Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Summary

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Abstract

Wewnętrzne komórki rzęsate ślimaka (IHC) przesyłają sygnały akustyczne do neuronów spiralnych (SGN) poprzez synapsy wstęgowe. Kilka badań eksperymentalnych wykazało, że synapsy komórek rzęsatych mogą być początkowymi celami w odbiorczym ubytku słuchu (SNHL). W takich badaniach zaproponowano koncepcję "synaptopatii" ślimaka, która odnosi się do zmian w liczbie, strukturze lub funkcji synaps wstęgowych, które skutkują nieprawidłową transmisją synaptyczną między IHC i SGN. Chociaż synaptopatia ślimakowa jest nieodwracalna, nie wpływa na próg słyszenia. W modelach eksperymentalnych wywołanych hałasem, ograniczone uszkodzenie synaps IHC w wybranych obszarach częstotliwości jest wykorzystywane do identyfikacji czynników środowiskowych, które specyficznie powodują synaptopatię, a także fizjologicznych konsekwencji zakłócenia tego obwodu ucha wewnętrznego. W tym miejscu przedstawiamy protokół analizy morfologii i funkcji synaps ślimaka w określonym regionie częstości u dorosłych myszy. W tym protokole lokalizacja ślimaka w określonych regionach częstości jest przeprowadzana przy użyciu map miejsca i częstotliwości w połączeniu z danymi ze ślimaka, po czym ocenia się cechy morfologiczne synaps wstęgowych za pomocą synaptycznego barwienia immunologicznego. Stan funkcjonalny synaps wstęgowych jest następnie określany na podstawie amplitudy fali I słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR). Niniejszy raport pokazuje, że podejście to może być wykorzystane do pogłębienia naszej wiedzy na temat patogenezy i mechanizmów dysfunkcji synaps w ślimaku, co może pomóc w opracowaniu nowych interwencji terapeutycznych.

Introduction

Częstotliwości w zakresie około 20\u201220,000 Hz mogą być odbierane przez ludzi jako bodźce słuchowe. Ludzki słuch jest zwykle najbardziej wrażliwy w pobliżu 1 000 Hz, gdzie średni poziom ciśnienia akustycznego wynosi 20 μPa u młodych dorosłych (tj. 0 decybeli poziomu ciśnienia akustycznego [dB SPL]). W niektórych stanach patologicznych ubytek słuchu jest ograniczony do określonych częstotliwości. Na przykład we wczesnych stadiach ubytku słuchu wywołanego hałasem (NIHL) na audiogramie można zaobserwować "wcięcie" (tj. podniesienie progu słyszenia) przy 4 kHz¹. Wzdłuż przegrody ślimaka ssaków, jego gradacje sztywności i masy tworzą wykładniczą mapę częstotliwości, z detekcją dźwięku o wysokiej częstotliwości u podstawy ślimaka i detekcją niskiej częstotliwości u podstawy ślimaka i detekcją niskiej częstotliwości w apex². Rzeczywiście, wzdłuż błony podstawnej znajduje się mapa lokalizacji ślimaka, co prowadzi do tego, co jest znane jako organizacja tonotopowa^2,3. Każde dane miejsce na błonie podstawnej ma najwyższą czułość tylko na jedną konkretną częstotliwość dźwięku, która jest zwykle określana jako częstotliwość charakterystyczna^3,4, chociaż można również zaobserwować reakcje na inne częstotliwości.

Do tej pory różne modele myszy były wykorzystywane do badania normalnego funkcjonowania, procesów patologicznych i skuteczności terapeutycznej w systemie słuchowym. Dokładna znajomość parametrów fizjologicznych ślimaka myszy jest warunkiem koniecznym do przeprowadzenia takich badań nad ubytkiem słuchu. Ślimak myszy jest anatomicznie podzielony na zwoje wierzchołkowe, środkowe i podstawne, które odpowiadają różnym obszarom częstotliwości. Oznaczając aferenty nerwu słuchowego w jądrze ślimaka w celu przeanalizowania odpowiadających im obwodowych miejsc unerwienia w ślimaku, Müller i wsp. udało się ustalić mapę częstości występowania miejsc w ślimaku u normalnej myszy in vivo⁵. W przedziale 7,2–61,8 kHz, który odpowiada położeniom między 90% a 10% pełnej długości błony podstawnej, mapa miejsca i częstotliwości ślimaka myszy może być opisana za pomocą prostej funkcji regresji liniowej, sugerującej związek między znormalizowaną odległością od podstawy ślimaka a logarytmem częstotliwości charakterystycznej⁵. U myszy laboratoryjnych mapa miejsca-częstotliwości może być wykorzystana do zbadania związku między progami słyszenia w określonych zakresach częstotliwości a ślimakami pokazującymi liczbę brakujących komórek rzęsatych w względnych obszarach wzdłuż błony podstawnej⁶. Co ważne, mapa częstotliwości miejsc zapewnia system pozycjonowania do badania minimalnych uszkodzeń strukturalnych, takich jak uszkodzenia synaps wstęgowych komórek rzęsatych w określonych lokalizacjach częstotliwości ślimaka u myszy z obwodowym urazem słuchowym^7,8.

W ślimaku ssaków, synapsy wstęgowe składają się z wstęgi presynaptycznej, gęstej od elektronów projekcji, która wiąże aureolę gotowych do uwolnienia pęcherzyków synaptycznych zawierających glutaminian w IHC, oraz postsynaptycznego zagęszczenia na końcu nerwowym SGN z receptorami glutaminianu⁹. Podczas transdukcji dźwięku ślimakowego ugięcie pęczka komórek rzęsatych powoduje depolaryzację IHC, która prowadzi do uwalniania glutaminianu z IHC do postsynaptycznych zakończeń aferentnych, aktywując w ten sposób szlak słuchowy. Aktywacja tej ścieżki prowadzi do przekształcenia sygnałów mechanicznych indukowanych dźwiękiem w kod szybkości w klasie SGN10. Rzeczywiście, synapsa wstęgowa IHC jest wysoce wyspecjalizowana w niestrudzonej transmisji dźwięku z szybkością setek Hz z dużą precyzją czasową i ma kluczowe znaczenie dla presynaptycznych mechanizmów kodowania dźwięku. Wcześniejsze badania wykazały, że synapsy wstęgowe różnią się znacznie pod względem wielkości i liczby w różnych regionach częstotliwości u dorosłej myszy cochlea^11,12, co prawdopodobnie odzwierciedla strukturalną adaptację do konkretnego kodowania dźwięku dla potrzeb przetrwania. Niedawne eksperymentalne badania na zwierzętach wykazały, że synaptopatia ślimakowa przyczynia się do wielu form upośledzenia słuchu, w tym ubytku słuchu spowodowanego hałasem, ubytku słuchu związanego z wiekiem i dziedzicznego ubytku słuchu^13,14. W związku z tym metody identyfikacji skorelowanych zmian w liczbie, strukturze i funkcji synaps w określonych regionach częstotliwości są coraz częściej stosowane w badaniach nad rozwojem słuchu i chorobami ucha wewnętrznego, przy użyciu modeli wygenerowanych za pomocą eksperymentalnej manipulacji zmiennymi genetycznymi lub środowiskowymi^15,16,17.

W bieżącym raporcie prezentujemy protokół analizy liczby, struktury i funkcji synaptycznej w określonym obszarze częstotliwości błony podstawnej u dorosłych myszy. Lokalizacja częstości ślimaka jest wykonywana przy użyciu danej mapy miejsca-częstotliwości w połączeniu z ślimakiem. Normalne cechy morfologiczne synaps wstęgowych ślimaka są oceniane za pomocą presynaptycznego i postsynaptycznego barwienia immunologicznego. Stan funkcjonalny synaps wstęgowych ślimaka określa się na podstawie amplitud nadprogowych I fali ABR. Z niewielkimi zmianami protokół ten może być stosowany do badania stanów fizjologicznych lub patologicznych w innych modelach zwierzęcych, w tym szczurach, świnkach morskich i myszoskoczkach.

Protocol

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NRC/ILAR dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (8. edycja). Protokół badania został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Stołecznego Uniwersytetu Medycznego w Pekinie w Chinach.

1. Selekcja zwierząt

1. Do wszystkich eksperymentów użyj dorosłych samców myszy C57BL/6J (w wieku 8 tygodni) jako modelu zwierzęcego.
   nuta: Myszy C57BL/6J noszące wariant splicingu Cdh23 wykazują przyspieszone starzenie się układu słuchowego, co objawia się 40% utratą synaps wstęgowych w podstawowym zwoju ślimaka i 10% utratą środkowego obrotu w wieku 6 miesięcy, po czym następuje szybki wzrost tej utraty w całym ślimaku wraz z wiekiem^{18, 19}. Dlatego zalecamy ostrożność podczas używania myszy C57BL/6J starszych niż 6 miesięcy do badań słuchowych. Inne szczepy myszy mogą być używane w zależności od określonych celów eksperymentalnych.
2. Sprawdź myszy za pomocą profesjonalnego diagnostycznego otoskopu kieszonkowego, aby wykluczyć patologie ucha zewnętrznego lub środkowego przed oceną słuchu. Potencjalne objawy mogą obejmować płyn lub ropę w przewodzie słuchowym zewnętrznym, zaczerwienienie i obrzęk miejscowej tkanki oraz perforację błony bębenkowej.
   nuta: Chociaż jest to rzadko spotykane, po zidentyfikowaniu myszy z chorobami ucha zewnętrznego lub środkowego należy wykluczyć
.

2. Ocena słuchu

1. Znieczulenie myszy za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny chlorowodorku ketaminy (100 mg/kg) i chlorowodorku ksylazyny (10 mg/kg). Oceń głębokość znieczulenia na podstawie bolesnych bodźców (np. odruch szczypania palców).
   nuta: Gdy odruch szczypania palców u nóg jest całkowicie nieobecny, zwierzę osiągnęło odpowiednią głębokość znieczulenia do badania słuchowego. Jeśli obustronne zapisy ABR wymagają więcej czasu, należy podać mniejszą dawkę (jedną piątą pierwotnej dawki) środków znieczulających, aby przywrócić pierwotną płaszczyznę znieczulania. Należy uważać, aby uniknąć przedawkowania środka znieczulającego, ponieważ może to prowadzić do śmierci myszy.
2. Utrzymuj temperaturę ciała znieczulonego zwierzęcia na poziomie 37,5 °C za pomocą termoregulującej poduszki grzewczej. Umieść znieczulone zwierzę w pomieszczeniu osłoniętym elektrycznie i akustycznie, aby uniknąć zakłóceń podczas badania słuchu.
   nuta: Utrzymuj temperaturę fizjologiczną podczas całego zabiegu, aż zwierzę całkowicie się obudzi, aby zapobiec śmierci spowodowanej hipotermią po znieczuleniu.
3. Umieść podskórne elektrody igłowe (20 mm, 28 G) na wierzchołku czaszki (elektroda rejestrująca), w okolicy ślinianki przyusznej poniżej małżowiny usznej mierzonego ucha (elektroda referencyjna) oraz w okolicy ślinianki przyusznej po przeciwnej stronie (elektroda uziemiająca), na głębokości 3 mm pod skórą głowy myszy, odpowiednio²⁰.
4. Użyj głośnika o zamkniętym polu, aby przeprowadzić stymulację akustyczną za pomocą plastikowej rurki o średnicy 2 cm z końcówką w kształcie stożka. Dopasuj końcówkę do zewnętrznego kanału słuchowego²¹.
   nuta: Upewnij się, że impedancja elektryczna elektrody rejestrującej i referencyjnej jest mniejsza niż 3 kOhm (zwykle 1 kOhm). Jeśli impedancja jest wysoka, zmień miejsce wprowadzenia elektrody, wyczyść elektrodę alkoholem lub wymień elektrodę, aby uniknąć zmian amplitudy fali ABR.
5. W przypadku nagrywania ABR wygeneruj pipsy tonów (czas trwania 3 ms, czasy narastania/opadania 1 ms, z szybkością 21,1/s, częstotliwość: 4–48 kHz) i prezentuj je przy malejących SPL od 90 do 10 dB w krokach 5\u20121210 dB SPL²⁰. Na tym etapie odpowiedzi są wzmacniane (10 000 razy), filtrowane (0,1–3 kHz) i uśredniane (1 024 próbki/poziom bodźca).
   nuta: ABR są zbierane dla każdego poziomu bodźca w krokach co 10 dB, z dodatkowymi 5 dB krokami w pobliżu progu.
6. Dla każdej częstotliwości określ próg ABR, który odnosi się do minimalnego SPL, co daje wiarygodny zapis ABR z jedną lub kilkoma rozróżnialnymi falami, które można wyraźnie zidentyfikować przez oględziny (Rysunek 1).
   nuta: Zwykle konieczne jest powtórzenie procesu dla niskich SPL wokół progu, aby zapewnić spójność przebiegów. Próg odpowiedzi to najniższy poziom bodźca, przy którym można zaobserwować przebieg, gdy spadek o 5 dB doprowadziłby do zaniku przebiegu.

3. Przetwarzanie tkanek ślimakowych

1. Po nagraniu ABR należy poddać znieczulone myszy eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy, odciąć im głowę, odsłonić pęcherz od strony brzusznej i otworzyć ostrymi nożyczkami, aby uzyskać dostęp do ślimaka.
2. Za pomocą cienkich kleszczy usuń kości skroniowe, przetnij tętnicę strzemiączka, usuń strzemiączko z okienka owalnego i rozerwij okrągłą błonę okienną. Zrób mały otwór na wierzchołku ślimaka, delikatnie obracając końcówkę igły (13 mm, 27 G).
3. Utrwalić wyizolowane kości za pomocą 4% (wag./obj.) paraformaldehydu w 0,1 M soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS, pH 7,4) przez noc w temperaturze 4 °C. Za pomocą pipety z cienką końcówką delikatnie przepłukać utrwalacz przez przestrzenie perylimfatyczne poprzez nałożenie na owalne lub okrągłe okienka (jako wlot) i otwór na wierzchołku (jako wylot).
   nuta: Niektóre białka wymagają krótkiego czasu utrwalenia, aby uniknąć zniszczenia ich epitopów do znakowania immunologicznego. W takich przypadkach inkubować kości w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 godziny, w zależności od instrukcji producenta dotyczących immunohistochemii. Utrwalenie można również przeprowadzić poprzez perfuzję serca w celu usunięcia krwi ślimakowej, unikając szumu tła spowodowanego niespecyficznym barwieniem na późniejszych etapach, szczególnie w mysich modelach synaptopatii ślimakowej.
4. Opłucz kości trzy razy przez 5 minut 0,1 M zimnym PBS, aby usunąć resztki paraformaldehydu. Odwapnić kości 10% kwasem etylenodiaminotetraoctowym (EDTA) w temperaturze pokojowej przez 4 godziny lub w temperaturze 4 °C przez 24 godziny poprzez delikatne wytrząsanie w wytrząsarce poziomej przy 20 obr./min. EDTA można odświeżyć w połowie.
   nuta: Czas odwapnienia zależy od stężenia EDTA i preferencji użytkowników. Odwapniona tkanka powinna zachowywać pewien stopień wytrzymałości, co ułatwia manipulowanie izolacją całych wierzchołków ślimaka na późniejszych etapach. Kości skroniowe mogą być odwapnione w 10% EDTA z rotacją, co pozwala naukowcom opuścić laboratorium po testach ABR i eksperymentach z utrwalaniem. Czas odwapnienia jest elastyczny w zakresie od 20 do 30 godzin w temperaturze 4 °C.
5. Przenieś jedną odwapnioną kość skroniową z EDTA do 0,1 M PBS. Użyj kleszczyków Dumonta #3, #5 i igły 27 G, aby kolejno wypreparować wierzchołkowe, środkowe i podstawowe obszary ślimaka, a następnie wypreparuj ślimak z kości pod mikroskopem stereoskopowym (jak opisano wcześniej²²). Wykonaj serię małych nacięć wzdłuż więzadła spiralnego za pomocą żyletki i usuń membranę tektorialną oraz błonę Reissnera (Rysunek 2).
   nuta: Tak długo, jak wypreparowany ślimak jest nienaruszony, proces ten może być modyfikowany zgodnie ze zwykłym protokołem danego operatora.
6. Następnie należy rozciąć pozostały nabłonek słuchowy, w tym rąbek spiralny, na poszczególne zwoje ślimaka (wierzchołek, środek i podstawa z obszarem haczyka) w celu przygotowania całego mocowania.
7. Pod 40-krotnym obiektywem olejowym mikroskopu świetlnego zmierz długość błony podstawnej za pomocą skali 250 μm umieszczonej w okularze, którą można regulować wzdłuż stereorzęsek IHC.
8. Oblicz długość każdego skrętu ślimaka, dodając wszystkie długości segmentów (250 μm na segment) i jednocześnie uzyskaj całkowitą długość błony podstawnej, sumując długości każdego zwoju.
9. Przelicz całkowitą długość błony podstawnej, w tym obszar haczyka, na wartość procentową opartą na odległości od wierzchołka ślimaka (0% odnosi się do wierzchołka ślimaka, 100% do podstawy ślimaka).
10. Przelicz tę odległość na częstotliwość charakterystyczną ślimaka za pomocą funkcji logarytmicznej (d(%) = 1 - 156,5 + 82,5 × log(f), z nachyleniem 1,25 mm/oktawę częstotliwości, gdzie d jest znormalizowaną odległością od wierzchołka ślimaka w procentach, f jest częstotliwością w kHz), jak opisano wcześniej^5,6. W ten sposób można uzyskać zakres częstotliwości w odpowiednim obszarze błony podstawnej przy każdym zwrocie ślimaka.

4. Barwienie immunofluorescencyjne

1. Po rozbiorze umieść każdy obrót ślimaka w osobnej probówce wirówkowej o pojemności 2,5 ml i inkubuj zwoje ślimaka w 10% koziej surowicy/PBS/0,1% Triton X-100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na rotatorze.
2. Usunąć powyższy roztwór blokujący/przepuszczalny z każdej probówki za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl pod mikroskopem preparacyjnym i inkubować próbki z przeciwciałami pierwszorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej/PBS/0,1% Triton X-100 przez noc w temperaturze 4 °C na rotatorze.
   nuta: Do znakowania immunologicznego wstążek synaptycznych ślimaka należy użyć presynaptycznego markera mysiego białka wiążącego anty-karboksylowe 2 IgG1 (CtBP2, znakujące domenę B białka rusztowania RIBEYE, 1:400) i postsynaptycznego markera mysiego receptora antyglutaminianu 2 IgG2a (GluR2, znakującego podjednostkę receptora AMPA, 1:200)²³.
3. Przepłukać trzy razy przez 5 minut 0,1 M zimnym PBS w celu usunięcia pozostałości przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować próbki z przeciwciałami drugorzędowymi rozcieńczonymi w 5% surowicy koziej/PBS/0,1% Triton X-100 w temperaturze pokojowej przez 2\u20123 h w ciemności na rotatorze.
   UWAGA: Przygotuj odpowiednie mieszaniny przeciwciał drugorzędowych przy użyciu koziego przeciwciała anty-mysiego Alexa Fluor 568 (IgG1, 1:500) i koziego anty-mysiego Alexa Fluor 488 (IgG2a, 1:500), które są komplementarne do przeciwciał pierwszorzędowych użytych w kroku 4.2. Aby poprawić skuteczność znakowania wstęg synaptycznych, zalecamy wybór określonych przeciwciał drugorzędowych. Niektóre laboratoria przedłużają inkubację z przeciwciałami drugorzędowymi, aby zwiększyć immunoznakowanie GluR2²⁴.
4. Przepłukać trzy razy przez 5 minut 0,1 M PBS w celu usunięcia pozostałości przeciwciał drugorzędowych i przenieść próbki z probówek wirówkowych o pojemności 2,5 ml na płytki 35 mm zawierające 0,1 M PBS.
5. Umieścić kroplę podłoża montażowego zawierającego 4',6-diamidyn-2-fenyloindol (DAPI) na szkiełku podstawowym i przenieść próbki z PBS do podłoża mocującego. Umieść jedną krawędź szkiełka nakrywkowego na szkiełku podstawowym i zwolnij, aby szkiełko nakrywkowe delikatnie opadło.
   nuta: Aby upewnić się, że komórki rzęsate są skierowane do góry i że podczas zabiegu nie dochodzi do fałdowania lub skręcania próbek ślimaka, należy zamontować próbki ślimaka pod mikroskopem stereoskopowym.
6. Umieścić szkiełka w pudełku ze szkiełkami w temperaturze 4 °C na noc, aby szkiełka wyschły, a następnie zobrazować pod laserowym mikroskopem konfokalnym
.

5. Ocena morfologiczna synaps wstęgowych ślimaka

1. Preparaty obrazu za pomocą mikroskopu konfokalnego z trzema laserami - diodą UV 405 nm, laserem argonowym 488 nm i laserem półprzewodnikowym pompowanym diodą 561 nm (DPSS) w celu wzbudzenia DAPI (widmo wzbudzenia 409–464 nm), Alexa Fluor 488 (widmo wzbudzenia 496–549 nm) i Alexa Fluor 568 (widmo wzbudzenia 573–631 nm), odpowiednio.
2. Uzyskuj konfokalne stosy osi Z w odległości 8 μm od każdego obrotu ślimaka za pomocą 63-krotnej soczewki olejowej o wysokiej rozdzielczości.
   nuta: Po zdefiniowaniu wszystkie parametry do digitalizacji mikrofotografii powinny zostać zapisane i zastosowane jednolicie do wszystkich slajdów.
3. W przypadku zliczania punktów synaptycznych należy ustawić stosy z (rozmiar kroku 0,3 μm) tak, aby obejmowały całą długość IHC, zapewniając w ten sposób, że można zobrazować wszystkie punkty synaptyczne.
4. Scal obrazy zawierające puncta w stosie z, aby uzyskać projekcję osi z, a następnie zaimportuj je do oprogramowania do przetwarzania obrazu.
5. Podziel całkowitą liczbę synaps w każdym stosie z w określonych obszarach częstotliwości przez liczbę IHC (równą ręcznym zliczeniom jądrowym DAPI), aby obliczyć liczbę punktów synaptycznych dla każdego IHC. W każdym określonym obszarze częstości uśrednij wszystkie punkty synaptyczne na trzech obrazach różnych pól mikroskopowych zawierających 9-11 IHC.
   1. Nakreśl obszar zainteresowania (ROI), w tym obszary podstawno-boczne każdego IHC, za pomocą przycisku wyboru odręcznego. Użyj funkcji miary do automatycznego określania ilościowego punktu, a funkcji działu wodnego do rozróżnienia blisko sąsiadujących miejsc.
   2. Po każdym automatycznym liczeniu należy przeprowadzić oględziny z ręcznymi poprawkami, aby zapewnić niezawodne liczenie punktowe.
      nuta: Eksperymentatorzy powinni pozostać ślepi co do tego, czy szkiełko pochodzi z wierzchołka, środkowego czy podstawnego zwoju ślimaka.
6. Wizualnie oceń strukturę i rozmieszczenie synaptyczne, aby ręcznie odizolować poszczególne IHC od ich sąsiadów za pomocą narzędzia Pencil Tool (M), aby lepiej zobrazować architekturę cytoszkieletu i lokalizację synaptyczną.
7. Aby sprawdzić zestawienie wstęg presynaptycznych (CtBP2) i plam receptorów postsynaptycznych (GluR2), wyodrębnij przestrzeń woksela wokół wstęgi za pomocą narzędzia Zaznaczanie prostokątne i wyizoluj pojedynczą wstęgę za pomocą Przytnij. Klikając Obraz > Rozmiar obrazu, uzyskaj tablicę miniatur tych miniaturowych projekcji, które można następnie wykorzystać do identyfikacji sparowanych synaps (pojawiających się jako ściśle zestawione pary CtBP2-dodatnich i GluR2-dodatnich punkta) w porównaniu z sierocymi wstążkami (bez postsynaptycznych łat receptora glutaminianu) (Rysunek 3).
   >nuta: Normalne synapsy ślimakowe pojawiają się jako połączone znakowanie immunologiczne wstążki presynaptycznej w komórce rzęsatej (anty-CtBP2) i postsynaptycznego receptora glutaminianu na zakończeniu nerwu słuchowego (anty-GluR2)²⁵. Niektóre laboratoria używają projekcji konfokalnych w połączeniu z modelowaniem 3D w celu ilościowego określenia rozmiaru lub objętości plamy synaptycznej^26,27. Przed znaczną utratą synaps wstęgowych, wstążki wykazujące zmiany rozmiaru lub bez sparowanych plastrów receptora glutaminianu prawdopodobnie wskazują na dysfunkcję synapsów^27,28.

6. Ocena funkcjonalna synaps wstęgowych ślimaka

1. Zbierz wszystkie fale ABR dla każdego bodźca częstotliwościowego prezentowanego przy SPL 90 dB w celu analizy ponadprogowych amplitud fali ABR I.
   nuta: Badania neurofizjologiczne i morfologiczne wykazały, że włókna o niskim wskaźniku spontaniczności i wysokim progu są szczególnie podatne na starzenie się i narażenie na hałas^29,30. Chociaż prosta utrata synaps wstęgowych nie może wpływać na progi ABR, zwykle powoduje znaczne zmniejszenie amplitud fali I fali ABR, ponieważ te aferenty, w tym włókna o niskiej spontaniczności, wysokim progu i włókna o wysokiej spontaniczności, o niskim progu, w znacznym stopniu przyczyniają się do sumowania aktywności włókien nerwowych ślimaka^28,29,31. W tym miejscu wybiera się natężenie ponadprogowe 90 dB SPL.
2. Określ amplitudę fali I od szczytu do szczytu za pomocą programu do analizy offline (Rysunek 4). Każda fala I w badaniu ABR składa się z początkowego odchylenia dodatniego (p) i następującego po nim odchylenia ujemnego (n). Amplituda fali I ABR jest definiowana jako różnica napięcia między Ip (dodatni szczyt fali I) i In (ujemny szczyt fali I)²⁹.
   nuta: W stanach patologicznych synaptopatię ślimakową można określić na podstawie amplitud ponadprogowych załamka ABR I, które odzwierciedlają zsumowane odpowiedzi początkowe SGN wywołanych dźwiękiem. Jednak wrażliwość ślimaka, która nie jest zagrożona z powodu dysfunkcji OHC, jest warunkiem wstępnym tej metody.

Results

Testy słuchu ABR przeprowadzono dla 10 myszy C57BL/6J (w wieku 8 tygodni) pod narkozą. ABR wywołano za pomocą bodźców impulsów tonalnych o częstotliwości 4, 8, 16, 32 i 48 kHz. Próg słyszenia każdego zwierzęcia został wykryty wizualnie poprzez rozróżnienie co najmniej jednego wyraźnego kształtu fali w ABR. Wszystkie myszy wykazywały progi ABR w odpowiedzi na wybuchy tonów, w zakresie od 25 do 70 dB SPL w zależności od częstotliwości bodźca. Nasze wyniki wykazały, że próg słyszenia był najniższy przy częstotliwości 16 kHz...

Discussion

Ponieważ synaptopatia ślimakowa została po raz pierwszy scharakteryzowana u dorosłych myszy z tymczasowym przesunięciem progu (TTS) wywołanym szumem pasma oktawowego 8\u201216 kHz przy 100 dB SPL przez 2 godziny³¹, naukowcy coraz częściej badają wpływ synaptopatii u różnych ssaków, w tym małp i ludzi^32,33. Oprócz narażenia na hałas, kilka innych schorzeń jest związanych z synaptopatią ślimaka (np. starzenie się, stosowanie leków ototoksycz...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorowodorek ketaminy	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, Chiny	H35020148	100 mg/kg
chlorowodorek ksylazyny	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	X-1251	10 mg/kg
Aparatura fizjologiczna TDT	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	System Fizjologii Słuchu III
Oprogramowanie SigGen/BioSig	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, Stany Zjednoczone	System Fizjologii Słuchu III
Podkładka elektryczna	Pet Fun	11072931136
Kleszcze Dumont 3#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Kanada	0203-3-PO
Kleszcze Dumonta 5#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Kanada	0209-5-PO
Stereoskopowy mikroskop preparacyjny	Nikon Corp., Tokio, Japonia	SMZ1270
Kozia surowica	ZSGB-BIO, Pekin, Chiny	ZLI-9021
Receptor antyglutaminianu 2, zewnątrzkomórkowy, klon 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, USA	Mysz MAB397
Oczyszczona mysz Anti-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, USA	612044	mysz
Alexa Fluor 568 kozie przeciwciało anty-mysie IgG1	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	A21124	koza
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG2a	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Koza A21131
Podłoże montażowe zawierające DAPI	ZSGB-BIO, Pekin, Chiny	ZLI-9557
Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna	Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy	TCS SP8 II
Image Pro Plus	Media Cybernetyka, Bethesda, MD, USA	wersja 6.0
Profesjonalny diagnostyczny otoskop kieszonkowy	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	HS-OT10
Elektroda igłowa	Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an, Chiny	1029	20 mm, 28 G
Zamknięte pole prelegent	Tucker-Davis Technologies, Alachua, Floryda, USA	CF1