Artykuł metodologiczny

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

8.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59235

⸱

29 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Epigenetics, Van Andel Research Institute, 2Amgen

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Streszczenie

Tutaj opisujemy protokół implementacji systemu REMOTE-control (Reversible Manipulation off Transcription at Endogenous loci), który pozwala na odwracalną i przestrajalną kontrolę ekspresji endogennego genu będącego przedmiotem zainteresowania w żywych systemach modelowych. System REMOTE-control wykorzystuje wzmocnione systemy tłumienia lac i aktywacji tet w celu obniżenia lub zwiększenia regulacji docelowego genu w ramach jednego systemu biologicznego. Ścisłą represję można osiągnąć dzięki miejscom wiązania represorów elastycznie zlokalizowanym daleko za miejscem rozpoczęcia transkrypcji poprzez hamowanie wydłużania transkrypcji. Solidną regulację w górę można osiągnąć poprzez wzmocnienie transkrypcji endogennego genu poprzez skierowanie aktywatorów transkrypcji tet na pokrewny promotor. Ta odwracalna i dostrajalna kontrola ekspresji może być wielokrotnie stosowana i wycofywana w organizmach. Siła działania i wszechstronność systemu, jak wykazano w przypadku endogennego Dnmt1, pozwoli na bardziej precyzyjne analizy funkcjonalne in vivo, umożliwiając badanie funkcji genów na różnych poziomach ekspresji oraz testując odwracalność fenotypu.

Wprowadzenie

Podejścia polegające na wyłączeniu genów (knockout) lub metody transgeniczne zostały skuteczne środki do badania funkcji genów w modelach zwierzęcych. Jednakże regulacja ekspresji za pomocą tych podejść jest dychotomiczna (włączona/wyłączona), nieczasowa i w związku z tym nie jest w stanie ujawnić pełnego spektrum funkcjonalnego genu. Warunkowy układ Cre/LoxP technologie te umożliwiły czasoprzestrzenną inaktywację lub aktywację funkcji genów, jednak ich dychotomiczny charakter nadal stanowi ograniczenie, przejawiające się m.in. w letalności komórkowej i nieodwracalności tych procesów1,2,3Aby wypełnić tę lukę, opracowano metody warunkowego wyciszania ekspresji genów z wykorzystaniem tetregulowane shRNA lub miRNA4Jednak efekty poza celowe wciąż stanowią problem w przypadku RNAi5 i stanowią wyzwanie w kontekście kontroli in vivo. W ostatnim czasie technologie kontroli transkrypcyjnej za pomocą systemu CRISPR/Cas wprowadziły bardziej wszechstronne podejście do osiągania zarówno zwiększenia, jak i zmniejszenia ekspresji endogennych genów, wykazując swoją użyteczność.6,7Jednakże skuteczność kontroli transkrypcyjnej za pośrednictwem systemu CRISPR/Cas in vivo nie jest jeszcze jasna, a odwracalność represji opartej na KRAB pozostaje kwestią otwartą, ponieważ wykazano, że silna represja wywołana przez KRAB oraz jego białko oddziałujące KAP1 może prowadzić do trwałego wyciszenia genów8,9.

Aby wyeliminować te ograniczenia, opracowaliśmy nowy system regulacji transkrypcyjnej zdolny do warunkowego kontrolowania ekspresji genów endogennych w sposób odwracalny i regulowalny u myszy, wykorzystując zmodyfikowane prokariotyczne binarne systemy regulacji transkrypcyjnej10. Prokariotyczne binarne systemy regulacji transkrypcyjnej z ligandami regulacyjnymi, takimi jak lac i tet, umożliwiły taką odwracalną i regulowalną kontrolę ekspresji11,12,13,14. Jednakże niewystarczająca siła represji obecnych systemów binarnych utrudniała ich powszechne zastosowanie do kontroli ekspresji genów endogennych u ssaków. Opracowaliśmy ulepszony system represji lac, wystarczająco silny do represji genów endogennych, oraz zastosowaliśmy nową strategię kierowania aktywatorów transkrypcyjnych tet bezpośrednio do pokrewnego promotora genu endogennego, aby osiągnąć silną upregulację (Rycina 1)10. Dzięki tej technologii osiągnęliśmy kontrolę ekspresji endogennego genu Dnmt1 w zakresie prawie dwóch rzędów wielkości w sposób regulowalny, indukowalny i odwracalny10. W niniejszym materiale przedstawiamy instrukcje krok po kroku dotyczące jego zastosowania in vivo w odniesieniu do innych genów i organizmów, wykorzystując myszy jako gatunek modelowy.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Przegląd systemu REMOTE-control. Transkrypcja endogennego genu docelowego może być regulowana przy użyciu zmodyfikowanych systemów represora lac i aktywatora tet. Promotor lub intron genu docelowego jest modyfikowany tak, aby zawierać operatory dla silnie wiążącego represora LacIGY i/lub aktywatora rtTA-M2. R oznacza Repron (Repression intron), który zawiera 12 symetrycznych operatorów lac (S) oraz częściowy intron beta-globiny królika. T oznacza operator tet. Represor i/lub aktywator są ekspresowane z promotora specyficznego dla danej tkanki. Ekspresja genu docelowego może być następnie odwracalnie dostrajana do pożądanego poziomu poprzez podanie IPTG (izopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranozydu, antagonisty represora LacIGY) lub doksycykliny (Dox). Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Lee i wsp.10 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Przed rozpoczęciem procedury należy zapoznać się z Tabelą 1, aby zidentyfikować kroki odpowiednie dla pożądanego sposobu kontroli ekspresji genów. Na przykład, aby stworzyć mysz umożliwiającą odwracalną regulację w dół „Gen X”, należy wykonać sekcje 1, 3 i 4 poniższego protokołu. Tabela 1 zawiera również podsumowanie niezbędnych komponentów systemu REMOTE-control.

Pożądana zmiana ekspresjiWyłącznie represjaWyłącznie aktywacjaZarówno represja, jak i aktywacja
Istotne sekcje protokołu1, 3-42-41-4
Konieczność występowania sekwencji sterującej zdalnie w genie docelowymRepron ("Intron represyjny"; 12 symetrycznych operatorów lac oraz fragment intronu beta-globiny królika)operator(y) TetRepron i operator(y) Tet
Lokalizacja sekwencji sterowania zdalnegoIntronPromotorIntron & Promotor
Wymagany aktywator/represor dla pożądanego sterowaniaRepresor LacIGYAktywator rtTA-M2Represor LacIGY i aktywator rtTA-M2
Ligandy regulacyjneIPTGDoksycyklinaIPTG i/lub doksycyklina

Tabela 1: Przegląd komponentów REMOTE-control.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Południowej Kalifornii oraz Instytutu Badawczego Van Andel oraz zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych z National Institutes of Health15.

1. Modyfikuj gen zainteresowania do represji za pomocą ZDALNEGO sterowania

  1. Korzystając z poniższych wskazówek, zidentyfikuj obojętny transkrypcyjnie intron w kierunku końca 5' genu będącego przedmiotem zainteresowania w celu insercji sekwencji Repron ("Repression intron"; 12 symetrycznych operatorów lac plus częściowy intron beta-globiny królika). Należy pamiętać o alternatywnych promotorach dla genu będącego przedmiotem zainteresowania i wybrać intron zgodnie z transkryptem(-ami), który ma być kontrolowany (tj. intron wspólny dla wszystkich transkryptów lub specyficzny dla pożądanego transkryptu).
    UWAGA: W przypadku genów bez intronu lub z jedynkami na końcu 3', wstaw sekwencję Repron do promotora (zobacz Lee, et al.10 dla szczegółowej procedury).
    1. Uzyskaj sekwencję genomową dla genu będącego przedmiotem zainteresowania.
      1. Przejdź do UCSC Genome Browser16,17 i wybierz najnowszą wersję roboczą genomu myszy (Mouse GRCm38/mm10 w momencie publikacji), która obecnie znajduje się w zakładce Genomy.
      2. Wprowadź nazwę lub symbol interesującego Cię genu w pasku wyszukiwania, aby wyświetlić transkrypcje genu. Kliknij przycisk Przejdź.
      3. Wybierz żądany wariant transkryptu dla interesującego Cię genu.
      4. Kliknij symbol genu obok interesującego nas wariantu transkryptu (symbol wcześniej wybranego transkryptu będzie znajdował się w ciemnym polu).
      5. Pod banerem Sekwencja i łącza do narzędzi i baz danych kliknij łącze Sekwencja genomowa.
      6. W polu Opcje regionu pobierania sekwencji wybierz tylko eksony (5' UTR, CDS i 3' UTR), introny i domyślny Jeden rekord FASTA na gen. W polu Opcje formatowania sekwencji wybierz opcję Eksony pisane wielkimi literami, wszystko inne małymi literami i Maska powtarza się do N (aby ukryć powtarzające się sekwencje). Następnie kliknij przycisk Prześlij.
      7. Zapisz tę sekwencję, zachowując formatowanie wielkimi i małymi literami, w dokumencie lub programie, do którego można dodawać adnotacje.
    2. Unikaj przerywania wysp CpG, które mogą wskazywać na regiony z funkcją regulacji genów.
      UWAGA: Chociaż intron 5' jest preferowany do insercji sekwencji Repronu, pierwszy intron może zawierać transkrypcyjne elementy regulatorowe, takie jak wyspy CpG (badane w tym kroku) lub elementy wzmacniające (badane w kroku 1.1.4), których należy unikać w przypadku insercji Repronu.
      1. Pod banerem Expression and Regulation (Wyrażenie i regulacja) przeglądarki genomu UCSC (UCSC) (Wyrażenie i regulacja) w przeglądarce genomu UCSC (UCSC Genome Browser) wybierz opcję show (pokaż) dla ścieżki CpG Islands (Wyspy CpG), a następnie kliknij przycisk Odśwież.
      2. Powiększając 5-calowe introny, kliknij na każdą wyspę CpG (pokazaną na zielono w momencie publikacji, jeśli jest obecna) i wybierz Wyświetl DNA dla tej funkcji.
      3. Po wybraniu opcji Maska powtarza się do N, wybierz pobierz DNA, aby uzyskać sekwencję wyspy CpG.
      4. Nałóż te sekwencje na oryginalny plik sekwencji i dodaj je jako regiony intronowe, których należy unikać ze względu na możliwe funkcje regulacyjne genów.
    3. Unikaj przerywania niekodujących RNA, w przypadku, gdy pełnią one funkcję regulacyjną.
      1. Pod banerem Genes and Gene Predictions (Geny i przewidywania genów) przeglądarki UCSC Genome Browser (Przeglądarka genomu UCSC) wybierz opcję pokaż dla ścieżki GENCODE (Ensembl) i kliknij przycisk Odśwież.
      2. Powiększając introny 5', kliknij na każdy niekodujący RNA (pokazany na zielono w momencie publikacji, jeśli jest obecny) i uzyskaj sekwencję DNA dla każdego z nich, klikając jego współrzędne chromosomowe.
      3. Z menu rozwijanego Widok wybierz DNA, a następnie kliknij opcję Maska powtarza się do N. Następnie kliknij pobierz DNA.
      4. Nałóż te sekwencje na oryginalny plik sekwencji i dodaj je jako regiony intronowe, których należy unikać ze względu na możliwe funkcje regulacyjne genów.
    4. Unikaj regionów intronowych z sygnaturami wzmacniacza w tkankach będących przedmiotem zainteresowania, takich jak H3K4me1, H3K27ac i nadwrażliwość DNazy I18,19,20,21, a także miejsc wiązania CTCF, które regulują pętlę wzmacniacza22,23.
      1. Przejdź do bazy danych ENCODE24,25, a następnie wybierz ikonę Experiments (Eksperymenty).
      2. Jako typ testu wybierz ChIP-seq lub DNase-seq i wypełnij pozostałe kategorie (Organizm, Typ biopróbki itp.) zgodnie z komórkami, które mają być zaprojektowane.
      3. Po wybraniu funkcji najedź kursorem na piktogramy w kolorze niebieskim i wybierz ten, dla którego pojawia się opcja Wyświetl wyniki jako listę (piktogram po lewej stronie w momencie publikacji).
      4. Wybierz zestawy danych dla obiektów docelowych H3K4me1, H3K27ac, DNazy I i CTCF, które najbardziej pasują do komórek, które mają zostać zaprojektowane.
      5. W każdym odpowiednim zestawie danych przewiń do sekcji Pliki, sprawdź, czy wybrano mm10 (lub najnowszą wersję genomu) i UCSC, a następnie kliknij przycisk Wizualizuj.
      6. Teraz w przeglądarce genomu UCSC i powiększając introny 5' dla interesującego genu, kliknij każdy pik H3K4me1, H3K27ac, DNase I i CTCF w odpowiednich ścieżkach pików z adnotacjami.
      7. Uzyskaj sekwencję DNA dla każdego regionu szczytu, klikając jego współrzędne chromosomowe.
      8. Z menu rozwijanego Widok wybierz DNA, a następnie kliknij opcję Maska powtarza się do N. Następnie kliknij pobierz DNA.
      9. Nałóż te sekwencje na oryginalny plik sekwencji i dodaj je jako regiony intronowe, których należy unikać ze względu na możliwe funkcje regulacyjne genów.
    5. Unikaj zakłóceń uzgodnionych sekwencji splicingu, aby nie zakłócać prawidłowego splicingu eksonów.
      UWAGA: Chociaż sekwencje wymagane do splicingu są w dużej mierze ograniczone do około sześciu zasad na końcu 5' intron26 i około 60 zasad na końcu 3' 27, zaleca się wybranie dużego intronu, co pozwala na znacznie szersze marginesy z tych regionów konsensusu, aby zminimalizować prawdopodobieństwo wpływu na łączenie. Zaleca się korzystanie z narzędzi do analizy intronów, takich jak SVM-BPfinder28, w celu dokładniejszej analizy potencjalnych sekwencji spawów.
  2. Po zidentyfikowaniu regionu intronowego, który spełnia powyższe kryteria (jak pokazano dla Dnmt1 w danych uzupełniających), przeprowadź badanie przesiewowe sekwencji za pomocą internetowego narzędzia do projektowania sgRNA, aby zidentyfikować sgRNA w regionie o wysokiej swoistości i przewidywanych wynikach wydajności.
    1. Przejdź do wybranego narzędzia do projektowania sgRNA online, takiego jak CRISPOR29.
    2. Wprowadź sekwencję interesującego nas regionu intronowego, określ odpowiedni genom referencyjny i wybierz żądany motyw sąsiadujący z protospacerem (PAM). Kliknij przycisk Prześlij.
    3. Posortuj przewidywane sgRNA według wyniku swoistości i wybierz jeden lub więcej sgRNA, które również mają wysoki przewidywany wynik wydajności29.
      1. Opcjonalnie: Aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo użycia skutecznego sgRNA, najpierw przetestuj wydajność cięcia kilku najwyżej punktowanych sgRNA w teście in vitro30, a następnie postępuj z najbardziej wydajnym sgRNA in vivo.
  3. Zaprojektuj matrycę DNA zawierającą sekwencję lądowiska PITT (Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis), jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1A,B, otoczoną z obu stron przez ramiona homologii 60 zasad, które odpowiadają miejscu cięcia sgRNA31.
    UWAGA: Lądowisko zawiera dwa heterotypowe miejsca loxP (JT15 i Lox2272) i umożliwia ukierunkowane wprowadzanie dużych sekwencji poprzez podejście dwuetapowe; Upewnij się, że połączenia tego wstawiania nie tworzą tajemniczych miejsc łączenia. Alternatywnie, strategia knock-in oparta na embrionalnych komórkach macierzystych (ESC) może być wykorzystana do bezpośredniego wprowadzenia sekwencji Repron.
  4. Przygotuj matrycę sgRNA, białka Cas9 i jednoniciowego DNA (ssDNA) na lądowisko i wstrzyknij mikroiniekcję do zapłodnionych jaj (od myszy B6C3F1/J lub innego pożądanego szczepu) zgodnie z ustalonymi protokołami32,33.
  5. Ekran dla myszy z wciskaniem lądowiska.
    1. Zaprojektuj startery PCR komplementarne do locus genomu, ale poza regionami docelowymi ramion homologii, jak pokazano dla Dnmt1 na rysunku uzupełniającym 1C. Unikaj powtarzających się sekwencji genomowych podczas projektowania starterów.
    2. Wyodrębnij DNA z klipsów ogonowych myszy zgodnie z ustalonymi protokołami34.
    3. Użyj PCR i elektroforezy żelowej, aby zidentyfikować myszy z wprowadzeniem lądowiska.
    4. Upewnij się, że wkłucie się powiodło, sekwencjonując produkty PCR.
      UWAGA: Niechciane duże usunięcia i przegrupowania mogą być wprowadzane przez CRISPR/Cas935, dlatego przed kontynuowaniem zaleca się staranne sprawdzenie pod kątem edycji poza celem35,36,37.
  6. Używając zapłodnionych jaj myszy z lądowiska, mikrowstrzyknij mRNA38 i transgeniczny plazmid zawierający sekwencję Repron otoczoną miejscami rekombinacji JTZ17 i Lox227231,39,40,41 zgodnie z ustalonymi metodami38,42,43.
  7. Ekran dla myszy z wstawieniem Reprona.
    1. Zaprojektuj startery PCR komplementarne do locus genomu, poza insertem Repron. Unikaj powtarzających się sekwencji genomowych podczas projektowania starterów.
    2. Wyodrębnij DNA z klipsów ogonowych myszy zgodnie z ustalonymi protokołami34.
    3. Użyj PCR i elektroforezy żelowej, aby zidentyfikować myszy z insercją Repronu.
    4. Upewnij się, że knock-in powiódł się, sekwencjonując produkty PCR.

2. Modyfikuj interesujący gen w celu regulacji w górę za pomocą ZDALNEGO sterowania

  1. Korzystając z poniższych wskazówek, zidentyfikuj region w promotorze genu będącego przedmiotem zainteresowania, który prawdopodobnie nie zaburzy funkcji promotora po wstawieniu sekwencji operatora tet. Należy pamiętać o alternatywnych promotorach dla genu będącego przedmiotem zainteresowania i wybrać promotor zgodnie z transkryptem (transkryptami), który ma być kontrolowany (tj. promotor wspólny dla wszystkich transkryptów lub specyficzny dla pożądanego transkryptu).
    1. Uzyskaj sekwencję genomową dla promotora będącego przedmiotem zainteresowania.
      1. Przejdź do UCSC Genome Browser16,17 i wybierz najnowszą wersję roboczą genomu myszy (Mouse GRCm38/mm10 w momencie publikacji), która obecnie znajduje się w zakładce Genomy.
      2. Wprowadź nazwę lub symbol interesującego Cię genu w pasku wyszukiwania, aby wyświetlić transkrypcje genu. Kliknij przycisk Przejdź.
      3. Wybierz żądany wariant transkryptu dla interesującego Cię genu.
      4. Kliknij symbol genu obok interesującego nas wariantu transkryptu (symbol genu poprzednio wybranego transkryptu będzie znajdował się w ciemnym polu).
      5. Pod banerem Sekwencja i łącza do narzędzi i baz danych kliknij łącze Sekwencja genomowa.
      6. W polu Sequence Retrieval Region Options (Opcje regionu pobierania sekwencji) wybierz tylko Promoter/Upstream o 1000 baz. W polu Opcje formatowania sekwencji wybierz opcję Maskuj powtórzenia na N (aby ukryć powtarzające się sekwencje). Następnie kliknij przycisk Prześlij.
      7. Zapisz tę sekwencję promotora w dokumencie lub programie, do którego można dodawać adnotacje.
    2. Wybierz regiony, które są wolne od przypuszczalnych miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego, ponieważ przerwanie tych sekwencji może zmienić endogenną ekspresję genów.
      1. Przejdź do przeglądarki genomu UCSC i otwórz najnowszą wersję genomu myszy.
      2. Nad banerem Mapowanie i sekwencjonowanie wybierz pozycję koncentratory ścieżek.
      3. Kliknij mm10 obok nazwy huba JASPAR 2018 TFBS (lub najnowszej wersji JASPAR).
      4. Wprowadź nazwę lub symbol interesującego Cię genu w pasku wyszukiwania, aby wyświetlić transkrypcje genu. Kliknij przycisk Przejdź.
      5. Wybierz żądany wariant transkryptu dla interesującego Cię genu.
      6. Przewiń w dół do banera JASPAR 2018 TFBS i kliknij strzałkę listy rozwijanej, aby wybrać żądaną opcję wyświetlania ścieżki, taką jak zgniatanie. Kliknij przycisk Odśwież.
      7. Powiększ obszar promotora interesującego genu i zidentyfikuj regiony, które są wolne (lub względnie wolne) od miejsc wiązania czynnika transkrypcyjnego zgodnie ze ścieżką JASPAR. Zapisz współrzędne chromosomalne tych regionów.
      8. Uzyskaj sekwencję genomową tych współrzędnych chromosomowych, wpisując je w pasku wyszukiwania i klikając przycisk Przejdź. Z menu rozwijanego Widok wybierz DNA, a następnie kliknij opcję Maska powtarza się do N. Następnie kliknij pobierz DNA.
      9. Nałóż te sekwencje na oryginalny plik sekwencji i oznacz je jako idealne regiony promotorowe do celu z powodu braku wiązania czynnika transkrypcyjnego.
    3. W ramach tych sekwencji wybierz zaburzony region promotora, który znajduje się powyżej, ale w pobliżu miejsca rozpoczęcia transkrypcji interesującego genu.
      UWAGA: Insercja, która znajduje się zbyt blisko miejsca rozpoczęcia transkrypcji, może zwiększyć ryzyko upośledzenia aktywności promotora, ale insercja, która jest zbyt daleko, może obniżyć poziom regulacji w górę. Wstawienie sekwencji operatorów tet około 200 par zasad przed miejscem rozpoczęcia transkrypcji spowodowało solidną regulację w górę dwóch testowanych promotorów (patrz dyskusja)10.
  2. Przeprowadź badanie przesiewowe wybranego regionu promotora za pomocą internetowego narzędzia do projektowania sgRNA, aby zidentyfikować sgRNA w regionie o wysokiej swoistości i przewidywanych wynikach wydajności.
    1. Przejdź do wybranego narzędzia do projektowania sgRNA online, takiego jak CRISPOR29.
    2. Wprowadź sekwencję obszaru zainteresowania, określ odpowiedni genom referencyjny i wybierz żądany motyw sąsiadujący z protospacerem (PAM). Kliknij przycisk Prześlij.
    3. Posortuj przewidywane sgRNA według wyniku swoistości i wybierz jeden lub więcej sgRNA, które również mają wysoki przewidywany wynik wydajności29.
      1. Opcjonalnie: Aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo użycia skutecznego sgRNA, najpierw przetestuj wydajność cięcia kilku sgRNA w teście in vitro30, a następnie postępuj z najbardziej wydajnym sgRNA in vivo.
  3. Zaprojektuj matrycę DNA zawierającą operatory tet otoczone z obu stron przez ramiona homologii 60 zasad, które odpowiadają miejscu cięcia sgRNA31,33.
    UWAGA: Liczba operatorów tet jest konfigurowalna; Wcześniej wykazano, że wprowadzanie dwóch do czterech sekwencji operatorów TET w tandemie jest skuteczne, ale w zasadzie więcej operatorów jest pożądanych do napędzania wyższej ekspresji. Alternatywnie, do wstawiania operatorów tet można użyć strategii knock-in opartej na ESC.
    1. Opcjonalnie: Aby uzyskać dowody eksperymentalne, że proponowane modyfikacje prawdopodobnie nie zakłócą endogennej aktywności transkrypcyjnej interesującego genu, sklonuj zmodyfikowaną sekwencję promotora do wektora lucyferazy świetlika (takiego jak pGL3-Basic) i porównaj jej skuteczność z oryginalnym promotorem za pomocą testu lucyferazy.
  4. Przygotuj sgRNA, białko Cas9 i matrycę ssDNA zawierającą sekwencje operatora tet i wstrzyknij mikro do zapłodnionych jaj (od myszy B6C3F1/J lub innego pożądanego szczepu) zgodnie z ustalonymi protokołami32,33.
    UWAGA: Ze względu na złożoność syntezy powtarzalnej sekwencji, zaleca się podejście oparte na transkrypcji in vitro/odwrotnej transkrypcji w celu syntezy matrycy ssDNA z plazmidu dwuniciowego DNA (dsDNA) class44. Alternatywnie, matryca dsDNA może być użyta do mikroiniekcji, ale skuteczność knock-in może być zmniejszona45.
  5. Ekran dla myszy z knock-in operatorów tet.
    1. Zaprojektuj startery PCR komplementarne do locus genomu, poza regionami, do których skierowane są ramiona homologii. Unikaj powtarzających się sekwencji genomowych podczas projektowania starterów.
    2. Wyodrębnij DNA z klipsów ogonowych myszy zgodnie z ustalonymi protokołami34.
    3. Użyj PCR i elektroforezy żelowej, aby zidentyfikować myszy z insercją operatorów tet.
    4. Upewnij się, że wkłucie się powiodło, sekwencjonując produkty PCR.
      UWAGA: Niechciane duże usunięcia i przegrupowania mogą być wprowadzane przez CRISPR/Cas935, dlatego przed kontynuowaniem zaleca się staranne sprawdzenie pod kątem edycji poza celem35,36,37.

3. Rozwijanie myszy z ekspresją aktywatora i/lub represora

  1. Zidentyfikuj silnie ulegający ekspresji promotor dla tkanki (tł) lub typu komórki będącego przedmiotem zainteresowania.
    UWAGA: Przeszukanie literatury i baza danych Tissue-Specific Promoter Database46 mogą być przydatne do identyfikacji takiego promotora.
  2. Umieść dostarczoną sekwencję wzmocnionego represora lac lub aktywatora tet za pożądanym promotorem, aby wygenerować konstrukt transgeniczny.
  3. Wytwórz linię (linie) myszy transgenicznych przy użyciu standardowych procedur transgenicznych42,43,47. Alternatywnie, można zastosować podejście transgenezy specyficzne dla miejsca, aby uniknąć efektów pozycji i umożliwić insercję transgenu w pojedynczej kopii31,48.
  4. Rozmnażaj założycieli i określ wzorzec ekspresji i poziom transgenu u potomstwa każdego założyciela. Wybrać linie o silnej ekspresji w zamierzonym typie tkanki (typach) tkanki do dalszej hodowli.
    1. Wyhoduj założycieli z myszami typu dzikiego.
    2. Zaprojektuj startery PCR, które wykryją wprowadzenie aktywatora i/lub represora.
    3. Wyodrębnij DNA z klipsów ogonowych potomstwa zgodnie z ustalonymi protokołami34.
    4. Użyj PCR i elektroforezy żelowej, aby zidentyfikować myszy z insercją.
    5. Potwierdź insercję transgenu poprzez sekwencjonowanie produktów PCR.
    6. Propaguj linie transgeniczne.
    7. Uświęć kilka młodych z każdej linii i zbierz interesujące tkanki do qRT-PCR, immunohistochemii i / lub western blotting, aby przeanalizować ekspresję interesującego genu / białka w docelowym typie tkanki.
    8. Wybierz linie o najsilniejszej ekspresji w tkankach będących przedmiotem zainteresowania do wykorzystania w sekcji 4.

4. Manipulowanie ekspresją genów in vivo

  1. Rozmnażaj myszy ze zmodyfikowanym genem będącym przedmiotem zainteresowania (sekcja 1 i/lub 2) z transgenicznymi myszami z sekcji 3 zgodnie z ustalonymi praktykami hodowlanymi49. Aby uzyskać maksymalną kontrolę ekspresji, wyhoduj myszy do homozygotyczności dla zmodyfikowanego allelu.
  2. W celu odwrócenia lub dostosowania represji genu docelowego, należy podać IPTG w wodzie pitnej.
    1. Aby eksperymentalnie określić dawkę IPTG do użycia, należy leczyć myszy o odpowiednim genotypie i grupie kontrolnej jedną z różnych dawek (zalecany zakres początkowy: 0 – 400 mM IPTG) przez co najmniej tydzień50,51. Uwzględnij co najmniej trzy myszy w każdej grupie leczonej i wybierz wiek i płeć myszy, które są najbardziej istotne dla planowanych przyszłych eksperymentów. UWAGA: Pary hodowlane myszy mogą być traktowane wodą IPTG, aby zapewnić rozwojową ekspozycję IPTG potomstwu, jeśli jest to pożądane13, lub myszy mogą rozpocząć leczenie w dowolnym momencie po urodzeniu.
      1. W dniu podania rozpuścić pożądaną masę IPTG w sterylnej wodzie destylowanej i mieszać za pomocą mieszadła przez 5 minut lub do całkowitego rozpuszczenia.
      2. Owiń butelkę folią i podawaj wodę IPTG w butelce zabezpieczonej przed światłem. Wymieniaj dwa razy w tygodniu. Zapewnij to samo źródło wody myszom otrzymującym 0 mM IPTG.
      3. Po upływie co najmniej tygodnia należy złożyć myszy w ofierze i przeanalizować ekspresję interesującego genu w tkance docelowej (tkankach) za pomocą qRT-PCR, immunohistochemii i / lub western blot.
      4. Zidentyfikuj dawkę, która przywraca ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania do ekspresji genu kontrolnego typu dzikiego i użyj tej dawki do osiągnięcia normalnej ekspresji genu w przyszłych eksperymentach.
  3. W celu indukcji regulacji w górę genów należy podawać Doksycyklinę (Dox) w diecie.
    1. Aby eksperymentalnie określić stężenie Dox do podania, należy leczyć myszy o odpowiednim genotypie i grupie kontrolnej jednym z zakresów stężeń Dox (zalecany zakres początkowy: 0 – 5000 mg/kg Hyclate Doksycykliny) przez co najmniej jeden tydzień52,53, w tym co najmniej trzy myszy na grupę leczoną. Kup karmę dla myszy zawierającą Dox od komercyjnego sprzedawcy.
      UWAGA: Pary hodowlane myszy mogą być leczone pokarmem Dox, aby zapewnić rozwojową ekspozycję Dox potomstwu, jeśli jest to pożądane54,55, lub myszy mogą rozpocząć leczenie w dowolnym momencie po urodzeniu.
    2. Zmieniaj dietę raz w tygodniu. Tę samą dietę podstawową należy podawać myszom otrzymującym pokarm wolny od Dox.
    3. Po upływie co najmniej tygodnia należy złożyć myszy w ofierze i przeanalizować ekspresję interesującego genu w tkance docelowej (tkankach) za pomocą qRT-PCR, immunohistochemii i / lub western blot.
    4. Zidentyfikuj dawkę, która podnosi ekspresję genu będącego przedmiotem zainteresowania do pożądanego poziomu i użyj tej dawki do osiągnięcia nadekspresji genu w przyszłych eksperymentach.

Wyniki

Zdolność supresyjna systemu REMOTE-control została dotychczas zademonstrowana w dwóch różnych podejściach. W pierwszym podejściu miejsca wiązania represora lac wstawiono w endogenny promotor genu Dnmt1. W drugim podejściu, rekomendowanym w niniejszym protokole, miejsca wiązania represora wstawiono do intronu położonego w regionie downstream, aby uniknąć potencjalnego ryzyka wpływu insercji na funkcję promotora, a tym samym uprościć zastosowanie systemu REMOTE-control. Oba podejścia doprowadziły do skutecznej supresji (Rysunek 2A,B oraz Rysunek 3A-C)10. Ekspresja Dnmt1 została zredukowana do 15% poziomu nieuregulowanego przy zastosowaniu podejścia opartego na promotorze (Rysunek 2A). Ta silna supresja została odwrócona w sposób zależny od dawki poprzez podawanie myszom różnych ilości IPTG (Rysunek 2A). Obserwowana supresja Dnmt1 została potwierdzona na poziomie białka za pomocą immunobarwienia (Rysunek 2B). Nie zaobserwowano żadnej zauważalnej różnicy w ekspresji Dnmt1 pomiędzy myszami Dnmt1+/+ a Dnmt1LO/LO, co potwierdza, że insercja operatora lac nie zaburzyła prawidłowej funkcji promotora10. Podejście oparte na intronie pozwoliło osiągnąć ponad 90% supresji dzięki operatorom zlokalizowanym kilka kilobaz downstream od miejsca rozpoczęcia transkrypcji, poprzez osłabienie elongacji transkrypcji (Rysunek 3A, B)10. Podejście oparte na intronie zostało następnie zwalidowane na siedmiu dodatkowych silnych promotorach (Rysunek 3C). W każdym przypadku uzyskano silną supresję dla wszystkich badanych promotorów. Nie zaobserwowano korelacji pomiędzy resztkowymi poziomami ekspresji a siłą promotorów, co sugeruje, że zdolność supresyjna naszego systemu opartego na intronie przewyższa potencjał transkrypcyjny wszystkich przetestowanych silnych promotorów (Rysunek 3C).

Zdolność systemu REMOTE-control do aktywacji in vivo została wykazana również na przykładzie genu Dnmt1. Do promotora Dnmt1 wprowadziliśmy dwie kopie operatora tet wraz z sekwencjami operatora lac, aby umożliwić zarówno nadróbkowanie (upregulację), jak i wyciszenie (downregulację) w zależności od obecności konkretnego białka efektorowego>. Silna aktywacja i wyciszenie ekspresji Dnmt1, obejmujące prawie dwa rzędy wielkości (od 10% do 650%), zostały osiągnięte w komórkach ESC zawierających zmodyfikowany endogenny allel Dnmt1 (Dnmt1LGT) (Rycyna 4A)10. Obie formy regulacji były w pełni odwracalne i indukowalne odpowiednio przez traktowanie IPTG i Dox (Rycyna 4A). Następnie wprowadziliśmy modyfikację Dnmt1LGT do linii zarodkowej myszy, aby przetestować zdolność systemu REMOTE-control do aktywacji in vivo. Silna upregulacja Dnmt1 została zaobserwowana w wątrobie, śledzionie i nerkach, podczas gdy w sercu nie stwierdzono wykrywalnej aktywacji (Rycyna 4B)7. Podłożem tej obserwacji może być zależny od cyklu komórkowego wzorzec ekspresji Dnmt1 oraz niewielka liczba komórek proliferujących w sercu10,56. Pozostaje kwestią otwartą, czy ograniczenie to można pokonać poprzez zwiększenie poziomu ekspresji aktywatora lub liczby jego miejsc wiązania.

figure-results-1
Rysunek 2: Represja Dnmt1 in vivo przez represor LacIGY. (A) Myszy z operatorami lac (LO) wstawionymi w promotor Dnmt1 , z ekspresją lub bez ekspresji LacIGY, poddano działaniu różnych dawek IPTG. Analiza qRT-PCR ekspresji Dnmt1 wykazuje zależne od dawki odwrócenie represji Dnmt1 in vivo po zastosowaniu IPTG. Każdy słupek reprezentuje dane z innej myszy. Dane przedstawiono jako średnia ± SEM (n = 3). (B) Immunobarwienie białka Dnmt1 w kryptach jelita grubego myszy, którym przez 3 tygodnie podawano wodę pitną z 160 mM IPTG lub bez IPTG. Rysunek został zmodyfikowany na podstawie pracy Lee i wsp.10 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Represja różnych promotorów in vivo i in vitro za pomocą systemu REMOTE-control. (A) Wczesna wersja sekwencji Repron (R*) została wprowadzona do intronu poniżej promotora Villin u myszy transgenicznej Villin-mKate2 (VilmKate2). Przedstawiono analizę qRT-PCR ekspresji mKate2 w jelicie cienkim myszy z represorem LacIGY lub bez niego. Każdy słupek reprezentuje dane z innej myszy. (B) Konfokalne obrazy mKate2 jelita cienkiego z ekspresją LacIGY i bez niej. (C) Sześć symetrycznych operatorów lac (S) wprowadzono pomiędzy różne promotory a reporter lukyferazy. Reportery (50 ng/dołek w płytce 96-dołkowej) oraz plazmidy represora wprowadzono przejściowo do komórek NIH/3T3 w stosunku molowym 1:1. Wartości lukyferazy oceniono 24 h po transfekcji. Te dane in vitro reprezentują procent ekspresji lukyferazy w komórkach wykazujących ekspresję LacIGY w stosunku do tych wykazujących ekspresję niefunkcjonalnego LacI (NFlacI). Do określenia istotności statystycznej zastosowano testy T. Dane reprezentują średnią ± SEM (n = 3). *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Lee et al.10 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 4: Hamowanie i/lub zwiększanie ekspresji Dnmt1 in vitro i in vivo. (A) Kompletny system REMOTE-control został zaprojektowany w hodowlanych ESC za pomocą metod targetowania genów i elektroporacji. Maksymalna represja ekspresji Dnmt1 została osiągnięta bez podawania czynników, natomiast maksymalna aktywacja nastąpiła po zastosowaniu zarówno IPTG, jak i Dox. Dane przedstawiają średnią ± SEM (n = 3). *P ≤ 0,05, **P ≤ 0,01 (testy t Welcha). (B) Aktywacja Dnmt1 in vivo za pomocą systemu REMOTE-control, wykazana poprzez immunobarwienie białka Dnmt1 w różnych tkankach myszy REMOTE-control. Allel LGT reprezentuje modyfikację promotora Dnmt1 w celu wprowadzenia operatora lac oraz miejsc wiązania aktywatora tet. Myszy otrzymywały standardową dietę lub dietę zawierającą Dox (5000 mg/kg hydrochlorчку doksycykliny) przez jeden miesiąc. Rycina została zmodyfikowana na podstawie pracy Lee et al.10 Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-results-4
Rycina uzupełniająca 1: Przykład insercji landing pad do intronu 1 genu Dnmt1 u myszy. (A) Schemat matrycy DNA dla insercji landing pad, zaadaptowany z Quadros et al. (2015)31. Heterotypowe miejsca loxP, JT15 i Lox2272, są oddzielone krótką sekwencją łącznikową (sp) i flankowane po obu stronach przez 60-bp DNA homologicznego do docelowego regionu genomowego. (B) Przykładowa matryca DNA do insercji landing pad do intronu Dnmt1 z wykorzystaniem następującego sgRNA: CTAGTACCACTCCTGTACCG (celującego w nić odwrotną). Wybrany region intronowy został wyznaczony bioinformatycznie w kroku 1.1, a sgRNA zidentyfikowano za pomocą CRISPOR29. (C) Przykład projektu starterów PCR do oceny insercji landing pad. Startery PCR zaprojektowano poza ramionami homologii matrycy, aby potwierdzić integrację z endogennym genem Dnmt1. Amplikon PCR typu dzikiego ma długość 213 bp; po insercji jego długość wzrasta do 291 bp. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Kluczowym etapem i potencjalnym ograniczeniem systemu REMOTE-control jest wyzwanie związane z insercją miejsc wiązania represora i/lub aktywatora bez wpływu na ekspresję genów docelowych. Nasze pierwotne podejście do represji, zastosowane do genu Dnmt1 , obejmowało insercję miejsc wiązania represorów lac w krytycznych transkrypcyjnie regionach promotora. W celu zmniejszenia ryzyka wpływu na funkcję promotora, a tym samym poprawy ogólnej możliwości zastosowania systemu REMOTE-control, opracowaliśmy podejście oparte na represjach opartych na intronach. Siła działania naszego ulepszonego systemu lac pozwoliła nam na ścisłe stłumienie transkrypcji wszystkich silnych promotorów, które testowaliśmy u operatorów znajdujących się od setek do kilku kilozasad poniżej miejsc rozpoczęcia transkrypcji (Figura 3A-C)10. Co ważne, poziomy represji były niezależne od siły transkrypcji promotorów (Figura 3A-C)10. Sugeruje to, że zdolność represyjna naszego systemu represji opartego na intronie przekracza siłę transkrypcyjną badanych promotorów. W tym podejściu opartym na intronie jest prawdopodobne, że represja jest pośredniczona przez fizyczną interferencję między dwoma składnikami, maszynerią wydłużania transkrypcji i represorami lac57. Ten prosty mechanizm represji i wykazana solidność metody opartej na intronach mogą sprawić, że podejście to będzie ogólnie stosowane do różnych genów, tkanek i organizmów.

Regulacja w górę przez system REMOTE-control wymaga, aby sekwencje wiążące transaktywator znajdowały się blisko promotora genu docelowego, co wiąże się z ryzykiem wpływu na funkcję promotora. Odkryliśmy jednak, że pozycja sekwencji wiążących może znajdować się poza regionem krytycznym transkrypcyjnie. Zarówno promotory Dnmt1 , jak i EF1α były silnie regulowane w górę od operatorów tet zlokalizowanych kilkaset zasad powyżej miejsc rozpoczęcia transkrypcji10. To złagodzone ograniczenie znacznie zmniejsza ryzyko wpływu na funkcję promotora genu docelowego w przypadku braku transaktywatora. Zwiększenie liczby sekwencji wiążących i/lub zastosowanie silniejszych transaktywatorów może pomóc w dalszym zmniejszeniu ryzyka poprzez umożliwienie regulacji w górę z miejsc bardziej oddalonych od miejsca rozpoczęcia transkrypcji.

Nasz system zdalnego sterowania zapewnia elegancką kontrolę poziomu, czasu i lokalizacji endogennej ekspresji genów, umożliwiając testowanie odwracalności fenotypu i konsekwencji różnych poziomów ekspresji, które nie są łatwo osiągalne przy użyciu obecnych technologii kontroli ekspresji genów in vivo. Należy zauważyć, że w większości analiz ekspresji genów, w tym w naszej, wartości ekspresji reprezentują średnią populacji komórek, wśród których można znaleźć znaczne różnice. Ta heterogeniczność może wpływać na komórkowe procesy decyzyjne, takie jak różnicowanie lub apoptoza58. Chociaż precyzja kontroli ekspresji genów mogłaby być prawdopodobnie jeszcze bardziej poprawiona przez dodatkową inżynierię obwodów genetycznych59, obserwowana moc naszego obecnego systemu pozwoli na użyteczne badanie funkcji genów w wielu kontekstach biologicznych. Ponadto oczekuje się wysokiego stopnia swoistości docelowej ze względu na złożoność sekwencji operatorów, a także dużą odległość ewolucyjną między ssakami a gatunkami pochodzącymi ze składników regulacyjnych60. Co więcej, transgeniczne mysie linie represorów i aktywatorów mogą być opracowywane i stosowane dla dowolnego genu endogennego. Na przykład, istniejące modele myszy z transaktywatorem tet można dostosować do regulacji w górę docelowego genu w pożądanych tkankach myszy. Niedawno opracowaliśmy linię transgeniczną, która może napędzać silną, specyficzną tkankowo ekspresję naszego ulepszonego represora lac w wielu typach tkanek w połączeniu z istniejącymi liniami Cre poprzez wprowadzenie genu lacIGY do locus48 Hipp11 pod kontrolą elementu Lox-STOP-Lox (niepublikowanego). Linia ta znacznie ułatwiłaby specyficzne tkankowo zastosowanie systemu REMOTE-control.

Regulacja w górę genów za pomocą systemu REMOTE-control ma kilka zalet w porównaniu z obecnymi indukowalnymi metodami transgenicznymi. Nie wymaga generowania wielu linii transgenicznych w celu przetestowania efektów położenia insercji, ponieważ wykorzystuje endogenne locus. Ponadto podejście to dobrze nadaje się do regulacji w górę genów o silnej ekspresji wyjściowej, ponieważ zwiększa ekspresję z już silnego promotora, podczas gdy konwencjonalne modele transgeniczne opierają się na minimalnych promotorach wirusa. Wreszcie, specyficzność tkankowa, kontrola cyklu komórkowego i warianty splicingu docelowego genu mogą zostać zachowane po regulacji w górę przez nasze podejście, ponieważ zachowuje ono elementy naturalnej regulacji, takie jak wrodzone elementy cis-regulatorowe. Pojawienie się technologii celowania genowego za pośrednictwem CRISPR/Cas znacznie ułatwi zastosowanie tej technologii w różnych systemach modelowych.

Oświadczenia

PWL zasiada w Naukowych Radach Doradczych AnchorDx i Progenity, Inc.

Podziękowania

Dziękujemy zmarłej dr Heidi Scrable za jej hojny dar w postaci konstruktu genu lacI u ssaków (Mayo Clinic, Rochester, MN), dr Danielowi Louvardowi (Institut Curie, Paryż, Francja) za dostarczenie promotora Villin oraz dr Laurie Jackson-Grusby (Szpital Dziecięcy, Boston, MA) za jej wkład we wczesne etapy rozwoju tej technologii. Jesteśmy wdzięczni dr Nancy Wu i dr Robertowi Maxsonowi za ich pomoc w wyhodowaniu myszy transgenicznych i nokautujących. Dziękujemy członkom laboratorium Laird za pomocne dyskusje i wsparcie. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health [R01 CA75090, R01 DA030325, R01 CA157918 i R01 CA212374 do P.W.L. i 1F31CA213897-01A1 do N.A.V.S.].

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
B6C3F1/JThe Jackson Laboratory100010https://www.jax.org/strain/100010
Cas9 BiałkoPNA BioCP04http://www.pnabio.com/products/CRISPR_Cas9.htm?gclid=EAIaIQobChMIsoG8pLL33QIVBr7ACh0naQ4dEAAYAiAAEgKyHvD_BwE
CRISPORHaeussler i in. 2016http://crispor.tefor.net/
Dieta myszy zawierająca doksycyklinęEnvigoRóżni się w zależności od stężeniahttps://www.envigo.com/products-services/teklad/laboratory-animal-diets/custom-research/doxycycline-diets/
ENCODE Baza danychUniwersytetuhttps://www.encodeproject.org/
iCre synteza mRNA plazmid (pBBI)Addgene65795https://www.addgene.org/65795/
IPTGGoldBioI2481Chttps://www.goldbio.com/search?isSearch=Y&q=iptg
pGL3-BasicPromegaE1751https://www.promega.com/products/reporter-assays-and-transfection/reporter-vectors-and-cell-lines/pgl3-luciferase-reporter-vectors/?catNum=E1751
SVM-BPfinderGenomika regulacyjna, Uniwersytethttp://regulatorygenomics.upf.edu/Software/SVM_BP/
TiProD: Tkanka promotor specjalny Baza danych KatedraBioinformatyki, UMG,  Uniwersytet Gö Ttingen http://tiprod.bioinf.med.uni-goettingen.de
UCSC Przeglądarka Genomu UniwersytetKalifornijski w Santa Cruzhttps://genome.ucsc.edu/
Stanforda Pompeu Fabra

Bibliografia

  1. Jackson-Grusby, L., et al. Loss of genomic methylation causes p53-dependent apoptosis and epigenetic deregulation. Nature Genetics. 27 (1), 31-39 (2001).
  2. David, G., Turner, G. M., Yao, Y., Protopopov, A., DePinho, R. A. mSin3-associated protein, mSds3, is essential for pericentric heterochromatin formation and chromosome segregation in mammalian cells. Genes & Development. 17 (19), 2396-2405 (2003).
  3. Sumi-Ichinose, C., Ichinose, H., Metzger, D., Chambon, P. SNF2beta-BRG1 is essential for the viability of F9 murine embryonal carcinoma cells. Molecular and Cellular Biology. 17 (10), 5976-5986 (1997).
  4. Premsrirut, P. K., et al. A rapid and scalable system for studying gene function in mice using conditional RNA interference. Cell. 145 (1), 145-158 (2011).
  5. Qiu, S., Adema, C. M., Lane, T. A computational study of off-target effects of RNA interference. Nucleic Acids Research. 33 (6), 1834-1847 (2005).
  6. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  7. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  8. Peng, H., Ivanov, A. V., Oh, H. J., Lau, Y. F., Rauscher, F. J. Epigenetic gene silencing by the SRY protein is mediated by a KRAB-O protein that recruits the KAP1 co-repressor machinery. The Journal of Biological Chemistry. 284 (51), 35670-35680 (2009).
  9. Groner, A. C., et al. KRAB-zinc finger proteins and KAP1 can mediate long-range transcriptional repression through heterochromatin spreading. PLOS Genetics. 6 (3), 1000869(2010).
  10. Lee, K. H., Oghamian, S., Park, J. A., Kang, L., Laird, P. W. The REMOTE-control system: a system for reversible and tunable control of endogenous gene expression in mice. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12256-12269 (2017).
  11. Gossen, M., Bonin, A. L., Bujard, H. Control of gene activity in higher eukaryotic cells by prokaryotic regulatory elements. Trends in Biochemical Sciences. 18 (12), 471-475 (1993).
  12. Hu, M. C., Davidson, N. The inducible lac operator-repressor system is functional in mammalian cells. Cell. 48 (4), 555-566 (1987).
  13. Cronin, C. A., Gluba, W., Scrable, H. The lac operator-repressor system is functional in the mouse. Genes & Development. 15 (12), 1506-1517 (2001).
  14. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  15. Council, N. R. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. (2011).
  16. Casper, J., et al. The UCSC Genome Browser database: 2018 update. Nucleic Acids Research. 46 (1), 762-769 (2018).
  17. Church, D. M., et al. Lineage-specific biology revealed by a finished genome assembly of the mouse. PLOS Biology. 7 (5), 1000112(2009).
  18. Creyghton, M. P., et al. Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21931-21936 (2010).
  19. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  20. Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nature Genetics. 39 (3), 311-318 (2007).
  21. Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).
  22. Handoko, L., et al. CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells. Nature Genetics. 43 (7), 630-638 (2011).
  23. Splinter, E., et al. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes & Development. 20 (17), 2349-2354 (2006).
  24. The ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).
  25. Rosenbloom, K. R., et al. ENCODE data in the UCSC Genome Browser: year 5 update. Nucleic Acids Research. 41, Database issue 56-63 (2013).
  26. Murray, J. I., Voelker, R. B., Henscheid, K. L., Warf, M. B., Berglund, J. A. Identification of motifs that function in the splicing of non-canonical introns. Genome Biology. 9 (6), 97(2008).
  27. Taggart, A. J., et al. Large-scale analysis of branchpoint usage across species and cell lines. Genome Research. 27 (4), 639-649 (2017).
  28. Corvelo, A., Hallegger, M., Smith, C. W., Eyras, E. Genome-wide association between branch point properties and alternative splicing. PLOS Computational Biology. 6 (11), 1001016(2010).
  29. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  30. Grainger, S., et al. CRISPR Guide RNA Validation In Vitro. Zebrafish. 14 (4), 383-386 (2017).
  31. Quadros, R. M., Harms, D. W., Ohtsuka, M., Gurumurthy, C. B. Insertion of sequences at the original provirus integration site of mouse ROSA26 locus using the CRISPR/Cas9 system. FEBS Open Bio. 5, 191-197 (2015).
  32. Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current Protocols in Human Genetics. 83, (2014).
  33. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  34. Laird, P. W., et al. Simplified mammalian DNA isolation procedure. Nucleic Acids Research. 19 (15), 4293(1991).
  35. Kosicki, M., Tomberg, K., Bradley, A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements. Nature Biotechnology. 36 (8), 765-771 (2018).
  36. Akcakaya, P., et al. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations. Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).
  37. Lazzarotto, C. R., et al. Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq. Nature Protocols. 13 (11), 2615-2642 (2018).
  38. Ohtsuka, M., et al. Improvement of pronuclear injection-based targeted transgenesis (PITT) by iCre mRNA-mediated site-specific recombination. Transgenic Research. 22 (4), 873-875 (2013).
  39. Ohtsuka, M., et al. Pronuclear injection-based mouse targeted transgenesis for reproducible and highly efficient transgene expression. Nucleic Acids Research. 38 (22), 198(2010).
  40. Lee, G., Saito, I. Role of nucleotide sequences of loxP spacer region in Cre-mediated recombination. Gene. 216 (1), 55-65 (1998).
  41. Thomson, J. G., Rucker, E. B., Piedrahita, J. A. Mutational analysis of loxP sites for efficient Cre-mediated insertion into genomic DNA. Genesis. 36 (3), 162-167 (2003).
  42. Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of Transgenic Mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.11 (2009).
  43. Pu, X. A., Young, A. P., Kubisch, H. M. Production of Transgenic Mice by Pronuclear Microinjection. Methods in Molecular Biology. 1874, 17-41 (2019).
  44. Murgha, Y., et al. Combined in vitro transcription and reverse transcription to amplify and label complex synthetic oligonucleotide probe libraries. Biotechniques. 58 (6), 301-307 (2015).
  45. Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92(2017).
  46. Chen, X., Wu, J. M., Hornischer, K., Kel, A., Wingender, E. TiProD: the Tissue-specific Promoter Database. Nucleic Acids Research. 34, Database issue 104-107 (2006).
  47. Haruyama, N., Cho, A., Kulkarni, A. B. Overview: Engineering transgenic constructs and mice. Current Protocols in Cell Biology. , Chapter Unit-19.10 (2009).
  48. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  49. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. Journal of Visualized Experiments. , (2018).
  50. Wyborski, D. L., DuCoeur, L. C., Short, J. M. Parameters affecting the use of the lac repressor system in eukaryotic cells and transgenic animals. Environmental and Molecular Mutagenesis. 28 (4), 447-458 (1996).
  51. Wyborski, D. L., Short, J. M. Analysis of inducers of the E.coli lac repressor system in mammalian cells and whole animals. Nucleic Acids Research. 19 (17), 4647-4653 (1991).
  52. Traykova-Brauch, M., et al. An efficient and versatile system for acute and chronic modulation of renal tubular function in transgenic mice. Nature Medicine. 14 (9), 979-984 (2008).
  53. Michel, G., Mosser, J., Fauran, F. Serum kinetics of doxycycline polyphosphate in dogs. European Journal of Drug Metabolism and Pharmacokinetics. 4 (1), 43-48 (1979).
  54. Bertocchi, I., et al. Regulatory functions of limbic Y1 receptors in body weight and anxiety uncovered by conditional knockout and maternal care. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (48), 19395-19400 (2011).
  55. Plageman, T. F., Lang, R. A. Generation of an Rx-tTA: TetOp-Cre knock-in mouse line for doxycycline regulated Cre activity in the Rx expression domain. PLOS One. 7 (11), 50426(2012).
  56. Mollova, M., et al. Cardiomyocyte proliferation contributes to heart growth in young humans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (4), 1446-1451 (2013).
  57. Ptashne, M. Principles of a switch. Nature Chemical Biology. 7 (8), 484-487 (2011).
  58. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  59. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451(2013).
  60. Labow, M. A., Baim, S. B., Shenk, T., Levine, A. J. Conversion of the lac repressor into an allosterically regulated transcriptional activator for mammalian cells. Molecular and Cellular Biology. 10 (7), 3343-3356 (1990).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Odwracalna kontrola gen wrepresja Lacaktywacja Tetindukcja IPTGtraktowanie doksycyklinanaliza ekspresji gen win ynieria intron wregulacja transkrypcyjna
Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.