Nadekspresja długich niekodujących RNA przy użyciu CRISPR aktywującego geny

Summary

Tradycyjne techniki nadekspresji oparte na cDNA mają ograniczone zastosowanie do nadekspresji długich, niekodujących RNA, ze względu na ich liczne formy splicingowe z potencjalną funkcjonalnością. W niniejszym przeglądzie opisano protokół wykorzystujący technologię CRISPR do nadekspresji wielu wariantów splicingu długiego, niekodującego RNA.

Abstract

Biologia długiego niekodującego RNA (lncRNA) to nowa i ekscytująca dziedzina badań, której liczba publikacji rośnie wykładniczo od 2007 roku. Badania te potwierdziły, że lncRNA są zmienione w prawie wszystkich chorobach. Jednak badanie funkcjonalnych ról lncRNA w kontekście choroby pozostaje trudne ze względu na brak produktów białkowych, ekspresję specyficzną dla tkanki, niskie poziomy ekspresji, złożoność form splicingowych i brak ochrony między gatunkami. Biorąc pod uwagę ekspresję specyficzną dla gatunku, badania lncRNA są często ograniczone do kontekstów badawczych na ludziach podczas badania procesów chorobowych. Ponieważ lncRNA funkcjonują na poziomie molekularnym, jednym ze sposobów analizy biologii lncRNA jest usunięcie lncRNA lub nadekspresja lncRNA i zmierzenie efektów komórkowych. W artykule przedstawiono napisany i zobrazowany protokół nadekspresji lncRNA in vitro. Jako reprezentatywny eksperyment wykazano, że lncRNA związany z nieswoistym zapaleniem jelit, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), ulega nadekspresji w modelu limfocytów T Jurkat. Aby to osiągnąć, stosuje się technikę CRISPR (Activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats), aby umożliwić nadekspresję w endogennych loci genomu. Technika aktywacji CRISPR jest ukierunkowana na zestaw czynników transkrypcyjnych do miejsca rozpoczęcia transkrypcji genu, umożliwiając solidną nadekspresję wielu form splicingu lncRNA. Procedura ta zostanie podzielona na trzy etapy, a mianowicie: (i) projektowanie przewodnika RNA (gRNA) i konstrukcja wektora, (ii) generowanie i transdukcja wirusa oraz (iii) badanie przesiewowe kolonii pod kątem nadekspresji. W tym reprezentatywnym eksperymencie zaobserwowano ponad 20-krotne zwiększenie IFNG-AS1 w limfocytach T Jurkat.

Introduction

Podczas gdy większość badań biomedycznych skupia się na transkryptach kodujących białka, większość transkrybowanych genów składa się z niekodujących RNA (Ensembl release 93). Obecne badania zaczynają zgłębiać tę dziedzinę, a liczba publikacji na temat lncRNA w procesach chorobowych rosła wykładniczo w latach 2007-2017¹. Publikacje te pokazują, że wiele lncRNA jest związanych z chorobą. Jednak mechanizmy molekularne tych lncRNA są trudne do zbadania ze względu na ich zróżnicowane funkcje w porównaniu z mRNA. Problem ze zrozumieniem roli lncRNA w chorobie komplikuje fakt, że lncRNA są często wyrażane na niższych poziomach niż kodujące RNAs². Dodatkowo, lncRNA są słabo zachowane, co ogranicza badania funkcjonalne w technikach opartych na ludzkiej linii komórkowej³. Jedną z metod badania mechanizmu działania tych nowych genów jest endogenna nadekspresja ich w hodowanych komórkach. Badania nad nadekspresją mogą dostarczyć kluczowych informacji na temat funkcji określonych genów i umożliwić naukowcom analizę kluczowych szlaków molekularnych.

Nowa metoda aktywacji transkrypcji genów lncRNA opiera się na technologiach CRISPR opracowanych początkowo przez laboratorium Gersbach⁴. Protokół ten został zaadaptowany do stosowania w biologii lncRNA oraz do ekspresji tych genów w innych systemach modelowych. W technice nadekspresji CRISPR białko zwane białkiem związanym z CRISPR 9 (Cas9) może być kierowane w kierunku sekwencji DNA za pośrednictwem antysensownego gRNA, które jest rozpoznawane przez Cas9. Zwykle Cas9 indukuje rozszczepienie DNA; jednak mutacje w Cas9, wcześniej opracowane dla techniki nadekspresji, dezaktywują ten krok⁵. Gdy aktywator transkrypcji jest połączony z "martwym" Cas9 (dCas9) i transdukowany do linii komórkowych, można osiągnąć endogenną nadekspresję lncRNA^4,6. Dodanie dodatkowych modyfikacji do gRNA, umożliwiających wiązanie się dodatkowych czynników transkrypcyjnych z gRNA, zwiększyło skuteczność systemu aktywacji genu dCas9 10-krotnie⁷. Co ważne, wykazano, że aktywacja transkrypcji wymaga bliskiej odległości (<200 pz) od genów miejsca rozpoczęcia transkrypcji, co umożliwia specyficzną regulację w górę w obszarach bogatych w geny⁷. W przeciwieństwie do technologii nokautu CRISPR, kasety dCas9 i gRNA muszą być zintegrowane z genomem, aby umożliwić komórkom zachowanie nadekspresji przez wiele pokoleń. Jedną z metod osiągnięcia tego celu jest użycie lentiwirusów do integracji kaset zawierających dCas9 i gRNA. Po integracji można określić ekspresję genu lncRNA.

W tym artykule zostanie zademonstrowany protokół nadekspresji lncRNA w modelu limfocytów T Jurkat. Pokazana jest procedura krok po kroku, którą można również dostosować do komórek przylegających.

Protocol

UWAGA: Ważne jest, aby pamiętać, że ten protokół używa lentiwirusów z niedoborem replikacji. Postępowanie z wirusem należy przeprowadzać tylko po odpowiednim przeszkoleniu w zakresie bezpieczeństwa w laboratorium. Wybielać wszystkie przedmioty i powierzchnie, które mają kontakt z żywymi wirusami przez co najmniej 10 minut po użyciu. Przez cały czas używaj jednorazowego fartucha laboratoryjnego i ochrony twarzy/oczu, a także podwójnych rękawiczek. Wykonuj badania nad wirusami w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2+ z certyfikatem wirusowym. Poświęć kaptury do hodowli tkankowych i inkubatory do pracy z wirusami.

1. Projektowanie i generowanie wektorów

UWAGA: Najlepszym sposobem na zidentyfikowanie sekwencji gRNA jest użycie narzędzi do projektowania online (np. http://crispr-era.stanford.edu) (Rysunek uzupełniający 1: Projektowanie gRNA). Na potrzeby towarzyszącego eksperymentu reprezentatywnego firma zaprojektowała i stworzyła wektory gRNA wykorzystane w reprezentatywnym eksperymencie. Plazmid dCas9 został również zakupiony online.

1. Sekwencja gRNA znajduje się przed sekwencją nukleotydową "NGG", gdzie "N" to dowolny nukleotyd, który również znajduje się w obrębie 100 par zasad od miejsca rozpoczęcia transkrypcji. Przeszukaj genetyczne bazy danych, takie jak BLAT (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat?command=start) w poszukiwaniu sekwencji gRNA, aby upewnić się, że w genomie nie ma innych miejsc o podobnych sekwencjach (rysunek uzupełniający 2: BLAT). Zapewni to, że sekwencja gRNA jest unikalna dla genu będącego przedmiotem zainteresowania (GOI).
2. Plazmidy gRNA i dCas9, które występują w postaci zalążków bakterii, należy przechowywać w temperaturze 4 °C. Na płytce agarowej z bulionu Luria (LB) usunąć Escherichia coli z ampicyliną (tabela uzupełniająca 1) i hodować bakterie przez noc w temperaturze 37 °C.
3. Wybierz kolonię i hoduj bakterie w 5 ml LB z ampicyliną (tabela uzupełniająca 1) przez noc, energicznie potrząsając płytką w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Następnego dnia dodać 2 ml bakterii do 200 ml LB z ampicyliną rosnąć w kolbie o pojemności 2 l, energicznie potrząsając kolbą przez noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
4. Obracaj bakterie w temperaturze 3 724 x g przez 20 minut. Usuń pożywkę i umieść probówkę zawierającą bakterie na lodzie.
5. Oczyść DNA bakterii za pomocą zestawu do oczyszczania plazmidu zgodnie z protokołem producenta.
   UWAGA: Zestawy do oczyszczania plazmidu zawierają zastrzeżony bufor do resuspensji, bufor do lizy, bufor do płukania, bufor równowagowy i bufor elucyjny.
   1. Dodać 10 ml buforu do reprodukcji z zestawu do bakterii i pipetować bakterie do roztworu. Następnie dodaj 10 ml buforu do lizy z zestawu do zawieszonych bakterii i wymieszaj je, odwracając probówkę. Odczekaj 5 minut, aby bakterie uległy lizie; Następnie dodaj 10 ml lodowatego buforu neutralizującego z zestawu do lizowanych bakterii i wymieszaj je, odwracając probówkę.
   2. Zrównoważyć kolumnę DNA z zestawu z 10 ml buforu równowagowego przez 5 minut. Wlać próbki do filtra kolumny DNA i przepuścić roztwór przez filtr.
   3. Przemyć próbki 2x 30 ml buforu do przemywania płucz, a następnie wymyć DNA za pomocą 30 ml buforu elucyjnego w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Powoli nałóż 10,5 ml izopropanolu w temperaturze pokojowej na eluowane DNA, odwróć probówkę i natychmiast obracaj ją przy 16 200 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   4. Usunąć supernatant i dodać 1 ml 70% etanolu do osadu DNA. Ponownie zawieś pellet, przesuwając rurkę. Wirować w temperaturze 16 200 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i użyć końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby usunąć większość etanolu. Suszyć granulki na powietrzu przez 5 minut, a następnie ponownie zawiesić je w 200 μl wody, a następnie przechowywać DNA w temperaturze -20 °C. Przewidywane stężenie wyniesie >1 μg/μL.

2. Generowanie wirusów i liczba cząsteczek

1. Gdy będziesz gotowy do stworzenia lentiwirusa zawierającego dCAS9, pokryj 100-milimetrowe szalki do hodowli tkankowych 5 ml 0,01% poli-L-lizyny (tabela uzupełniająca 1). Dokładnie usuń nadmiar płynu z płytek i pozostaw je do wyschnięcia na powietrzu przez kilka minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
2. Płytka 5 x 10⁶ komórek HEK 293T na szalkę w 10 ml kompletnej zmodyfikowanej pożywki Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco (tabela uzupełniająca 1) i inkubować je przez noc w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Następnego dnia wyjmij pożywkę z szalek HEK 293T i dodaj 10 ml kompletnego DMEM.
3. Zmieszać 6,5 μg plazmidu pMDLg/pRRE zawierającego gag/pol (składniki wirusa), 3,5 μg plazmidu pMDG2.G zawierającego VSV-G (składnik wirusa), 2,5 μg plazmidu pRSV-Rev zawierającego Rev (składnik wirusa), 10 μg wektora gRNA zawierającego długie powtórzenia końcowe (LTR) lub wektora dCas9 zawierającego LTR i dodać wodę do całkowitej objętości 450 μL. Przefiltrować mieszaniny przez końcówkę filtra 0,2 μm przymocowaną do strzykawki.
4. Dodać 50 μl 2,5 M CaCl₂ (tabela uzupełniająca 1) do każdej próbki transfekcji DNA i delikatnie wymieszać. Przefiltruj mieszaninę wapnia i DNA przez końcówkę filtra 0,2 μm dołączoną do strzykawki. Odpipetować 500 μl 2x HBS (Tabela uzupełniająca 1) do probówki polistyrenowej o pojemności 5 ml. Dodaj kroplami 500 μl DNA/CaCl₂ i delikatnie zwiruj. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 3 minuty.
5. Powoli dodawać 1 ml zawiesiny DNA/CaCl₂/HBS do każdej potrawy. Natychmiast zakręć naczyniami, aby równomiernie rozprowadzić zawartość. Każdą potrawę inkubować przez noc w inkubatorze o stężeniu 5%_{CO2 w} temperaturze 37 °C.
6. W dniu 3 powoli wyjmij i wyrzuć media z naczyń. Ostrożnie umyj komórki 1x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS). Dodać 6 ml kompletnego DMEM uzupełnionego 20 mM HEPES i 10 mM maślanu sodu. Inkubować komórki przez 5–6 godzin w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
7. Umyj komórki 1x PBS i dodaj 5 ml kompletnego DMEM z 20 mM HEPES do komórek HEK 293T. Inkubować przez 12 godzin przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO_{2 w} temperaturze 37 °C.
8. W 4 dniu zebrać supernatanty komórek HEK 293T i przefiltrować supernatant. Zamrozić 1 ml porcji w temperaturze -80 °C.
9. Gdy wirus jest gotowy do użycia, rozmrozić na lodzie podwielokrotność cząsteczki wirusa zawierającej kondycjonowaną pożywkę (przechowywaną w sposób opisany w kroku 2.8). Doprowadź wszystkie odczynniki do temperatury pokojowej.
10. Użyj zestawu do testu immunoenzymatycznego p24 (ELISA), aby określić ilościowo liczbę cząstek wirusa na mililitr.
    1. Rozcieńczyć koncentrat do płukania z zestawu, dodając 19 części destylowanej wody dejonizowanej. Rozcieńczyć kontrolę dodatnią z zestawu do 200 ng/ml, używając RMPI 1640 jako rozcieńczalnika i rozcieńczyć dla krzywej wzorcowej w probówkach o pojemności 1,5 ml zgodnie z tabelą rozcieńczeń p24 ELISA (tabela uzupełniająca 2).
    2. Dodać 20 μl 5% Triton X-100 do wszystkich studzienek z wyjątkiem ślepej próby substratu. Dodać 200 μl RPMI 1640 do studzienek kontroli ujemnej. Dodaj 200 μl każdego wzorca (w dwóch egzemplarzach) do wyznaczonych studzienek.
    3. Za pomocą spektrofotometru zmierzyć stężenie wirusa w próbkach, używając krzywej wzorcowej. Rozpocząć rozcieńczanie próbki w stosunku 1:1 000 i w razie potrzeby zmodyfikować objętość, aby mieściła się w zakresie krzywej wzorcowej. Rozcieńczyć próbki preparatem Triton X-100 do końcowego stężenia 0,5% i dodać 200 μl każdej próbki w RPMI 1640 do wyznaczonych studzienek. Uszczelnić płytkę i inkubować ją przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    4. Przemyć płytkę 6x 300 μl 1x buforu do płukania na studzienkę. Usuń nadmiar płynu, odwracając talerz i stukając nim w ręcznik papierowy. Dodać 100 μl przeciwciała detektorowego z zestawu do wszystkich studzienek z wyjątkiem ślepej próby substratu. Zamknąć płytkę i inkubować ją przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Umyć płytkę, a następnie usunąć nadmiar płynu, odwracając płytkę i stukając nią w ręcznik papierowy.
    5. W celu zmierzenia przeciwciała detektora należy przygotować peroksydazę streptawidynowo-chrzanową (SA-HRP) w ciągu 15 minut od użycia. Rozcieńczyć SA-HRP w stosunku 1:100 rozcieńczalnikiem SA-HRP. Dokładnie wymieszać rozcieńczony SA-HRP i dodać 100 μl do wszystkich studzienek z wyjątkiem ślepej próby. Uszczelnić i inkubować płytkę przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Umyj płytkę 1x buforem myjącym i strzepnij nadmiar płynu, jak w kroku 2.10.4. W ciągu 15 minut od przygotowania należy użyć roztworu substratu orto-fenylenodiaminy (OPD), który dostarcza peroksydazie substratów niezbędnych do wytworzenia chemiluminescencji. Użyć jednej tabletki OPD na 11 ml rozcieńczalnika do substratu na każdą płytkę.
    7. Energicznie wymieszaj roztwór OPD, aby całkowicie go rozpuścić i chronić przed światłem. Dodać 100 μl roztworu substratu OPD do wszystkich studzienek, w tym do ślepej próby. Za pomocą spektrofotometru natychmiast odczytać absorbancję przy 450 nm, powtórzyć to 10x w odstępach 1 s i wykonać średni pomiar.

3. Transformacja dCas9-VP 64

1. Hodowla limfocytów T Jurkat w kompletnym DMEM w kolbie T75 o gęstości 2 x 10⁶ komórek w 15 ml pożywki. Hodować komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO_{2 .}
2. Wirować komórki przez 5 minut w temperaturze 233 x g, a następnie ponownie zawiesić je w 10 ml zredukowanej pożywki surowicy. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
3. Zawiesić i umieścić na płytce 1 x 10⁶ komórek Jurkata w 5 ml zredukowanej pożywki surowicy z polibrenem (tabela uzupełniająca 1) w kolbie T75. Dodać pożywkę kondycjonowaną przez HEK 293T zawierającą 1 x 10⁶ cząstek wirusa zawierających dCas9. Liczbę cząstek wirusa można obliczyć w przybliżeniu na podstawie testu ELISA p24, ponieważ 1 μg/ml p24 równa się 1 x 10⁷ cząstek wirusa. Umieścić kolby w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .

4. Wybór i tworzenie klonów

1. Trzy dni po zakażeniu odwirować komórki w temperaturze 233 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić je w 10 ml kompletnego DMEM z puromycyną (Tabela uzupełniająca 1). Umieścić komórki w kolbach T75 i hodować je w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Co trzeci dzień, przez okres 9 dni, wirować komórki przy 233 x g przez 5 minut i zastąpić pożywkę kompletnym DMEM z puromycyną.
2. Policz komórki za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Na 96-dołkowej płytce poddanej hodowli tkankowej umieścić 10 000 komórek w 100 μl kompletnego DMEM z puromycyną w pierwszym dołku i seryjnie rozcieńczyć 1:1 zawartość kolejnych dołków kompletnym DMEM z puromycyną. Wykonaj 24 rozcieńczenia i powtórz to 4 razy na płytkę, aby upewnić się, że w każdym dołku jest odpowiednia liczba komórek. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
3. Rozwiń komórki klonalne na dwie 24-dołkowe płytki, następnie na 6-dołkową płytkę, a na końcu na kolbę T75. Aby skupić się na trzech klonach, płytka 2 x 10⁶ komórek na dołek 6-dołkowej płytki dla trzech klonów. Pozostałe trzy studzienki należy pokryć nietransdukowanymi komórkami Jurkat jako kontrolą. Umieść komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych na noc.
4. Do ekstrakcji RNA należy użyć dostępnego w handlu zestawu do izolacji RNA. Wirować komórki w temperaturze 233 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i usunąć pożywkę. Użyj końcówki do pipety o pojemności 1 ml, aby ponownie zawiesić komórki w 350 μl buforu do lizy. Dodać 350 μl 70% etanolu do zlizowanych komórek, dokładnie wymieszać pipetą o pojemności 1 ml i przenieść próbkę do kolumny RNA.
5. Wirować lizaty w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę, usunąć przepływ i dodać 700 μl niskorygorystycznego buforu płuczącego z zestawu do kolumny. Wirować lizaty w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę, usunąć przepływ i dodać 80 μl roztworu DNazy I z zestawu do kolumny; Pozostawić próbki do inkubacji przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
6. Wirować lizaty w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę, usunąć przepływ i dodać 700 μl buforu płuczącego o wysokiej rygorystyczności z zestawu do kolumny. Wirować lizaty w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę, usunąć przepływ i dodać 700 μl niskorygorystycznego buforu płuczącego do kolumny.
7. Wyjąć kolumnę z probówki zbiorczej i przenieść ją do nowej probówki zbiorczej. Wiruj lizaty w temperaturze 10 000 x g przez 1 minutę, a następnie przenieś kolumnę RNA do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodaj 50 μl wody do kolumny i wiruj w temperaturze 10 000 x g przez 1 min.
8. Użyj spektrofotometru, aby określić ilościowo stężenie RNA. Spodziewaj się, że stężenie będzie wynosić od 100 do 500 ng/μl, a absorbancja 260/280 między 1,9 a 2,1. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.
9. Do probówek o pojemności 250 μl dodać 1 μg RNA, 4 μl buforu do syntezy komplementarnego DNA (cDNA), 1 μl odwrotnej transkryptazy i wodę do końcowej objętości 20 μl. Nie należy uwzględniać kontroli odwrotnej transkryptazy. W termocyklerze syntetyzować cDNA w temperaturze 42 °C przez 30 minut i w temperaturze 95 °C przez 5 minut, aby dezaktywować odwrotną transkryptazę. Po syntezie rozcieńczyć cDNA w 60 μl wody.
10. Przygotuj reakcje łańcuchowe polimerazy (PCR) zawierające 5 μl zieleni SYBR, 4 μl cDNA, 0,5 μl startera forward (10 μM) i 0,5 μl startera reverse (10 μM). Uruchom PCR w następujący sposób: krok 1 = 95 °C przez 3 minuty, krok 2 = 95 °C przez 10 s, krok 3 = 60 °C przez 10 s, a następnie powtórz kroki 2 i 3 przez 30x.
    UWAGA: Sekwencja dla startera do przodu dCas9 to 5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGAAGAAGA, a sekwencja dla startera wstecznego dCas9 to 5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT. Starterem do przodu dla fosforybozylotransferazy hipoksantynowej 1 (HPRT1) jest 5'-GACCAGTCAACAGGGGACAT, a starterem odwrotnym jest 5'-GCTTGCACCTTGACCATCT.

5. Transdukcja, selekcja, tworzenie klonów i badania przesiewowe gRNA

1. Ponowna transdukcja zwalidowanych komórek Jurkat-dCas9 za pomocą wirusów zawierających gRNA, jak opisano w sekcji 3. Wybierz komórki w DMEM z higromycyną (Tabela uzupełniająca 1) przez 10 dni. Wiruj komórki i zmieniaj nośnik co 3 dni.
2. Wykonaj seryjne rozcieńczanie komórek (jak opisano w kroku 4.2) i rozmnoż poszczególne kolonie (jak opisano w kroku 4.3). Oczyść RNA z kolonii dokładnie tak, jak opisano w kroku 4.5 i przeprowadź syntezę cDNA zgodnie z opisem w kroku 4.9. Wykonaj PCR w czasie rzeczywistym przeciwko rządowi Indonezji i HPRT1 lub odpowiedniemu genowi porządkowania, podobnie jak w przypadku PCR opisanego w kroku 4.10, z wyjątkiem tego przypadku, zobrazuj studzienki w każdym cyklu po kroku 3.
3. Użyj metody progu cyklu porównawczego (Ct), aby określić zmianę krotności w klasie GOI8. Krótko mówiąc, użyj następującego równania do obliczenia względnych poziomów transkryptu (RTL): 2^{- (średnia Ct GOI - średnia Ct genu porządkowego)}. Następnie oblicz średni RTL kontrolnych i podziel wszystkie wartości RTL przez średni kontrolny RTL, aby wygenerować zmianę krotności w porównaniu z próbkami kontrolnymi.

Results

System dwuwektorowy do nadekspresji lncRNA IFNG-AS1
Przykładowym eksperymentem w tym manuskrypcie jest nadekspresja systemu modelowego komórek T Jurkat wyrażającego lncRNA IFNG-AS1⁹. IFNG-AS1 jest lncRNA związanym z nieswoistym zapaleniem jelit, w którym zaobserwowano, że reguluje Interferon Gamma¹⁰. Gen IFNG-AS1 zawiera trzy warianty splicingu, z których wszystkie wykorzystują to samo miejsce startowe transkrypcji (

Discussion

Niniejszy manuskrypt przedstawia protokół wykorzystania aktywacji CRISPR do nadekspresji lncRNA in vitro. Jest to szczególnie ważna technika podczas badania długich, niekodujących RNA, ponieważ produktem transkryptomicznym jest jednostka funkcjonalna. Po nadekspresji badacz może następnie wykorzystać te komórki do zwiększenia stosunku sygnału do szumu podczas badania partnerów wiążących, a nawet zmierzyć komórkowe konsekwencje zwiększonego poziomu lncRNA. Dodatkowo, ponieważ lncRNA często działają na geny cis, ta technik...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin	Fisher Scientific	BP1760-5
CaCl2	Sigma Zestaw	C1016
(iScript)	Starter do
dCas9	Zintegrowane technologie DNA	n/a	5'-TCGCCACAGCATAAAGAAGA
Odwrócony starter dCas9	Zintegrowane technologie DNA	n/a	5'-CTTTTCATGGTACGCCACCT
wektor dCas9	Addgene	50918
DMEM	Corning	10013CM
Etanol	Acros Organics	61509-0010
FBS	Sigma Aldrich	F2442
plazmid gRNA	VectorBuilder	VB180119-1195qxv
HEK293T ogniwa	ATCC&	nbsp; CRL-1573
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
HPRT1 starter do przodu	Zintegrowane technologie DNA	n/a	GACCAGTCAACAGAGGGGACAT
Odwrócony starter HPRT1	Zintegrowane technologie DNA nie	dotyczy	GCTTGCGACCTTGACCATCT
Hygromycyna B	Corning	MT3024CR
Isopropanol	Fisher Scientific	BP2618-500
Komórki Jurkata	ATCC&	nbsp; TIB-152	klon E6-1
L-glutamina	Agar Corning	25005Cl
LB	Fisher Scientific	BP1425-500
LB bulion	Fisher Scientific	BP1426-2
Maxi-prep kit (zestaw do oczyszczania plazmidu)	Qiagen	12362
Na2HPO4	Sigma Aldrich
Optimem I zmniejszył pożywkę w surowicy	Gibco	31985070
p24 elisa	Perkin Elmer	NEK050B
PBS	Corning	21-040-CMR
Penicylina i Streptomycyna	Corning	30-002-Cl
pMDG2.G	Addgene	#12259
pMDLg/pRRE	Addgene	#60488
Poli-L-Lizyna	Sigma Aldrich	P-4832
Polibren	EMD Milipore	TR-1003
pRSV-REV	Addgene	#12253
RNA dichlorowodorku puromycyny	Sigma Aldrich	P8833
(Aurum RNA mini)	BioRad	7326820
Maślan Sodu	Sigma Aldrich	B5887
SYBR zielony (iTaq universal)	BioRad	1725122
Triton X-100	Sigma Aldrich	X100