutralnie buforowany, 10% | utrwalacz | Sigma-Aldrich | HT501128-4L |
| 10X PBS | Invitrogen | AM9625 | , rozcieńczony do 1X przy użyciu wody destylowanej |
| Triton-x 100 | Sigma-Aldrich | T8787-250ML | detergent |
| azydek sodu | Sigma-Aldrich | S2002-25G | antybakteryjny |
| albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich | A9647-100G | szklana fiolka z odczynnikiem blokującym |
| zakrętką 4 ml | Fiolka do barwienia | Wheaton | 224742 |
| plastikowa siatka siatkowa do zbiornika hodowlanego | Pentair | N1670 | Pokrój w prostokąt o 6 mm większy na wszystkich krawędziach niż wymiary dna zbiornika hodowlanego. Wytnij kwadrat o boku 6 mm z każdego rogu prostokąta. Zegnij krawędzie ekranu w dół wzdłuż wszystkich czterech krawędzi. Umieść parę magnesów dyskowych pokrytych winylem o grubości 6 mm po obu stronach (na górze i na dole) siatki w każdym rogu. Ekran powinien być jak najściślej przylegający do boków zbiornika. Sito można wyjąć ze zbiornika za pomocą metalowej siatki na ryby. |
| Magnesy dyskowe powlekane winylem | Kjmagnets | D84PC-AST | |
| New Life Spectrum Thera-A granulat pokarm dla ryb | New Life International | na | karmę dla ryb dla dorosłych. Lista sprzedawców tego produktu jest dostępna na stronie internetowej firmy |
| Przeciwciała | |||
| insulina przeciwciało od świnki morskiej | Dako | A0564 | 1:200 |
| przeciwciało glukagonu od owiec | Abcam | ab36215 | 1:200 |
| acetylowane przeciwciało tubuliny od myszy | Sigma | T6793 | 1:500 |
| przeciwciało HuD/HuC od mysz | Life Technologies | A-21271 | 1:500 |
| przeciwciało syntazy tlenku azotu (nNOS) od królika | Abcam | ab106417 | 5μ g/ml |
| acetylotransferazy choliny (ChAT) z królika | Abcam | ab178850 | 1:2000 |
| seratonina (5HT) z królika | Immunostar | 20080 | 1:500 |
Bibliografia
- Carlson, B. M., Klingler, I. B., Meyer, B. J., Gross, J. B. Genetic analysis reveals candidate genes for activity QTL in the blind Mexican tetra, Astyanax mexicanus. PeerJ. 6, e5189(2018).
- Chin, J. S. R., Gassant, C. E., et al. Convergence on reduced stress behavior in the Mexican blind cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 319-327 (2018).
- Lloyd, E., Olive, C., et al. Evolutionary shift towards lateral line dependent prey capture behavior in the blind Mexican cavefish. Developmental Biology. 441 (2), 328-337 (2018).
- Tabin, J. A., Aspiras, A., et al. Temperature preference of cave and surface populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 338-344 (2018).
- Xiong, S., Krishnan, J., Peuß, R., Rohner, N. Early adipogenesis contributes to excess fat accumulation in cave populations of Astyanax mexicanus. Developmental Biology. 441 (2), 297-304 (2018).
- Riddle, M. R., Aspiras, A. C., et al. Insulin resistance in cavefish as an adaptation to a nutrient-limited environment. Nature. 555 (7698), 647-651 (2018).
- Moran, D., Softley, R., Warrant, E. J. Eyeless Mexican cavefish save energy by eliminating the circadian rhythm in metabolism. PloS One. 9 (9), e107877(2014).
- Aspiras, A. C., Rohner, N., Martineau, B., Borowsky, R. L., Tabin, C. J. Melanocortin 4 receptor mutations contribute to the adaptation of cavefish to nutrient-poor conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (31), 9668-9673 (2015).
- Tang, J. L. Y., Guo, Y., et al. The developmental origin of heart size and shape differences in Astyanax mexicanus populations. Developmental Biology. 441 (2), 272-284 (2018).
- Riddle, M. R., Boesmans, W., Caballero, O., Kazwiny, Y., Tabin, C. J. Morphogenesis and motility of the Astyanax mexicanus gastrointestinal tract. Developmental Biology. 441 (2), 285-296 (2018).
- Gore, A. V., Tomins, K. A., et al. An epigenetic mechanism for cavefish eye degeneration. Nature Ecology & Evolution. 2 (7), 1155-1160 (2018).
- McGaugh, S. E., Gross, J. B., et al. The cavefish genome reveals candidate genes for eye loss. Nature Communications. 5, (2014).
- Gross, J. B., Furterer, A., Carlson, B. M., Stahl, B. A. An Integrated Transcriptome-Wide Analysis of Cave and Surface Dwelling Astyanax mexicanus. PLoS One. 8 (2), e55659(2013).
- Hinaux, H., Pottin, K., et al. A Developmental Staging Table for Astyanax mexicanus Surface Fish and Pachón Cavefish. Zebrafish. 8 (4), 155-165 (2011).
- Borowsky, R. Breeding Astyanax mexicanus through natural spawning. Cold Spring Harbor Protocols. 3 (11), (2008).
- Borowsky, B. R. Handling Astyanax mexicanus Eggs and Fry. CSH Protocols. , (2008).
- Stahl, B. A., Gross, J. B. A Comparative Transcriptomic Analysis of Development in Two Astyanax Cavefish Populations. Journal of Experimental Zoology Part B: Molecular and Developmental Evolution. 328 (6), 515-532 (2017).
- Elipot, Y., Legendre, L., Père, S., Sohm, F., Rétaux, S. Astyanax Transgenesis and Husbandry. How Cavefish Enters the Laboratory. Zebrafish. 11 (4), 291-299 (2014).
- Ma, L., Jeffery, W. R., Essner, J. J., Kowalko, J. E. Genome editing using TALENs in blind Mexican Cavefish, Astyanax mexicanus. PloS One. 10 (3), e0119370(2015).
- JoVE. Current methods in Astyanax mexicanus research. , Available from: https://www.jove.com/methods-collections/16/current-methods-inastyanax-mexicanusresearch (2018).
- Heanue, T. A., et al. A Novel Zebrafish ret Heterozygous Model of Hirschsprung Disease Identifies a Functional Role for mapk10 as a Modifier of Enteric Nervous System Phenotype Severity. PLoS Genetics. 12 (11), (2016).
- Reed Mariculture Culturing Rotifers in Small Systems (Home or Lab). , Available from: http://reedmariculture.com/support_rotifers_culturing.php (2018).
- Riddle, M. R., Baxter, B. K., Avery, B. J. Molecular identification of microorganisms associated with the brine shrimp Artemia franciscana. Aquatic Biosystems. 9 (1), (2013).
- Tsang, B., et al. Breeding Zebrafish: A Review of Different Methods and a Discussion on Standardization. Zebrafish. 14 (6), 561-573 (2017).
- Cave fish assembly and gene annotation. , Available from: http://useast.ensembl.org/Astyanax_mexicanus/Info/Annotation (2018).
Przedruki i uprawnienia
