Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Precelowana radioimmunoterapia oparta na odwróconej reakcji Dielsa-Aldera na odwrócone zapotrzebowanie elektronowe

7.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59041

⸱

29 stycznia 2019

 ,  , 
1Department of Chemistry, Hunter College of the City University of New York, 2Ph.D. Program in Chemistry, Graduate Center of the City University of New York, 3Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 4Department of Radiology, Weill Cornell Medical College

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje syntezę i charakterystykę przeciwciała modyfikowanego trans-cyklooctenem (TCO) oraz 177znakowanego Lu radioligandu tetrazyny (Tz) do radioterapii pretargetowanej (PRIT). Ponadto szczegółowo opisano zastosowanie tych dwóch konstruktów w badaniach biodystrybucji in vivo i terapii podłużnej w mysim modelu raka jelita grubego.

Streszczenie

Chociaż radioimmunoterapia (RIT) jest obiecującym podejściem do leczenia raka, długi okres półtrwania farmakokinetyki przeciwciał znakowanych radioaktywnie może skutkować wysokimi dawkami promieniowania do zdrowych tkanek. Być może nie jest zaskoczeniem, że opracowano kilka różnych strategii, aby obejść to niepokojące ograniczenie. Jednym z najbardziej obiecujących podejść jest radioimmunoterapia precelowana (PRIT). PRIT opiera się na oddzieleniu radionuklidów od immunoglobuliny, wstrzyknięciu ich oddzielnie, a następnie umożliwieniu ich połączenia in vivo w tkance docelowej. Podejście to wykorzystuje wyjątkowe właściwości przeciwciał ukierunkowanych na nowotwory, jednocześnie omijając ich wady farmakokinetyczne, obniżając w ten sposób dawki promieniowania do tkanek niedocelowych i ułatwiając stosowanie radionuklidów o okresie półtrwania, który jest uważany za zbyt krótki do stosowania w tradycyjnych radioimmunokoniugatach. W ciągu ostatnich pięciu lat nasze laboratorium i inne laboratorium opracowały podejście do wstępnego celowania in vivo w oparciu o reakcję Dielsa-Aldera (IEDDA) z odwrotnym zapotrzebowaniem na elektrony między transcyklooktenem (TCO) a tetrazyną (Tz). Strategia ta została z powodzeniem zastosowana do obrazowania pretargetowanej pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) i tomografii komputerowej emisji pojedynczych fotonów (SPECT) z wykorzystaniem różnych układów przeciwciało-antygen. W dwóch ostatnich publikacjach wykazaliśmy skuteczność PRIT opartego na IEDDA w mysich modelach gruczolakoraka przewodowego trzustki i raka jelita grubego. W tym protokole opisujemy protokoły PRIT przy użyciu radioliganda tetrazynowego znakowanego 177Lu-DOTA ([177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz) i zmodyfikowanego TCO wariantu raka jelita grubego ukierunkowanego na przeciwciało huA33 (huA33-TCO). Dokładniej rzecz ujmując, opiszemy budowę huA33-TCO, syntezę i znakowanie radioaktywne [177Lu]Lu-DOTA-PEG 7-Tz oraz wyniki badań biodystrybucji in vivo i terapii podłużnej w mysich modelach raka jelita grubego.

Wprowadzenie

Radioimmunoterapia (RIT) — wykorzystanie przeciwciał do dostarczania terapeutycznych radionuklidów do nowotworów — od dawna jest kuszącym podejściem do leczenia raka1,2. Rzeczywiście, obietnica ta została podkreślona przez zatwierdzenie przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków dwóch radioimmunokoniugatów do leczenia chłoniaka nieziarniczego: 90Y-ibritumomab tiuxetan i 131I-tositumomab3,4. Jednak już od samego początku kliniczne perspektywy RIT były utrudnione przez krytyczną komplikację: wysokie dawki promieniowania dla zdrowych tkanek5,6. Ogólnie rzecz biorąc, radioimmunokoniugaty RIT są znakowane długożyciowymi radionuklidami (np. 131I [t1/2 = 8,0 dni] i 90Y [t1/2 = 2,7 dnia]) z fizycznymi okresami półtrwania, które dobrze współgrają z długimi farmakokinetycznym okresami półtrwania immunoglobulin. Jest to niezbędne, ponieważ zapewnia, że wystarczająca radioaktywność pozostaje wystarczająca, gdy przeciwciało osiągnie optymalną biodystrybucję po kilku dniach krążenia. Jednak ta kombinacja długiego czasu przebywania we krwi i długiego fizycznego okresu półtrwania nieuchronnie prowadzi do napromieniania zdrowych tkanek, zmniejszając w ten sposób proporcje terapeutyczne i ograniczając skuteczność terapii7. Zbadano kilka strategii obejścia tego problemu, w tym użycie skróconych fragmentów przeciwciał, takich jak Fab, Fab', F(ab')2, miniciała i nanociała8,9,10. Jednym z najbardziej obiecujących i fascynujących, a jednocześnie niezaprzeczalnie złożonych, alternatywnych podejść jest pretargetowanie in vivo11.

Wstępne celowanie in vivo to podejście do obrazowania jądrowego i terapii, które ma na celu wykorzystanie wyjątkowego powinowactwa i selektywności przeciwciał, jednocześnie omijając ich wady farmakokinetyczne11,12,13. W tym celu znakowane radioizotopem przeciwciało stosowane w tradycyjnej radioimmunoterapii rozkłada się na dwa składniki: małocząsteczkowy radioligand i immunokoniugat, który może wiązać zarówno antygen nowotworowy, jak i wspomniany radioligand. Immunokoniugat jest najpierw wstrzykiwany i otrzymuje "przewagę", często trwający kilka dni, podczas których gromadzi się w tkance docelowej i usuwa się z krwi. Następnie podaje się małocząsteczkowy radioligand i albo łączy się z immunokoniugatem w guzie, albo szybko usuwa się z organizmu. Zasadniczo pretargeting in vivo opiera się na przeprowadzeniu radiochemii w samym ciele. Zmniejszając krążenie promieniotwórczości, podejście to jednocześnie zmniejsza dawki promieniowania do zdrowych tkanek i ułatwia stosowanie radionuklidów (np. 68Ga, t1/2 = 68 min211; As, t1/2 = 7,2 h) z okresami półtrwania, które są zwykle uważane za niezgodne z wektorami opartymi na przeciwciałach.

Począwszy od późnych lat 80-tych, opracowano kilka różnych podejść do pretargetingu in vivo, w tym strategie oparte na bispecyficznych przeciwciałach, interakcji między streptawidyną a biotyną oraz hybrydyzacji komplementarnych oligonukleotydów14,15,16,17,18. Jednak każdy z nich został w różnym stopniu powstrzymany przez powikłania, z których najbardziej znaną jest silna immunogenność przeciwciał modyfikowanych streptawidyną19,20. W ciągu ostatnich pięciu lat nasza grupa i inni opracowali podejście do wstępnego celowania in vivo w oparciu o szybką i bioortogonalną ligację Dielsa-Aldera o odwrotnym zapotrzebowaniu na elektrony między transcyklooktenem (TCO) a tetrazyną (Tz)21,22,23,24. Najbardziej skuteczna z tych strategii wykorzystuje przeciwciało zmodyfikowane TCO i radioligand zawierający Tz, ponieważ TCO jest zazwyczaj bardziej stabilny in vivo niż jego partner Tz (Rysunek 1) < sup class="xref">25,26. Podobnie jak w innych metodologiach pretargetingu, immunokoniugat mAb-TCO jest podawany jako pierwszy i daje mu się czas na usunięcie z krążenia i akumulację w tkance nowotworowej. Następnie wstrzykuje się małą cząsteczkę radioliganda Tz, po czym albo klika się z immunokoniugatem w tkance docelowej, albo szybko usuwa się z organizmu. Ta strategia pretargetowania in vivo okazała się bardzo skuteczna w obrazowaniu PET i SPECT z kilkoma różnymi systemami przeciwciał/antygenów, konsekwentnie tworząc obrazy o wysokim kontraście i umożliwiając stosowanie krótkożyciowych radionuklidów, takich jak 18F (t1/2 = 109 min) i 64Cu (t1/2 = 12,7 h)21,22,24. Ostatnio wykazano skuteczność radioimmunoterapii pretargetowanej (PRIT) opartej na kliknięciach w mysich modelach gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) i raka jelita grubego27,28. W tym celu zastosowano terapeutyczny radionuklid 177Lu (βmax = 498 keV, t1/2 = 6,7 dnia) w połączeniu z dwoma różnymi przeciwciałami: 5B1, który jest ukierunkowany na antygen węglowodanowy 19,9 (CA19,9) powszechnie ulegający ekspresji w PDAC, oraz huA33, który jest ukierunkowany na A33, transbłonową glikoproteinę ulegającą ekspresji w >95% przypadków raka jelita grubego. W obu przypadkach to podejście do 177Lu-PRIT dało wysokie stężenia aktywności w tkance nowotworowej, stworzyło zależny od dawki efekt terapeutyczny i jednocześnie zmniejszyło stężenia aktywności w zdrowych tkankach w porównaniu z tradycyjnymi bezpośrednio znakowanymi radioimmunokoniugatami.

W tym artykule opisujemy protokoły dla PRIT przy użyciu radioligandu tetrazynowego znakowanego 177Lu-DOTA ([177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz) oraz zmodyfikowanego przez TCO wariantu przeciwciała huA33 (huA33-TCO). Dokładniej rzecz ujmując, opisujemy budowę huA33-TCO (Rysunek 2), syntezę i znakowanie radioaktywne [177Lu]Lu-DOTA-PEG 7-Tz (Rysunek 3 i Rysunek 4), oraz wyniki badań in vivo nad biodystrybucją i terapią podłużną w mysich modelach raka jelita grubego. Ponadto w reprezentatywnych wynikach i dyskusji prezentujemy przykładowy zestaw danych, omawiamy możliwe strategie optymalizacji tego podejścia i rozpatrujemy tę strategię w szerszym kontekście pretargetingu in vivo i PRIT. Na koniec należy zauważyć, że chociaż zdecydowaliśmy się skupić na pretargetowaniu przy użyciu huA33-TCO i [177Lu]Lu-DOTA-PEG 7-Tz w tym protokole, strategia ta jest wysoce modułowa i może być dostosowana do szerokiego zakresu przeciwciał i radionuklidów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach in vivo opisane w tej pracy zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami i przeprowadzone zgodnie z etycznymi wytycznymi Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medical Center oraz Hunter College Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC).

1. Przygotowanie huA33-TCO

UWAGA: Synteza huA33-TCO została już wcześniej zgłoszona29. Jednak dla wygody czytelnika jest on tutaj powielany z dostosowaniami do optymalnych warunków.

  1. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml przygotować 125 μl roztworu węglanu (E)-cyklooct-4-enylu 2,5-diokso-1-pirolidynylu (TCO-NHS) w suchym dimetyloformamidzie (DMF) o stężeniu 40 mg/ml (0,15 M). Roztwór ten można podzielić na porcje i zamrozić w temperaturze -80 °C w celu wykorzystania w przyszłych doświadczeniach.
  2. W oddzielnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml przygotuj roztwór huA33 o stężeniu 5 mg/ml w 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 2,7 mM chlorek potasu, 137 mM chlorek sodu i 11,9 mM fosforan potasu, pH 7,4).
  3. Stosując małe podwielokrotności (<5 μL) 0,1 M Na2CO3 dostosować pH roztworu przeciwciała z kroku 1.2 do 8.8-9.0. Do monitorowania pH należy używać papieru do pomiaru pH lub pH-metru z mikroelektrodą i uważać, aby pH nie przekraczało 9,0.
  4. Do roztworu przeciwciała opisanego w kroku 1.3 powoli dodawać objętość odpowiadającą 40 równoważnikom molowym TCO-NHS w stosunku do ilości przeciwciała. Na przykład, jeśli w roztworze znajduje się 5 mg (30 nmol) huA33, dodaj 9,0 μl (1,20 μmol) roztworu 40 mg/ml (0,15 M) TCO-NHS.
    UWAGA: TCO-NHS jest hydrofobowy. Dodając go do roztworu przeciwciała, dodawaj go powoli i z mieszaniem, aby zapobiec wytrącaniu się. Nie przekraczać 10% objętości DMF w końcowym roztworze reakcyjnym.
  5. Pozostawić reakcję do inkubacji w temperaturze 25 °C na termomikserze przez 1 godzinę z łagodnym mieszaniem (500 obr./min).
  6. Po 1 godzinie oczyścić immunokoniugat huA33-TCO za pomocą wstępnie zapakowanej jednorazowej kolumny odsalającej.
    1. Zrównoważyć kolumnę wykluczającą wielkość zgodnie z opisem dostawcy, aby usunąć wszelkie konserwanty obecne w kolumnie podczas przechowywania. Typowa procedura polega na przemyciu kolumny 5x objętością PBS odpowiadającą objętości kolumny: 5 x 2,5 ml PBS.
    2. Dodać mieszaninę reakcyjną do kolumny wykluczającej rozmiar, zwracając uwagę na objętość mieszaniny reakcyjnej.
    3. Po wprowadzeniu mieszaniny reakcyjnej do kolumny dodać odpowiednią ilość PBS, aby całkowita objętość roztworu dodanego do kolumny wynosiła 2,5 ml. Na przykład, jeśli reakcja koniugacji dała całkowitą objętość 1,3 ml, dodaj 1,2 ml dodatkowego PBS do kolumny.
    4. Zebrać produkt, używając 2 ml PBS jako eluentu.
      UWAGA: Ten krok da ostateczną konstrukcję huA33-TCO w 2 ml PBS, pH 7,4.
  7. Zmierzyć stężenie huA33-TCO za pomocą spektrofotometru UV-Vis monitorującego długość fali 280 nm. Współczynnik ekstynkcji molowej dla większości IgG (ε280) wynosi 210 000 M-1 cm-1.
  8. Jeśli pożądany jest roztwór o wyższym stężeniu immunokoniugatu, należy stężyć roztwór huA33-TCO za pomocą odśrodkowej jednostki filtrującej z granicą masy cząsteczkowej 50 000 zgodnie z instrukcjami producenta.
    UWAGA: Wiadomo, że wiele przeciwciał agreguje się lub wytrąca podczas koncentracji. Podejmując próbę przeprowadzenia tej procedury z nowym przeciwciałem, badacze powinni odwołać się do literatury lub własnego doświadczenia w pracy z danym przeciwciałem.
  9. Gotowy immunokoniugat huA33-TCO należy przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności, jeśli jest natychmiast potrzebny. Jeśli ma być używany dłużej niż 4 dni w przyszłości, przechowuj go w temperaturze -80 °C w ciemności.
    UWAGA: Jest to dopuszczalny punkt zatrzymania procedury. Gotowy immunokoniugat huA33-TCO powinien być stabilny przez co najmniej 6 miesięcy przechowywania w temperaturze -80 °C w ciemności.

2. Synteza Tz-PEG 7-NHBoc

  1. W probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml rozpuść 5 mg estru N-hydroksysukcynimidylu tetrazyny (Tz-NHS; 12,6 μmol) w 0,15 ml bezwodnego dimetylosulfotlenku (DMSO).
  2. W oddzielnej probówce do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml rozpuść 8 mg chronionego przed Boc polimeru amino PEG, glikolu O-(2-aminoetylo)-O′-[2-(Boc-amino)etylo]heksaetylenowego (NHBoc-PEG7-NH2; 17,1 μmol) w 0,15 ml bezwodnego DMSO.
  3. Do roztworu Tz-NHS dodać 3 μl (21,3 μmol, 1,7 ekwiwalentu molowego) trietyloaminy (TEA) i dokładnie wymieszać.
  4. Dodać różowy roztwór tetrazyny do roztworu NHBoc-PEG7-NH 2 z kroku 2.2 i inkubować mieszaninę reakcyjną przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT) z łagodnym mieszaniem.
  5. Po 30 minutach rozcieńczyć reakcję w stosunku 1:1 wH2Oi oczyścić reakcję za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami C18 w celu oddzielenia nieprzereagowanego Tz-NHS od Tz-PEG7-NHBoc. Stosować rozpuszczalniki bez kwasu, aby zapobiec przedwczesnemu usunięciu grupy ochronnej Boc. Monitoruj zarówno Tz-PEG 7-NHBoc, jak i Tz-NHS na długości fali 525 nm.
    UWAGA: Czasy retencji są oczywiście w dużym stopniu zależne od sprzętu HPLC każdego laboratorium (pompy, kolumny, rurki itp.), a przed oczyszczaniem należy przeprowadzić odpowiednie kontrole. Jednakże, aby przedstawić przykład, jeśli stosuje się gradient od 5:95 MeCN/H2O (oba bez żadnego dodatku) do 95:5 MeCN/H2O w ciągu 30 minut, natężenie przepływu 1 ml/min i analityczną kolumnę C18o wymiarach 4,6 mm x 250 mm, czasy retencji Tz-NHS i Tz-PEG 7-NHBoc wynoszą około 16 min i 18 min, odpowiednio.
  6. Zamrozić zebrany eluent HPLC za pomocą ciekłego azotu i owinąć zamrożoną probówkę zbiorczą folią aluminiową. Umieść zamrożoną probówkę zbiorczą na liofilizatorze na noc, aby usunąć ruchomą fazę HPLC. Produkt będzie charakterystycznym jasnoróżowym ciałem stałym.
    UWAGA: Jeśli ciekły azot nie jest dostępny, zamrozić zebrany eluent HPLC w suchym lodzie lub na noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C.

3. Synteza Tz-PEG7-NH 2

  1. Do produktu z kroku 2.6, Tz-PEG 7-NHBoc, dodać 1,5 ml dichlorometanu (DCM) i przenieść ten roztwór do małej kolby okrągłodennej.
  2. Dodać kroplami 0,25 ml kwasu trifluorooctowego (TFA) do różowego roztworu z kroku 3.1.
  3. Pozostawić reakcję do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem.
  4. Po 30 minutach odparować rozpuszczalnik poprzez odparowanie obrotowe. Nie przekraczać temperatury łaźni wodnej 37 °C.
  5. Rozpuścić różowy lepki produkt w 0,5 ml wody.
  6. Oczyścić produkt za pomocą HPLC C18 z odwróconymi fazami w celu oddzielenia Tz-PEG7-NH 2 od prekursora chronionego przed Boc. Monitoruj zarówno Tz-PEG 7-NHBoc, jak i Tz-PEG 7-NH 2 na długości fali 525 nm.
    UWAGA: Czasy retencji są oczywiście w dużym stopniu zależne od sprzętu HPLC każdego laboratorium (pompy, kolumny, rurki itp.), a przed oczyszczaniem należy przeprowadzić odpowiednie kontrole. Jednakże, dla przykładu, jeżeli stosuje się gradient od 5:95 MeCN/H2O (oba z 0,1% TFA) do 95:5 MeCN/H2O przez 30 minut, natężenie przepływu 1 mL/min i analityczną kolumnę C18o wymiarach 4,6 mm x 250 mm, czasy retencji Tz-PEG 7-NHBoc i Tz-PEG7-NH 2 wynoszą około 18 min i 13 min, odpowiednio.
  7. Zamrozić zebrany eluent HPLC za pomocą ciekłego azotu i owinąć zamrożoną probówkę zbiorczą folią aluminiową. Umieść zamrożoną probówkę zbiorczą na liofilizatorze na noc, aby usunąć ruchomą fazę HPLC. Produkt będzie jasnoróżowym ciałem stałym.
  8. Rozpuścić produkt z kroku 3.7, Tz-PEG7-NH 2, w 150 μl DMSO i przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,7 ml.
  9. Zmierzyć stężenie Tz-PEG7-NH 2 za pomocą spektrofotometru UV-Vis monitorującego długość fali 525 nm. Współczynnik ekstynkcji molowej dla Tz-PEG7-NH 2 (ε525) wynosi 535 M-1 cm-1.

4. Synteza Tz-PEG 7-DOTA

  1. Rozpuść Tz-PEG7-NH 2 (4,5 mg, 6,9 μmol) w 0,15 ml DMSO (lub po prostu kontynuuj z roztworem utworzonym w kroku 3.8).
  2. Dodać 22 równoważniki molowe TEA (21 μl, 0,15 mmol) do roztworu zawierającego tetrazynę z kroku 4.1.
  3. Dodać 10 mg (14,2 μmol) p-SCN-Bn-DOTA w postaci stałej i mieszać roztwór przez około 2 minuty lub do całkowitego rozpuszczenia materiału.
  4. Pozostawić reakcję do inkubacji przez 30 minut w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem.
  5. Po 30 minutach rozcieńczyć reakcję w stosunku 1:1 wH2Oi oczyścić produkt za pomocą HPLC C18 z odwróconymi fazami w celu usunięcia nieprzereagowanego p-SCN-Bn-DOTA. p-SCN-Bn-DOTA może być monitorowany na długości fali 254 nm, podczas gdy Tz-PEG7-DOTA najlepiej monitorować na długości fali 525 nm.
    UWAGA: Czasy retencji są oczywiście w dużym stopniu zależne od sprzętu HPLC każdego laboratorium (pompy, kolumny, rurki itp.), a przed oczyszczaniem należy przeprowadzić odpowiednie kontrole. Jednakże, dla przykładu, jeśli stosuje się gradient od 5:95 MeCN/H2O (oba z 0,1% TFA) do 95:5 MeCN/H2O przez 30 minut i stosuje się analityczną kolumnę C18o wymiarach 4,6 x 250 mm, Tz-PEG7-DOTA i p-SCN-Bn-DOTA mają czasy retencji około 15,6 min i 16,1 min, odpowiednio.
  6. Zamrozić zebrany eluent HPLC za pomocą ciekłego azotu i owinąć zamrożoną probówkę zbiorczą folią aluminiową. Umieść zamrożoną probówkę zbiorczą na liofilizatorze na noc, aby usunąć ruchomą fazę HPLC. Produkt będzie jasnoróżowym pudrem.
  7. Rozpuść produkt w 0,15 ml DMSO i zmierz stężenie za pomocą spektrofotometru UV-Vis monitorującego długość fali 525 nm. Molowy współczynnik ekstynkcji dla Tz-PEG7-DOTA (ε525) wynosi 535 M-1 cm-1.
  8. Przeanalizuj końcowy związek za pomocą magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) i spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości (HRMS), aby sprawdzić, czy synteza się powiodła. Patrz Tabela 1 dla eksperymentalnie wyznaczonych przesunięć chemicznych i mas cząsteczkowych wszystkich związków omówionych w tej pracy.
  9. Oczyszczony roztwór Tz-PEG7-DOTA należy przechowywać w ciemności w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Jest to dopuszczalny punkt zatrzymania procedury. Gotowy prekursor Tz-PEG7-DOTA jest stabilny przez co najmniej 1 rok w tych warunkach.

5. 177Lu Radioznakowanie Tz-PEG7-DOTA

UWAGA: Ten etap protokołu obejmuje obsługę i manipulację radioaktywnością. Przed wykonaniem tych kroków – lub wykonaniem jakichkolwiek innych prac związanych z radioaktywnością – naukowcy powinni skonsultować się z Departamentem Bezpieczeństwa Radiologicznego swojej instytucji macierzystej. Podejmij wszelkie możliwe kroki, aby zminimalizować narażenie na promieniowanie jonizujące.

UWAGA: Podczas pracy z małymi ilościami radiometali zaleca się, aby wszystkie były wolne od śladowych ilości metali, aby zapobiec zakłóceniom w wiązaniu miejsca koordynacji.

  1. Do probówki wirówkowej o pojemności 1,7 ml dodać 200 μl 0,25 M buforu octanu amonu dostosowanego porcjami 1 M HCl do pH 5,5,
    UWAGA: W przypadku użycia mniej niż 370 MBq aktywności do etykietowania, objętość użytego buforu należy zmniejszyć do 100 μl.
  2. Dodać żądaną ilość [177Lu]LuCl3 do roztworu buforowego. Dodana ilość będzie zależała od liczby osób biorących udział w eksperymencie i podawanych dawek radioaktywnych. Zaleca się dodanie 1-2 dodatkowych dawek radioaktywności jako środka ostrożności w celu zrekompensowania potencjalnej utraty radioaktywności podczas etapów oczyszczania.
  3. Dodaj Tz-PEG7-DOTA w DMSO do mieszaniny radioaktywnej w kroku 5.2. Ilość Tz-PEG7-DOTA zależy od liczby badanych osób. Więcej szczegółów na ten temat można znaleźć w kroku 6.2.2.2.
  4. Pozostawić roztwór do inkubacji w temperaturze 37 °C przez 20 minut.
  5. Sprawdzić, czy znakowanie radioaktywne zostało zakończone za pomocą natychmiastowej chromatografii cienkowarstwowej (radio-iTLC) z 50 mM EDTA, pH 5,5 jako fazą ruchomą. Oznaczony [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz pozostanie na linii podstawowej - Rf = 0 - podczas gdy wolny [177Lu]Lu3+ będzie koordynowany przez EDTA i będzie przemieszczał się z czołem rozpuszczalnika, Rf = 1,0 (Rysunek 3B).
  6. Jeśli etykietowanie ilościowe nie zostanie osiągnięte, dodać dodatkowy ligand w celu skoordynowania wolnego radiometalu. Alternatywnie, oczyść oznaczoną [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz za pomocą wkładu C18. Postępuj zgodnie z instrukcjami użytkowania producenta. Przykładowa procedura znajduje się poniżej.
    1. Zalać wkład, powoli przepuszczając przez niego 5 ml etanolu za pomocą dużej strzykawki. Następnie przepuść przez 5 ml acetonitrylu, a następnie 5 ml dejonizowanego (DI)H2O.
    2. Pobrać roztwór radioliganda z kroku 5.3 do mniejszej strzykawki i powoli wstrzyknąć go do wkładu C18. Następnie przemyć wkład 10 ml DIH2O, aby usunąć wszelkie niezwiązane [177Lu]LuCl3.
    3. Eluować za pomocą 500 μl etanolu. Usunąć etanol z produktu końcowego, przepuszczając przez naczynie o niskim natężeniu przepływu suchego azotu lub argonu przez 10-15 minut. Następnie ponownie zawiesić radioligand w soli fizjologicznej w objętości określonej w kroku 6.2.2.2.

6. Badania in vivo

UWAGA: Podobnie jak w sekcji 5, ten etap protokołu obejmuje postępowanie i manipulację radioaktywnością. Przed wykonaniem tych czynności badacze powinni skonsultować się z Departamentem Bezpieczeństwa Radiologicznego swojej instytucji macierzystej. Podejmij wszelkie możliwe kroki, aby zminimalizować narażenie na promieniowanie jonizujące.

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. U samic nagich myszy atymicznych należy wszczepić podskórnie 5 x 106 komórek raka jelita grubego SW1222 zawieszonych w 150 μl mieszaniny pożywki komórkowej i macierzy 1:1 (np. Matrigel) i pozwolić im wyrosnąć w ksenoprzeszczep 100-150 mm3 (14-18 dni po inokulacji).
    2. Sortowanie zwierząt do eksperymentu biodystrybucji
      1. Gdy guzy osiągną wystarczającą wielkość, określoną za pomocą pomiaru suwmiarki, posortuj zwierzęta, aby upewnić się, że każda kohorta ma w przybliżeniu taką samą średnią objętość guza. Zwierzęta można odróżnić w każdej klatce po oznaczeniach na ogonie niezmywalnym tuszem (jedna opaska, dwie opaski itp.).
    3. Sortowanie zwierząt do badania terapii podłużnej
      1. Gdy guzy osiągną wystarczającą wielkość, określoną za pomocą pomiaru suwmiarki, przymocuj kolczyki do każdego ze zwierząt, aby zapewnić prawidłowe śledzenie przez cały czas trwania eksperymentu.
        UWAGA: Numeryczne kolczyki mogą spaść w trakcie trwania eksperymentu. W rezultacie, zaleca się, aby tym fizycznym znacznikom towarzyszyć nacięcia na uszy w sposób systematyczny (tj. prawy, lewy, dwustronny, prawy x 2, lewy x 2).
      2. Posortuj zwierzęta tak, aby średnia objętość guza w każdej kohorcie była mniej więcej równa. Poniższą metodę sortowania zwierząt można wykonać za pomocą programu do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.
        1. Wymień numery identyfikacyjne zwierząt, wzór wycięcia w uchu i objętość guza w trzech oddzielnych kolumnach.
        2. Sortuj dane od najmniejszej do największej objętości guza.
        3. W czwartej kolumnie przypisz każdemu zwierzęciu numer klatki i przechodź przez klatki w wężowy wzór. Na przykład, jeśli jest 5 klatek, ta kolumna będzie wypełniana "5, 4, 3, 2, 1, 1, 2, 3, 4, 5...", dopóki wszystkie zwierzęta nie zostaną przypisane do klatki.
        4. Po przypisaniu klatek posortuj dane według numeru klatki. Jeśli używane są nacięcia na uszy, upewnij się, że każde zwierzę w danej klatce ma unikalny wzór nacięcia na uszy. Jeśli w danej klatce znajdują się duplikaty (dwie lub więcej tego samego wzoru), zamień jedną mysz na jedną z innej klatki z brakującym wzorem, aż w każdej klatce będą zwierzęta z unikalnymi wzorami nacięć w uszach.
  2. Preparaty i iniekcje
    UWAGA: Sekwencja wstrzykiwania zarówno w przypadku badania biodystrybucji, jak i terapii przebiega w następujący sposób: najpierw wstrzykuje się huA33-TCO, a następnie [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz po upływie wcześniej ustalonego czasu.
    1. Immunokoniugat
      1. Rozcieńczyć podwielokrotność roztworu huA33-TCO z kroku 1.9 do stężenia 0,8 mg/ml w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej.
      2. Pobrać dawki 150 μl (100 μg) roztworu huA33-TCO do strzykawek potraktowanych 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w PBS i przechowywać te strzykawki na lodzie.
        UWAGA: Leczenie BSA zmniejsza nieswoiste wiązanie przeciwciała ze ściankami strzykawki.
      3. Ogrzej zwierzęta pod lampą grzewczą przez 3 minuty, aby rozszerzyć żyłę ogonową.
      4. Wstrzyknąć roztwór huA33-TCO do żyły ogonowej myszy z ksenograftem. Odczekaj 24 godziny (lub inny z góry określony przedział czasu), aby huA33-TCO zgromadził się w guzie myszy.
    2. Radioligand (Radioligand)
      1. Znakowanie radioaktywne Tz-PEG7-DOTA, jak opisano w rozdziale 5.
      2. Pobrać dawki w 150 μl 0,9% sterylnego roztworu soli fizjologicznej zawierającego 1,1 molowego odpowiednika Tz-PEG7-DOTA w stosunku do ilości podanego huA33-TCO. Na przykład, jeśli zwierzęciu wstrzyknięto 100 μg (0,67 nmol) huA33-TCO i wytworzono mieszaninę reakcyjną [177Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz o aktywności właściwej 12,4 GBq/μmol, wówczas zostaną pobrane dawki zawierające 9,14 MBq aktywności każda. Odpowiada to 0,74 nmol Tz (1,1 mola w stosunku do huA33-TCO).
      3. Ogrzej zwierzęta pod lampą grzewczą przez 3 minuty, aby rozszerzyć żyłę ogonową.
      4. Wstrzyknąć dawkę radioligandu do żyły ogonowej myszy z ksenoprzeszczepem. Ilość aktywności, która ma zostać wstrzyknięta, jest określana przez badacza. Opublikowane dane wykazały zależne od dawki efekty terapeutyczne na wielkość guza w zakresie 7,4 - 55,5 MBq.
  3. Biodystrybucja
    1. W pożądanym punkcie czasowym po podaniu radioligandu należy poddać eutanazji każdą kohortę myszy za pomocą mieszaniny gazów 2%O2 / 6%CO2.
      UWAGA: Należy przestrzegać wszelkich wymogów instytucjonalnych dotyczących metod wtórnej eutanazji fizycznej (np. zwichnięcie szyjki macicy).
    2. Dla każdego zwierzęcia należy usunąć wszystkie interesujące nas narządy, umyć je w łaźni wodnej w celu usunięcia nadmiaru krwi i osuszyć na ręczniku papierowym na świeżym powietrzu przez 5 minut. Przykładowa lista narządów w sugerowanej kolejności: krew, guz, serce, płuca, wątroba, śledziona, żołądek, jelito cienkie, jelito grube, nerki, mięśnie, kości, skóra, ogon.
    3. Po wystarczającym wysuszeniu umieść narządy w wstępnie zważonych jednorazowych probówkach hodowlanych. Ponownie zważ napełnione probówki, aby uzyskać masę każdego narządu lub tkanki.
    4. Zmierz aktywność w każdej z probówek za pomocą licznika gamma. Skalibrować zmierzoną aktywność w liczniku gamma do detektora używanego do pomiaru pobranej dawki. Policz wzorce radioaktywne 177Lu na każdym przyrządzie i określ współczynnik kalibracji dla wzajemnej konwersji między aktywnością a liczbą na minutę (cpm).
    5. Wykreślić dane dotyczące biodystrybucji w postaci wykresu słupkowego (zob. rysunek 5) ze średnim znormalizowanym wychwytem dla każdego narządu przedstawionym wraz ze słupkiem oznaczającym jedno odchylenie standardowe. Statystyczne różnice w wychwytywaniu między grupami próby można ocenić za pomocą niesparowanego testu t, w którym istotność uzyskuje się, gdy p < 0,05.
  4. Monitorowanie terapii
    1. Za pomocą suwmiarki zmierz najdłuższy bok podłużnego guza (długość), a także szerokość, która jest prostopadła do długości. Oblicz objętość, korzystając ze wzoru na objętość elipsoidy: (4/3)πL·W·H, co upraszcza się do 1/2L·W2, zakładając, że wysokość jest w przybliżeniu równa szerokości.
      UWAGA: Możliwe jest również użycie ręcznego urządzenia do pomiaru guza, jeśli jest dostępne (patrz Tabela materiałów).
    2. Zważ każdą mysz na wadze, aby śledzić przyrost lub utratę wagi w czasie.
    3. Co ważne, należy monitorować wygląd fizyczny każdego zwierzęcia pod kątem oznak niepokoju, takich jak zgarbione plecy lub pęknięte naczynia krwionośne skóry (które mogą wskazywać na hematotoksyczność).
      UWAGA: Pomiary guza należy pobierać co 1-2 dni w trakcie badania terapii podłużnej.
    4. Wykreśl dane z badania terapii podłużnej jako średnią objętość guza w czasie i w razie potrzeby znormalizuj do początkowej objętości guza. Statystyczne różnice w wychwycie w tym samym dniu między grupami próby można ocenić za pomocą niesparowanego testu t, w którym istotność osiąga się, gdy P < 0,05. Bardziej szczegółowe analizy statystyczne mogą i powinny być przeprowadzane zgodnie z zaleceniami przeszkolonego biostatystyka.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Koniugacja TCO do huA33 opiera się na sprzęganiu reaktywnego względem grup aminowych TCO-NHS z resztami lizyny na powierzchni immunoglobuliny. Metoda ta jest wysoce stabilna i powtarzalna, a stopień znakowania wynosi zazwyczaj od 2 do 4 TCO/mAb. W tym przypadku wykorzystano spektrometrię mas MALDI-ToF, aby potwierdzić stopień znakowania wynoszący około 4,0 TCO/mAb; podobną wartość uzyskano, stosując jako reporter tetrazynę modyfikowaną fluoroforem24. Synteza ligand...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Jedną z mocnych stron tego podejścia do pretargetowania in vivo – zwłaszcza w odniesieniu do strategii opartych na przeciwciałach bispecyficznych i haptenach znakowanych radioaktywnie – jest jego modułowość: ugrupowania transcyklooktenowe mogą być dołączane do dowolnego przeciwciała, a radioligandy tetrazynowe mogą być znakowane radioaktywnie za pomocą nadzwyczajnej różnorodności radionuklidów bez uszczerbku dla ich zdolności do reagowania z ich partnerami klikającymi. Jednak adaptacja tego podejścia d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują dr Jacobowi Houghtonowi za pomocne rozmowy. Autorzy chcieliby również podziękować NIH za hojne finansowanie (R00CA178205 i U01CA221046).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
(E)-Cyclooct-4-enyl 2,5-dioxo-1-pirolidynylowęglan (TCO-NHS)Sigma-Aldrich764523Przechowywać w temperaturze -80 & deg;
C-2,5-diokso-1-pirolidynylo5-[4-(1,2,4,5-tetrazyno-3-ylo)benzyloamino]-5-oksopentanosan (Tz-NHS)Sigma-Aldrich764701Przechowywać w temperaturze -80 & deg; C
Acetonitryl (MeCN)Fisher ScientificA998-4
Octan amonu (NH4OAc)Fisher ScientificA639-500
Boc-PEG7-amina (O-(2-aminoetylo)-O′-[2-(Boc-amino)etylo]glikol heksaetylenowy)Sigma-Aldrich70023Przechowywać w temperaturze -20 ° C
Dichlorometan (DCM)Fisher ScientificD143-1
Dimetylosulfotlenek (DMSO), bezwodnyFisher ScientificD12345
EMD Millipore Amicon Ultra-2 Filtr odśrodkowyFisher ScientificUFC205024
GE Healthcare Jednorazowe kolumny odsalające PD-10Fisher Scientific45-000-148
N, N-dimetyloformamid (DMF), bezwodnyFisher ScientificAC610941000
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS)Fisher Scientific70-011-04410x Skoncentrowane
makrocyklep-SCN-Bn-DOTAB-205Przechowywać w temperaturze -20 ° C
Trietyloamina (HERBATA)Fisher ScientificAC157911000
Kwas trifluorooctowy (TFA)Fisher ScientificA116-50
Urządzenie do pomiaru guzaPeira TM900Peira TM900

Bibliografia

  1. Goldenberg, D. M. Targeted Therapy of Cancer with Radiolabeled Antibodies. Journal of Nuclear Medicine. 43 (5), 693-713 (2002).
  2. Goldenberg, D. M., et al. Radioimmunotherapy of B-cell Lymphomas with Iodine-131-labeled LL2 Monoclonal Antibody. Journal of Clinical Oncology. 9 (4), 548-564 (1991).
  3. Kaminski, M. S., et al. Radioimmunotherapy with 131I-Tositumomab for Relapsed or Refractory B-cell non-Hodgkin Lymphoma: Updated Results and Long-Term Follow-Up of the University of Michigan Experience. Blood. 96 (4), 1259-1266 (2000).
  4. Davies, A. J. Radioimmunotherapy for B-cell Lymphoma: Y90 Ibritumomab Tiuxetan and I131 Tositumomab. Oncogene. 26, 3614(2007).
  5. Rajendran, J., et al. Comparison of Radiation Dose Estimation for Myeloablative Radioimmunotherapy for Relapsed or Recurrent Mantle Cell Lymphoma Using 131I Tositumomab to That of Other Types of Non-Hodgkin's Lymphoma. Cancer Biotherapy and Radiopharmaceuticals. 19 (6), 738-745 (2004).
  6. Rajendran, J. G., et al. High-Dose 131I-Tositumomab (Anti-CD20) Radioimmunotherapy for Non-Hodgkin's Lymphoma: Adjusting Radiation Absorbed Dose to Actual Organ Volumes. Journal of Nuclear Medicine. 45 (6), 1059-1064 (2004).
  7. Larson, S. M., Carrasquillo, J. A., Cheung, N. -K. V., Press, O. Radioimmunotherapy of Human tumours. Nature Reviews Cancer. 15 (6), 347-360 (2015).
  8. Kelly, M. P., et al. Tumor Targeting by a Multivalent Single-Chain Fv (scFv) Anti-Lewis Y Antibody Construct. Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals. 23 (4), 411-423 (2008).
  9. Yazaki, P. J., et al. Tumor Targeting of Radiometal Labeled Anti-CEA Recombinant T84.66 Diabody and T84.66 Minibody: Comparison to Radioiodinated Fragments. Bioconjugate Chemistry. 12 (2), 220-228 (2001).
  10. van Duijnhoven, S. M. J., et al. Diabody Pretargeting with Click Chemistry In Vivo. Journal of Nuclear Medicine. 56 (9), 1422-1428 (2015).
  11. Altai, M., Membreno, R., Cook, B., Tolmachev, V., Zeglis, B. M. Pretargeted Imaging and Therapy. Journal of Nuclear Medicine. 58 (10), 1553-1559 (2017).
  12. Goldenberg, D. M., Chatal, J. -F., Barbet, J., Boerman, O., Sharkey, R. M. Cancer Imaging and Therapy with Bispecific Antibody Pretargeting. Update on cancer therapeutics. 2 (1), 19-31 (2007).
  13. Rossin, R., et al. In-Vivo Chemistry for Pretargeted Tumor Imaging in Live Mice. Angewandte Chemie International Edition. 49 (19), 3375-3378 (2010).
  14. Gestin, J. F., et al. Two-Step Targeting of Xenografted Colon Carcinoma Using a Bispecific Antibody and 188Re-Labeled Bivalent Hapten: Biodistribution and Dosimetry Studies. Journal of Nuclear Medicine. 42 (1), 146-153 (2001).
  15. Green, D. J., et al. Comparative Analysis of Bispecific Antibody and Streptavidin-Targeted Radioimmunotherapy for B-cell Cancers. Cancer Research. 76 (22), 6669(2016).
  16. Sharkey, R. M., et al. Development of a Streptavidin−Anti-Carcinoembryonic Antigen Antibody, Radiolabeled Biotin Pretargeting Method for Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer. Studies in a Human Colon Cancer Xenograft Model. Bioconjugate Chemistry. 8 (4), 595-604 (1997).
  17. Knox, S. J., et al. Phase II Trial of Yttrium-90-DOTA-Biotin Pretargeted by NR-LU-10 Antibody/Streptavidin in Patients with Metastatic Colon Cancer. Clinical Cancer Research. 6 (2), 406(2000).
  18. Schubert, M., et al. Novel Tumor Pretargeting System Based on Complementary L-Configured Oligonucleotides. Bioconjugate Chemistry. 28 (4), 1176-1188 (2017).
  19. Forero, A., et al. Phase 1 Trial of a Novel Anti-CD20 Fusion Protein in Pretargeted Radioimmunotherapy for B-cell Non-Hodgkin Lymphoma. Blood. 104 (1), 227(2004).
  20. Kalofonos, H. P., et al. Imaging of Tumor in Patients with Indium-111-Labeled Biotin and Streptavidin-Conjugated Antibodies: Preliminary Communication. Journal of Nuclear Medicine. 31 (11), 1791-1796 (1990).
  21. Zeglis, B. M., et al. A Pretargeted PET Imaging Strategy Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Journal of Nuclear Medicine. 54 (8), 1389-1396 (2013).
  22. Meyer, J. -P., et al. 18F-Based Pretargeted PET Imaging Based on Bioorthogonal Diels-Alder Click Chemistry. Bioconjugate Chemistry. 27 (2), 298-301 (2016).
  23. Rossin, R., Läppchen, T., vanden Bosch, S. M., Laforest, R., Robillard, M. S. Diels-Alder Reaction for Tumor Pretargeting: In Vivo Chemistry Can Boost Tumor Radiation Dose Compared with Directly Labeled Antibody. Journal of Nuclear Medicine. 54 (11), 1989-1995 (2013).
  24. Zeglis, B. M., et al. Optimization of a Pretargeted Strategy for the PET Imaging of Colorectal Carcinoma via the Modulation of Radioligand Pharmacokinetics. Molecular Pharmaceutics. 12 (10), 3575-3587 (2015).
  25. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A Strain-Promoted [3 + 2] Azide−Alkyne Cycloaddition for Covalent Modification of Biomolecules in Living Systems. Journal of the American Chemical Society. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  26. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine Ligation: Fast Bioconjugation Based on Inverse-Electron-Demand Diels−Alder Reactivity. Journal of the American Chemical Society. 130 (41), 13518-13519 (2008).
  27. Houghton, J. L., et al. Establishment of the In Vivo Efficacy of Pretargeted Radioimmunotherapy Utilizing Inverse Electron Demand Diels-Alder Click Chemistry. Molecular Cancer Therapeutics. 16 (1), 124-133 (2017).
  28. Membreno, R., Cook, B. E., Fung, K., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Click-Mediated Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Carcinoma. Molecular Pharmaceutics. 15 (4), 1729-1734 (2018).
  29. Reiner, T., Lewis, J. S., Zeglis, B. M. Harnessing the Bioorthogonal Inverse Electron Demand Diels-Alder Cycloaddition for Pretargeted PET Imaging. Journal of Visualized Experiments. (96), e52335(2015).
  30. Cook, B. E., Membreno, R., Zeglis, B. M. Dendrimer Scaffold for the Amplification of In Vivo Pretargeting Ligations. Bioconjugate Chemistry. 29 (8), 2734-2740 (2018).
  31. Cheal, S. M., et al. Theranostic Pretargeted Radioimmunotherapy of Colorectal Cancer Xenografts in Mice Using Picomolar Affinity Y-86- or Lu-177-DOTA-Bn Binding scFv C825/GPA33 IgG Bispecific Immunoconjugates. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 43 (5), 925-937 (2016).
  32. Meyer, J. -P., et al. Bioorthogonal Masking of Circulating Antibody-TCO Groups Using Tetrazine-Functionalized Dextran Polymers. Bioconjugate Chemistry. 29 (2), 538-545 (2018).
  33. Houghton, J. L., et al. Pretargeted Immuno-PET of Pancreatic Cancer: Overcoming Circulating Antigen and Internalized Antibody to Reduce Radiation Doses. Journal of Nuclear Medicine. 57 (3), 453-459 (2016).
  34. Keinänen, O., et al. Pretargeting of Internalizing Trastuzumab and Cetuximab with a (18)F-Tetrazine Tracer in Xenograft Models. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging Research. 7, 95(2017).
  35. Billaud, E. M. F., et al. Micro-flow Photosynthesis of New Dienophiles for Inverse-Electron-Demand Diels-Alder Reactions. Potential Applications for Pretargeted In Vivo PET Imaging. Chemical Science. 8 (2), 1251-1258 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tetrazyna trans cyklooktnowatetrazyna DOTA z lutenem 177przeciwcia o huA33 TCOksenograft raka jelita grubegobadania biodystrybucjipod u ne badanie terapeutycznechromatografia wykluczania cz steczkowegoradiochemiczna cienkowarstwowa chromatografia b yskawiczna
Precelowana radioimmunoterapia oparta na odwróconej reakcji Dielsa-Aldera na odwrócone zapotrzebowanie elektronowe
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.