Fagocytoza makrofagów pęcherzykowych i klirens bakteryjny u myszy

Podsumowanie

Tutaj przedstawiamy powszechne metody analizy funkcji fagocytarnej mysich makrofagów pęcherzykowych i klirensu bakteryjnego z płuc. Metody te badają fagocytozę in vitro kulek izotiocyjanianu fluoresceiny oraz fagocytozę in vivo białka zielonej fluorescencji Pseudomonas aeruginosa. Opisujemy również metodę usuwania P. aeruginosa u myszy.

Streszczenie

Makrofagi pęcherzykowe (AM) strzegą przestrzeni pęcherzykowej płuca. Fagocytoza przez AM odgrywa kluczową rolę w obronie przed atakującymi patogenami, usuwaniu martwych komórek lub obcych cząstek oraz w rozwiązywaniu reakcji zapalnych i przebudowie tkanek, procesach, w których pośredniczą różne receptory powierzchniowe AM. W tym miejscu przedstawiamy metody analizy funkcji fagocytarnej AM przy użyciu testów in vitro i in vivo oraz strategii eksperymentalnych w celu różnicowania fagocytozy za pośrednictwem receptora rozpoznawania wzorców, receptora dopełniacza i receptora gamma Fc. Na koniec omawiamy metodę ustalania i charakteryzowania modelu zapalenia płuc P. aeruginosa u myszy w celu oceny klirensu bakteryjnego in vivo. Testy te reprezentują najczęstsze metody oceny funkcji AM i mogą być również wykorzystywane do badania funkcji makrofagów i klirensu bakteryjnego w innych narządach.

Wprowadzenie

AMs są głównymi fagocytami rezydującymi w pęcherzykach płucnych w stanie spoczynku i jednym z głównych czynników wpływających na wrodzoną odpowiedź immunologiczną poprzez rozpoznawanie i internalizację wdychanych patogenów i obcych cząstek1^,2. Doniesiono, że AM są niezbędne do szybkiego usuwania wielu patogenów płucnych, takich jak P. aeruginosa i Klebsiella pneumonia^3,4, więc niedobór fagocytozy AM często powoduje infekcje dróg oddechowych, takie jak ostre zapalenie płuc, które powodują wyższą śmiertelność i zachorowalność.

AMs również inicjują wrodzone reakcje zapalne w płucach, wytwarzając cytokiny i chemokiny, takie jak TNF-α i IL-1β, które komunikują się z innymi komórkami środowiska pęcherzykowego w celu produkcji chemokin i rekrutacji zapalnych neutrofili, monocytów i adaptacyjnych komórek odpornościowych w płucach⁵. Na przykład IL-1β wytwarzana przez AMs pomaga w uwalnianiu chemokiny neutrofilowej CXCL8 z komórek nabłonkowych⁶. Co więcej, AM przyczyniają się do fagocytozy apoptotycznych leukocytów wielojądrzastych (PMN), których niepowodzenie prowadzi do trwałego wycieku enzymów wewnątrzkomórkowych z PMN do otaczającej tkanki, co skutkuje uszkodzeniem tkanek i przedłużonym stanem zapalnym^7,8,9.

Fagocytoza przez AMs jest pośredniczona przez bezpośrednie rozpoznawanie wzorców molekularnych związanych z patogenami na powierzchni patogenu przez receptory rozpoznawania wzorców (PRR) AMs lub przez wiązanie opsonizowanych patogenów z receptorami efektorów immunologicznych klasy AMs10. W tym ostatnim przypadku AM mogą rozpoznawać cele opsonizowane immunoglobuliną (IgG) przez ich receptory Fcγ (FcγR) lub patogeny pokryte fragmentami dopełniacza, C3b i C3bi, poprzez ich receptory dopełniacza (CR)¹¹. Wśród receptorów dopełniacza CR nadrodziny immunoglobulin (CRIg) ulega selektywnej ekspresji w makrofagach tkankowych¹², a niedawne odkrycie podkreśliło rolę CRIg w fagocytozie AM w kontekście zapalenia płuc P. aeruginosa¹³.

Wiele oryginalnych badań wykorzystuje metody do oceny fagocytozy makrofagów w celu opisania molekularnych mechanizmów funkcji makrofagów^14,15. Jednak metody takie jak fagocytoza in vivo wymagają precyzyjnego określenia ilościowego fagocytozy. W tym miejscu podsumowujemy szczegółową metodologię fagocytozy zarówno in vitro, jak i in vivo, stosując odpowiednio kulki szklane izotiocyjanianu fluoresceiny (FITC) i białko zielonej fluorescencji (GFP) P. aeruginosa. Ponadto wyjaśniamy metodę różnicowania fagocytozy za pośrednictwem PRR, CR i FcγR. Na koniec przedstawiamy metodę charakteryzowania klirensu bakteryjnego u myszy w odniesieniu do zapalenia płuc wywołanego przez P. aeruginosa.

Protokół

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Szkoły Medycznej Wschodniej Wirginii.

1. Koraliki fluorescencyjne Fagocytoza

1. Eutanazja myszy (C57BL/6J, 6 tygodni, samica) przez uduszenie CO₂ zgodnie z protokołami IACUC dotyczącymi etycznej eutanazji zwierząt.
2. Połóż mysz brzuchem do góry na desce sekcyjnej pokrytej ręcznikami papierowymi. Przygwoźdź jego łapy do dołu z rozłożonymi kończynami i zaczep sznurek pod przednimi zębami, aby odciągnąć głowę do tyłu, tak aby tchawica była ustawiona prosto i poziomo.
3. Zwilż gardło, klatkę piersiową i brzuch myszy 70% etanolem, aby zdezynfekować i zapobiec przywieraniu futra do narzędzi.
4. Za pomocą zwykłych kleszczy podciągnij skórę na linii środkowej ciała i przetnij nożyczkami chirurgicznymi w górę linii środkowej do górnej części gardła.
5. Używając końca standardowych nożyczek chirurgicznych, ostrożnie odsuń mięśnie i tkanki łączne na gardle i użyj nożyczek sprężynowych (mikronożyczek), aby odsłonić tchawicę.
6. Chwytając pierścień chrząstki kleszczami, ostrożnie wykonaj małe nacięcie (~1,5 mm) za pomocą mikronożyczek na powierzchni komory tchawicy i włóż kaniulę 18 G do tchawicy.
7. Delikatnie przepłukać 3 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), po 1 ml na raz. Za każdym razem delikatnie pobieraj płyn do strzykawki i wlej go z powrotem do płuc, 3 razy z rzędu. Po pobraniu BALF należy wykonać zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić eutanazję. Przenieś pobrany PBS (~2,8 ml), który jest płynem z płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BALF), do probówki, odwiruj przy 1,000 x g przez 10 minut i zbierz osad. Dodać 1 ml świeżego PBS do probówki i odwirować przy 1 000 x g przez 10 minut, aby umyć zanieczyszczenia i zebrać granulowane makrofagi pęcherzykowe.
8. Zawiesić osad w 2 ml zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco z 10% nieinaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS) i posaź pierwotne makrofagi pęcherzykowe w tym samym podłożu przez 2 dni na naczyniu ze szklanym dnem w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze.
9. Odessać starą pożywkę, przemyć ją 1 ml PBS i dodać 2 ml świeżej pożywki. Dodać kulki FITC (karboksylowane kulki lateksowe o średnicy 2 μm, 50 kulek/komórkę) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze.
10. Dokładnie umyj PBS (1 ml na raz, w sumie pięć prań), aby usunąć kulki zewnątrzkomórkowe. Zobrazuj losowo 100 komórek i policz komórki za pomocą kulek wewnątrzkomórkowych (488 nm).
    UWAGA: Indeksy fagocytarne to liczba połkniętych kulek podzielona przez całkowitą liczbę makrofagów; Procent komórek fagocytarnych to liczba makrofagów, które połykają co najmniej jeden koralik podzielona przez całkowitą liczbę makrofagów¹⁶.
    1. Alternatywnie, po 1 godzinnej inkubacji z kulkami, umyj komórki 3 ml PBS i przetwórz je do cytometrii przepływowej w celu ilościowego określenia fagocytozy. Podobnie, przetwarzaj AM bez kulek jako niebarwione komórki lub komórki kontrolne. Oblicz procentową dodatniość i średnią intensywność fluorescencji za pomocą oprogramowania do cytometrii przepływowej, wybierając te opcje w oprogramowaniu.

2. Fagocytoza zależna od FcγR i CR

1. W celu opsonizacji inkubować 2 x 10⁸ czerwonych krwinek owczych (SRBC) z 50 μL króliczego anty-SRBC-IgM lub 50 μL króliczego anty-SRBC-IgG przez 30 minut w temperaturze pokojowej¹¹.
2. Inkubować opsonizowane IgM-opsonizowane SRBC z 50 μl ludzkiej surowicy z niedoborem C5 (C5D) przez 30 minut w temperaturze 37 °C w celu utrwalenia fragmentów dopełniacza C3b i C3bi na SRBC pokrytych IgM.
3. Wysiewaj mysie komórki makrofagów myszy (komórki MH-S) (10 000 komórek / dołek) na 96-dołkowej płytce i inkubuj przez noc, aby uzyskać ~ 70% konfluencji. Dodać 100 μl 1 x 10 opsonizowanych SRBC 7/ml do każdego dołka komórek MH-S i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Bardzo szybko (~1 min) przemyć niezwiązane SRBC 100 μl buforu do lizy chlorku amonu i potasu (ACK).
4. Zjonizować komórki 0,1% SDS i dodać 50 μl 2,7-diaminofluorenu (DAF) zawierającego 3% nadtlenku wodoru i 6 M mocznika. Zmierzyć absorbancję formacji błękitu fluorenowego katalizowanego hemoglobiną przy długości fali 620 nm.
5. Określić liczbę SRBC, stosując krzywą wzorcową przy wartościach absorbancji 620 nm ze znaną liczbą SRBC. Podobnie, przetwarzaj komórki MH-S inkubowane z nieopsonizowanymi SRBC w celu wykorzystania jako kontroli negatywnej.

3. Fagocytoza zależna od PRR

1. Wykonaj kroki 1.1-1.9, aby wyizolować i wyhodować pierwotne makrofagi pęcherzykowe myszy.
2. Po 2 dniach usuń pożywkę, umyj komórki 1 ml PBS i dodaj 500 μl świeżej pożywki zawierającej biocząstki zymozanu A sprzężone z Alexa Fluor-488 (100 cząstek/naczynie).
3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zatrzymać fagocytozę, dodając 500 μl lodowatego PBS.
4. Dokładnie umyj komórki PBS (1 ml na raz, w sumie pięć płukań). Utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
5. Dokładnie umyj komórki PBS (1 ml na raz, w sumie pięć płukań) i trzymaj komórki w 500 μl PBS.
6. Zobrazuj komórki w kontraście interferencyjnym różnicowym i kanale fluorescencyjnym przy 488 nm. Policz AM zawierające biocząstki zymozanu-A i określ procent fagocytozy.

4. Fagocytoza in vivo przez makrofagi pęcherzykowe

UWAGA: Zaszczepij P. aeruginosa GFP na płytce z pożywką i inkubuj płytkę w temperaturze 37°C przez noc. Następnego dnia zaszczepij pojedynczą kolonię do 2 ml bulionu odżywczego i hoduj bakterie w temperaturze 37°C przez noc.

1. Następnego dnia znieczulij myszy dootrzewnowym podawaniem 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Potwierdź prawidłowe znieczulenie poprzez brak reakcji na uszczypnięcie palca u nogi.
2. Połóż mysz na płaskiej desce z gumką recepturką w poprzek górnych siekaczy i umieść ją w pozycji półleżącej (45°) z powierzchnią brzuszną i mównicą skierowaną do góry. Za pomocą zakrzywionych kleszczy częściowo schuj język. Za pomocą mikroopryskiwacza podać dotchawiczo 50 μL (5 x 10⁶ jednostek tworzących kolonie [CFU])¹⁷ P. aeruginosa GFP do płuc znieczulonych myszy.
3. Po 1 godzinie od infekcji wykonaj kroki 1.1-1.7.
4. Ponownie zawiesić komórki w PBS i poddać je cytowirówce (1000 x g, 1 min w temperaturze pokojowej) na szkiełku podstawowym.
5. Różnicowo wybarwić szkiełka cytospinowe pod kątem makrofagów pęcherzykowych, neutrofili i limfocytów, zgodnie z instrukcjami producenta.
6. Losowo wybierz 100 AM, policz AM zawierające bakterie wewnątrzkomórkowe i określ procent fagocytozy.

5. Usuwanie bakterii in vivo za pomocą P. aeruginosa

1. Zaszczepić P. aeruginosa na płytce agarowej do izolacji P. aeruginosa i inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez noc. Zaszczep pojedynczą kolonię do 2 ml bulionu lizogenicznego (LB) i hoduj bakterie w temperaturze 37°C przez noc. Oblicz jtk, używając następującego wzoru.
   
   CFU/ml = (liczba kolonii x współczynnik rozcieńczenia)/objętość płytki hodowlanej.
   
   Rozcieńczyć kulturę PBS, aby uzyskać pożądany CFU/ml.
2. W badaniu 1 wstrzyknąć dotchawiczo subletalną dawkę ~ 2,5 x 10⁵ CFU / ml P. aeruginosa znieczulonym myszom typu dzikiego (WT) i TRIM72^KO, jak podano w kroku 4.2. Mierz masę ciała codziennie przez 6 dni.
3. W badaniu 2 należy wstrzyknąć drugą dawkę P. aeruginosa (5 x 10⁵ CFU/ml) myszom, które przeżyły w badaniu 1 i mierzyć masę ciała przez 4 dni.
4. W badaniu 3, przy użyciu innego zestawu myszy, wstrzyknij myszom WT i TRIM72^KO śmiertelną dawkę (3 x 10⁷ CFU/mL) P. aeruginosa i zarejestruj śmiertelność w ciągu 2 dni od wstrzyknięcia. Zwierzęta wykazujące oznaki silnego stresu, takie jak znaczna utrata masy ciała, zgarbione plecy, anoreksja lub duszność, zostaną ocenione przez lekarzy weterynarii. Zwierzęta, które nie nadają się do leczenia, będą natychmiast uśmiercane.
5. W chwili śmierci lub po eutanazji w 2. dniu po wstrzyknięciu należy pobrać całą tkankę płucną w celu ilościowego określenia obciążenia bakteryjnego płuc w szczytowym momencie zakażenia.
6. Aby zbadać obciążenie bakteryjne płuc, dodaj 200 μl soli fizjologicznej do tkanek płucnych i homogenizuj je, używając wcześniej przetestowanego ustawienia na elektronicznym homogenizatorze, który całkowicie rozbija tkankę płucną bez rozbijania bakterii. Dostosować całkowitą objętość homogenatu płucnego do 1 ml i umieścić 100 μl lizatu płucnego na płytkach agarowych do izolacji Pseudomonas w 10-krotnych rozcieńczeniach seryjnych.
7. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 24 godziny i policzyć kolonie bakteryjne w celu oznaczenia jtk na całe płuco.

6. Analiza statystyczna

1. Użyj testu t-Studenta, aby określić istotność statystyczną różnicy między dwiema grupami. Rozważmy różnicę statystycznie istotną, gdy p < 0,05. Wszystkie dane są przedstawione jako średnie ± błędu standardowego średniej (SEM).

Wyniki

W pierwszej kolejności przeprowadziliśmy eksperyment w celu analizy fagocytozy przez pierwotne makrofagi pęcherzykowe (AMs) myszy. We wszystkich analizach porównywano AMs wyizolowane z myszy WT oraz TRIM72^KO. Jak pokazano na Ryc. 1A, mikroskopia fluorescencyjna wykazała, że fagocytoza szklanych kuleczek FITC przez pierwotne AMs myszy zachodzi po 1 h inkubacji. Ryc. 1B przedstawia anali...

Dyskusja

Pełniąc funkcję wymiany gazowej, płuca nieustannie konfrontują się z obcymi cząstkami, patogenami i alergenami. AM stanowią pierwszą linię obrony ze względu na swoją główną funkcję, a mianowicie fagocytozę. AM koordynują również z innymi komórkami odpornościowymi w niszczeniu patogenów i ustępowaniu stanu zapalnego. Tutaj opisaliśmy metody specyficznej oceny fagocytozy przez AM wyizolowane z płuca myszy. Protokół przedstawiony w tym manuskrypcie wyjaśnia szczegółowe badanie fagocytozy zarówno in vivo, jak i in vitro, któ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igła 18-G	Nipro Medyczna	CI + 1832-2C	Biologia molekularna klasy
2,7-diaminofluoren (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Biologia molekularna klasy
70% Etanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Klasa analityczna
96-dołkowa płytka	Corning	3603
Bufor do lizy klasy ACK	Life Technologies	A10492	Klasa biologii molekularnej
Alexa fluor-488 Biocząstka Zymosan-A	Thermofisher Scientific	Z23373	Biologia molekularna klasy
C5 niedobór surowicy	Sigma-Aldrich	C1163	Odczynnik biochemiczny
Wirówka	Labnet International	C0160-R
Cytospin 4 Cytotrifuge	Thermofisher Scientific	A78300101 wydanie 11
Pożywka do hodowli komórkowych DMEM	Gibco	11995-065	Klasa biologii komórki
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Klasa biologii komórki
Przepływ Cytometr	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Kleszcze	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Nadaje się do laboratoryjnej sekcji zwierząt
FITC-karboksylowane kulki lateksowe	Sigma-Aldrich	L4530	Klasa biologii komórki
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Nadaje się do dla  testy infekcji komórkowych
Naczynie ze szklanym dnem	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C
Strzykawka wysokociśnieniowa	Penn-Century	FMJ-250	Nadaje się do użytku laboratoryjnego
dla zwierząt Homogenizator	Omni International	TH-01
Nadtlenek wodoru	Sigma-Aldrich	H1009
odwróconej fluorescencji	Olympus	IX73
Ketamina Chlorowodorek	Hospira	CA-2904
Barwienia Shandon Kwik-Diff	Thermofisher Scientific	9990700	Klasa biologii komórki
LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Biologia molekularna klasa
LB Broth	Fisher Scientific	BP1427	klasy biologii molekularnej
Aerozol	Penn-Century	IA-1C	Nadaje się do użytku laboratoryjnego na zwierzętach
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	P6148	Odczynnik klasy
PBS	Gibco	20012-027	Klasa Cell Biology
królik anty-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Nadaje się do testów immunologicznych
królika anty-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Nadaje się do testów immunologicznych
Nożyczki	Miltex	5-2	Nadaje się do sekcji zwierząt laboratoryjnych
Laryngoskop dla małych zwierząt	Penn-Century	LS-2	Nadaje się do użytku laboratoryjnego
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	BioRad	1610301	Analityczne
nożyczki sprężynowe (Med)	Narzędzia do nauki pięknej	15012-12	Nadaje się do laboratoryjnego rozbioru zwierząt
Nożyczki sprężynowe (małe)	Fine Science Tools	91500-09	Nadaje się do laboratoryjnego rozbioru
czerwonych krwinek owiec (SRBC)	MP Biomedicals	55876	Umyte, zakonserwowane SRBC
Mocznik	Sigma-Aldrich	U5378	Klasa biologii molekularnej
Ksylazyna	Akorn Animal Health	59399-110-20	Klasa farmaceutyczna

do biologii komórki klasy biologii komórki Mikroskop klasy analitycznej klasy farmaceutycznej Mikroopryskiwacz