Artykuł metodologiczny

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

DOI:

10.3791/59235

⸱

29 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute, 2Amgen

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy protokół implementacji systemu REMOTE-control (Reversible Manipulation off Transcription at Endogenous loci), który pozwala na odwracalną i przestrajalną kontrolę ekspresji endogennego genu będącego przedmiotem zainteresowania w żywych systemach modelowych. System REMOTE-control wykorzystuje wzmocnione systemy tłumienia lac i aktywacji tet w celu obniżenia lub zwiększenia regulacji docelowego genu w ramach jednego systemu biologicznego. Ścisłą represję można osiągnąć dzięki miejscom wiązania represorów elastycznie zlokalizowanym daleko za miejscem rozpoczęcia transkrypcji poprzez hamowanie wydłużania transkrypcji. Solidną regulację w górę można osiągnąć poprzez wzmocnienie transkrypcji endogennego genu poprzez skierowanie aktywatorów transkrypcji tet na pokrewny promotor. Ta odwracalna i dostrajalna kontrola ekspresji może być wielokrotnie stosowana i wycofywana w organizmach. Siła działania i wszechstronność systemu, jak wykazano w przypadku endogennego Dnmt1, pozwoli na bardziej precyzyjne analizy funkcjonalne in vivo, umożliwiając badanie funkcji genów na różnych poziomach ekspresji oraz testując odwracalność fenotypu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genetyczne nokautowanie lub transgeniczne metody były skutecznymi środkami do badania funkcji genów w modelach zwierzęcych. Jednak regulacja ekspresji za pomocą tych podejść jest dychotomiczna (włączanie/wyłączanie), nieczasowa, a zatem nie jest w stanie ujawnić pełnego spektrum funkcjonalnego genu. Technologie warunkowego Cre/LoxP pozwoliły na czasoprzestrzenną inaktywację lub aktywację funkcji genów, ale ich dychotomiczny charakter nadal stwarza ograniczenia, takie jak śmiertelność i nieodwracalność komórek1,2,3. Aby wypełnić tę pustkę, opracowano metody warunkowego knockdown przy użyciu regulowanego tet shRNA lub miRNA4. Jednak efekty off-target pozostają problemem dla RNAi5 i były trudne do kontrolowania in vivo. Ostatnio technologie kontroli transkrypcji za pośrednictwem CRISPR/Cas wprowadziły bardziej wszechstronne podejście do osiągania regulacji endogennej ekspresji genów zarówno w górę, jak i w dół i wykazały swoją użyteczność6,7. Jednak skuteczność kontroli transkrypcji za pośrednictwem CRISPR/Cas jest jeszcze niejasna in vivo, a odwracalność represji opartej na KRAB pozostaje nieznana, ponieważ wykazano, że silna represja przez KRAB i jego oddziałujące białko KAP1 indukuje trwałe wyciszanie genów8,9.

Aby rozwiązać te ograniczenia, opracowaliśmy nowy system regulacji transkrypcji, zdolny do warunkowego kontrolowania endogennej ekspresji genów w odwracalny i dostrajalny sposób u myszy za pomocą zmodyfikowanych prokariotycznych binarnych systemów regulacyjnych transkrypcji10. Prokariotyczne binarne transkrypcyjne systemy regulacyjne z ligandami regulatorowymi, takie jak lac i tet, umożliwiły taką odwracalną i dostrajalną kontrolę ekspresji11,12,13,14. Jednak niewystarczająca siła tłumienia obecnych systemów binarnych utrudniła ich szerokie zastosowanie do kontrolowania endogennej ekspresji genów u ssaków. Opracowaliśmy ulepszony system represji lac, wystarczająco silny do tłumienia endogennych genów i zastosowaliśmy nowatorską strategię kierowania aktywatorów transkrypcji tet bezpośrednio na pokrewny promotor endogennego genu, aby osiągnąć solidną regulację w górę (Figura 1) 10. Dzięki tej technologii udało nam się osiągnąć prawie dwa rzędy wielkości kontrolę ekspresji endogennego genu Dnmt1 w sposób przestrajalny, indukowalny i odwracalny10. Tutaj podajemy instrukcje krok po kroku dotyczące jego zastosowania in vivo do innych genów i organizmów przy użyciu myszy jako gatunku modelowego.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd systemu REMOTE-control. Transkrypcja endogennego genu docelowego może być regulowana za pomocą zmodyfikowanych systemów represorów lac i aktywatorów tet. Docelowy promotor genu lub intron jest zaprojektowany tak, aby zawierał operatory ściśle wiążącego represora LacIGY i/lub aktywatora rtTA-M2. R oznacza Repron (Repression intron), który zawiera 12 symetrycznych operatorów lac (S) oraz częściowy intron beta-globiny królika. T oznacza operator tet. Represor i/lub aktywator jest/są wyrażane z promotora specyficznego dla tkanki. Ekspresja docelowego genu może być następnie odwracalnie dostrojona do pożądanego poziomu ekspresji poprzez podanie IPTG (izopropylu β-D-1-tiogalaktopiranozydu, antagonisty represora LacIGY) lub doksycykliny (Dox). Ten rysunek został zmodyfikowany z Lee et al.10 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Przed rozpoczęciem tego protokołu, przejrzyj Tabelę 1, aby zidentyfikować odpowiednie kroki dla pożądanej kontroli ekspresji genów. Na przykład, aby zaprojektować mysz, która umożliwia odwracalną regulację w dół "genu X", wypełnij sekcje 1, 3 i 4 poniższego protokołu. Tabela 1 zawiera również podsumowanie potrzebnych elementów systemu ZDALNEGO sterowania.

Żądana zmiana wyrażenia Tylko represje Tylko aktywacja Zarówno represje, jak i aktywizacja Odpowiednie sekcje Protokołu 1, 3-4 2-4 1-4 Sekwencja zdalnego sterowania potrzebna w genie docelowym Repron ("Intron represji"; 12 symetrycznych operatorów lac plus częściowy intron beta-globiny królika) Operator(y) tet Operator(zy) Repron i Tet Lokalizacja sekwencji ZDALNEGO STEROWANIA Intron promotor Intron i Promotor Aktywator/represor potrzebny do pożądanej kontroli Represor LacIGY Aktywator rtTA-M2 Represor LacIGY i aktywator rtTA-M2 Ligandy regulatorowe Protokół IPTG Doksycyklina IPTG i/lub doksycyklina

Tabela 1: Przegląd komponentów ZDALNEGO sterowania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Południowej Kalifornii oraz Instytutu Badawczego Van Andel oraz zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych z National Institutes of Health15.

1. Modyfikuj gen zainteresowania do represji za pomocą ZDALNEGO sterowania

  1. Korzystając z poniższych wskazówek, zidentyfikuj obojętny transkrypcyjnie intron w kierunku końca 5' genu będącego przedmiotem zainteresowania w celu insercji sekwencji Repron ("Repression intron"; 12 symetrycznych operatorów lac plus częściowy intron beta-globiny królika). Należy pamiętać o alternatywnych promotorach dla genu będącego przedmiotem zainteresowania i wybrać intron zgodnie z transkryptem(-ami), który ma być kontrolowany (tj. intron wspólny dla wszystkich transkryptów lub specyficzny dla pożądanego transkryptu).
    UWAGA: W przypadku genów bez intronu lub z jedynkami na końcu 3', wstaw sekwencję Repron do promotora (zobacz Lee, et al.10 dla szczegółowej procedury).
    1. Uzyskaj sekwencję genomową dla genu będącego przedmiotem zainteresowania.
      1. Przejdź do UCSC Genome Browser16,17 i wybierz najnowszą wersję roboczą genomu myszy (Mouse GRCm38/mm10 w momencie publikacji), która obecnie znajduje się w zakładce Genomy.
      2. Wprowadź nazwę lub symbol interesującego Cię genu w pasku wyszukiwania, aby wyświetlić transkrypcje genu. Kliknij przycisk Przejdź.
      3. Wybierz żądany wariant transkryptu dla interesującego Cię genu.
      4. Kliknij symbol genu obok interesującego nas wariantu transkryptu (symbol wcześniej wybranego transkryptu będzie znajdował się w ciemnym polu).
      5. Pod banerem Sekwencja i łącza do narzędzi i baz danych kliknij łącze Sekwencja genomowa.
      6. W polu Opcje regionu pobierania sekwencji wybierz tylko eksony (5' UTR, CDS i 3' UTR), introny i domyślny Jeden rekord FASTA na gen. W polu Opcje formatowania sekwencji wybierz opcję Eksony pisane wielkimi literami, wszystko inne małymi literami i Maska powtarza się do N (aby ukryć powtarzające się sekwencje). Następnie kliknij przycisk Prześlij.
      7. Zapisz tę sekwencję, zachowując formatowanie wielkimi i małymi literami, w dokumencie lub programie, do którego można dodawać adnotacje.
    2. Unikaj przerywania wysp CpG, które mogą wskazywać na regiony z funkcją regulacji genów.
      UWAGA: Chociaż intron 5' jest preferowany do insercji sekwencji Repronu, pierwszy intron może zawierać transkrypcyjne elementy regulatorowe, takie jak wyspy CpG (badane w tym kroku) lub elementy wzmacniające (badane w kroku 1.1.4), których należy unikać w przypadku insercji Repronu.
      1. Pod banerem Expression and Regulation (Wyrażenie i regulacja) przeglądarki genomu UCSC (UCSC) (Wyrażenie i regulacja) w przeglądarce genomu UCSC (UCSC Genome Browser) wybierz opcję show (pokaż) dla ścieżki CpG Islands (Wyspy CpG), a następnie kliknij przycisk Odśwież.
      2. Powiększając 5-calowe introny, kliknij na każdą wyspę CpG (pokazaną na zielono w momencie publikacji, jeśli jest obecna) i wybierz Wyświetl DNA dla tej funkcji.
      3. Po wybraniu opcji Maska powtarza się do N, wybierz pobierz DNA, aby uzyskać sekwencję wyspy CpG.
      4. Nałóż te sekwencje na oryginalny plik sekwencji i dodaj je jako regiony intronowe, których należy unikać ze względu na możliwe funkcje regulacyjne genów.
    3. Unikaj przerywania niekodujących RNA, w przypadku, gdy pełnią one funkcję regulacyjną.
      1. Pod banerem Genes and Gene Predictions (Geny i przewidywania genów) przeglądarki UCSC Genome Browser (Przeglądarka genomu UCSC) wybierz opcję pokaż dla ścieżki GENCODE (Ensembl) i kliknij przycisk Odśwież.
      2. Powiększając introny 5', kliknij na każdy niekodujący RNA (pokazany na zielono w momencie publikacji, jeśli jest obecny) i uzyskaj sekwencję DNA dla każdego z nich, klikając jego współrzędne chromosomowe.
      3. Z menu rozwijanego Widok wybierz DNA, a następnie kliknij opcję Maska powtarza się do N. Następnie kliknij pobierz DNA.
      4. Nałóż te sekwencje na oryginalny plik sekwencji i dodaj je jako regiony intronowe, których należy unikać ze względu na możliwe funkcje regulacyjne genów.
    4. Unikaj regionów intronowych z sygnaturami wzmacniacza w tkankach będących przedmiotem zainteresowania, takich jak H3K4me1, H3K27ac i nadwrażliwość DNazy I18,19,20,21, a także miejsc wiązania CTCF, które regulują pętlę wzmacniacza22,23.
      1. Przejdź do bazy danych ENCODE24,25, a następnie wybierz ikonę Experiments (Eksperymenty).
      2. Jako typ testu wybierz ChIP-seq lub DNase-seq i wypełnij pozostałe kategorie (Organizm, Typ biopróbki itp.) zgodnie z komórkami, które mają być zaprojektowane.
      3. Po wybraniu funkcji najedź kursorem na piktogramy w kolorze niebieskim i wybierz ten, dla którego pojawia się opcja Wyświetl wyniki jako listę (piktogram po lewej stronie w momencie publikacji).
      4. Wybierz zestawy danych dla obiektów docelowych H3K4me1, H3K27ac, DNazy I i CTCF, które najbardziej pasują do komórek, które mają zostać zaprojektowane.
      5. W każdym odpowiednim zestawie danych przewiń do sekcji Pliki, sprawdź, czy wybrano mm10 (lub najnowszą wersję genomu) i UCSC, a następnie kliknij przycisk Wizualizuj.
      6. Teraz w przeglądarce genomu UCSC i powiększając introny 5' dla interesującego genu, kliknij każdy pik H3K4me1, H3K27ac, DNase I i CTCF w odpowiednich ścieżkach pików z adnotacjami.
      7. Uzyskaj sekwencję DNA dla każdego regionu szczytu, klikając jego współrzędne chromosomowe.
      8. Z menu rozwijanego Widok wybierz DNA, a następnie kliknij opcję Maska powtarza się do N. Następnie kliknij pobierz DNA.
      9. Nałóż te sekwencje na oryginalny plik sekwencji i dodaj je jako regiony intronowe, których należy unikać ze względu na możliwe funkcje regulacyjne genów.
    5. Unikaj zakłóceń uzgodnionych sekwencji splicingu, aby nie zakłócać prawidłowego splicingu eksonów.
      UWAGA: Chociaż sekwencje wymagane do splicingu są w dużej mierze ograniczone do około sześciu zasad na końcu 5' intron26 i około 60 zasad na końcu 3' 27, zaleca się wybranie dużego intronu, co pozwala na znacznie szersze marginesy z tych regionów konsensusu, aby zminimalizować prawdopodobieństwo wpływu na łączenie. Zaleca się korzystanie z narzędzi do analizy intronów, takich jak SVM-BPfinder28, w celu dokładniejszej analizy potencjalnych sekwencji spawów.
  2. Po zidentyfikowaniu regionu intronowego, który spełnia powyższe kryteria (jak pokazano dla Dnmt1 w danych uzupełniających), przeprowadź badanie przesiewowe sekwencji za pomocą internetowego narzędzia do projektowania sgRNA, aby zidentyfikować sgRNA w regionie o wysokiej swoistości i przewidywanych wynikach wydajności.
    1. Przejdź do wybranego narzędzia do projektowania sgRNA online, takiego jak CRISPOR29.
    2. Wprowadź sekwencję interesującego nas regionu intronowego, określ odpowiedni genom referencyjny i wybierz żądany motyw sąsiadujący z protospacerem (PAM). Kliknij przycisk Prześlij.
    3. Posortuj przewidywane sgRNA według wyniku swoistości i wybierz jeden lub więcej sgRNA, które również mają wysoki przewidywany wynik wydajności29.
      1. Opcjonalnie: Aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo użycia skutecznego sgRNA, najpierw przetestuj wydajność cięcia kilku najwyżej punktowanych sgRNA w teście in vitro30, a następnie postępuj z najbardziej wydajnym sgRNA in vivo.
  3. Zaprojektuj matrycę DNA zawierającą sekwencję lądowiska PITT (Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis), jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1A,B, otoczoną z obu stron przez ramiona homologii 60 zasad, które odpowiadają miejscu cięcia sgRNA31.
    UWAGA: Lądowisko zawiera dwa heterotypowe miejsca loxP (JT15 i Lox2272) i umożliwia ukierunkowane wprowadzanie dużych sekwencji poprzez podejście dwuetapowe; Upewnij się, że połączenia tego wstawiania nie tworzą tajemniczych miejsc łączenia. Alternatywnie, strategia knock-in oparta na embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) może być wykorzystana do bezpośredniego wprowadzenia sekwencji Repron.
  4. Przygotuj matrycę sgRNA, białka Cas9 i jednoniciowego DNA (ssDNA) na lądowisko i wstrzyknij mikroiniekcję do zapłodnionych jaj (od myszy B6C3F1/J lub innego pożądanego szczepu) zgodnie z ustalonymi protokołami32,33.
  5. Ekran dla myszy z wciskaniem lądowiska.
    1. Zaprojektuj startery PCR komplementarne do locus genomu, ale poza regionami docelowymi ramion homologii, jak pokazano dla Dnmt1 na rysunku uzupełniającym 1C. Unikaj powtarzających się sekwencji genomowych podczas projektowania starterów.
    2. Wyodrębnij DNA z klipsów ogonowych myszy zgodnie z ustalonymi protokołami34.
    3. Użyj PCR i elektroforezy żelowej, aby zidentyfikować myszy z wprowadzeniem lądowiska.
    4. Upewnij się, że wkłucie się powiodło, sekwencjonując produkty PCR.
      UWAGA: Niechciane duże usunięcia i przegrupowania mogą być wprowadzane przez CRISPR/Cas935, dlatego przed kontynuowaniem zaleca się staranne sprawdzenie pod kątem edycji poza celem35,36,37.
  6. Używając zapłodnionych jaj myszy z lądowiska, mikrowstrzyknij mRNA38 i transgeniczny plazmid zawierający sekwencję Repron otoczoną miejscami rekombinacji JTZ17 i Lox227231,39,40,41 zgodnie z ustalonymi metodami38,42,43.
  7. Ekran dla myszy z wstawieniem Reprona.
    1. Zaprojektuj startery PCR komplementarne do locus genomu, poza insertem Repron. Unikaj powtarzających się sekwencji genomowych podczas projektowania starterów.
    2. Wyodrębnij DNA z klipsów ogonowych myszy zgodnie z ustalonymi protokołami34.
    3. Użyj PCR i elektroforezy żelowej, aby zidentyfikować myszy z insercją Repronu.
    4. Upewnij się, że knock-in powiódł się, sekwencjonując produkty PCR.

2. Modyfikuj interesujący gen w celu regulacji w górę za pomocą ZDALNEGO sterowania

  1. Korzystając z poniższych wskazówek, zidentyfikuj region w promotorze genu będącego przedmiotem zainteresowania, który prawdopodobnie nie zaburzy funkcji promotora po wstawieniu sekwencji operatora tet. Należy pamiętać o alternatywnych promotorach dla genu będącego przedmiotem zainteresowania i wybrać promotor zgodnie z transkryptem (transkryptami), który ma być kontrolowany (tj. promotor wspólny dla wszystkich transkryptów lub specyficzny dla pożądanego transkryptu).
    1. Uzyskaj sekwencję genomową dla promotora będącego przedmiotem zainteresowania.
      1. Przejdź do UCSC Genome Browser16,17 i wybierz najnowszą wersję roboczą genomu myszy (Mouse GRCm38/mm10 w momencie publikacji), która obecnie znajduje się w zakładce Genomy.
      2. Wprowadź nazwę lub symbol interesującego Cię genu w pasku wyszukiwania, aby wyświetlić transkrypcje genu. Kliknij przycisk Przejdź.
      3. Wybierz żądany wariant transkryptu dla interesującego Cię genu.
      4. Kliknij symbol genu obok interesującego nas wariantu transkryptu (symbol genu poprzednio wybranego transkryptu będzie znajdował się w ciemnym polu).
      5. Pod banerem Sekwencja i łącza do narzędzi i baz danych kliknij łącze Sekwencja genomowa.
      6. W polu Sequence Retrieval Region Options (Opcje regionu pobierania sekwencji) wybierz tylko Promoter/Upstream o 1000 baz. W polu Opcje formatowania sekwencji wybierz opcję Maskuj powtórzenia na N (aby ukryć powtarzające się sekwencje). Następnie kliknij przycisk Prześlij.
      7. Zapisz tę sekwencję promotora w dokumencie lub programie, do którego można dodawać adnotacje.
    2. Wybierz regiony, które są wolne od przypuszczalnych miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego, ponieważ przerwanie tych sekwencji może zmienić endogenną ekspresję genów.
      1. Przejdź do przeglądarki genomu UCSC i otwórz najnowszą wersję genomu myszy.
      2. Nad banerem Mapowanie i sekwencjonowanie wybierz pozycję koncentratory ścieżek.
      3. Kliknij mm10 obok nazwy huba JASPAR 2018 TFBS (lub najnowszej wersji JASPAR).
      4. Wprowadź nazwę lub symbol interesującego Cię genu w pasku wyszukiwania, aby wyświetlić transkrypcje genu. Kliknij przycisk Przejdź.
      5. Wybierz żądany wariant transkryptu dla interesującego Cię genu.
      6. Przewiń w dół do banera JASPAR 2018 TFBS i kliknij strzałkę listy rozwijanej, aby wybrać żądaną opcję wyświetlania ścieżki, taką jak zgniatanie. Kliknij przycisk Odśwież.
      7. Powiększ obszar promotora interesującego genu i zidentyfikuj regiony, które są wolne (lub względnie wolne) od miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego zgodnie ze ścieżką JASPAR. Zapisz współrzędne chromosomalne tych regionów.
      8. Uzyskaj sekwencję genomową tych współrzędnych chromosomowych, wpisując je w pasku wyszukiwania i klikając przycisk Przejdź. Z menu rozwijanego Widok wybierz DNA, a następnie kliknij opcję Maska powtarza się do N. Następnie kliknij pobierz DNA.
      9. Nałóż te sekwencje na oryginalny plik sekwencji i oznacz je jako idealne regiony promotorowe do celu z powodu braku wiązania czynnika transkrypcyjnego.
    3. W ramach tych sekwencji wybierz zaburzony region promotora, który znajduje się powyżej, ale w pobliżu miejsca rozpoczęcia transkrypcji interesującego genu.
      UWAGA: Insercja, która znajduje się zbyt blisko miejsca rozpoczęcia transkrypcji, może zwiększyć ryzyko upośledzenia aktywności promotora, ale insercja, która jest zbyt daleko, może obniżyć poziom regulacji w górę. Wstawienie sekwencji operatorów tet około 200 par zasad przed miejscem rozpoczęcia transkrypcji spowodowało solidną regulację w górę dwóch testowanych promotorów (patrz dyskusja)10.
  2. Przeprowadź badanie przesiewowe wybranego regionu promotora za pomocą internetowego narzędzia do projektowania sgRNA, aby zidentyfikować sgRNA w regionie o wysokiej swoistości i przewidywanych wynikach wydajności.
    1. Przejdź do wybranego narzędzia do projektowania sgRNA online, takiego jak CRISPOR29.
    2. Wprowadź sekwencję obszaru zainteresowania, określ odpowiedni genom referencyjny i wybierz żądany motyw sąsiadujący z protospacerem (PAM). Kliknij przycisk Prześlij.
    3. Posortuj przewidywane sgRNA według wyniku swoistości i wybierz jeden lub więcej sgRNA, które również mają wysoki przewidywany wynik wydajności29.
      1. Opcjonalnie: Aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo użycia skutecznego sgRNA, najpierw przetestuj wydajność cięcia kilku sgRNA w teście in vitro30, a następnie postępuj z najbardziej wydajnym sgRNA in vivo.
  3. Zaprojektuj matrycę DNA zawierającą operatory tet otoczone z obu stron przez ramiona homologii 60 zasad, które odpowiadają miejscu cięcia sgRNA31,33.
    UWAGA: Liczba operatorów tet jest konfigurowalna; Wcześniej wykazano, że wprowadzanie dwóch do czterech sekwencji operatorów TET w tandemie jest skuteczne, ale w zasadzie więcej operatorów jest pożądanych do napędzania wyższej ekspresji. Alternatywnie, do wstawiania operatorów tet można użyć strategii knock-in opartej na ESC.
    1. Opcjonalnie: Aby uzyskać dowody eksperymentalne, że proponowane modyfikacje prawdopodobnie nie zakłócą endogennej aktywności transkrypcyjnej interesującego genu, sklonuj zmodyfikowaną sekwencję promotora do wektora lucyferazy świetlika (takiego jak pGL3-Basic) i porównaj jej skuteczność z oryginalnym promotorem za pomocą testu lucyferazy.
  4. Przygotuj sgRNA, białko Cas9 i matrycę ssDNA zawierającą sekwencje operatora tet i wstrzyknij mikro do zapłodnionych jaj (od myszy B6C3F1/J lub innego pożądanego szczepu) zgodnie z ustalonymi protokołami32,33.
    UWAGA: Ze względu na złożoność syntezy powtarzalnej sekwencji, zaleca się podejście oparte na transkrypcji in vitro/odwrotnej transkrypcji w celu syntezy matrycy ssDNA z plazmidu dwuniciowego DNA (dsDNA) class44. Alternatywnie, matryca dsDNA może być użyta do mikroiniekcji, ale skuteczność knock-in może być zmniejszona45.
  5. Ekran dla myszy z knock-in operatorów tet.
    1. Zaprojektuj startery PCR komplementarne do locus genomu, poza regionami, do których skierowane są ramiona homologii. Unikaj powtarzających się sekwencji genomowych podczas projektowania starterów.
    2. Wyodrębnij DNA z klipsów ogonowych myszy zgodnie z ustalonymi protokołami34.
    3. Użyj PCR i elektroforezy żelowej, aby zidentyfikować myszy z insercją operatorów tet.
    4. Upewnij się, że wkłucie się powiodło, sekwencjonując produkty PCR.
      UWAGA: Niechciane duże usunięcia i przegrupowania mogą być wprowadzane przez CRISPR/Cas935, dlatego przed kontynuowaniem zaleca się staranne sprawdzenie pod kątem edycji poza celem35,36,37.

3. Rozwijanie myszy z ekspresją aktywatora i/lub represora

  1. Zidentyfikuj silnie ulegający ekspresji promotor dla tkanki (tł) lub typu komórki będącego przedmiotem zainteresowania.
    UWAGA: Przeszukanie literatury i baza danych Tissue-Specific Promoter Database46 mogą być przydatne do identyfikacji takiego promotora.
  2. Umieść dostarczoną sekwencję wzmocnionego represora lac lub aktywatora tet za pożądanym promotorem, aby wygenerować konstrukt transgeniczny.
  3. Wytwórz linię (linie) myszy transgenicznych przy użyciu standardowych procedur transgenicznych42,43,47. Alternatywnie, można zastosować podejście transgenezy specyficzne dla miejsca, aby uniknąć efektów pozycji i umożliwić insercję transgenu w pojedynczej kopii31,48.
  4. Rozmnażaj założycieli i określ wzorzec ekspresji i poziom transgenu u potomstwa każdego założyciela. Wybrać linie o silnej ekspresji w zamierzonym typie tkanki (typach) tkanki do dalszej hodowli.
    1. Wyhoduj założycieli z myszami typu dzikiego.
    2. Zaprojektuj startery PCR, które wykryją wprowadzenie aktywatora i/lub represora.
    3. Wyodrębnij DNA z klipsów ogonowych potomstwa zgodnie z ustalonymi protokołami34.
    4. Użyj PCR i elektroforezy żelowej, aby zidentyfikować myszy z insercją.
    5. Potwierdź insercję transgenu poprzez sekwencjonowanie produktów PCR.
    6. Propaguj linie transgeniczne.
    7. Uświęć kilka młodych z każdej linii i zbierz interesujące tkanki do qRT-PCR, immunohistochemii i / lub western blotting, aby przeanalizować ekspresję interesującego genu / białka w docelowym typie tkanki.
    8. Wybierz linie o najsilniejszej ekspresji w tkankach będących przedmiotem zainteresowania do wykorzystania w sekcji 4.

4. Manipulowanie ekspresją genów in vivo

  1. Rozmnażaj myszy ze zmodyfikowanym genem będącym przedmiotem zainteresowania (sekcja 1 i/lub 2) z transgenicznymi myszami z sekcji 3 zgodnie z ustalonymi praktykami hodowlanymi49. Aby uzyskać maksymalną kontrolę ekspresji, wyhoduj myszy do homozygotyczności dla zmodyfikowanego allelu.
  2. W celu odwrócenia lub dostosowania represji genu docelowego, należy podać IPTG w wodzie pitnej.
    1. Aby eksperymentalnie określić dawkę IPTG do użycia, należy leczyć myszy o odpowiednim genotypie i grupie kontrolnej jedną z różnych dawek (zalecany zakres początkowy: 0 – 400 mM IPTG) przez co najmniej tydzień50,51. Uwzględnij co najmniej trzy myszy w każdej grupie leczonej i wybierz wiek i płeć myszy, które są najbardziej istotne dla planowanych przyszłych eksperymentów. UWAGA: Pary hodowlane myszy mogą być traktowane wodą IPTG, aby zapewnić rozwojową ekspozycję IPTG potomstwu, jeśli jest to pożądane13, lub myszy mogą rozpocząć leczenie w dowolnym momencie po urodzeniu.
      1. W dniu podania rozpuścić pożądaną masę IPTG w sterylnej wodzie destylowanej i mieszać za pomocą mieszadła przez 5 minut lub do całkowitego rozpuszczenia.
      2. Owiń butelkę folią i podawaj wodę IPTG w butelce zabezpieczonej przed światłem. Wymieniaj dwa razy w tygodniu. Zapewnij to samo źródło wody myszom otrzymującym 0 mM IPTG.
      3. Po upływie co najmniej tygodnia należy złożyć myszy w ofierze i przeanalizować ekspresję interesującego genu w tkance docelowej (tkankach) za pomocą qRT-PCR, immunohistochemii i / lub western blot.
      4. Zidentyfikuj dawkę, która przywraca ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania do ekspresji genu kontrolnego typu dzikiego i użyj tej dawki do osiągnięcia normalnej ekspresji genu w przyszłych eksperymentach.
  3. W celu indukcji regulacji w górę genów należy podawać Doksycyklinę (Dox) w diecie.
    1. Aby eksperymentalnie określić stężenie Dox do podania, należy leczyć myszy o odpowiednim genotypie i grupie kontrolnej jednym z zakresów stężeń Dox (zalecany zakres początkowy: 0 – 5000 mg/kg Hyclate Doksycykliny) przez co najmniej jeden tydzień52,53, w tym co najmniej trzy myszy na grupę leczoną. Kup karmę dla myszy zawierającą Dox od komercyjnego sprzedawcy.
      UWAGA: Pary hodowlane myszy mogą być leczone pokarmem Dox, aby zapewnić rozwojową ekspozycję Dox potomstwu, jeśli jest to pożądane54,55, lub myszy mogą rozpocząć leczenie w dowolnym momencie po urodzeniu.
    2. Zmieniaj dietę raz w tygodniu. Tę samą dietę podstawową należy podawać myszom otrzymującym pokarm wolny od Dox.
    3. Po upływie co najmniej tygodnia należy złożyć myszy w ofierze i przeanalizować ekspresję interesującego genu w tkance docelowej (tkankach) za pomocą qRT-PCR, immunohistochemii i / lub western blot.
    4. Zidentyfikuj dawkę, która podnosi ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania do pożądanego poziomu i użyj tej dawki do osiągnięcia nadekspresji genu w przyszłych eksperymentach.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zdolność systemu ZDALNEGO sterowania do tłumienia została do tej pory zademonstrowana w dwóch różnych podejściach. W pierwszym podejściu miejsca wiązania represorów lac zostały wstawione do endogennego promotora genu Dnmt1. W drugim podejściu, które jest zalecane w niniejszym protokole, miejsca wiązania represora zostały wstawione do dalszego intronu, aby uniknąć potencjalnego ryzyka wpływu na funkcję promotora przez insercję, a tym samym uprościć zastosowanie systemu REMOTE-control. Oba podejścia zakończyły się udaną represją (Rysunek 2A,B i Rysunek 3A-C)10. Ekspresja Dnmt1 została stłumiona do 15% nieuregulowanych poziomów przy użyciu podejścia opartego na promotorze (Rysunek 2A). Ta ścisła represja została odwrócona w sposób zależny od dawki poprzez traktowanie myszy różnymi ilościami IPTG (Rysunek 2A). Zaobserwowana represja Dnmt1 została zwalidowana na poziomie białka przez barwienie immunologiczne (Rysunek 2B). Nie zaobserwowaliśmy żadnej zauważalnej różnicy w wyrażeniu Dnmt1 między myszami Dnmt1 +/+ i Dnmt1LO/LO, potwierdzając, że nasza insercja operatora lac nie zakłóciła normalnej funkcji promotora10. Podejście oparte na intronie osiągnęło ponad 90% represji ze strony operatorów znajdujących się kilka kilozasad poniżej miejsca rozpoczęcia transkrypcji poprzez osłabienie wydłużenia transkrypcji (Rysunek 3A, B) 10. To podejście oparte na intronach zostało następnie zweryfikowane na siedmiu dodatkowych solidnych promotorach (Rysunek 3C). Niezmiennie stosowano ścisłe represje wobec wszystkich badanych promotorów. Nie zaobserwowano żadnej korelacji między resztkowymi poziomami ekspresji a siłą promotorów, co sugeruje, że zdolność tłumienia naszego systemu represji opartego na intronie przekracza moc transkrypcyjną wszystkich testowanych przez nas silnych promotorów (Rysunek 3C).

Zdolność systemu REMOTE-control do regulacji in vivo została również zademonstrowana na genie Dnmt1. Wprowadziliśmy dwie kopie operatora tet do promotora Dnmt1, wraz z sekwencjami operatora lac, aby umożliwić regulację w górę lub w dół w zależności od tego, które białko efektorowe jest obecne. Solidna regulacja w górę i w dół ekspresji Dnmt1, bliska dwóm rzędom wielkości (10% do 650%), została osiągnięta w ESC zawierających zmodyfikowany endogenny allel Dnmt1 (Dnmt1LGT) (Rysunek 4A)10. Obie regulacje były w pełni odwracalne i indukowane odpowiednio przez leczenie IPTG i Dox (Rysunek 4A). Następnie wprowadziliśmy modyfikację Dnmt1LGT do linii zarodkowej myszy, aby przetestować zdolność systemu REMOTE-control do regulacji w górę in vivo. Silną regulację w górę Dnmt1 zaobserwowano w wątrobie, śledzionie i nerkach, podczas gdy nie zaobserwowano wykrywalnej regulacji w górę w sercu (Ryc. 4B)7. Zależny od cyklu komórkowego wzorzec ekspresji Dnmt1 i niedobór komórek proliferacyjnych w sercu mogą leżeć u podstaw tej obserwacji10,56. Czas pokaże, czy to ograniczenie można przezwyciężyć poprzez zwiększenie poziomu ekspresji aktywatora lub liczby jego miejsc wiązania.

figure-results-1
Rysunek 2: Tłumienie in vivo Dnmt1 przez represor LacIGY. (A) Myszy z operatorami lac (LO) wstawionymi do promotora Dnmt1, z ekspresją LacIGY lub bez, leczono różnymi dawkami IPTG. Analiza qRT-PCR ekspresji Dnmt1 wykazuje zależne od dawki odwrócenie represji Dnmt1 in vivo przez leczenie IPTG. Każdy pasek reprezentuje dane z innej myszy. Dane reprezentują średnią ± SEM (n = 3). (B) Barwienie immunologiczne białka Dnmt1 w kryptach okrężnicy myszy, którym podawano wodę pitną z lub bez 160 mM IPTG przez 3 tygodnie. Ten rysunek został zmodyfikowany z Lee et al.10 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Tłumienie in vivo i in vitro różnych promotorów przez system REMOTE-control. (A) Wczesna wersja sekwencji Repron (R*) została wstawiona do intronu poniżej promotora Villin u transgenicznej myszy Villin-mKate2 (VilmKate2). Przedstawiono analizę qRT-PCR ekspresji mKate2 w jelicie cienkim myszy z represorem LacIGY lub bez niego. Każdy pasek reprezentuje dane z innej myszy. (B) Konfokalne obrazy mKate2 jelita cienkiego z ekspresją LacIGY i bez niej. (C) Sześć symetrycznych operatorów lac (S) wstawiono między różne promotory i reportera lucyferazy. Reportery (50 ng / dołek w płytce 96-dołkowej) i plazmidy represorowe zostały przejściowo wprowadzone do komórek NIH / 3T3 w stosunku molowym 1: 1. Wartości lucyferazy oceniano 24 godziny po transfekcji. Te dane in vitro reprezentują procent ekspresji lucyferazy w komórkach eksprymujących LacIGY w stosunku do komórek wykazujących ekspresję niefunkcjonalnego LacI (NFlacI). Do określenia istotności statystycznej wykorzystano testy T. Dane reprezentują średnią ± SEM (n = 3). *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01. Ten rysunek został zmodyfikowany z Lee et al.10 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 4: Regulacja w dół i/lub w górę ekspresji Dnmt1 in vitro i in vivo. (A) Kompletny system zdalnego sterowania został opracowany w hodowlanych ESC za pomocą metod celowania w geny i elektroporacji. Maksymalne ograniczenie ekspresji Dnmt1 osiągnięto bez leczenia, podczas gdy maksymalną aktywację osiągnięto zarówno przez leczenie IPTG, jak i Dox. Dane reprezentują średnią ± SEM (n = 3). *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (testy t Welcha). (B) Aktywacja Dnmt1 in vivo przez system REMOTE-control, jak wykazano przez barwienie immunologiczne białka Dnmt1 w różnych tkankach myszy sterowanych metodą REMOTE. Allel LGT reprezentuje modyfikację promotora Dnmt1 w celu zawarcia operatora lac i miejsc wiązania aktywatora tet. Myszy leczono dietą normalną lub zawierającą Dox (5000 mg/kg Doxycycline Hyclate) przez jeden miesiąc. Ten rysunek został zmodyfikowany z Lee et al.10 Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek uzupełniający 1: Przykład wstawienia lądowiska do mysiego intronu 1 Dnmt1. (A) Schemat matrycy DNA do insercji lądowiska, zaadaptowany z Quadros et al. (2015)31. Heterotypowe miejsca loxP, JT15 i Lox2272, są oddzielone krótką sekwencją dystansową (sp) i otoczone z każdej strony 60-pzowym DNA, które jest homologiczne do docelowego regionu genomu. (B) Próbka matrycy DNA do wprowadzenia lądowiska do intronu Dnmt1 przy użyciu następującego sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG (który jest ukierunkowany na odwrotną nić). Wybrany region intronowy został poinformowany bioinformatycznie w kroku 1.1, a sgRNA został zidentyfikowany za pomocą CRISPOR29. (C) Przykład projektu startera do PCR do oceny włożenia lądowiska. Startery PCR zaprojektowano poza ramionami homologii matrycy, aby potwierdzić integrację z endogennym Dnmt1. Amplikon PCR typu dzikiego wynosi 213 pz; po wstawieniu staje się 291 pz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczowym etapem i potencjalnym ograniczeniem systemu REMOTE-control jest wyzwanie związane z insercją miejsc wiązania represora i/lub aktywatora bez wpływu na ekspresję genów docelowych. Nasze pierwotne podejście do represji, zastosowane do genu Dnmt1 , obejmowało insercję miejsc wiązania represorów lac w krytycznych transkrypcyjnie regionach promotora. W celu zmniejszenia ryzyka wpływu na funkcję promotora, a tym samym poprawy ogólnej możliwości zastosowania systemu REMOTE-control, opracowaliśmy podejście oparte na represjach opartych na intronach. Siła działania naszego ulepszonego systemu lac pozwoliła nam na ścisłe stłumienie transkrypcji wszystkich silnych promotorów, które testowaliśmy u operatorów znajdujących się od setek do kilku kilozasad poniżej miejsc rozpoczęcia transkrypcji (Figura 3A-C)10. Co ważne, poziomy represji były niezależne od siły transkrypcji promotorów (Figura 3A-C)10. Sugeruje to, że zdolność represyjna naszego systemu represji opartego na intronie przekracza siłę transkrypcyjną badanych promotorów. W tym podejściu opartym na intronie jest prawdopodobne, że represja jest pośredniczona przez fizyczną interferencję między dwoma składnikami, maszynerią wydłużania transkrypcji i represorami lac57. Ten prosty mechanizm represji i wykazana solidność metody opartej na intronach mogą sprawić, że podejście to będzie ogólnie stosowane do różnych genów, tkanek i organizmów.

Regulacja w górę przez system REMOTE-control wymaga, aby sekwencje wiążące transaktywator znajdowały się blisko promotora genu docelowego, co wiąże się z ryzykiem wpływu na funkcję promotora. Odkryliśmy jednak, że pozycja sekwencji wiążących może znajdować się poza regionem krytycznym transkrypcyjnie. Zarówno promotory Dnmt1 , jak i EF1α były silnie regulowane w górę od operatorów tet zlokalizowanych kilkaset zasad powyżej miejsc rozpoczęcia transkrypcji10. To złagodzone ograniczenie znacznie zmniejsza ryzyko wpływu na funkcję promotora genu docelowego w przypadku braku transaktywatora. Zwiększenie liczby sekwencji wiążących i/lub zastosowanie silniejszych transaktywatorów może pomóc w dalszym zmniejszeniu ryzyka poprzez umożliwienie regulacji w górę z miejsc bardziej oddalonych od miejsca rozpoczęcia transkrypcji.

Nasz system zdalnego sterowania zapewnia elegancką kontrolę poziomu, czasu i lokalizacji endogennej ekspresji genów, umożliwiając testowanie odwracalności fenotypu i konsekwencji różnych poziomów ekspresji, które nie są łatwo osiągalne przy użyciu obecnych technologii kontroli ekspresji genów in vivo. Należy zauważyć, że w większości analiz ekspresji genów, w tym w naszej, wartości ekspresji reprezentują średnią populacji komórek, wśród których można znaleźć znaczne różnice. Ta heterogeniczność może wpływać na komórkowe procesy decyzyjne, takie jak różnicowanie lub apoptoza58. Chociaż precyzja kontroli ekspresji genów mogłaby być prawdopodobnie jeszcze bardziej poprawiona przez dodatkową inżynierię obwodów genetycznych59, obserwowana moc naszego obecnego systemu pozwoli na użyteczne badanie funkcji genów w wielu kontekstach biologicznych. Ponadto oczekuje się wysokiego stopnia swoistości docelowej ze względu na złożoność sekwencji operatorów, a także dużą odległość ewolucyjną między ssakami a gatunkami pochodzącymi ze składników regulacyjnych60. Co więcej, transgeniczne mysie linie represorów i aktywatorów mogą być opracowywane i stosowane dla dowolnego genu endogennego. Na przykład, istniejące modele myszy z transaktywatorem tet można dostosować do regulacji w górę docelowego genu w pożądanych tkankach myszy. Niedawno opracowaliśmy linię transgeniczną, która może napędzać silną, specyficzną tkankowo ekspresję naszego ulepszonego represora lac w wielu typach tkanek w połączeniu z istniejącymi liniami Cre poprzez wprowadzenie genu lacIGY do locus48 Hipp11 pod kontrolą elementu Lox-STOP-Lox (niepublikowanego). Linia ta znacznie ułatwiłaby specyficzne tkankowo zastosowanie systemu REMOTE-control.

Regulacja w górę genów za pomocą systemu REMOTE-control ma kilka zalet w porównaniu z obecnymi indukowalnymi metodami transgenicznymi. Nie wymaga generowania wielu linii transgenicznych w celu przetestowania efektów położenia insercji, ponieważ wykorzystuje endogenne locus. Ponadto podejście to dobrze nadaje się do regulacji w górę genów o silnej ekspresji wyjściowej, ponieważ zwiększa ekspresję z już silnego promotora, podczas gdy konwencjonalne modele transgeniczne opierają się na minimalnych promotorach wirusa. Wreszcie, specyficzność tkankowa, kontrola cyklu komórkowego i warianty splicingu docelowego genu mogą zostać zachowane po regulacji w górę przez nasze podejście, ponieważ zachowuje ono elementy naturalnej regulacji, takie jak wrodzone elementy cis-regulatorowe. Pojawienie się technologii celowania genowego za pośrednictwem CRISPR/Cas znacznie ułatwi zastosowanie tej technologii w różnych systemach modelowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PWL zasiada w Naukowych Radach Doradczych AnchorDx i Progenity, Inc.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy zmarłej dr Heidi Scrable za jej hojny dar w postaci konstruktu genu lacI u ssaków (Mayo Clinic, Rochester, MN), dr Danielowi Louvardowi (Institut Curie, Paryż, Francja) za dostarczenie promotora Villin oraz dr Laurie Jackson-Grusby (Szpital Dziecięcy, Boston, MA) za jej wkład we wczesne etapy rozwoju tej technologii. Jesteśmy wdzięczni dr Nancy Wu i dr Robertowi Maxsonowi za ich pomoc w wyhodowaniu myszy transgenicznych i nokautujących. Dziękujemy członkom laboratorium Laird za pomocne dyskusje i wsparcie. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 i R01 CA212374 do P.W.L. i 1F31CA213897-01A1 do N.A.V.S.].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
B6C3F1/JThe Jackson Laboratory100010https://www.jax.org/strain/100010
Cas9 BiałkoPNA BioCP04http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE
CRISPORHaeussler i in. 2016http://crispor.tefor.net/
Dieta myszy zawierająca doksycyklinęEnvigoRóżni się w zależności od stężeniahttps://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/
ENCODE Baza danychUniwersytetuhttps://www.encodeproject.org/
iCre synteza mRNA plazmid (pBBI)Addgene65795https://www.addgene.org/65795/
IPTGGoldBioI2481Chttps://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg
pGL3-BasicPromegaE1751https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751
SVM-BPfinderGenomika regulacyjna, Uniwersytethttp://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/
TiProD: Tkanka promotor specjalny Baza danych KatedraBioinformatyki, UMG,  Uniwersytet Gö Ttingen http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de
UCSC Przeglądarka Genomu UniwersytetKalifornijski w Santa Cruzhttps://genome.ucsc.edu/
Stanforda Pompeu Fabra

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jackson-Grusby, L., et al. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nature Genetics. 27 (1), 31-39 (2001).
  2. David, G., Turner, G. M., Yao, Y., Protopopov, A., DePinho, R. A. mSin3-associated protein, mSds3, is essential for pericentric heterochromatin formation and chromosome segregation in mammalian cells. Genes & Development. 17 (19), 2396-2405 (2003).
  3. Sumi-Ichinose, C., Ichinose, H., Metzger, D., Chambon, P. SNF2beta-BRG1 is essential for the viability of F9 murine embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 17 (10), 5976-5986 (1997).
  4. Premsrirut, P. K., et al. A rapid and scalable system for studying gene function in mice using conditional RNA interference. Cell. 145 (1), 145-158 (2011).
  5. Qiu, S., Adema, C. M., Lane, T. A computational study of off-target effects of RNA interference. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1834-1847 (2005).
  6. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  7. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  8. Peng, H., Ivanov, A. V., Oh, H. J., Lau, Y. F., Rauscher, F. J. Epigenetic gene silencing by the SRY protein is mediated by a KRAB-O protein that recruits the KAP1 co-repressor machinery. The Journal of Biological Chemistry. 284 (51), 35670-35680 (2009).
  9. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLOS Genetics. 6 (3), 1000869(2010).
  10. Lee, K. H., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W. The REMOTE-control system: a system for reversible and tunable control of endogenous gene expression in mice. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12256-12269 (2017).
  11. Gossen, M., Bonin, A. L., Bujard, H. Control of gene activity in higher eukaryotic cells by prokaryotic regulatory elements. Trends in Biochemical Sciences. 18 (12), 471-475 (1993).
  12. Hu, M. C., Davidson, N. The inducible lac operator-repressor system is functional in mammalian cells. Cell. 48 (4), 555-566 (1987).
  13. Cronin, C. A., Gluba, W., Scrable, H. The lac operator-repressor system is functional in the mouse. Genes & Development. 15 (12), 1506-1517 (2001).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Council, N. R. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. (2011).
  16. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 762-769 (2018).
  17. Church, D. M., et al. Lineage-specific biology revealed by a finished genome assembly of the mouse. PLOS Biology. 7 (5), 1000112(2009).
  18. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  19. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  20. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  21. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  22. Handoko, L., et al. CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells. Nature Genetics. 43 (7), 630-638 (2011).
  23. Splinter, E., et al. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes & Development. 20 (17), 2349-2354 (2006).
  24. The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  25. Rosenbloom, K. R., et al. ENCODE data in the UCSC Genome Browser: year 5 update. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 56-63 (2013).
  26. Murray, J. I., Voelker, R. B., Henscheid, K. L., Warf, M. B., Berglund, J. A. Identification of motifs that function in the splicing of non-canonical introns. Genome Biology. 9 (6), 97(2008).
  27. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Research. 27 (4), 639-649 (2017).
  28. Corvelo, A., Hallegger, M., Smith, C. W., Eyras, E. Genome-wide association between branch point properties and alternative splicing. PLOS Computational Biology. 6 (11), 1001016(2010).
  29. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  30. Grainger, S., et al. CRISPR Guide RNA Validation In Vitro. Zebrafish. 14 (4), 383-386 (2017).
  31. Quadros, R. M., Harms, D. W., Ohtsuka, M., Gurumurthy, C. B. Insertion of sequences at the original provirus integration site of mouse ROSA26 locus using the CRISPR/Cas9 system. FEBS Open Bio. 5, 191-197 (2015).
  32. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83, (2014).
  33. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  34. Laird, P. W., et al. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Research. 19 (15), 4293(1991).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  37. Lazzarotto, C. R., et al. Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq. Nature Protocols. 13 (11), 2615-2642 (2018).
  38. Ohtsuka, M., et al. Improvement of pronuclear injection-based targeted transgenesis (PITT) by iCre mRNA-mediated site-specific recombination. Transgenic Research. 22 (4), 873-875 (2013).
  39. Ohtsuka, M., et al. Pronuclear injection-based mouse targeted transgenesis for reproducible and highly efficient transgene expression. Nucleic Acids Research. 38 (22), 198(2010).
  40. Lee, G., Saito, I. Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene. 216 (1), 55-65 (1998).
  41. Thomson, J. G., Rucker, E. B., Piedrahita, J. A. Mutational analysis of loxP sites for efficient Cre-mediated insertion into genomic DNA. Genesis. 36 (3), 162-167 (2003).
  42. Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of Transgenic Mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.11 (2009).
  43. Pu, X. A., Young, A. P., Kubisch, H. M. Production of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection. Methods in Molecular Biology. 1874, 17-41 (2019).
  44. Murgha, Y., et al. Combined in vitro transcription and reverse transcription to amplify and label complex synthetic oligonucleotide probe libraries. Biotechniques. 58 (6), 301-307 (2015).
  45. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92(2017).
  46. Chen, X., Wu, J. M., Hornischer, K., Kel, A., Wingender, E. TiProD: the Tissue-specific Promoter Database. Nucleic Acids Research. 34, Database issue 104-107 (2006).
  47. Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.10 (2009).
  48. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  49. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  50. Wyborski, D. L., DuCoeur, L. C., Short, J. M. Parameters affecting the use of the lac repressor system in eukaryotic cells and transgenic animals. Environmental and Molecular Mutagenesis. 28 (4), 447-458 (1996).
  51. Wyborski, D. L., Short, J. M. Analysis of inducers of the E.coli lac repressor system in mammalian cells and whole animals. Nucleic Acids Research. 19 (17), 4647-4653 (1991).
  52. Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nature Medicine. 14 (9), 979-984 (2008).
  53. Michel, G., Mosser, J., Fauran, F. Serum kinetics of doxycycline polyphosphate in dogs. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 4 (1), 43-48 (1979).
  54. Bertocchi, I., et al. Regulatory functions of limbic Y1 receptors in body weight and anxiety uncovered by conditional knockout and maternal care. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19395-19400 (2011).
  55. Plageman, T. F., Lang, R. A. Generation of an Rx-tTA: TetOp-Cre knock-in mouse line for doxycycline regulated Cre activity in the Rx expression domain. PLOS One. 7 (11), 50426(2012).
  56. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  57. Ptashne, M. Principles of a switch. Nature Chemical Biology. 7 (8), 484-487 (2011).
  58. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  59. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451(2013).
  60. Labow, M. A., Baim, S. B., Shenk, T., Levine, A. J. Conversion of the lac repressor into an allosterically regulated transcriptional activator for mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 10 (7), 3343-3356 (1990).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Odwracalna kontrola gen wrepresja Lacaktywacja Tetindukcja IPTGtraktowanie doksycyklinanaliza ekspresji gen win ynieria intron wregulacja transkrypcyjna

Powiązane artykuły