Ocena morfologiczna i funkcjonalna synaps wstęgowych w określonych obszarach częstości ślimaka myszy

Summary

Ten manuskrypt opisuje eksperymentalny protokół oceny cech morfologicznych i statusu funkcjonalnego synaps wstęgowych u normalnych myszy. Prezentowany model nadaje się również do modeli z ograniczeniami synaptopatii ślimakowej wywołanych hałasem i związanych z wiekiem. Omówiono również korelacyjne wyniki poprzednich badań na myszach.

Abstract

Wewnętrzne komórki rzęsate ślimaka (IHC) przesyłają sygnały akustyczne do neuronów spiralnych (SGN) poprzez synapsy wstęgowe. Kilka badań eksperymentalnych wykazało, że synapsy komórek rzęsatych mogą być początkowymi celami w odbiorczym ubytku słuchu (SNHL). W takich badaniach zaproponowano koncepcję "synaptopatii" ślimaka, która odnosi się do zmian w liczbie, strukturze lub funkcji synaps wstęgowych, które skutkują nieprawidłową transmisją synaptyczną między IHC i SGN. Chociaż synaptopatia ślimakowa jest nieodwracalna, nie wpływa na próg słyszenia. W modelach eksperymentalnych wywołanych hałasem, ograniczone uszkodzenie synaps IHC w wybranych obszarach częstotliwości jest wykorzystywane do identyfikacji czynników środowiskowych, które specyficznie powodują synaptopatię, a także fizjologicznych konsekwencji zakłócenia tego obwodu ucha wewnętrznego. W tym miejscu przedstawiamy protokół analizy morfologii i funkcji synaps ślimaka w określonym regionie częstości u dorosłych myszy. W tym protokole lokalizacja ślimaka w określonych regionach częstości jest przeprowadzana przy użyciu map miejsca i częstotliwości w połączeniu z danymi ze ślimaka, po czym ocenia się cechy morfologiczne synaps wstęgowych za pomocą synaptycznego barwienia immunologicznego. Stan funkcjonalny synaps wstęgowych jest następnie określany na podstawie amplitudy fali I słuchowej odpowiedzi pnia mózgu (ABR). Niniejszy raport pokazuje, że podejście to może być wykorzystane do pogłębienia naszej wiedzy na temat patogenezy i mechanizmów dysfunkcji synaps w ślimaku, co może pomóc w opracowaniu nowych interwencji terapeutycznych.

Introduction

Częstotliwości w zakresie około 20\u201220,000 Hz mogą być odbierane przez ludzi jako bodźce słuchowe. Ludzki słuch jest zwykle najbardziej wrażliwy w pobliżu 1 000 Hz, gdzie średni poziom ciśnienia akustycznego wynosi 20 μPa u młodych dorosłych (tj. 0 decybeli poziomu ciśnienia akustycznego [dB SPL]). W niektórych stanach patologicznych ubytek słuchu jest ograniczony do określonych częstotliwości. Na przykład we wczesnych stadiach ubytku słuchu wywołanego hałasem (NIHL) na audiogramie można zaobserwować "wcięcie" (tj. podniesienie progu słyszenia) przy 4 kHz¹. Wzdłuż przegrody ślimaka ssaków, jego gradacje sztywności i masy tworzą wykładniczą ....

Protocol

Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NRC/ILAR dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych (8. edycja). Protokół badania został zatwierdzony przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Stołecznego Uniwersytetu Medycznego w Pekinie w Chinach.

1. Selekcja zwierząt

1. Do wszystkich eksperymentów użyj dorosłych samców myszy C57BL/6J (w wieku 8 tygodni) jako modelu zwierzęcego.
   nuta: Myszy C57BL/6J noszące wariant splicingu Cdh23 wykazują przyspieszone starzenie się układu słuchowego, co objawia się 40% utratą synaps wstęgowych w podstawowym....

Results

Testy słuchu ABR przeprowadzono dla 10 myszy C57BL/6J (w wieku 8 tygodni) pod narkozą. ABR wywołano za pomocą bodźców impulsów tonalnych o częstotliwości 4, 8, 16, 32 i 48 kHz. Próg słyszenia każdego zwierzęcia został wykryty wizualnie poprzez rozróżnienie co najmniej jednego wyraźnego kształtu fali w ABR. Wszystkie myszy wykazywały progi ABR w odpowiedzi na wybuchy tonów, w zakresie od 25 do 70 dB SPL w zależności od częstotliwości bodźca. Nasze wyniki wykazały, że próg słyszenia był najniższy przy częstotliwości 16 kHz.......

Discussion

Ponieważ synaptopatia ślimakowa została po raz pierwszy scharakteryzowana u dorosłych myszy z tymczasowym przesunięciem progu (TTS) wywołanym szumem pasma oktawowego 8\u201216 kHz przy 100 dB SPL przez 2 godziny³¹, naukowcy coraz częściej badają wpływ synaptopatii u różnych ssaków, w tym małp i ludzi^32,33. Oprócz narażenia na hałas, kilka innych schorzeń jest związanych z synaptopatią ślimaka (np. starzenie się, stosowanie leków ototoksycz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chlorowodorek ketaminy	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., Fujian, Chiny	H35020148	100 mg/kg
chlorowodorek ksylazyny	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	X-1251	10 mg/kg
Aparatura fizjologiczna TDT	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, USA	System Fizjologii Słuchu III
Oprogramowanie SigGen/BioSig	Tucker-Davis Technologies, Alachua, FL, Stany Zjednoczone	System Fizjologii Słuchu III
Podkładka elektryczna	Pet Fun	11072931136
Kleszcze Dumont 3#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Kanada	0203-3-PO
Kleszcze Dumonta 5#	Fine Science Tools, North Vancouver, B.C., Kanada	0209-5-PO
Stereoskopowy mikroskop preparacyjny	Nikon Corp., Tokio, Japonia	SMZ1270
Kozia surowica	ZSGB-BIO, Pekin, Chiny	ZLI-9021
Receptor antyglutaminianu 2, zewnątrzkomórkowy, klon 6C4	Millipore Corp., Billerica, MA, USA	Mysz MAB397
Oczyszczona mysz Anti-CtBP2	BD Biosciences, Billerica, MA, USA	612044	mysz
Alexa Fluor 568 kozie przeciwciało anty-mysie IgG1	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	A21124	koza
Alexa Fluor 488 kozie przeciwciało anty-mysie IgG2a	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA	Koza A21131
Podłoże montażowe zawierające DAPI	ZSGB-BIO, Pekin, Chiny	ZLI-9557
Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna	Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy	TCS SP8 II
Image Pro Plus	Media Cybernetyka, Bethesda, MD, USA	wersja 6.0
Profesjonalny diagnostyczny otoskop kieszonkowy	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., Szanghaj, Chiny	HS-OT10
Elektroda igłowa	Friendship Medical Electronics Co., Ltd., Xi'an, Chiny	1029	20 mm, 28 G
Zamknięte pole prelegent	Tucker-Davis Technologies, Alachua, Floryda, USA	CF1