Nadekspresja długich niekodujących RNA przy użyciu CRISPR aktywującego geny

Carl  Robert Rankin; Janet Treger; Emmanuelle Faure-Kumar; Jihane Benhammou; Deborah Anisman-Posner; Alex  Edward Bollinger; Charalabos Pothoulakis; David Miguel Padua

doi:10.3791/59233

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nadekspresja długich niekodujących RNA przy użyciu CRISPR aktywującego geny

8.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59233

⸱

1 marca 2019

Carl Robert Rankin¹ , Janet Treger¹ , Emmanuelle Faure-Kumar² , Jihane Benhammou¹ , Deborah Anisman-Posner³ , Alex Edward Bollinger³ , Charalabos Pothoulakis¹ , David Miguel Padua¹

¹Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Department of Medicine, University of California, Los Angeles, ²Vatche and Tamar Manoukian Division of Digestive Diseases, Integrated Molecular Technologies (IMT) Core, Department of Medicine, University of California, Los Angeles, ³Division of Hematology and Oncology, Department of Medicine, University of California, Los Angeles

W tym artykule

Podsumowanie

Tradycyjne techniki nadekspresji oparte na cDNA mają ograniczone zastosowanie do nadekspresji długich, niekodujących RNA, ze względu na ich liczne formy splicingowe z potencjalną funkcjonalnością. W niniejszym przeglądzie opisano protokół wykorzystujący technologię CRISPR do nadekspresji wielu wariantów splicingu długiego, niekodującego RNA.

Streszczenie

Biologia długiego niekodującego RNA (lncRNA) to nowa i ekscytująca dziedzina badań, której liczba publikacji rośnie wykładniczo od 2007 roku. Badania te potwierdziły, że lncRNA są zmienione w prawie wszystkich chorobach. Jednak badanie funkcjonalnych ról lncRNA w kontekście choroby pozostaje trudne ze względu na brak produktów białkowych, ekspresję specyficzną dla tkanki, niskie poziomy ekspresji, złożoność form splicingowych i brak ochrony między gatunkami. Biorąc pod uwagę ekspresję specyficzną dla gatunku, badania lncRNA są często ograniczone do kontekstów badawczych na ludziach podczas badania procesów chorobowych. Ponieważ lncRNA funkcjonują na poziomie molekularnym, jednym ze sposobów analizy biologii lncRNA jest usunięcie lncRNA lub nadekspresja lncRNA i zmierzenie efektów komórkowych. W artykule przedstawiono napisany i zobrazowany protokół nadekspresji lncRNA in vitro. Jako reprezentatywny eksperyment wykazano, że lncRNA związany z nieswoistym zapaleniem jelit, Interferon Gamma Antisense 1 (IFNG-AS1), ulega nadekspresji w modelu limfocytów T Jurkat. Aby to osiągnąć, stosuje się technikę CRISPR (Activating clustered regularly interspaced short palindromic repeats), aby umożliwić nadekspresję w endogennych loci genomu. Technika aktywacji CRISPR jest ukierunkowana na zestaw czynników transkrypcyjnych do miejsca rozpoczęcia transkrypcji genu, umożliwiając solidną nadekspresję wielu form splicingu lncRNA. Procedura ta zostanie podzielona na trzy etapy, a mianowicie: (i) projektowanie przewodnika RNA (gRNA) i konstrukcja wektora, (ii) generowanie i transdukcja wirusa oraz (iii) badanie przesiewowe kolonii pod kątem nadekspresji. W tym reprezentatywnym eksperymencie zaobserwowano ponad 20-krotne zwiększenie IFNG-AS1 w limfocytach T Jurkat.

Wprowadzenie

Podczas gdy większość badań biomedycznych skupia się na transkryptach kodujących białka, większość transkrybowanych genów składa się z niekodujących RNA (Ensembl release 93). Obecne badania zaczynają zgłębiać tę dziedzinę, a liczba publikacji na temat lncRNA w procesach chorobowych rosła wykładniczo w latach 2007-2017¹. Publikacje te pokazują, że wiele lncRNA jest związanych z chorobą. Jednak mechanizmy molekularne tych lncRNA są trudne do zbadania ze względu na ich zróżnicowane funkcje w porównaniu z mRNA. Problem ze zrozumieniem roli lncRNA w chorobie komplikuje fakt, że lncRNA są często wyrażane na niższych poziomach niż kodujące RNAs