Wysokoprzepustowy test do przewidywania toksyczności chemicznej za pomocą zautomatyzowanego profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans

Podsumowanie

Metoda ilościowa została opracowana do identyfikacji i przewidywania ostrej toksyczności chemikaliów poprzez automatyczną analizę profilowania fenotypowego Caenorhabditis elegans. Protokół ten opisuje, jak leczyć robaki chemikaliami w 384-dołkowej płytce, przechwytywać filmy i określać ilościowo fenotypy związane z toksykologią.

Streszczenie

Stosowanie testów toksyczności substancji chemicznych w organizmach wyższego rzędu, takich jak myszy czy szczury, jest czasochłonne i kosztowne, ze względu na ich długą żywotność i problemy z konserwacją. Wręcz przeciwnie, nicień Caenorhabditis elegans (C. elegans) ma zalety, które sprawiają, że jest idealnym wyborem do testów toksyczności: krótka żywotność, łatwa uprawa i wydajna reprodukcja. W tym miejscu opisujemy protokół automatycznego profilowania fenotypowego C. elegans na płytce 384-dołkowej. Nicienie są hodowane na 384-dołkowej płytce z płynnym podłożem i obróbką chemiczną, a następnie nagrywane są filmy z każdej studzienki w celu ilościowego określenia wpływu chemicznego na 33 cechy robaków. Wyniki eksperymentalne pokazują, że ilościowo określone cechy fenotypu mogą klasyfikować i przewidywać ostrą toksyczność dla różnych związków chemicznych oraz ustanowić listę priorytetów dla dalszych tradycyjnych testów oceny toksyczności chemicznej w modelu gryzoni.

Wprowadzenie

Wraz z szybkim rozwojem związków chemicznych stosowanych w produkcji przemysłowej i codziennym życiu ludzi, ważne jest zbadanie modeli testowania toksyczności dla tych chemikaliów. W wielu przypadkach model zwierzęcy gryzonia jest wykorzystywany do oceny potencjalnej toksyczności różnych substancji chemicznych dla zdrowia. Ogólnie rzecz biorąc, oznaczanie stężeń śmiertelnych (tj. oznaczonej 50% dawki śmiertelnej [LD50] różnych substancji chemicznych) jest stosowane jako tradycyjny parametr w modelu gryzoni (szczur/mysz) in vivo, co jest czasochłonne i bardzo kosztowne. Ponadto, ze względu na zasadę redukcji, udoskonalenia lub zastąpienia (3R), która ma kluczowe znaczenie dla dobrostanu zwierząt i etyki, nowe metody, które pozwalają na zastąpienie zwierząt wyższych, są cenne dla badań naukowych^1,2,3. C. elegans to wolno żyjący nicień, który został wyizolowany z gleby. Jest szeroko stosowany jako organizm badawczy w laboratorium ze względu na swoje korzystne cechy, takie jak krótka żywotność, łatwa uprawa i wydajna reprodukcja. Ponadto wiele podstawowych szlaków biologicznych, w tym podstawowe procesy fizjologiczne i reakcje na stres u C. elegans, jest zachowanych u ssaków wyższych^4,5,6,7,8. W kilku porównaniach, które przeprowadziliśmy wraz z innymi, istnieje dobra zgodność między toksycznością C. elegans a toksycznością obserwowaną u gryzoni⁹. Wszystko to sprawia, że C. elegans jest dobrym modelem do testowania skutków toksyczności chemicznej in vivo.

Ostatnio, niektóre badania określiły ilościowo cechy fenotypowe C. elegans. Funkcje te mogą być używane do analizy toksyczności substancji chemicznych^2,3,10 oraz starzenia się robaków¹¹. Opracowaliśmy również metodę, która łączy system hodowli płynnych robaków i system analizy obrazu, w którym robaki są hodowane na 384-dołkowej płytce pod różnymi zabiegami chemicznymi¹². Ta technika ilościowa została opracowana w celu automatycznej analizy 33 parametrów C. elegans po 12-24 godzinach obróbki chemicznej w 384-dołkowej płytce z ciekłym podłożem. Zautomatyzowany stolik mikroskopowy służy do eksperymentalnej akwizycji wideo. Filmy są przetwarzane przez specjalnie zaprojektowany program, a 33 funkcje związane z poruszaniem się robaków są określane ilościowo. Metodę stosuje się do ilościowego określenia fenotypów robaków pod wpływem 10 związków. Wyniki pokazują, że różne toksyczności mogą zmieniać fenotypy C. elegans. Te ilościowo określone fenotypy można wykorzystać do identyfikacji i przewidywania ostrej toksyczności różnych związków chemicznych. Ogólnym celem tej metody jest ułatwienie obserwacji i kwantyfikacji fenotypowej eksperymentów z C. elegans w płynnej kulturze. Metoda ta jest przydatna do stosowania C. elegans w ocenach toksyczności chemicznej i kwantyfikacjach fenotypów, które pomagają przewidzieć ostrą toksyczność różnych związków chemicznych i ustanowić listę priorytetów dla dalszych tradycyjnych badań oceny toksyczności chemicznej w modelu gryzoni. Ponadto metoda ta może być stosowana do badań przesiewowych toksyczności i badań toksyczności nowych substancji chemicznych lub związku jako dodatku do żywności zanieczyszczenie, związki farmaceutyczne, egzogenny związek środowiskowy i tak dalej.

Protokół

Protokół jest zgodny z wytycznymi Komisji ds. Etyki Zwierząt w Pekińskim Centrum Zapobiegania i Kontroli Chorób w Chinach.

1. Przygotowanie chemiczne

1. Zaopatrzyć się w substancje chemiczne (Tabela 1 i Tabela materiałów).
2. Określ najwyższą i najniższą dawkę poszczególnych substancji chemicznych dla minimalnego stężenia 100% śmiertelności (LC100, 24 h) i maksymalnego stężenia 100% nieśmiertelności (LC0, 24 h) dla robaków. Użyć co najmniej sześciu rozcieńczeń o najwyższym stężeniu (tabela 1).
   UWAGA: Przeprowadź wstępny test śmiertelności robaków⁹, aby zbadać LC100 i LC0 pod kątem nowej substancji chemicznej, aby określić dawkę.
3. Rozcieńczyć każdą substancję chemiczną pożywką K (tabela materiałów) do 2x wymaganego stężenia. Użyj K-medium jako kontroli, aby porównać zmiany fenotypowe spowodowane przez chemikalia.
   1. Na przykład przygotuj 7 gradientowych stężeń chlorku kadmu (CdCl₂) (Tabela 1). Aby przygotować 2x najwyżej stężony roztwór wodny (4,64 mg/ml), rozpuść 92,8 mg stałego proszku CdCl₂ w 8 ml K-pożywki i napełnij do 10 ml po całkowitym rozpuszczeniu proszku. Przygotować pozostałe poziomy stężenia, rozcieńczając je pożywką K.
4. Przygotuj osiem równoległych studzienek dla każdego stężenia w gradiencie chemicznym. Każda studzienka zawiera 50 μl 2x roztworu chemicznego. Przygotować co najmniej trzy grupy po osiem równoległych studzienek pożywki K jako kontrole (Tabela 2).
   UWAGA: Krótko mówiąc, objętość 500 μL 2x roztworu roboczego jest niezbędna do podania pojedynczej dawki każdej substancji chemicznej.

2. Przygotowanie robaka

1. Uzyskaj robaki N2 typu dzikiego i szczepy Escherichia coli OP50 z Caenorhabditis Genetics Center (CGC).
2. Uzyskaj zsynchronizowane robaki L4.
   1. Wybierz pojedynczą kolonię E. coli OP50 z płytki smugowej. Aseptycznie zaszczepić kolonię w 100 ml bulionu LB i hodować ją przez noc w temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Roztwór E. coli OP50 jest teraz gotowy do wysiewu na płytki pożywki wzrostowej nicieni (NGM, Tabela Materiałów).
   2. Wlej NGM do plastikowej płytki Petriego o średnicy 90 mm. Wysiewaj każdą płytkę 300 μl roztworu E. coli OP50 następnego dnia po wylaniu. Inkubować robaki N2 na płytkach NGM z OP50 w temperaturze 20 °C przez około 2-3 dni, aż większość robaków osiągnie stadium dorosłe.
   3. Zbierz grawitacyjne robaki do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml ze sterylnym_H2O. Pozwól robakom osiąść na co najmniej 2 minuty, odessać H_2Oi dodać 5 ml buforu wybielającego (tabela materiałów).
   4. Wirować probówkę przez 5 minut, obracać probówkę przez 30 s (przy 1 300 x g) w celu osadzenia jaj i wyrzucić supernatant.
   5. Umyć jaja 5 ml sterylnego_H2Oi wirować probówkę przez 5 s. Odwirować probówkę przez 30 s (przy 1 300 x g), usunąć supernatant i ponownie umyć.
   6. Odpipetować jaja na nową płytkę NGM za pomocą OP50. Inkubować je w temperaturze 20 °C. Następnego ranka monitorować wyklute robaki L1; robaki osiągną stadium L4 w ciągu około 40 godzin.
3. Zmyć robaki L4 z 90 mm płytek Petriego za pomocą pożywki K-medium do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Dostosuj stężenie robaków do ~40 zwierząt na 100 μL pożywki K pod mikroskopem stereoskopowym. Dodaj 50 μl (~20 robaków) do każdego dołka płytki 384-dołkowej. Te zsynchronizowane robaki (stadium L4) są gotowe do następnego leczenia chemikaliami.

3. Obróbka chemiczna i nagrywanie filmów

UWAGA: W płytce 384-dołkowej, robaki (50 μL w każdym dołku) są traktowane sześcioma do siedmiu dawek pojedynczej substancji chemicznej (Tabela 1). Przygotować osiem równoległych studzienek, z których każda zawiera 50 μl 2x roztworu chemicznego dla każdej dawki (osiem studzienek jest wypełnionych tą samą substancją chemiczną i tym samym stężeniem, Tabela 2). Wszystkie filmy są zbierane za pomocą aparatu cyfrowego podłączonego do odwróconego mikroskopu (Tabela materiałów). Eksperyment z obróbką chemiczną trwa 24 godziny. Nie dodawaj pokarmu bakteryjnego do każdej studzienki podczas 24-godzinnego eksperymentu z obróbką chemiczną.

1. Przed dodaniem chemikaliów ustaw 384-dołkową płytkę ze zsynchronizowanymi robakami na automatycznym stoliku i nagraj filmy z każdej studzienki za pomocą zaprogramowanej procedury akwizycji (7 klatek na sekundę przez 2 s; skanowanie każdej płytki zajmuje ~25 minut).
2. Dodać 50 μl 2x chemicznego zapasu przygotowanego zgodnie z sekcją 1 dla każdej studzienki (Tabela 2). Ustaw czas jako punkt 0 h.
3. Inkubować 384-dołkową płytkę w temperaturze 20 °C i wstrząsnąć ją z prędkością 80 obr./min w wytrząsarce inkubatora.
4. Wyjąć płytkę z inkubatora i przenieść ją do etapu automatycznego. Zrób filmy z każdego dołka na całej płytce, po 12 godzinach i po 24 godzinach, aby sprawdzić fenotypy robaków dla każdej konkretnej obróbki chemicznej w pożywce K. Na jedno przesiewanie płyt potrzeba około 25 minut.

4. Eksperymentalne przetwarzanie wideo

UWAGA: Program do eksperymentalnego przetwarzania wideo i obrazów został napisany i spakowany. Można go bezpłatnie pobrać (patrz Spis Materiałów). Eksperymentalne wideo jest przechowywane w postaci sekwencji klatek obrazu, a sekwencja klatek każdego filmu jest przechowywana w określonym katalogu. Program może automatycznie rozpoznawać robaki i określać ilościowo fenotypy.

1. W graficznym interfejsie użytkownika (GUI, Rysunek 1) dodaj parametry, takie jak katalog sekwencji ramek, katalog wyjściowy, parametr rozmiaru robaka i parametr progu ruchu. Kliknij przycisk Analizuj, aby przetworzyć obrazy eksperymentalne.
   1. Kliknij przycisk Wybierz, aby wybrać katalog obrazów źródłowych.
   2. Dodaj środkowy katalog wyników w interface.
      UWAGA: Środkowe wyniki obejmują obrazy podzielone na segmenty. Te środkowe wyniki są przydatne do wizualnej obserwacji przetwarzanych obrazów.
   3. Dodaj katalog wyników końcowych w interfejsie.
   4. Dodaj parametr średniego rozmiaru robaka w polu tekstowym Rozmiar robaka w interface.
      UWAGA: Parametr rozmiaru używany w eksperymentach to 2 000.
   5. Dodaj Próg przesuniętego współczynnika w interfejsie.
      UWAGA: Współczynnik zastosowany w eksperymentach wynosi 0,93.
   6. Kliknij przycisk Analizuj, aby rozpocząć przetwarzanie obrazu. Kliknij przycisk Resetuj, aby wyczyścić dodane parametry.
      UWAGA: Istnieją 33 cechy zdefiniowane i określone ilościowo dla robaków. Wszystkie zdefiniowane fenotypy są posortowane według kategorii (wymienionych w tabeli 3). Cechy te można określić ilościowo na podstawie obrazów eksperymentalnych. Porównanie ilościowe między różnymi substancjami chemicznymi, które mają różną toksyczność, można przeprowadzić, porównując te cechy.

Wyniki

Przebadaliśmy fenotypy nicieni poddanych działaniu różnych stężeń ponad 10 substancji chemicznych¹². W teście dla każdego związku chemicznego w trzech punktach czasowych (0 h, 12 h i 24 h) zmierzono 33 odrębne cechy. Wcześniej przeprowadzono porównanie analizy manualnej i automatycznej w teście długości życia^11,12. W tym badaniu ustaliliśmy, że substancje chemiczne i ich stężenia mogą wpływać na fenotypy ni...

Dyskusja

Zalety C. elegans doprowadziły do jego coraz częstszego stosowania w toksykologii⁹, zarówno w badaniach mechanistycznych, jak i w wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych. Zwiększona rola C. elegans w uzupełnianiu innych systemów modelowych w badaniach toksykologicznych była w ostatnich latach niezwykła, zwłaszcza w przypadku szybkiej oceny toksyczności nowych substancji chemicznych. Niniejszy artykuł zawiera nowy test wysokoprzepustowych, ilościowych badań przesiewowych fenot...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
2-Propanol	Sigma-Aldrich	59300
Płytki 384-dołkowe	Throme	142761
Agar	Bacto	214010
Siarczan atropiny	Sigma-Aldrich	PHL80892
Bufor wybielający			0,5 ml 10 M NaOH, 0,5 ml 5% NaClO, 9 ml wody ultraczystej
Chlorek kadmu	Sigma-Aldrich
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	21074
Kamera CCD	Zeiss	AxioCam HRm	Zeiss microscopy GmbH
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C8667
Siarczan miedzi(II)	Sigma-Aldrich	451657
Etanol	Sigma-Aldrich	24105
Glikol etylenowy	Sigma-Aldrich	324558
Glicerol	Sigma-Aldrich	G5516
K-Medium			3,04 g NaCl i 2,39 g KCl w 1 l ultraczystej wody
LB Broth			10  g/L  Trypton,  5  g/L  Drożdże  Ekstrakt,  5  g/L  NaCl
Siarczan magnezu siedmiowodny	Sigma-Aldrich	63140
NGM Płytka			3 g NaCl, 17 g agaru, 2,5 g peptonu w 1 l ultraczystej wody, po autoklawie dodać 1 ml cholesterolu (5 mg/ml w etanolu), 1 ml MgSO4 (1 M), 1 ml CaCl2 (1 M), 25 ml buforu PPB
Pepton	Bacto	211677
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	60130
Fosforan potasu dwuzasadowy	Sigma-Aldrich	795496
Fosforan potasu jednozasadowy	Sigma-Aldrich	795488
bufor			35,6 g K2HPO4, 108,3 g KH2PO4 w 1 litrowej
wytrząsarce	ZHICHENG	ZWY-200D
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	71382
Fluorek	soduSigma-Aldrich	s7920
Wodorotlenek sodu	Sigma-Aldrich	71690
Roztwór podchlorynu sodu	Sigma-Aldrich	239305
Związek z programem
https://github.com/weiyangc/ImageProcessForWellPlate Trypton	Sigma-Aldrich	T7293
Ekstrakt drożdżowy	Sigma-Aldrich	Mikroskop automatyczny Y1625
Zeiss	Zeiss	AXIO Observer.Z1	Automatyczny mikroskop Zeiss z autorskim oprogramowaniem Zen2012 i kamerą z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD)

202908 PPB ultraczystej wody