Artykuł metodologiczny

Przygotowanie materiałów grzybowych i roślinnych do wyjaśnienia strukturalnego za pomocą dynamicznej polaryzacji jądrowej w stanie stałym NMR

DOI:

10.3791/59152

⸱

12 lutego 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Louisiana State University, 2National High Magnetic Field Laboratory, 3Departments of Pediatrics, and Microbiology, Immunology and Parasitology, Louisiana State University Health Sciences Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiono protokół przygotowania 13 C,15znakowanych N próbek grzybów i roślin do wielowymiarowej spektroskopii NMR w ciele stałym i badań dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP).

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół pokazuje, jak jednolicie można wyprodukować 13C, 15N znakowanych materiałami grzybowymi i jak te miękkie materiały powinny być postępowane w eksperymentach NMR w stanie stałym i DNP o zwiększonej czułości. Szczegółowo opisana jest również procedura przetwarzania próbek biomasy roślinnej. Metoda ta pozwala na pomiar szeregu widm korelacji 1D i 2D 13 C-13C/15N, co umożliwia wyjaśnienie strukturalne złożonych biomateriałów w ich stanie naturalnym w wysokiej rozdzielczości, przy minimalnych zakłóceniach. Znakowanie izotopowe można zbadać, określając ilościowo intensywność w widmach 1D i wydajność przenoszenia polaryzacji w widmach korelacji 2D. Powodzenie przygotowania próbki do dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) można ocenić za pomocą współczynnika zwiększenia czułości. Dalsze eksperymenty badające aspekty strukturalne polisacharydów i białek doprowadzą do stworzenia modelu architektury trójwymiarowej. Metody te mogą być modyfikowane i dostosowywane do badania szerokiej gamy materiałów bogatych w węglowodany, w tym naturalnych ścian komórkowych roślin, grzybów, glonów i bakterii, a także syntetyzowanych lub projektowanych polimerów węglowodanowych i ich kompleksu z innymi cząsteczkami.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Węglowodany odgrywają kluczową rolę w różnych procesach biologicznych, takich jak magazynowanie energii, budowanie struktur oraz rozpoznawanie i adhezja komórek. Są one wzbogacone w ścianę komórkową, która jest podstawowym składnikiem roślin, grzybów, glonów i bakterii1,2,3. Ściana komórkowa służy jako centralne źródło do produkcji biopaliw i biomateriałów, a także jako obiecujący cel dla terapii przeciwdrobnoustrojowych4,5,6,7,8,9.

Współczesne zrozumienie tych złożonych materiałów zostało znacznie rozwinięte dzięki dziesięcioleciom wysiłków, które poświęcono na charakterystykę strukturalną przy użyciu czterech głównych metod biochemicznych lub genetycznych. Pierwsza główna metoda opiera się na sekwencyjnym traktowaniu przy użyciu ostrych chemikaliów lub enzymów w celu rozbicia ścian komórkowych na różne części, po czym następuje analiza składu i powiązań cukrów w każdej frakcji10. Metoda ta rzuca światło na rozkład domenowy polimerów, ale interpretacja może być myląca ze względu na właściwości chemiczne i fizyczne biomolekuł. Na przykład trudno jest określić, czy frakcja ekstrahowana alkaliami pochodzi z pojedynczej domeny mniej ustrukturyzowanych cząsteczek, czy z przestrzennie oddzielonych cząsteczek o porównywalnej rozpuszczalności. Po drugie, wyekstrahowane części lub całe ściany komórkowe można również zmierzyć za pomocą roztworu NMR w celu określenia wiązań kowalencyjnych, określanych również jako sieciowanie, między różnymi cząsteczkami11,12,13,14,15. W ten sposób można było zbadać szczegółową strukturę kotew kowalencyjnych, ale mogą istnieć ograniczenia wynikające z niskiej rozpuszczalności polisacharydów, stosunkowo małej liczby miejsc sieciowania oraz ignorowania efektów niekowalencyjnych, które stabilizują upakowanie polisacharydów, w tym wiązania wodorowe, siłę van der Waalsa, oddziaływanie elektrostatyczne i splątanie polimeru. Po trzecie, powinowactwo wiązania zostało określone in vitro przy użyciu izolowanych polisacharydów16,17,18,19, ale procedury oczyszczania mogą znacząco zmienić strukturę i właściwości tych biomolekuł. Metoda ta nie jest również w stanie odtworzyć wyrafinowanego osadzania i składania makrocząsteczek po biosyntezie. Wreszcie, fenotyp, morfologia komórki i właściwości mechaniczne mutantów genetycznych z osłabioną produkcją niektórych składników ściany komórkowej rzucają światło na funkcje strukturalne polisacharydów, ale potrzeba więcej dowodów molekularnych, aby połączyć te makroskopowe obserwacje z inżynieryjną funkcją maszyn białkowych20.

Ostatnie postępy w rozwoju i zastosowaniu wielowymiarowej spektroskopii NMR w stanie stałym wprowadziły unikalną okazję do rozwiązania tych strukturalnych zagadek. Eksperymenty NMR w stanie stałym 2D/3D umożliwiają badanie składu i architektury materiałów bogatych w węglowodany w stanie naturalnym w wysokiej rozdzielczości bez większych zakłóceń. Z powodzeniem przeprowadzono badania strukturalne zarówno pierwotnych, jak i wtórnych ścian komórkowych roślin, katalitycznego traktowanego biomasy, biofilmu bakteryjnego, duchów barwnikowych w grzybach oraz, ostatnio przez autorów, nienaruszonych ścian komórkowych w chorobotwórczym grzybie Aspergillus fumigatus21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Rozwój dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP)32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42 znacznie ułatwia wyjaśnienie strukturalne NMR, ponieważ zwiększenie czułości przez DNP znacznie skraca czas eksperymentowania na tych złożonych biomateriałach. Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje procedury znakowania izotopowego grzyba A. fumigatus oraz przygotowania próbek grzybów i roślin do charakterystyki NMR w stanie stałym i DNP. Podobne procedury etykietowania powinny mieć zastosowanie do innych grzybów ze zmienioną pożywką, a procedury przygotowania próbek powinny być ogólnie stosowane do innych biomateriałów bogatych w węglowodany.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Wzrost 13C, 15N znakowanego Aspergillus fumigatus Liquid Medium

  1. Przygotowanie nieznakowanej i 13C, 15N znakowanej pożywki wzrostowej
    UWAGA: Do utrzymania hodowli grzybów użyto zarówno pożywki z dekstrozy peptonowej z ekstraktem drożdżowym (YPD), jak i ulepszonego minimalnego podłoża 43. Wszystkie etapy po autoklawowaniu są wykonywane w okapie z przepływem laminarnym, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
    1. Przygotowanie nieznakowanego płynnego podłoża: Rozpuścić 6,5 g proszku YPD w 100 ml wody destylowanej, a następnie sterylizować w autoklawie przez 25 minut w temperaturze 134 °C.
    2. Przygotowanie nieoznakowanego podłoża stałego
      1. Dodać 1,5 g agaru i 6,5 g proszku YPD do 100 ml wody destylowanej.
      2. Podłoże należy sterylizować w autoklawie przez 25 minut w temperaturze 121 °C, a następnie schłodzić do temperatury około 50 °C.
      3. Przenieś 13-15 ml pożywki do każdej wstępnie sterylnej plastikowej szalki Petriego i natychmiast przykryj naczynie pokrywką.
    3. Przygotowanie 13C, 15N znakowanego płynnym podłożem
      UWAGA: Aby przygotować roztwór wzrostowy do znakowania izotopowego, minimalną pożywkę zawierającą 13C-glukozę i 15azotan N-sodu oraz roztwór pierwiastka śladowego przygotowuje się oddzielnie, a następnie miesza przed użyciem.
      1. Przygotować 100 ml minimalnej pożywki zawierającej izotopy, jak podano w tabeli 1. Doprowadzić pH do 6,6 za pomocą roztworu NaOH (1 M) lub HCl (1M).
      2. Autoklawować w monoklawie minimalną pożywkę przez 25 minut w temperaturze 121 °C.
      3. Przygotować 100 ml (1000x) roztworu pierwiastków śladowych, rozpuścić sole wymienione w tabeli 2 w wodzie destylowanej. Roztwór należy sterylizować w autoklawie przez 25 minut w temperaturze 134 °C. Ostudzić i przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C do krótkotrwałego stosowania. pH wyniesie około 6,5 i można je sprawdzić za pomocą pH-metru.
      4. Przed użyciem dodać 0,1 ml roztworu pierwiastków śladowych do 100 ml minimalnego podłoża w temperaturze 13C, 15N, jak podano w Tabeli 2.
  2. Wzrost materiałów grzybowych
    1. Przenieś niewielką ilość grzybów z magazynu na płytkę YPD za pomocą pętli zaszczepiającej w okapie z przepływem laminarnym. Przechowywać kulturę w temperaturze 30 °C przez 2 dni w inkubatorze.
    2. Użyj pętli zaszczepiającej, aby przenieść aktywną krawędź rosnącego grzyba do roztworu znakującego 13 C,15N w okapie z przepływem laminarnym. Przechowywać kulturę w temperaturze 30 °C przez 3-5 dni z prędkością 220 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem.
    3. Wirować przy 4 000 x g przez 20 minut. Usunąć supernatant i zebrać osad.
    4. Użyj pęsety, aby zebrać ~ 0,5 g dobrze uwodnionego granulatu (>50% wag. uwodnienia) do badań NMR. Utrata nawodnienia w dowolnym momencie znacznie pogorszy rozdzielczość widmową.
      UWAGA: W razie potrzeby, niewielka ilość (0,1 g) uwodnionej grzybni może zostać oddzielona i całkowicie wysuszona pod przepływem gazuN2 w kapturze lub liofilizarze, aby oszacować poziom nawodnienia i obliczyć procent suchej masy. Zazwyczaj pellet zawierający ~0,3 g suchej masy można uzyskać po 3 dniach. Jeśli eksperyment NMR, który ma być przeprowadzony, jest długi (>7 dni) i/lub jeśli stan grzybów wymaga ustalenia, materiał grzybowy można głęboko zamrozić w płynieN2 na 10-20 minut przed dalszym przetwarzaniem. Jeśli eksperyment będzie krótki (3-6 dni), zamrażanie można pominąć, aby próbka pozostała świeża.
    5. Nadmiar materiału wymieszać z 20% (v/v) glicerolu w probówce wirówkowej i przechowywać w zamrażarce o temperaturze -80 oC do długotrwałego przechowywania.

2. Przygotowanie A. fumigatus do badań NMR i DNP w stanie stałym

  1. Przygotowanie A. fumigatus do eksperymentów NMR w stanie stałym
    1. Próbkę grzybów znakowaną izotopem 13C, 15N (etap 1.2.4) należy dializować w stosunku do 1 l 10 mM buforu fosforanowego (pH 7,0) w temperaturze 4°C za pomocą worka do dializy z odciętą masą cząsteczkową 3,5 kDa w celu usunięcia małych cząsteczek z pożywki wzrostowej przez łączny okres 3 dni. Zmieniaj bufor dwa razy dziennie.
      UWAGA: Alternatywnie próbkę można myć 6-10 razy przy użyciu wody dejonizowanej w celu usunięcia resztek małych cząsteczek.
    2. Przenieść próbkę do probówki o pojemności 15 ml i wirować przez 5 minut (10 000 x g) za pomocą wirówki stołowej. Usuń supernatant i zbierz pozostałe materiały grzybowe.
    3. Umieść 70-80 mg równomiernie 13znakowanej C i dobrze uwodnionej pasty próbki do 4-milimetrowego wirnika ZrO2 lub rotora 30-50 mg do 3,2 mm do eksperymentów NMR. Kilkakrotnie delikatnie ściskać próbkę za pomocą metalowego pręta i wchłaniać nadmiar wody za pomocą papieru.
    4. Szczelnie zakryj wirnik i włóż próbkę do spektrometru w celu scharakteryzowania NMR w stanie stałym.
      UWAGA: Sugeruje się, aby fabrycznie nowe wirniki zminimalizować możliwość awarii wirnika i rozlania próbki w spektrometrze NMR. W razie potrzeby jednorazowa wkładka Kel-F ze uszczelniającymi może służyć jako pojemnik wtórny wewnątrz wirnika.
  2. Przygotowanie próbek A. fumigatus do doświadczeń DNP
    1. Przygotuj 100 μl rozpuszczalników DNP29,44 (znany również jako matryca DNP) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml dla 13 C,15próbek grzybów znakowanych N. Ta matryca DNP zawiera mieszaninę d 8-glicerolu/D2O/H2O (60/30/10 Vol%).
      UWAGA: Jeśli mają być badane próbki nieznakowane, należy przygotować matrycę DNP przy użyciu 13 d-8-glicerolu zubożonego w C (12C 3, 99,95%; D8, 98%) orazD2OiH2O, aby uniknąć udziału rozpuszczalników w sygnale 13C.
    2. Rozpuścić 0,7 mg AMUPol45 w 100 μl rozpuszczalników DNP, aby utworzyć 10 mM radykalnego roztworu podstawowego. Wirować przez 2-3 minuty, aby upewnić się, że rodniki są całkowicie rozpuszczone w roztworze.
    3. Namoczyć 10 mg dializowanych 13C, 15N znakowanych materiałami grzybowymi zgodnie z opisem w poprzednich krokach (kroki 2.1.1 i 2.1.2) w 50 μl roztworu AMUPolu i delikatnie zmielić mieszaninę za pomocą tłuczka i moździerza, aby zapewnić przenikanie rodników do porowatych ścian komórkowych><. UWAGA: Aby zmniejszyć szybkość utraty nawodnienia, mielenie może również odbywać się w probówce mikrowirówkowej za pomocą mikrotłuczka.
    4. Dodaj kolejne 30 μl roztworu rodnika do zmielonego osadu, aby jeszcze bardziej uwodnić próbkę grzyba.
    5. Zapakuj granulat do szafirowego wirnika o średnicy 3,2 mm, delikatnie ściśnij i usuń nadmiar rozpuszczalnika DNP. Dodaj silikonową zatyczkę o średnicy 3,2 mm, aby zapobiec utracie nawilżenia. Zazwyczaj do wirnika można zapakować 5-30 mg próbki. Dokładna ilość musi być określona na podstawie wymagań dotyczących czułości eksperymentów NMR, które mają być przeprowadzone.
    6. Włożyć i odkręcić próbkę do spektrometru DNP, zmierzyć widmo wzmocnione DNP pod wpływem promieniowania mikrofalowego i porównać je z widmem wyłączonym z mikrofal. Doprowadzi to dowłączenia/wyłączenia ε współczynnika wzmacniającego, który powinien wynosić 20-40 dla tych złożonych materiałów. Uruchom zaprojektowane eksperymenty, aby określić strukturę ściany komórkowej.

3. Przygotowanie biomasy roślinnej do badań NMR i DNP

  1. Przygotowanie materiałów roślinnych do NMR w stanie stałym
    1. Wyprodukuj jednolicie 13roślin z oznaczeniem C we własnym zakresie, używając 13zapasów CO2 w komorze wzrostowej lub 13pożywki C-glukozy, jak opisano wcześniej46,47 lub bezpośrednio kupuj oznakowane materiały od firm zajmujących się etykietowaniem izotopów.
      UWAGA: 13C-glukoza może być stosowana tylko w ciemnym wzroście, aby uniknąć wprowadzenia 12C w procesie fotosyntezy.
    2. Pokrój równomiernie oznakowany materiał roślinny o temperaturze 13C na małe kawałki (zwykle o wymiarach 1-2 mm) za pomocą laboratoryjnej żyletki.
      UWAGA: W zależności od celu, wyekstrahowane ściany komórkowe są czasami używane do charakterystyki strukturalnej, a szczegółowe protokoły są opisane w poprzednich badaniach21,46.
    3. Jeśli próbka została wcześniej wysuszona, dodać 100 μl wody do 30 mg materiałów roślinnych w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml, wirować, równoważyć w temperaturze pokojowej przez 1 dzień. Wirować przy 4 000 x g przez 10 minut i usunąć nadmiar wody za pomocą pipety.
    4. Jeśli próbka nigdy nie była suszona w żadnym momencie, należy użyć próbki bezpośrednio bez dalszej obróbki.
    5. Upakuj powstałe materiały roślinne w wirniki ZrO2 o średnicy 3,2 mm lub 4 mm w celu przeprowadzenia eksperymentów NMR w stanie stałym.
  2. Przygotowanie materiału roślinnego do badań DNP
    1. Przygotować 60 μl roztworu podstawowego 10 mM rodnika AMUPol zgodnie z opisanymi krokami 2.2.1 i 2.2.2.
    2. Materiał roślinny oznaczony równomiernie w temperaturze 13°C do badania należy pokroić na małe kawałki (o wymiarach 1-2 mm) za pomocą laboratoryjnej żyletki i zważyć 20 mg materiału roślinnego.
    3. Ręcznie zmiel kawałki rośliny na małe cząstki (o wielkości ~1-2 mm) za pomocą moździerza i tłuczka. Końcowe proszki mają jednorodny wygląd.
    4. Dodać 40 μl roztworu podstawowego DNP przygotowanego w poprzednim etapie (etap 2.2.2) do materiału roślinnego i delikatnie mielić przez 5 minut, aby zapewnić jednorodne wymieszanie z rodnikiem.
    5. Dodaj kolejne 20 μl roztworu podstawowego, aby jeszcze bardziej uwodnić materiał roślinny po zmieleniu.
    6. Zapakuj zrównoważoną próbkę rośliny do szafirowego wirnika o średnicy 3,2 mm w celu przeprowadzenia eksperymentów DNP. Włóż silikonową zatyczkę, aby uniknąć utraty nawodnienia.

4. Standardowe eksperymenty NMR w stanie stałym do wstępnej charakterystyki biomateriałów bogatych w węglowodany

UWAGA: Krótki przegląd eksperymentów NMR znajduje się w tej sekcji. Jednak wyjaśnienie strukturalne zazwyczaj wymaga rozległej wiedzy specjalistycznej. Dlatego zaleca się współpracę ze spektroskopistami NMR.

  1. Zmierz widma 1D 13C Cross Polarization (CP), 13C Direct Polarization (DP) z 2-s i 35-s opóźnieniami recyklingu oraz 1 H-13C INEPT48,49 stry, aby uzyskać ogólne zrozumienie dynamicznego rozkładu składników komórek (Rysunek 1a). Ściany komórkowe są zazwyczaj stosunkowo sztywną częścią i wykazują dominujące sygnały w widmie CP.
  2. Zmierz serię standardowych eksperymentów korelacji 2D 13 C-13C w celu przypisania rezonansu sygnałów 13C. Zacznij od ponownego skoncentrowania INADEQUATE50,51, aby uzyskać łączność węglową, która musi być wspomagana przez serię eksperymentów w przestrzeni, takich jak 1,5-ms RFDR52 (Rysunek 1b) i 50-ms CORD/DARR53 eksperymenty.
    UWAGA: Jeśli interesujące jest znalezienie próbki bogatej w określony składnik, na przykład pierwotne lub wtórne ściany komórkowe, może być konieczne osobne zmierzenie wielu segmentów lub wielu roślin, aby znaleźć próbkę o optymalnym składzie.
  3. Przeprowadzanie eksperymentów korelacji 2D 15 N-13C, które można zmierzyć, aby ułatwić przypisywanie rezonansu białek i węglowodanów azotowanych.
    UWAGA: Przypisanie rezonansu jest zazwyczaj czasochłonne. Obecnie opracowywana jest metoda, która ma ułatwić rezonansowe przypisywanie sygnałów węglowodanowych tym naukowcom, którzy nie mają wcześniejszego doświadczenia.
  4. Zmierz bardziej specjalistyczne eksperymenty, aby określić bliskości przestrzenne (Rysunek 1c, d), nawodnienie i ruchliwość złożonych biomolekuł, aby określić trójwymiarową strukturę materiałów bogatych w węglowodany, jak systematycznie opisano wcześniej22,29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znakowanie izotopów znacznie zwiększa czułość NMR i umożliwia pomiar serii widm korelacji 2D 13 C-13C i 13 C-15N w celu analizy składu, hydratacji, mobilności i upakowania polimerów, które zostaną zintegrowane w celu skonstruowania trójwymiarowego modelu architektury ściany komórkowej (Rysunek 1). Jeśli jednolite znakowanie się powiedzie, w ciągu 1 godziny można zebrać kompletny zestaw widm 1D 13C i 15N,...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W porównaniu z metodami biochemicznymi, NMR w stanie stałym ma zalety jako technika nieniszcząca o wysokiej rozdzielczości. NMR jest również ilościowy w analizie składu i w przeciwieństwie do większości innych metod analitycznych nie ma niepewności wynikających z ograniczonej rozpuszczalności biopolimerów. Ustanowienie obecnego protokołu ułatwia przyszłe badania nad biomateriałami bogatymi w węglowodany i funkcjonalizowanymi polimerami. Należy jednak zauważyć, że przypisywanie rezonansu i analiza danych mogą być czasochł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez National Science Foundation poprzez NSF OIA-1833040. Narodowe Laboratorium Silnych Pól Magnetycznych (NHMFL) jest wspierane przez National Science Foundation za pośrednictwem DMR-1157490 i stan Floryda. System MAS-DNP w NHMFL jest częściowo finansowany przez NIH S10 OD018519 i NSF CHE-1229170.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Tetrahydrat molibdenianu amonuAcros Organics12054-85-2
AMUPolCortecnetC010P002
Waga analitycznaOhausB730439218Model PA84C
Bioklaw 16 LVWR470230-598
Szafa bezpieczeństwa biologicznegoLabconco corporation302319100
Kwas borowyVWRBDH9222przechowywać w sklepach w godzinach 15-30 &; C
Sześciowodny chlorek kobaltu(II)Honeywell |Fluka60820≥ 98 %
Pięciowodny siarczan miedzi(II)BDHBDH9312≥ 98 %
Inkubator wytrząsający Corning LSEThermo Fisher Scientific7202152
D2OSigma Aldrich15188299,9 atom % D
d6-DMSOSigma Aldrich15187499,9 atom % D
d8-glicerolSigma Aldrich447498≥ 99 atom % D
Rurka do dializy 3,2 kDaSigma AldrichD2272132724
Fosforan dipotasowyVWRBDH9266≥ 98 %
GlicerolSigma AldrichG5516≥ 99,5 %
Wirówka Heraus Megafuge 16RThermo Fischer Scientific750004271Maksymalny RCF 25 830 x g
Zestaw jednorazowych wkładek HR-MASBrukerB4493Kel-F
Siarczan żelaza(II) siedmiowodnyAlfa Aesar14498≥ 99+ %
Siarczan magnezu siedmiowodnyVWR10034998przechowywać w temperaturze 18-26 stopni; C
Tetrahydrat chlorku manganu(II)Alfa Aesar11563≥ 99 %
Fosforan monopotasowyVWR470302-254≥ 99
pH-metrMettler ToledoB706689216
Tetrasodowy etylenodiaminotetraoctanAcros Organics13235-36-9≥ 99,5 %
Siarczan siedmiowodnyAlfa Aesar33399&ge; 98
12C3, d8-glicerolCambridge Isotope LaboratoryCDLM-866012C3, 99,95%; D8, 98%
13C6-glukozaSigma Alrdrich 364606≥ 99 % (CP)
15azotan soduSigma Aldrich364606≥ 98 % 15N, ≥ 99 (cp)
Szafirowy wirnik NMR 3,2 mmCortecnetB6939
3,2 mm Wtyczka silikonowaBrukerB7089
Zestaw wirnika MAS 4 mmBrukerH14355Cyrkonia
% %

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Murrey, H. E., Hsieh-Wilson, L. C. The chemical neurobiology of carbohydrates. Chemical Reviews. 108 (5), 1708-1731 (2008).
  2. Latge, J. P. The cell wall: a carbohydrate armour for the fungal cell. Molecular Microbiology. 66 (2), 279-290 (2007).
  3. Cosgrove, D. J. Growth of the plant cell wall. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (11), 850-861 (2005).
  4. Furtado, A., et al. Modifying plants for biofuel and biomaterial production. Plant Biotechnology Journal. 12 (9), 1246-1258 (2014).
  5. Loqué, D., Scheller, H. V., Pauly, M. Engineering of plant cell walls for enhanced biofuel production. Current Opinion in Plant Biology. 25, 151-161 (2015).
  6. Latge, J. P. Aspergillus fumigatus and aspergillosis. Clinical Microbiology Reviews. 12 (2), 310-350 (1999).
  7. Ragauskas, A. J., et al. The path forward for biofuels and biomaterials. Science. 311 (5760), 484-489 (2006).
  8. Service, R. F. Cellulosic ethanol - Biofuel researchers prepare to reap a new harvest. Science. 315 (5818), 1488-1491 (2007).
  9. Somerville, C., Youngs, H., Taylor, C., Davis, S. C., Long, S. P. Feedstocks for Lignocellulosic Biofuels. Science. 329 (5993), 790-792 (2010).
  10. Schiavone, M., et al. A combined chemical and enzymatic method to determine quantitatively the polysaccharide components in the cell wall of yeasts. FEMS Yeast Research. 14 (6), 933-947 (2014).
  11. Cheng, K., Sorek, H., Zimmermann, H., Wemmer, D. E., Pauly, M. Solution-State 2D NMR Spectroscopy of Plant Cell Walls Enabled by a Dimethylsulfoxide-d(6)/1-Ethyl-3-methylimidazolium Acetate Solvent. Analytical Chemistry. 85 (6), 3213-3221 (2013).
  12. Mansfield, S. D., Kim, H., Lu, F. C., Ralph, J. Whole plant cell wall characterization using solution-state 2D NMR. Nature Protocols. 7 (9), 1579-1589 (2012).
  13. Tan, L., et al. An Arabidopsis Cell Wall Proteoglycan Consists of Pectin and Arabinoxylan Covalently Linked to an Arabinogalactan Protein. Plant Cell. 25 (1), 270-287 (2013).
  14. Kollar, R., Petrakova, E., Ashwell, G., Robbins, P. W., Cabib, E. Architecture of the Yeast-Cell Wall - the Linkage between Chitin and Beta(1-3)-Glucan. Journal of Biological Chemistry. 270 (3), 1170-1178 (1995).
  15. Kollar, R., et al. Architecture of the yeast cell wall - beta(1->6)-glucan interconnects mannoprotein, beta(1-3)-glucan, and chitin. Journal of Biological Chemistry. 272 (28), 17762-17775 (1997).
  16. Mccann, M. C., et al. Old and new ways to probe plant cell wall architecture. Canadian Journal of Botany. 73, S103-S113 (1995).
  17. Whitney, S. E. C., Brigham, J. E., Darke, A. H., Reid, J. S. G., Gidley, M. J. In-Vitro Assembly of Cellulose/Xyloglucan Networks - Ultrastructural and Molecular Aspects. The Plant Journal. 8 (4), 491-504 (1995).
  18. Zykwinska, A. W., Ralet, M. C. J., Garnier, C. D., Thibault, J. F. J. Evidence for in vitro binding of pectin side chains to cellulose. Plant Physiology. 139 (1), 397-407 (2005).
  19. Kiemle, S. N., et al. Role of (1,3)(1,4)-beta-Glucan in Cell Walls: Interaction with Cellulose. Biomacromolecules. 15 (5), 1727-1736 (2014).
  20. Pogorelko, G., Lionetti, V., Bellincampi, D., Zabotina, O. Cell wall integrity: targeted post-synthetic modifications to reveal its role in plant growth and defense against pathogens. Plant Signaling & Behavior. 8 (9), e25435(2013).
  21. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  22. Wang, T., Salazar, A., Zabotina, O. A., Hong, M. Structure and dynamics of Brachypodium primary cell wall polysaccharides from two-dimensional 13C solid-state nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biochemistry. 53 (17), 2840-2854 (2014).
  23. Grantham, N. J., et al. An even pattern of xylan substitution is critical for interaction with cellulose in plant cell walls. Nature Plants. 3 (11), 859-865 (2017).
  24. Simmons, T. J., et al. Folding of xylan onto cellulose fibrils in plant cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 7, 13902(2016).
  25. Komatsu, T., Kikuchi, J. Selective Signal Detection in Solid-State NMR Using Rotor-Synchronized Dipolar Dephasing for the Analysis of Hemicellulose in Lignocellulosic Biomass. The Journal of Physical Chemistry Letters. 4 (14), 2279-2283 (2013).
  26. Perras, F. A., et al. Atomic-Level Structure Characterization of Biomass Pre- and Post-Lignin Treatment by Dynamic Nuclear Polarization-Enhanced Solid-State NMR. The Journal of Physical Chemistry A. 121 (3), 623-630 (2017).
  27. Chatterjee, S., Prados-Rosales, R., Itin, B., Casadevall, A., Stark, R. E. Solid-state NMR Reveals the Carbon-based Molecular Architecture of Cryptococcus neoformans Fungal Eumelanins in the Cell Wall. Journal of Biological Chemistry. 290 (22), 13779-13790 (2015).
  28. Zhong, J., Frases, S., Wang, H., Casadevall, A., Stark, R. E. Following fungal melanin biosynthesis with solid-state NMR: biopolymer molecular structures and possible connections to cell-wall polysaccharides. Biochemistry. 47 (16), 4701-4710 (2008).
  29. Kang, X., et al. Molecular architecture of fungal cell walls revealed by solid-state NMR. Nature Communications. 9 (1), 2747(2018).
  30. Takahashi, H., et al. Solid-state NMR on bacterial cells: selective cell wall signal enhancement and resolution improvement using dynamic nuclear polarization. Journal of the American Chemical Society. 135 (13), 5105-5110 (2013).
  31. Wang, T., Hong, M. Solid-state NMR investigations of cellulose structure and interactions with matrix polysaccharides in plant primary cell walls. Journal of Experimental Botany. 67, 503-514 (2016).
  32. Mentink-Vigier, F., Akbey, Ü, Oschkinat, H., Vega, S., Feintuch, A. Theoretical aspects of magic angle spinning-dynamic nuclear polarization. Journal of Magnetic Resonance. 258, 102-120 (2015).
  33. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  34. Takahashi, H., Hediger, S., De Paëpe, G. Matrix-free dynamic nuclear polarization enables solid-state NMR 13 C-13 C correlation spectroscopy of proteins at natural isotopic abundance. Chemical Communications. 49 (82), 9479-9481 (2013).
  35. Ni, Q. Z., et al. High frequency dynamic nuclear polarization. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1933-1941 (2013).
  36. Koers, E. J., et al. NMR-based structural biology enhanced by dynamic nuclear polarization at high magnetic field. Journal of Biomolecular NMR. 60 (2-3), 157-168 (2014).
  37. Saliba, E. P., et al. Electron Decoupling with Dynamic Nuclear Polarization in Rotating Solids. Journal of the American Chemical Society. 139 (18), 6310-6313 (2017).
  38. Mentink-Vigier, F., et al. Efficient cross-effect dynamic nuclear polarization without depolarization in high-resolution MAS NMR. Chemical Science. 8 (12), 8150-8163 (2017).
  39. Smith, A. N., Twahir, U. T., Dubroca, T., Fanucci, G. E., Long, J. R. Molecular Rationale for Improved Dynamic Nuclear Polarization of Biomembranes. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (32), 7880-7888 (2016).
  40. Su, Y., Andreas, L., Griffin, R. G. Magic angle spinning NMR of proteins: high-frequency dynamic nuclear polarization and 1H detection. Annual Reviews of Biochemistry. 84, 465-497 (2015).
  41. Hediger, S., Lee, S., Mentink-Vigier, F., Paepe, G. D. MAS-DNP Enhancements: Hyperpolarization, Depolarization, and Absolute Sensitivity. eMagRes. 7, 1-13 (2018).
  42. Ni, Q. Z., et al. In Situ Characterization of Pharmaceutical Formulations by Dynamic Nuclear Polarization Enhanced MAS NMR. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (34), 8132-8141 (2017).
  43. Hill, T. W., Kafer, E. Improved protocols for Aspergillus minimal medium: trace element and minimal medium salt stock solutions. Fungal Genetics Reports. 48 (1), 20-21 (2001).
  44. Rossini, A. J., et al. Dynamic nuclear polarization surface enhanced NMR spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 46 (9), 1942-1951 (2013).
  45. Sauvée, C., et al. Highly efficient, water-soluble polarizing agents for dynamic nuclear polarization at high frequency. Angewandte Chemie International Edition. 125 (41), 11058-11061 (2013).
  46. Phyo, P., et al. Gradients in Wall Mechanics and Polysaccharides along Growing Inflorescence Stems. Plant physiology. 175 (4), 1593-1607 (2017).
  47. White, P. B., Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Water-polysaccharide interactions in the primary cell wall of Arabidopsis thaliana from polarization transfer solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 136 (29), 10399-10409 (2014).
  48. Jippo, T., Kamo, O., Nagayama, K. Determination of long-range proton-carbon 13 coupling constants with selective two-dimensional INEPT. Journal of Magnetic Resonance. 66 (2), 344-348 (1969).
  49. Morris, G. A. Sensitivity enhancement in nitrogen-15 NMR: polarization transfer using the INEPT pulse sequence. Journal of the American Chemical Society. 102 (1), 428-429 (1980).
  50. Cadars, S., et al. The refocused INADEQUATE MAS NMR experiment in multiple spin-systems: interpreting observed correlation peaks and optimising lineshapes. Journal of Magnetic Resonance. 188 (1), 24-34 (2007).
  51. Lesage, A., Bardet, M., Emsley, L. Through-bond carbon− carbon connectivities in disordered solids by NMR. Journal of the American Chemical Society. 121 (47), 10987-10993 (1999).
  52. Bennett, A. E., et al. Homonuclear radio frequency-driven recoupling in rotating solids. The Journal of Chemical Physics. 108 (22), 9463-9479 (1998).
  53. Lu, X., Guo, C., Hou, G., Polenova, T. Combined zero-quantum and spin-diffusion mixing for efficient homonuclear correlation spectroscopy under fast MAS: broadband recoupling and detection of long-range correlations. Journal of Biomolecular NMR. 61 (1), 7-20 (2015).
  54. Wang, T., Zabotina, O., Hong, M. Pectin-cellulose interactions in the Arabidopsis primary cell wall from two-dimensional magic-angle-spinning solid-state nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 51 (49), 9846-9856 (2012).
  55. Wang, T., Yang, H., Kubicki, J. D., Hong, M. Cellulose Structural Polymorphism in Plant Primary Cell Walls Investigated by High-Field 2D Solid-State NMR Spectroscopy and Density Functional Theory Calculations. Biomacromolecules. 17 (6), 2210-2222 (2016).
  56. Kirui, A., et al. Atomic Resolution of Cotton Cellulose Structure Enabled by Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR. Cellulose. , In Press (2019).
  57. Wang, T., et al. Sensitivity-enhanced solid-state NMR detection of expansin's target in plant cell walls. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (41), 16444-16449 (2013).
  58. Wang, T., Park, Y. B., Cosgrove, D. J., Hong, M. Cellulose-Pectin Spatial Contacts Are Inherent to Never-Dried Arabidopsis thaliana Primary Cell Walls: Evidence from Solid-State NMR. Plant Physiology. 168 (3), 871-884 (2015).
  59. Liao, S. Y., Lee, M., Wang, T., Sergeyev, I. V., Hong, M. Efficient DNP NMR of membrane proteins: sample preparation protocols, sensitivity, and radical location. Journal of Biomolecular NMR. 64 (3), 223-237 (2016).
  60. Kang, X., et al. Lignin-Polysaccharide Interactions in Plant Secondary Cell Walls Revealed by Solid-State NMR. Nature Communications. 10, 347(2019).
  61. Takahashi, H., et al. Rapid Natural-Abundance 2D 13C-13C Correlation Spectroscopy Using Dynamic Nuclear Polarization Enhanced Solid-State NMR and Matrix-Free Sample Preparation. Angewandte Chemie International Edition. 51 (47), 11766-11769 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Materia y grzybowebiomasa ro linnaznakowanie izotopoweprzygotowanie pr bekspektroskopia NMRanaliza DNPw giel 13 azot 15architektura ciany kom rkowej

Powiązane artykuły